la técnica de hibridación reversa en línea para el diagnóstico de

LA TÉCNICA DE HIBRIDACIÓN REVERSA EN LÍNEA PARA EL
DIAGNÓSTICO DE BABESIA Y THEILERIA EN MEDICINA VETERINARIA
REVISIÓN NARRATIVA
CLAUDIA FERNANDA MEDINA LOMBANA
CÓDIGO: 70410066
UNIVESIDAD DE CIENCIAS APLICADAS Y AMBIENTALES
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
PROYECTO TRABAJO DE GRADO
BOGOTÁ D.C. 2009
1
LA TÉCNICA DE HIBRIDACIÓN REVERSA EN LÍNEA PARA EL
DIAGNÓSTICO DE BABESIA Y THEILERIA EN MEDICINA VETERINARIA
REVISIÓN NARRATIVA
Claudia Fernanda Medina Lombana
código: 70410066
Trabajo de grado para optar el título de
Médico Veterinario Zootecnista
Director:
Dr. Jorge Alexander León
Profesor Universidad de Ciencias Aplicadas y Ambientales
M.V. Esp.
UNIVESIDAD DE CIENCIAS APLICADAS Y AMBIENTALES
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
PROYECTO TRABAJO DE GRADO
BOGOTÁ D.C. 2009
2
Nota de aceptación:
___________________________
___________________________
___________________________
___________________________
___________________________
___________________________
Dra. Sandra Stella Ujueta
Decana facultad MVZ
____________________________
Jurado
Dr. Mairo Urbina
Vicedecano facultad MV
_____________________________
Jurado
Dr. Jorge Alexander León G.
Docente facultad MVZ
Director
Bogotá D.C, Octubre de 2009
3
DEDICATORIA
A
mis padres, quienes con su irremplazable
afecto e interminable
colaboración, fabrican los escalones que me facilitan alcanzar todas las
metas propuestas en mi vida. A todos aquellos que me han acompañado en
el proceso de formación personal y académica.
4
AGRADECIMIENTOS
Un agradecimiento muy especial al Dr. Jorge Alexander León, ya que sin su
apoyo y orientación como director no hubiera sido posible la realización de
este trabajo; y también, porque su entusiasmo despertó en mi el espíritu de
la investigación.
Al Dr. Yimmy Vargas del Instituto de Genética de la Universidad Nacional,
quien con sus conocimientos y enseñanza, fortaleció mi afinidad por la
ciencia de la Biología Molecular e instauró en mí la necesidad de aprender
de ella cada día más.
Agradezco a los jurados, ya que sus observaciones y recomendaciones,
hacen que esta revisión sea un trabajo de excelente calidad y pueda cumplir
con el objetivo de ser una herramienta útil para el campo de la Medicina
Veterinaria.
5
CONTENIDO
Pág.
INTRODUCCIÓN
13
1. OBJETIVOS
15
1.1. OBJETIVO GENERAL
15
1.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
15
2. MARCO TEORICO
16
2.1 HEMOPARASITOS
16
2.1.2 Babesia y Theileria
16
2.1.2 Biología y taxonomía de Babesia y Theileria
17
2.1.3 Babesiosis bovina y piroplasmosis equina
18
2.1.4 Diagnóstico de hemoparasitos
19
2.1.5 Técnicas más utilizadas para el diagnóstico de hemoparasitos
20
2.1.5.1 Extendido de sangre
20
2.1.5.2 Pruebas serológicas
20
2.1.5.3 Pruebas de biología molecular
21
2.2 HISTORIA Y DESARROLLO DE LA TECNICA DE HIBRIDACION REVRESA
EN LINEA (RLB)
21
2.3 FUNDAMENTO DE LA RLB
22
2.3.1 Procedimiento de la técnica
23
2.4 VENTAJAS DEL USO DE LA RLB
23
3. METODOLOGIA
25
3.1 TIPO DE ESTUDIO
25
3.2 POBLACION OBJETIVO DE LA REVISIÓN
25
3.3 CRITERIOS DE BUSQUEDA
25
6
3.4 FUENTES
25
3.5 DESCRIPTORES DE BUSQUEDA
26
3.6 SELECCIÓN DE LA INFORMACIÓN
26
3.7 ORGANIZACIÓN DE LA INFORMACIÓN
26
3.8 REDACCIÓN DE LA REVISIÓN
28
4. RESULTADOS
29
4.1 DESCRIPCIÓN DE LOS ARTICULOS ANALIZADOS
29
4.2 USO DE LA RLB PARA EL DIAGNÓSTICO DE HEMOPARÁSITOS (BABESIA
Y THEILERIA) EN SANGRE DE BOVINOS
33
4.3 CEBADORES UTILIZADOS Y DISEÑO DE SONDAS
38
4.4 ESPECIFICIDAD DE LA TECNICA DE RLB
40
4.5 SENSIBILIDAD DE LA TECNICA DE RLB
41
5. DISCUSIÓN
43
6. CONSLUSIONES Y RECOMENDACIONES
45
7. BIBLIOGRAFIA
46
7
LISTA DE TABLAS
Pág.
Tabla 1. Descriptores de búsqueda
26
Tabla 2. Estructura de la Tabla para síntesis de estudios de la Primera
selección.
27
Tabla 3. Estructura de la tabla para síntesis de los estudios
Finalmente seleccionados.
28
Tabla 4. Región de estudio de los 20 artículos analizados.
31
Tabla 5. Institutos que desarrollaron los estudios seleccionados
32
Tabla 6. Análisis comparado de los 20 estudios sobre el uso de la RLB en las
diferentes especies animales
33
Tabla 7. Análisis comparado de los 11 estudios sobre el uso de la RLB en
sangre de bovinos
36
Tabla 8. Cebadores utilizados para la amplificación del gen V4 rRNA 18s. 38
Tabla 9.Cebadores utilizados en los estudios para amplificar la región V4 39
Tabla10.Sondas utilizadas para la técnica de RLB en los estudios
8
40
LISTA DE FIGURAS
Pág.
Figura 1. Ciclo biológico de Babesia sp.
17
Figura 2. Representación esquemática de la RLB
23
Figura 3. Estructura del mapa conceptual
27
Figura 4. Porcentaje de los estudios seleccionados que fueron realizados en
las diferentes especies animales
29
Figura 5. Porcentaje de los estudios seleccionados según el continente
9
30
GLOSARIO
Apicomplexa: Grupo de protistas caracterizados por la presencia de un
orgánulo único denominado complejo apical.
Babesia: protozoo del filo apicomplexa; parasito intracelular, que produce la
enfermedad conocida como babesiosis en animales y seres humanos.
Biología molecular: Disciplina de la bioquímica que estudia la estructura,
función y composición de las moléculas biológicamente importantes; como el
ADN y ARN.
Cebadores: Iniciadores de la PCR, también denominados primers, son
oligonucleótidos sintéticos que hibridan con la región complementaria al ADN
molde, que se desea amplificar y propician el inicio de la reacción de
elongación por la Taq ADN polimerasa.
Clamidias: Género de bacterias gramnegativas pertenecientes a la familia
Chlamydiaceae, orden Chlamydiales, filo Chlamydiae.
Endémico: Enfermedad que se presenta sistemáticamente, de manera
regular, y sin variaciones apreciables de población afectada dentro de un
segmento demográfico.
Especificidad: Probabilidad de una prueba diagnóstica de definir en forma
correcta a un individuo sano, es decir, la probabilidad de que un sujeto
verdaderamente sano obtenga un resultado negativo en una prueba
diagnóstica. Otra forma de definir la especificidad es la capacidad para
detectar a los individuos sanos.
Extendido de sangre: Frotis sanguíneo, realizado para la observación
directa al microscopio.
GenBank: Base de datos de secuencias genéticas del NIH (National
Institutes of Health de Estados Unidos), es una colección de disponibilidad
pública de secuencias de ADN. Es parte de International Nucleotide
Sequence Database Collaboration, que está integrada por la base de datos
de ADN de Japón (DNA DataBank of Japan (DDBJ)), El Laboratorio Europeo
de Biología Molecular (European Molecular Biology Laboratory (EMBL)), y el
GenBank en el National Center for Biotechnology Information.
Genotipo: Constitución genética de un organismo, Conjunto de los alelos de
un individuo en uno, varios o todos sus loci.
Hemoglobinuria: Orina con residuos de hemoglobina.
10
Hemoparásitos: Parásitos que se alojan en la sangre del hospedero.
Hibridación: Unión complementaria del ADN y el ARN.
Intraeritrocitarios: Organismos que viven dentro de los eritrocitos o glóbulos
rojos.
Mycoplasmas: Género de bacterias que carecen de pared celular.
Pertenece a la clase Mollicutes, que incluye bacterias que tienen genomas
pequeños.
PCR: Polimerase Chain Reaction (Reacción en Cadena de la Polimerasa).
Técnica de Biología Molecular descrita en 1986 por Kary Mullis; cuyo objetivo
es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN en particular
partiendo de un mínimo.
Protozoarios: Pertenecen al reino protista, son eucariotas y heterótrofos,
existen aproximadamente 45.000 especies descritas.
Quimioluminiscencia: Reacción química que produce luz
Revisión sistemática: Resumen de evidencias, habitualmente realizada por
un experto o panel de expertos en un tema determinado, que utiliza un
riguroso proceso para minimizar los sesgos. Identifica, evalúa y sintetiza
estudios para contestar a una pregunta clínica específica o extraer
conclusiones sobre los datos recopilados.
Ricketssias: Género de bacterias
que pertenecen a la familia
Rickettsiaceae. Son parásitos intracelulares obligados, muy pequeñas, Gramnegativas y no forman esporas.
RLB: Reverse Line Blot (Hibridación Reversa en Línea). Técnica de biología
molecular que se basa en el trabajo conjunto de la hibridación y la PCR;
puesto que la esencia de la técnica es la hibridación de los productos de la
PCR, con unas sondas (oligonucleótidos) inmovilizadas en una membrana,
que posteriormente será visualizada mediante quimioluminiscencia.
Sensibilidad: Probabilidad de una prueba diagnóstica para clasificar
correctamente a un individuo enfermo, es decir, la probabilidad de que para
un sujeto enfermo se obtenga en una prueba diagnóstica un resultado
positivo. La sensibilidad es, por lo tanto, la capacidad del test para detectar la
enfermedad.
Theileria: Genero de parasito protozoario, perteneciente al filo apicomplexa;
causante de la enfermedad conocida como theileriosis.
11
INTRODUCCIÓN
Dentro de los parásitos de interés veterinario, los hemoparásitos agrupan
una gran cantidad de agentes etiológicos causantes de enfermedades de
gran trascendencia para la salud animal y salud pública mundialmente (Vivas
et al, 2000), además generan continuamente pérdidas económicas
importantes en diferentes tipos de producción animal; llegando incluso a ser
impedimentos para el comercio internacional. Es por esto que son
considerados un problema y deben ser detectados de forma rápida y
eficiente para realizar un tratamiento oportuno.
De aquí la importancia de los diversos métodos de diagnóstico existentes
para los hemoparásitos; como el examen microscópico de extendidos
sanguíneos y algunas pruebas serológicas como: Fijación de Complemento
(FC), Inmunofluorescencia Indirecta de Anticuerpos (IFAT) y el Ensayo por
Inmunoabsorción Ligado a Enzimas (ELISA). Estos métodos serológicos se
han empleado para el diagnóstico de infecciones clínicas y subclínicas en
estudios epidemiológicos, pero han sido comunes los resultados falsos
positivos y falsos negativos, pues las respuestas varían según el nivel de
anticuerpos en la sangre del hospedero al momento de extraer la muestra
(Vargas et al, 2004); esto ha afectado en gran medida realizar un diagnóstico
certero y mejorar el diseño de programas de prevención, control y
erradicación. Por lo tanto, se hace necesaria la utilización de métodos
altamente sensibles y específicos (Altay et al, 2008), para garantizar un
diagnóstico.
En este contexto, las herramientas de la biología molecular han sido
aplicadas al conocimiento de la patogénesis, susceptibilidad, diagnóstico y
más recientemente al tratamiento de enfermedades, como las producidas por
hemoparásitos. (Prichard et al, 2001)
Es por esto que recientemente se han realizado estudios y desarrollado
grandes avances en el diagnóstico basado en las técnicas de biología
molecular. La secuenciación del genoma de múltiples parásitos está
permitiendo grandes avances en el estudio de la biología y taxonomía de los
parásitos (Allsopp et al, 2006), mejorando drásticamente el diagnóstico y
control de los mismos.
Los métodos moleculares pueden ser usados para identificar genotipos no
típicos o variantes genéticas de parásitos cuando hay especies
morfológicamente similares y no pueden ser distinguidas en extendidos de
sangre (Birkenheue et al, 2004), como es el caso de Babesia y Theileria, los
12
cuales son los hemoparásitos de mayor abundancia en las especies bovina y
equina (Hunfeld et al, 2008).
Técnicas para la detección de estos hemoparásitos han sido desarrolladas
por separado para cada género y especie infectante; basadas principalmente
en la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), técnica altamente
sensible. Aun así, es mucho más práctico desarrollar una prueba de tipo
universal que permita detectar simultáneamente y diferenciar los
hemoparásitos que puedan estar presentes en sangre de los animales
(Gubbels et al, 1999).
Una respuesta a este tipo de necesidad es la técnica de Hibridación Reversa
en Línea o mejor conocida como RLB que son las siglas de su nombre en
inglés (Reverse Line Blot), la cual se ha desarrollado para la identificación
simultanea y diferenciación de diferentes especies de hemoparásitos
incluyendo Babesia y Theileria (Altay et al, 2008). La RLB es una efectiva y
practica herramienta, con la cual es posible detectar parásitos presentes en
sangre, así se encuentren en números extremadamente bajos, por lo que
podría ser considerada una herramienta útil al momento de diagnosticar
animales con infecciones subclínicas (Nagore et al, 2004).
Atendiendo al desarrollo que ha venido teniendo esta tecnología y el impacto
de los hemoparásitos en la industria ganadera tanto a nivel mundial como
local, este trabajo pretende además de resaltar dicho impacto, establecer la
importancia de las técnicas de diagnóstico moleculares, haciendo énfasis en
las de mayor utilidad para la realización de estudios epidemiológicos, como
la RLB; puesto que estas pueden proveer datos de importancia para diseñar
estrategias de control y tratamiento.
De esta forma, se realizó una revisión narrativa de los estudios más
relevantes sobre el uso de la técnica de Hibridación Reversa en Línea para el
diagnóstico de hemoparasitos; principalmente Babesia y Theileria, en las
diferentes especies animales, enfatizando en bovinos; se tomaron los
estudios más importantes de los últimos 10 años (1999-2009); luego,
mediante un análisis de los resultados y las discusiones generadas por
estos, se establecieron conclusiones que pueden aportan información de
interés al momento de implementar esta técnica como herramienta para el
diagnóstico de hemoparásitos.
13
1. OBJETIVOS
1.1 OBJETIVO GENERAL:
Realizar una revisión narrativa de los estudios más relevantes sobre el
uso de la técnica de Hibridación Reversa en Línea (RLB) para el
diagnóstico de Babesia y Theileria en medicina veterinaria.
1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
1. Describir aspectos relevantes sobre los hemoparásitos (Babesia y
Theileria), la enfermedad que generan y los métodos de diagnóstico.
2. Proporcionar información sobre los fundamentos de la
diagnóstico RLB y sus ventajas de uso.
técnica de
3. Evaluar y dar a conocer la evidencia disponible del uso de la técnica
de RLB en el diagnóstico de hemoparásitos en medicina veterinaria,
principalmente para la detección de especies de Babesia y Theileria
en sangre de bovinos; con el fin de proveer información de utilidad
para estudios que se realicen posteriormente en Colombia.
4. Comparar, caracterizar y analizar la sensibilidad y especificidad de la
técnica en diferentes estudios.
14
2. MARCO TEORICO
2.1 HEMOPARASITOS
Los animales domésticos están expuestos a diferentes microorganismos
tales como bacterias, virus, Ricketssias, Mycoplasmas, Clamidias, hongos y
protozoarios (Vivas et al, 2000). Dentro de estos agentes, los que actúan
como
hemoparásitos son importantes por generar enfermedades
significativas para la salud animal y que suponen gran riesgo para la salud
humana a nivel mundial.
Entre los hemoparásitos que más afectan las especies bovina y equina, se
tienen a Babesia y Theileria. (Hunfeld et al, 2008)
2.1.1 Babesia y Theileria
Hacia el final del siglo XIX se reconoció que muchos organismos
intraeritrocitarios causaban enfermedades en el ganado; tales como los
protozoos Babesia y Theileria que son responsables de la mayoría de las
enfermedades hemoparasitarias en ganado.
Estos dos géneros son
eucariotas pertenecientes al filo apicomplexa con un gran potencial de
distribución por todo el mundo, asociado a la supervivencia de sus vectores.
Al ser observados directamente al microscopio en extendidos de sangre de
hospedadores infectados, resalta una característica
común y es la
apariencia en forma de pera; esta observación dio lugar a la denominación
de “piroplasmas” del latín pirum=pera, (Allsop et al, 2006).
La primera descripción de un piroplasma fue publicada por Babes en 1888
en sangre de ganado infectado de un microorganismo al que denomino
Haemotococcus bovis, renombrado como Babesia bovis en 1893, el cual fue
asociado con hemoglobinuria o fiebre del agua roja. La Theileria parva y T.
anulata fueron descritas años después por Koch en 1898 (Allsop et al, 2006)
y se asociaron con otra enfermedad conocida como “piroplasmosis tropical”.
Otra enfermedad compleja mostrada en equinos conocida como fiebre
biliar, fue considerada también según Koch causada por dos organismos
patógenos ahora conocidos como Babesia caballi y Theileria equi (antes
conocida como Babesia Equi), (Allsop et al, 2006).
15
2.1.2 Biología y taxonomía de Babesia y Theileria
Los Protozoarios apicomplexos incluyendo genero Babesia y su pariente
cercano Theileria generalmente pasan por tres etapas de reproducción:
gametogonia que corresponde a la fusión de gametos dentro de la garrapata;
esporogonia que se refiere a la reproducción asexual en glándulas salivales;
y merogonia que corresponde a la reproducción asexual en el hospedador
vertebrado. (Figura 1). (Hunfeld et al, 2008).
Figura 1. Ciclo biológico de Babesia sp.
(SZ: esporozoito, T: trofozoito, M: merozoito, G: gametocitos, Sk: Strahlenkörper, Z:
cigotos, K: kineto, E: huevos, Sg: glandula salival, St: esporoblasto. (Hunfeld K. P. et
al, 2008).Fuente: (Hunfeld K.P. et al, 2008)
No obstante estos dos géneros de hemoparasitos poseen algunas
diferencias en cuanto a su forma de transmisión y cinética tanto dentro de los
vectores como de los hospedadores, las cuales se detallan a continuación.
Desarrollo en la garrapata. La garrapata se infecta cuando ingiere células
sanguíneas que contienen piroplasmas, se ha considerado que
probablemente estos se encuentren en sus etapas tempranas; dentro de la
garrapata desarrollan gametos femeninos o macrogametos y masculinos o
microgametos, los que se fusionan y forman cigotos motiles (ookinetos)
16
(Melhorn y schein, 1984; citado por Uielenberg, 2006), a partir de este punto
se diferencian las siguientes fases de desarrollo entre Babesia y Theileria.
Los ookinetos de Babesia invaden numerosos órganos de la garrapata,
incluyendo glándulas salivales y ovarios; de esta forma la infección pasa a
través del ovario al huevo y así a la siguiente generación, esta transmisión es
llamada transovarica, la garrapata también se infecta al tener contacto con
un hospedador infectado.
En cambio los cigotos de Theileria no invaden los ovarios y por tanto no se
transmiten transovaricamente, pero invaden la hemolinfa de la garrapata,
hasta llegar a las glándulas salivales; allí maduraran a esporogonias y
cuando la garrapata ataque a un nuevo hospedador, este se infectara por la
inoculación de esporozoitos junto con la saliva; para que otro vector se
infecte se requiere que ataque a este mismo hospedador, dicha transmisión
es conocida como transestadial, (Uilenberg, 2006).
Desarrollo en el hospedador vertebrado. Los esporozoitos inoculados
dentro del hospedador junto con la saliva del vector, van directamente a
infectar las células sanguíneas principalmente, donde
se produce su
multiplicación la cual generalmente resulta en dos o hasta cuatro células
hijas conocidas como merozoitos, los cuales por distintos mecanismos
provocan la lisis de las células infectadas e invaden nuevas células para
continuar su multiplicación hasta la muerte del hospedador o hasta que el
sistema inmune ponga fin a la propagación del parasito, (Uilenberg, 2006;
Homer et al, 2000).
La diferencia entre Babesia y Theileria radica en que la Babesia infecta
directamente los glóbulos rojos, mientras que los esporozoitos de Theileria
penetran en los linfocitos, donde se desarrollan a esquizontes.
Posteriormente el merozoito sale del linfocito y entra a la célula roja donde
madura y se multiplica formando tétradas, algunas veces formando lo que se
conoce como la “Cruz de Malta”, (Melhorn et al, 1993 citado por Homer et al,
2000).
2.1.3 Babesiosis bovina y piroplasmosis equina
La Babesiosis y la piroplasmosis son las enfermedades causadas por
parásitos protozoarios del género Babesia y Theileria; estos infectan y
causan enfermedad a múltiples mamíferos; incluyendo bovinos y equinos. La
Babesiosis bovina es causada principalmente por B bigemina, B. bovis y B
divergens, generalmente, la B. bovis es mas patógena que la B. bigemina y B
divergens; el vector principal son las garrapatas del genero Rhipicephalus
17
(Boophilus) microplus, que se encuentran ampliamente distribuidas en los
trópicos y subtropicos; otros vectores importantes incluyen: Ixodes ricinus,
Haemaphysalis sp y Rhipicephalus spp. (Organización Mundial de Sanidad
Animal (OIE), 2004)
Las infecciones se caracterizan por fiebre alta, hemoglobinuria, anemia,
anorexia, y algunas veces signos nerviosos como el resultado del secuestro
de eritrocitos infectados en los capilares cerebrales, (OIE, 2004).
La piroplasmosis equina es causada por T. equi y B. caballi.
Aproximadamente 14 especies de garrapatas del genero Dermacentor sp,
Rhipicephalus sp. y Hyalomma sp., son capaces de transmitir los dos
parásitos. Los signos clínicos son variables y no específicos; en casos
hiperagudos los animales pueden encontrarse muertos o agonizando, sin
embargo, generalmente la piroplasmosis se presenta en su forma aguda, en
la cual se observa fiebre que puede exceder los 40°C, depresión,
inapetencia, membranas mucosas ictéricas, disnea, aumento en frecuencia
cardiaca y respiratoria, adicionalmente pueden encontrarse otros signos
como; hemorragias petequiales, edemas,
incoordinación y cólico. La
destrucción intravascular masiva de eritrocitos parasitados puede resultar en
hemoglobinuria. Los signos subagudos son menos severos y la infección
crónica resulta en variables presentaciones clínicas con signos como:
inapetencia, pérdida de peso, fiebre transitoria, intolerancia al ejercicio y
anemia entre otras, (Zobba et al, 2008).
2.1.4 Diagnóstico de hemoparásitos
Las enfermedades hemoparasitarias como la piroplasmosis son
consideradas endémicas en varias regiones del mundo, que incluyen:
Europa, África, Asia y América (Bhoora et al, 2009).
Por lo tanto, el diagnóstico de esos agentes patógenos se convierte en un
asunto estratégico para estas regiones y por ende debe ser muy eficiente y
realizado mediante pruebas que además de ser efectivas sean de bajo costo,
ya que la mayoría de los países afectados poseen bajos recursos o destinan
muy pocos para el mejoramiento de sus producciones agropecuarias.
Actualmente existen diversas técnicas que son implementadas para el
diagnóstico de hemoparásitos, estas pueden ser de tipo directo o indirecto;
las técnicas de diagnóstico directo se basan principalmente en la
observación del hemoparásito, tales como: el examen por microscopía de
extendidos de sangre o los cultivos in vitro. Por otro lado, las técnicas de tipo
18
indirecto buscan identificar la presencia del hemoparásito a través de la
respuesta inmune frente a los mismos.
Asimismo, los avances de la biología molecular han generado herramientas
de utilidad para el diagnóstico de hemoparásitos, reportando buenos
resultados en la realización de estudios epidemiológicos, (Sparagano et al,
2000; Georges et al, 2001; Salih et al, 2007).
2.1.5 Técnicas más utilizadas para el diagnóstico de hemoparásitos:
2.1.5.1
Extendido de sangre
Esta es la prueba tradicional para el diagnóstico de hemoparásitos (OIE,
2004), puesto que es fácil de realizar y de bajo costo, pero poco confiable, ya
que por lo general registran cierta proporción de falsos negativos,
dependiente de la cantidad de parásitos en la sangre, que en algunas
infecciones puede ser baja o fluctuante. Este es un método de baja
sensibilidad para el diagnóstico, y poco confiable para diferenciar entre
parásitos, (Asgarali et al, 2007).
El diagnóstico se basa en identificar la presencia de los hemoparásitos en las
células sanguíneas y en la identificación del género y especie del mismo,
según su morfología y el daño que se observe en las células, para esto se
requiere de cierta experticia.
2.1.5.2
Pruebas serológicas
Actualmente hay disponibles pruebas, como la Fijación del Complemento,
Inmunofluorescencia Indirecta de Anticuerpos y los Ensayos Ligados a
Enzimas; las cuales están aceptadas para el comercio internacional de
animales; pero, sus resultados varían según el nivel de anticuerpos en la
sangre del hospedero al momento de extraer la muestra. (Vargas et al,
2004).
Las pruebas serológicas se han empleado para el diagnóstico de infecciones
agudas y subclínicas, y en estudios epidemiológicos, pero es frecuente tener
resultados falsos positivos y falsos negativos, debido a reacciones cruzadas
o a respuestas inmunoespecificas. (Altay et al, 2008)
Aunque las técnicas de referencia citadas
por USDA (United State
Departament of Agriculture) y la OIE, son la FC y la IFAT, para el diagnóstico
de las infecciones por hemoparásitos (Theileria y Babesia), estas no permiten
19
la diferenciación entre las especies y no descartan falsos negativos. (Vargas
et al, 2004)
2.1.5.3
Pruebas de biología molecular
Los avances en las técnicas de biología molecular han dado lugar a mejorar
la detección, identificación y caracterización genética de muchos
hemoparásitos. La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), es una de
las más utilizadas y se ha aplicado para la detección de diferentes especies
de Babesia y Theileria, y ha demostrado tener mayor sensibilidad y
especificidad comparada con los ensayos serológicos, (Bhoora et al, 2009).
La PCR ofrece una plataforma ideal para el desarrollo de una gran variedad
de pruebas moleculares para la identificación y cuantificación de los agentes
infecciosos de interés clínico (Costa, 2004); como la PCR a tiempo real, la
PCR anidada (Battsetseg et al, 2001), la PCR-RLB (Reverse Line Blot)
(Gubbels et al, 1999), la PCR-RFLP (Restriction fragment length
polymorphism) (Heidarpour et al, 2009) y PCR- minisatelites (Oura et al,
2004).
De otro lado, se han desarrollado técnicas como la amplificación isotérmica
en circuito (LAMP) (Alhassan et al, 2007).
En conclusión las técnicas moleculares se han desarrollado ampliamente,
gracias a la mejor sensibilidad y especificidad para la detección de agentes
como los hemoparásitos y por ende se han convertido en una herramienta
esencial para el apoyo en el diagnóstico.
2.2 HISTORIA Y DESARROLLO DE LA TÉCNICA DE
REVERSA EN LÍNEA (RLB)
HIBRIDACIÓN
La RLB fue desarrollada en un principio para la identificación de serotipos de
Streptococcus, por Kaufhold et al (1994); luego fue utilizada para la
diferenciación de cepas de Mycobacterium tuberculosis por Kamerbeek et al
(1997); la primera aplicación para la detección y diferenciación de patógenos
encontrados en garrapatas, fue para Borrelia por Rijpkema et al (1995) y
posteriormente fue combinada para detectar Erlichia, (Gubbels et al, 1999;
Isogen Life Science, 2004.
Gubbels et al (1999), desarrollaron la técnica para la detección y
diferenciación de diferentes especies de Babesia y Theileria en sangre
bovina. Esta técnica se desarrollo con el fin de poder detectar y diferenciar
20
simultáneamente varios parásitos que pudieran encontrarse en la sangre de
ganado infectado.
Se ha utilizado para la caracterización de Babesia divergens en casos
humanos, incluso nuevas especies de Babesia y Theileria se han
descubierto, a través de su aplicación, (Isogen Life Science, 2004; Nijhof et
al, 2003).
La técnica de RLB ha sido utilizada para la detección y caracterización de
diferentes especies de Babesia y Theileria en caballos (Nagore et al, 2004;
Bhoora et al, 2009), ovejas (Nagore et al, 2004; Qingli Niu et al, 2009),
bovinos (Brigido et al, 2004), felinos salvajes (Boosman et al, 2007), jirafas y
antílopes (Oosthuizen et al, 2009); e incluso se ha desarrollado para la
detección e identificación de piroplasmas en garrapatas (sparagano et al,
2000).
Estas aplicaciones han convertido a la RLB en una herramienta molecular
para el diagnóstico, ampliamente utilizada en estudios epidemiológicos en
todo el mundo.
2.3 FUNDAMENTO DE LA RLB
Esta técnica está basada en el trabajo conjunto de la hibridación y la PCR;
puesto que la esencia de la técnica es la hibridación de los productos de la
PCR, con sondas inmovilizadas en una membrana, con un respectivo orden
de identificación, lo que permite analizar múltiples muestras y realizar una
detección simultánea de múltiples agentes patógenos, (Gubbels et al, 1999).
Después de la hibridación de sondas y productos de PCR, se realiza la
visualización de la reacción; esta se basa en quimioluminiscencia; para la
cual se requiere que el producto del PCR se encuentre biotinizado; la biotina
marcara el lugar donde el producto del PCR se haya hibridado a la sonda,
posteriormente se detectará mediante la adición de un conjugado de
peroxidasa-streptavidina que reaccionará con la biotina, generando una luz
azul, que puede ser captada por una película de rayos-x, (Isogen Life
Science, 2004).
Un aspecto importante de esta técnica es la región amplificada que se
detectará pues esta debe reunir las condiciones de ser altamente conservada
y poseer segmentos altamente variables, lo cual le permitirá tener una buena
sensibilidad. Por ejemplo, para la detección de Babesia y Theileria se utiliza
la región hipervariable V4 del gen RNA ribosomal de la subunidad 18s, para
ser amplificada, debido a que este gen contiene regiones altamente
21
conservadas y regiones variables; las regiones conservadas proveen una
ventaja practica para el diseño de cebadores, y las regiones variables para el
diseño de sondas altamente especificas. (Allsop, et al, 2006), de esta forma
se han diseñado oligonucleótidos (sondas) de regiones especificas del gen,
para detectar y diferenciar variedad de especies, (Gubbels et al, 1999).
2.3.1 Procedimiento de la técnica.
Se realiza la extracción de ADN del paciente, el cual es sometido a PCR bajo
los cebadores establecidos; posteriormente las sondas especie-especificas
diseñadas o tomadas del GenBank, se colocan en forma lineal usando un
minibloter y son unidas covalentemente a la membrana. Los productos de la
PCR biotinizado, son aplicados a la membrana también usando el minibloter,
en dirección perpendicular a las sondas; luego tomara lugar la hibridación
(sonda-producto PCR), que podrá ser visualizada mediante la reacción de
quimioluminiscencia que es registrada en una película de Rayos X. (Isogen
Life Science, 2004; Manual Reverse Line Blot Hibridisation, 2004; Gubbels et
al, 1999)
Figura 2. Representación esquemática de la RLB
Fuente: Isogen Life Science, 2004
2.4 VENTAJAS DEL USO DE LA RLB
Dentro de las ventajas de uso de esta técnica esta el poder realizar la
detección y diferenciación simultanea de diferentes especies de parásitos,
haciendo posible una reducción en el costo del diagnóstico, porque múltiples
patógenos pueden ser detectados en una misma prueba, (Gubbels, et al,
1999; Sparagano et al, 2000, Georges et al, 2001).
22
La técnica de RLB puede ser usada para detectar la presencia del patógeno
tanto en el hospedador como en el vector (Sparagano et al, 1999) y puede
ser considerada como una herramienta para el diagnóstico de infecciones
por piroplasmas no solo en animales que muestren signos clínicos sino
también en aquellos aparentemente sanos con potencial de una infección
subclinica; esto es poco probable con el uso de técnicas como extendidos de
sangre y las pruebas serológicas. De esta forma, con la RLB es posible
detectar animales transmisores más eficientemente y proveer información útil
para estudiar la epidemiologia y diversidad de piroplasmas en distintas
regiones, (Nagore et al, 2004).
La RLB posee ciertas ventajas sobre otras técnicas de diagnóstico utilizadas;
es una técnica rápida; solo se requiere el tiempo necesario para realizar la
extracción de ADN (máximo 2 horas), la PCR (15-20 minutos máximo) y
posteriormente realizar la hibridación de las sondas con el producto de la
PCR (máximo 3 horas); es práctica, puesto que en un solo test se analizan
múltiples muestras y no se convierte en una técnica dispendiosa en la cual
se deba realizar el procedimiento para cada muestra, como por ejemplo para
los extendidos de sangre; para realizarla se requiere disponer de un
laboratorio que contenga mínimo equipos como; un termociclador,
centrifugas, incubadora, pipetas y un miniblotter. El personal encargado de
realizarla solo requiere seguir cada paso al pie de la letra como se indica en
el manual de operación o protocolo estandarizado; teniendo muy en cuenta
los puntos claves, para evitar los resultados erróneos.
Por todo esto, el método de RLB se ha convertido en una efectiva y práctica
herramienta en cuanto a su uso, con la cual es posible detectar
hemoparásitos aun cuando el hospedador posea niveles de parasitemia
extremadamente bajos y simultáneamente identificar especies de Theileria y
Babesia usando sondas de oligonucleótidos específicas, (Altay et al, 2008).
23
3. METODOLOGÍA
3.1 TIPO DE ESTUDIO
Revisión de literatura; realizada a través de una estrategia organizada y
coherente de búsqueda, selección y análisis de la información que facilito la
redacción de una síntesis critica a partir de los estudios encontrados.
3.2 POBLACION OBJETIVO DE LA REVISION
La población objeto de la revisión son los artículos que hayan desarrollado la
técnica de Hibridación Reversa en Línea para el diagnóstico de
hemoparasitos en medicina veterinaria; de los últimos 10 años (1999-2009).
3.3 CRITERIOS DE BUSQUEDA
Para la búsqueda de las publicaciones se tendrán en cuenta los siguientes
criterios de inclusión y exclusión.
Criterios de inclusión:






Publicados en los últimos 10 años
Estudios veterinarios
Babesia y Theileria
Reportes de caso
Estudios epidemiológicos
Ingles y español
Dentro de la búsqueda se priorizaron estudios que establecían datos de
sensibilidad y especificidad de la técnica.
Criterios de Exclusión:
Se excluyeron artículos no relacionados con el tema en estudio; además de
aquellos que no se encontraron disponibles en la base de datos. No se
incluyeron literatura no indexada, ni editoriales.
3.4 FUENTES
A continuación se enumeran las bases de datos de literatura científica en
salud indexada nacional e internacional que se utilizaron en la búsqueda de
referencias.
24
Bases de datos internacionales:
Medline: Base de datos de literatura biomédica internacional de la Biblioteca
Nacional Médica de los Estados Unidos
Science Direct: acceso al texto completo, sumarios y resúmenes de 1707
revistas de las editoriales Elsevier, Pergamon, Excerpta40 Medica y North
Holland. Además ofrece los sumarios y resúmenes de un total de 2900
revistas de un producto adicional de Elsevier denominado ScienceDirect
Research Database. Estas revistas han sido seleccionadas de otras bases
de datos producidas por Elsevier como Beilstein (química orgánica),
Compendex (ingeniería), Embase (biomedicina) y Geobase (ciencias de la
Tierra y medio ambiente).
Springer Link: Colección de 1345 revistas digitales con cobertura en
arquitectura, economía, medicina, física y química, matemáticas, ingeniería,
informática, medio ambiente, humanidades, astronomía, biomedicina, ciencia
de vida, medicina clínica y humanidades.
3.5 DESCRIPTORES DE BUSQUEDA
Se utilizaron descriptores como: Babesia, Theileria, Molecular Detection,
PCR, Reverse Line Blot; también en el buscador Google académico,
utilizando como palabras claves: haemoparasites, RLB. Los registros
encontrados oscilaron entre 30 y 60, tras la combinación de las diferentes
palabras claves.
Tabla 1. Descriptores de búsqueda
código
Termino de búsqueda
1
2
3
4
5
6
7
Babesia
Theileria
Haemoparasites
Molecular detection
Reverse Line Blot
PCR
RLB
Combinación de
Ítem
términos
1-2, 1-2-3
Agente etiológico
2-1, 2-1-3
3, 3-2-1, 3-1-2
4-3, 4-1-2, 4
Técnica
de
5-4-3,5-1-2, 5
diagnóstico
6-4-3,6-1-2,6-5-3
7-4,7-4-3, 7-1-3
25
3.6 SELECCIÓN DE LA INFORMACIÓN
Se seleccionaron los estudios que cumplían con los criterios de inclusión y
que fueron realizados en regiones endémicas, entendidas como tales las
regiones tropicales o subtropicales en donde se ha reportado la enfermedad
con frecuencias altas (prevalencia e incidencia), también se enfatizo en los
estudios que utilizaron sangre de bovinos como muestra analizada.
3.7 ORGANIZACIÓN DE LA INFORMACIÓN
La información obtenida fue organizada siguiendo una guía, que se
desarrolló en forma de mapa conceptual (figura 3), elaborado con un orden
lógico; donde se fue introduciendo la información secuencialmente.
La información relevante encontrada se fue colocando en cada ítem del
mapa conceptual, de esta forma se combino la información de diferentes
fuentes, para facilitar posteriormente la redacción de la revisión.
Figura 3. Estructura del mapa conceptual
Revisión sobre el
uso de RLB para el
diagnóstico de
hemoparasitos
Recomendaciones
Marco teórico
(Babesia y Theileria)
(Historia y desarrollo de la RLB)
(Fundamento de la RLB)
(Ventajas del uso de la RLB)
Resultados, discusión y
conclusión
(sensibilidad y especificidad)
Fuentes
bibliográficas
Fuentes
bibliográficas
Para complementar el mapa, se elaboraron dos tablas de análisis (tabla 1 y
2), donde se incluyo la información esencial procedente de cada estudio,
para cumplir con el objetivo de comparación. Estas tablas ayudaron a
26
identificar los hallazgos comunes entre los diferentes estudios y a comparar y
contrastar los resultados.
Tabla 2. Estructura de la Tabla para síntesis de estudios de la primera
selección
N°
Autor y
año
Pal. claves
Región
Esp.
animal
Tipo de
muestra
Uso
Tabla 3. Estructura de la tabla para síntesis de los estudios finalmente
seleccionados
Autor y año
Titulo
Tipo de
muestra
Resultados
Sensibilidad
Especificidad
3.8 REDACCIÓN DE LA REVISIÓN
Finalmente luego de haber hecho una síntesis de la información recolectada,
se procedió a hacer la redacción con los datos más relevantes para cumplir
con los objetivos propuestos; esta se realizó siguiendo el orden establecido
en el mapa conceptual (Figura 3).
27
4 RESULTADOS
4.1. DESCRIPCIÓN DE LOS ARTICULOS ANALIZADOS.
La RLB ha sido aplicada en diferentes tipos de estudios para el diagnóstico
de hemoparásitos en medicina veterinaria, principalmente para determinar
prevalencia de esta enfermedad y la utilidad de la técnica.
Veinte artículos fueron seleccionados inicialmente, según los criterios
establecidos en la metodología; de estos, 11(55%) fueron realizados en
bovinos, 4(20%) en animales silvestres, 3(15%) en ovejas y cabras y 2(10%)
en equinos (Figura 4).
Figura 4. Porcentaje de los estudios seleccionados que fueron
realizados en las diferentes especies animales
% De estudios realizados en diferentes
especies
60%
% de estudios realizados en
diferentes especies
50%
40%
30%
20%
10%
0%
bovinos
an silvestres
ovejas y
cabras
equinos
Estos datos indican que la especie más utilizada para el estudio de los
hemoparásitos, utilizando esta técnica, ha sido la bovina y en proporciones
más bajas las restantes especies; situación probablemente asociada al
impacto económico de la infección en esta especie y la necesidad de
disponer de herramientas de diagnóstico agiles y precisas.
28
Todos los autores utilizaron sangre como muestra analizada, aunque
algunos recurrieron también a tejidos como bazo y encéfalo; estos, fueron
principalmente los estudios que se desarrollaron en animales clínicamente
enfermos y a los que se les hizo necropsia, como fueron los trabajos
realizados en especies silvestres (Oosthuizen et al, 2009; Nihjof et al, 2003);
otros recolectaron y utilizaron garrapatas, para complementar los estudios
epidemiológicos, (Georges et al 2001; Sparagano et al, 2000; Bekker et al,
2002 y M´ghirbi et al, 2008).
Los estudios se realizaron principalmente en regiones endémicas de África
(Uganda, Swazilandia, Namibia, Tunisia, Sudan, Sudáfrica, y Mozambique),
algunas regiones de España (Toledo, Cádiz, Basque Country y Norte de
España), Italia (Sicilia), China y Turquía (Kayseri, Tokat, Amasya,
Gumushane, Giresun, Trabzon). (figura 5 y tabla 4), tan solo se reportó uno
realizado en América (Argentina); esto se debe a que los estudios se
desarrollaron principalmente en regiones con reporte de brotes de
enfermedades transmitidas por garrapatas, que han generado importantes
pérdidas económicas, como es el caso de la Fiebre de la Costa Este en
África.
Figura 5. Porcentaje de los estudios seleccionados según el continente
29
Tabla 4. Región de estudio de los 20 artículos analizados.
La mayoría de estos estudios fueron desarrollados por instituciones como: la
Universidad de Utrecht en los Países Bajos, la Universidad de Pretoria en
Sudáfrica, el Instituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agrario (NEIKER),
y el Instituto Zooprofiláctico Experimental de Sicilia; dirigidos bajo las
facultades de medicina veterinaria y los departamentos de parasitología y
enfermedades tropicales. (Tabla 5)
30
Tabla 5. Institutos que desarrollaron los estudios seleccionados
AUTOR
Gubbels et al, 1999
ESTUDIO REALIZADO POR:
Universidad Utrecht (Utrecht- Países bajos), (Facultad de medicina
veterinaria, departamento de parasitología y medicina veterinaria tropical)
Instituto Nacional de Salud Pública y Medio Ambiente
(Netherlands) (laboratorio de investigación para las enfermedades
infecciosas),
Universidad de Granada (Granada-España) (facultad de
farmacología, departamento de parasitología)
Sparagano et al, 2000
Universidad Heriot-Watt (Edimburgo)(departamento de ciencias
biológicas),
Georges et al, 2001
Universidad Utrecht (Utrecht- Países bajos), (facultad de medicina
veterinaria, división de parasitología y medicina veterinaria tropical),
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sicilia. (Sicilia)
Universidad Utrecht (Utrecht- Países bajos) (facultad de medicina
veterinaria, división de parasitología y medicina veterinaria tropical),
Nagore et al, 2004
Oura et al, 2004
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sicilia,
Universidad Heriot-Watt (Edimburgo) (departamento de ciencias
biológicas),
Universidad
de
Newcastle
(New
CastleInglaterra)(departamento de agricultura)
Instituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agrario
(NEIKER)(Berreaga-España)(departamento de salud animal)
Universidad Makerere (Uganda-Africa))(facultad de medicina
veterinaria, departamento de microbiología y parasitología ),
Escuela Veterinaria Glasgow (Glasgow-Escocia)((departamento de
parasitología veterinaria),
Brigido et al, 2004
International Livestock Research Institute Kenya.(Kenia)
Universidad Nova de Lisboa (Lisboa-Portugal)(instituto de higiene y
medicina tropical, unidad de virología,
enfermedades tropicales),
centro de malaria y otras
Polo Universitario Alto da Ajuda (Lisboa-Portugal)( facultad de
medicina veterinaria)
Altay et al, 2008
Universidad de Firat (Elazig-Turkia) (facultad de medicina veterinaria,
departamento de parasitología)
Bhoora et al, 2009
Universidad de Pretoria (Sudafrica)(facultad de ciencia veterinaria,
centro de investigación equina, departamento de veterinaria enfermedades
tropicales),
Universidad Utrecht (Utrecht- Países bajos) (facultad de medicina
veterinaria ,departamento de enfermedades infecciosas e inmunología,
centro Utrecht para las enfermedades transmitidas por garrapatas),
Oostuhizen et al, 2008
Agricultural Research Council - Onderstepoort Veterinary
Instituto
Universidad de Pretoria (Sudafrica) (facultad de ciencia veterinaria,
departamento veterinario de enfermedades tropicales),
Oosthuizen et al, 2009
Agricultural Research Council - Onderstepoort Veterinary
Institute
Universidad de Pretoria (Sudafrica) (facultad de ciencia veterinaria,
departamento veterinario de enfermedades tropicales)
Nagore et al, 2004
Instituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agrario (España)
Nijhof et al, 2003
(departamento de salud animal).
Universidad Utrecht (Utrecht- Países bajos),
Universidad de Pretoria (Sudafrica),
Ministerio Del Agua Y Desarrollo De La Ganadería (ArushaTanzania)(centro de investigación veterinaria),
Sociedad Zoológica de Frankfurt (Tanzania)
31
Pethrigh et al, 2008
Bekker et al, 2002
INTA, Buenos Aires
Universidad Utrecht (Utrecht-Paises bajos)(división de bacteriología
y de parasitología y medicna veterinaria tropical ),
Universidad de Pretoria (Sudafrica) (departamento veterinario de
enfermedades tropicales)
Quingli Niu et al, 2009
Boosman et al, 2007
Lanzhou Veterinary Research Institute, laboratorio de veterinaria
parasitología, China.
Universidad de Pretoria (Sudafrica)(departamento de veterinaria
enfermedades tropicales)
Salih et al, 2007
Research Center Borstel (Borstel-Alemania)( división de veterinaria
infección biología e inmunología),
Al Amarat (Sudan)(central de laboratorios de investigación veterinaria)
San Martin et al, 2006
Instituto Vasco de investigación y desarrollo agrario NEIKER
(departamento de salud animal).(España)
M’Ghirbi et al, 2008
Ica et al, 2006
Instituto Pasteur de Tunisia, NEIKER
Universidad Erciyes (Turkia) (facultad de medicina veterinaria,
departamento de parasitología).
4.2 USO DE LA RLB PARA EL DIAGNÓSTICO DE HEMOPARÁSITOS
(BABESIA Y THEILERIA) EN SANGRE DE BOVINOS
Esta revisión enfatizó en los trabajos que analizaron sangre de bovinos en
búsqueda de Babesia y Theileria, y
que establecían sensibilidad y
especificidad de la técnica, como se mencionó en la metodología; de los 20
artículos, 11 fueron finalmente seleccionados y posteriormente analizados.
(Tabla 6 y 7)
Tabla 6. Análisis comparado de los 20 estudios sobre el uso de la RLB
en las diferentes especies animales
N
1
Autor y año
Gubbels et
Pal. claves
Esp.
Tipo de
Animal
muestra
Bovinos
Muestras
de sangre
De
Animales
experiment
almente
infectados
Muestras
de sangre y
garrapatas
al 1999
2
Sparagano
Bovinos
et al, 2000
32
Uso
Uso de RLB para
detección de diferentes
especies de Babesia y
Theileria en ganado
Uso de RLB para
diagnóstico de especies
de theileria y babesia de
Ganado en Italia
N
Autor y año
3
Georges et
al, 2001
4
Nagore et al,
2004
Pal. claves
Esp.
Tipo de
Animal
muestra
Cattle;
Epidemiology;
Ticks; Reverse
line blot; Sicily;
Tick-borne
diseases; PCR
Bovinos
Muestras
de sangre y
garrapatas
Se utilizo la técnica de
RLB para determinar la
prevalencia de
hemoparásitos en Sicilia
Theileria equi;
Babesia caballi;
Equine
piroplasmosis;
PCR; RLB; Tickborne diseases
Equinos
muestras
de sangre
de caballos
de carreras
examinación
hematológica y
microscópica
5
Oura et al,
2004
Theileria parva;
Carrier;
Diagnosis;
Reverse line blot
Bovinos
Muestras
de sangre
de ganado,
nativo,
cruzado y
exotico
6
Brigido et al,
2004
Bovine
Mirandesa
breed; RLB;
Phylogenetic
analysis
Bovinos
7
Altay et al,
2008
Theileria,
Babesia,PCR
Reverse line
blot; Cattle
Turkey
Bovinos
muestras
de sangre
de ganado
adulto de
raza
mirandesa
Muestreo
de sangre
Ganado
aparentem
ente sano
8
Bhoora et al,
2009
Theileria equi
Babesia caballi
Reverse line blot
hybridization
18S rRNA gene
Equinos
Muestra de
sangre
9
Oosthuizen
et al, 2008
Antilopes
Muestras
de sangre
10
Oosthuizen
et al, 2009
Jirafa,
antílope
Muestras
de sangre,
bazo
Theileria
Babesia
Giraffe,
Roan, antelope
Reverse Line
Blot
hybridization
assay,
18S rRNA gene,
Phylogenetic
analysis
33
Uso
uso de RLB para la
detección e identificación
de especies de Theileria
y Babesia
Aplicación de la técnica
de RLB para la
detección de
hemoparásitos.
Comparación de la
sensibilidad de RLB y
PCR de secuencias de
minisatelites.
*análisis microscópico
*PCR según Gubbels
* amplificaicon de un
fragmento de la región
V4, según Gubbels
Detección de babesia y
theileria basada en la
amplificación por PCR y
RLB.
Los resultados de la RLB
fueron comparados con
los extendidos de sangre
Explorar los niveles de
hetereogeneidad
genética entre las
especies de T y B en sur
Africa
Uso del kit TDB-RLB,
para la identificación de
una nueva especie de
Babesia
Uso del RLB para
identificar los parasitos
con secuencias del gen
18s, análisis y relación
filogenética con otros
piroplasmas
identificados en otros
rumiantes salvajes
N
Autor y año
11
Nagore et
al,2004
12
Nijhof et al,
2003
13
Petrigh et al,
2008
14
Bekker et al,
2002
Pal. claves
Theileria;
Babesia; Ovine
piroplasmosis;
PCR; Reverse
line blot; Tickborne diseases
Babesia
bigemina
Polymerase
chain reaction
reverse line blot
hybridization
Erlichia sp.
Anaplasma sp,
Amblyomma
varegatum,
simultaneum
detection,
heartwater
Esp.
Tipo de
Animal
muestra
ovejas
Muestras
de sangre
Uso de RLB, para
conocer la diversidad y
heterogenidad genetica
de T y B en ovejas
Rinoceront
es negros
Muestras
de sangre y
tejidos de
bazo y
encéfalo
Muestras
de sangre
Uso de PCR y RLB para
la identificación del
agente causal de los
casos fatales.
Cabras y
ovejas
Muestras
de sangre
y
garrapatas
Se utilizo la RLB para
detectar y diferenciar
especies de Anaplasma
y Erlichia conocidas que
ocurren en rumiantes en
los subtropicos
ovejas
Muestras
de sangre
Felinos
salvajes
Y gatos
Muestras
de sangre
Uso de RLB para
detectar y diferenciar
especies de theileria y
babesia de importancia
en pequeños rumiantes
en china
PCR,RLB,ELISA
Se utiliza la RLB para
identificar la prevalencia
de B felis y B leo en
varias especies de
felinos.
PCR,RLB
Se realizó un estudio
epidemiológico, en
ganado durante 3 meses
2005, se realizo
extendido de sangre,
PCR, RLB.
Se realizo la tecnica de
RLB microarrays para
determinar la presencia
y la identidad de los
prioplasmas en muestras
de sangre con sospecha
de piroplasmosis.
Examinación
microscópica, RLB
Se realizo para detectar
e identificar infección por
piroplasmas en ganado
en 3 regiones, basado
en microscopia, PCR,
RLB
Bovinos
15
Qingli Niu et
al, 2009
16
Boosman et
al, 2007
17
Salih et al,
2007
bovinos
Muestras
de sangre
18
Sanmartin et
al, 2006
Bovinos
Muestras
de sangre
19
M’ghirbi et
al, 2008
bovinos
Muestras
de sangre,
garrapatas
Babesia felis;
Babesia leo;
Reverse line blot
34
Uso
Uso del kit RLBH (TBDRLB) para la deteccion
de Babesia bigemina en
muestras de sangre
20
Ica et al,
2006
Theileria,
Babesia, cattle
RLB, blood
smears
bovinos
Muestras
de sangre
Se realizo este estudio
para detectar la
prevalencia de especies
de Babesia y Theileria
por examinación
microscópica, y RLB
Tabla 7. Análisis comparado de los 11 estudios sobre el uso de la RLB
en sangre de bovinos
Autor y año
Titulo
Tipo de muestra
Resultados
Sensibilidad
Gubbels et al
1999
Sparagano
et
al, 2000
Georges et al,
2001
Oura et al,
2004
Brigido et al,
2004
Simultaneous
Detection of
Bovine
Theileria and
Babesia
Species by
Reverse Line
Blot
Hybridization
Muestreo de sangre de
ganado:
especificidad
10-6 %
100%
3p/µl
No reacciones
cruzadas
Animales
experimentalmente
infectados con cepas
de diferentes países.
Ganado de España:
28 Toledo
17 Cádiz
(0.000001%)
Muestreo de sangre y
garrapatas de vacas,
en la isla sicilia
6 granjas en abril y 4
en noviembre
Mas sensible que
PCR
Se obtuvieron 187
muestras de sangre en
granjas donde se
reportaron brotes.
15 en abril-nov/98
12 en junio-ag-nov/99
Tambien recolectaron
garrapatas
La RLB es mucho
más sensible que
los extendidos de
sangre, el # de
muestras + fueron
hasta 2 veces
más altas que las
detectadas con
los métodos
tradicionales
No se reportan
reacciones
cruzadas
Application of a
reverse line blot
assay to the
study
of
haemoparasite
s in cattle in
Uganda
Muestras de sangre
Uganda:
1. 44 nativo
2. 48 cruce
3. 11 exotico
(infe. aguda)
4. 28 cruce(infe.
aguda)
4.4 ×10-5 a
1.4 ×10-5%
No se midio
para RLB.
1–2 parasites/µl
(T parva)
No se
reportaron
reacciones
cruzadas
Molecular and
phylogenetic
characterization
of
Theileria spp.
parasites in
116 muestras de
sangre de ganado
adulto de raza
mirandesa
Tanto en el PCR
como en la RLB
solo 3/116
animales
resultaron
positivos
Integrated
Molecular
Diagnosis of
Theileria
and
Babesia
Species of
Cattle in Italy
Detection of
haemoparasite
s in cattle by
reverse
line blot
hybridisation
with a note on
the
distribution of
ticks in Sicily
35
100%
No reacciones
cruzadas
autochthonous
bovines
(Mirandesa
breed) in
Portugal
Autor y año
Titulo
Tipo de muestra
Resultados
Sensibilidad
Especificidad
Salih et al,
2006
Epidemiological
studies on tickborne diseases
of cattle
in Central
Equatoria
State, Southern
Sudan
Muestreo de sangre
600 muestras de
ganado nativo
aparentemente sano de
diferentes edades
La RLB es una
técnica altamente
sensible, el ADN
parasitario fue
detectado aun sin
confirmación por
PCR o
microscopia
Altamente
especifico
San martin et
al, 2006
Molecular
diagnosis of
Theileria and
Babesia
species
infecting cattle
in Northern
Spain using
reverse line blot
macroarrays
Parasitological
and Molecular
Prevalence of
Bovine
Theileria and
Babesia
Species in the
Vicinity of
Kayseri
A molecular
survey of
Theileria and
Babesia
parasites
in cattle, with a
note on the
distribution of
ticks in Tunisia
Molecular
detection of
Theileria and
Babesia
infections in
cattle
Muestreo de sangre
263 muestras tomadas
de 79 granjas
La técnica de RLB
demostró la
infección en 54%
de las muestras,
de las cuales solo
28.8% fueron
postivas por
microscopia
Altamente
especifico
Muestreo de sangre,
337 muestras de
sangre
La técnica de RLB
fue más sensible
para la deteccion
de Babesia y
Theileria que la
microscopia (66
vs 61)
Muestreo de sangre
278 muestras y 7
garrapatas
Altamente
sensible, 3
parasitos por
microlitro como
reporta Gubbels.
Altamente
especifico
Muestreo de sangre de
Ganado aparentemente
sano
East Black Sea
Region of turkey
389 muestras en 6
provincias
Altamente
sensible
100% especifico
No reacciones
cruzadas
Improved
molecular tools
for detection of
Babesia
bigemina
Se obtuvo AND de
cultivos de eritrocitos
infectados con Babesia
sp, y de animales
experimentalmente
infectados con
Anaplasma sp.
Altamente
sensible
No reacciones
curzadas
Ica et al, 2007
M´Ghirbi et al,
2008
Altay et al,
2008
Petrigh et al,
2008
36
Algunas de las características que fueron analizadas en los trabajos fueron:
el tipo de cebadores empleados para amplificar el ADN de los protozoos
buscados; y asimismo, el diseño de las sondas de detección utilizadas y los
datos de sensibilidad y especificidad encontrados.
4.3 CEBADORES UTILIZADOS Y DISEÑO DE SONDAS
En cuanto al tipo de cebadores utilizados, se evidenció que la gran mayoría
de los estudios empleó los cebadores propuestos por Gubbels et al (1999);
trabajo que se considera como uno de los pioneros en el desarrollo de la
técnica para la identificación simultanea de diferentes especies de Theileria
y Babesia en sangre de bovinos, y en el cual se manejo un set de cebadores
para la amplificación de la región hipervariable V4 del gen RNA ribosomal de
la subunidad 18s para todas las especies de Babesia y Theileria; estos
amplificaban 460-520 pares de bases de un fragmento de la secuencia de la
región V4; y en base a esta, posteriormente se diseñaron oligonucleótidos
especie-específicos como sondas. No obstante, en el 2001 Georges realizó
unos cambios en estos cebadores y los adaptó para amplificar una
secuencia más corta (390-430pb del gen). (Tabla 8 y 9.)
Tabla 8. Cebadores utilizados para la amplificación del gen V4 rRNA 18s
Cebadores utilizados para la amplificación del gen V4 rRNA 18s
RLB-F (5’-GAGGTAGTGACAAGAAATAACAATA-3’)
Gubbels,1999
RLB-R (biotin-5’-TCTTCGATCCCCTAACTTTC-3’)
RLB-F2 (5’-GACACAGGGAGGTAGTGACAAG-3’)
RLB-R2 (biotin-5’-CTAAGAATTTCACCTCTGACAGT-3’)
Adaptación de
Georges, 2001
En solo un trabajo se desarrolló la amplificación de una secuencia diferente
a la región V4 del gen 18s; conocida como Rap-1ª (Petrigh et al, 2008),
utilizando como cebadores: Bbi400F: 5´-AGCTTGCTTTCACAACTCGCC-3’ y
Bbi-400R: 5’-TTGGTGCTTTGACCGACGACAT-3’ para Babesia bigemina y
también
incluyeron
una
nueva
sonda:
Bbi
CA:
5’TCTTTTCGCTGGCTTTTTTTTTA-3’, también para B. bigemina. El trabajo lo
desarrollaron utilizando un kit comercial conocido como RLBH kit (TBD-RLB
Kit; ISOGEN, Maarssen, the Netherlands), en el cual las sondas ya se
encuentran unidas a la membrana sin embargo todo el procedimiento se
realizo acorde con lo propuesto por Gubbels et al (1999).
37
Tabla 9. Cebadores utilizados en los estudios para amplificar la región
V4
Estudio Analizado
Gubbels et al, 1999
Sparagano et
al,2000
Georges et al, 2001
RLB-F
X
Primer Utilizado
RLB-R
RLB-F2
X
X
RLB-R2
X
X
X
Oura et al, 2004
X
X
Brigido et al, 2004
X
X
Salih et al, 2006
Sanmartin et al,
2006
Ica et al, 2007
X
X
X
X
Altay et al, 2008
X
X
M´ghirbi et al, 2008
X
X
X
X
La amplificación de la secuencia V4 del gen 18s, fue efectiva en todos los
estudios y resulto 100% específica para Theileria y Babesia, como lo
establecieron Allsop et al (2006).
En el estudio de Petrigh et al (2008), también se obtuvo gran especificidad,
debido a que realizaron la amplificación de un producto especifico de
aislados de B. bigemina, utilizando las regiones conservadas del 5 gen
parálogo Rap-1a.
Los estudios que tomaron como base a la región V4, diseñaron sondas
genero-especificas y subsecuentemente especie-especificas, para realizar la
hibridación. (Tabla 10)
38
Tabla 9. Sondas utilizadas para la técnica de RLB en los estudios
Sonda. (T. annulata. Ref. Georges, 2001)
Sonda. (T. annulata. ref. Gubbels, 1999)
4.4 ESPECIFICIDAD DE LA TÉCNICA RLB
En 10 artículos analizados se utilizó la sonda que detecta genero Babesia y
Theileria (catchall), diseñada por Gubbels et al (1999); esta demostró ser
altamente especifica, y no se reportaron reacciones cruzadas en ninguno de
los estudios con otro tipo de parásitos como Anaplasma Marginale, A.
39
Centrale, Tripanosoma vivax, Erlichia canis, entre otros, (Sparagano et al,
2001).
Se implementaron las sondas especie-especificas reportadas en la tabla 8,
los autores solo difirieron en las sondas para Theileria sp y T annulata; Oura
et al (2004) y Salih et al (2007), usaron la sonda Theileria. sp (bufalo) (CAG
ACG GAG TTT ACT TTG T), mientras que Sanmartin et al (2006) y M´ghirbi
et al (2008) utilizaron (Theileria. sp.(GTTGAATTTCTGCT(A/G)CAT(C/T)GC);
Gubbels et al (1999) y Sparagano et al (2000) utilizaron la sonda diseñada
por Gubbels (T annulata (ATTGCTTGTGTCCCTCTG)), mientras que el resto
de los autores se basaron en la sonda establecida por Georges et al (2001)
(T. annulata (CCTCTGGGGTCTGTGCA)).
En ninguno de los casos se generó alguna reacción cruzada, cada sonda
hibrido con su respectiva secuencia de ADN parasitario encontrado en la
muestra.
Petrigh et al (2008); desarrollaron el estudio solo para determinar Babesia
bigemina, por lo que no utilizaron otro tipo de sondas; y las muestras
obtenidas fueron tomadas de aislados con el hemoparásito y de animales
infectados experimentalmente; aun así no se reporto reacción cruzada con
otro agente.
4.5 SENSIBILIDAD DE LA TÉCNICA RLB
Cuando se desarrolló la técnica en un comienzo para el diagnóstico de
Babesia y Theileria; por Gubbels et al (1999), se evaluó la sensibilidad; con
una muestra de sangre de un animal con un nivel de parasitemia (T.
Annulata) conocido, serialmente diluido con sangre de un animal no
infectado y se determino que era del 1×10 -6% (0.000001%), correspondiendo
a 3 parásitos por microlitro de sangre; Pero en el estudio realizado por Oura
et al, (2004), la sensibilidad encontrada para T. parva, fue ligeramente más
alta, se determino de 4.4×10-5% a 1.4×10-5%, lo que equivale a 1-2 parásitos
por microlitro de sangre.
Para la determinación con especies de Babesia, se observó que la técnica de
RLB es menos sensible, cuando los picos de parasitemia puedan estar por
encima de 10-6; según los investigadores, la parasitemia de Babesia fluctúa
y algunas veces se escapa a la detección por esta técnica, (Gubbels et al,
1999; Altay et al, 2008).
Sin embargo, la RLB demostró ser mucho más sensible que los métodos
tradicionales utilizados para el diagnóstico (Sanmartin et al, 2006; Ica et al,
40
2007; Georges et al, 2001; M’ghirbi et al, 2008); por ejemplo, Georges et al,
2001, encontró que de 69 extendidos de sangre que tomaron en junio, el
46% fue positivo por microscopia y con la técnica de RLB el 89%; en el
estudio de Quingli Niu et al (2009), también se encontró que la técnica RLB
fue más sensible que la PCR y ELISA.
Igualmente, se demostró que la técnica de RLB detecta ADN parasitario aun
sin confirmación o resultado negativo por PCR o microscopia; como en el
estudio de Sparagano et al, (2000), en el que dos muestras resultaron
negativas por PCR, pero arrojaron un resultado positivo mediante la RLB.
En el estudio de Petrigh et al, (2008); el kit no detectó el aislado de
B.bigemina de origen Argentino, un estudio posterior revelo el polimorfismo
encontrado en el gen 18s rRNA entre la B bigemina argentina con la sonda
especifica de la membrana, por lo que diseñaron una nueva sonda (Bbi CA),
esta fue eficiente para detectar todos los aislados de B bigemina y no se
detectaron reacciones cruzadas.
41
5. DISCUSIÓN
De todos los artículos que fueron encontrados para desarrollar la revisión, la
mayoría realizaron el estudio para detectar Babesia y Theileria en sangre de
bovinos; esto puede asociarse principalmente, al impacto que ha generado el
problema de las hemoparasitosis en las producciones bovinas en todo el
mundo; los estudios se realizaron también, principalmente para evaluar
epidemiologia de la babesiosis y theileriosis en las diferentes regiones, para
lo que la técnica resulto ser muy practica y eficiente, ya que con esta es
posible evaluar muestras de poblaciones numerosas.
Los estudios que fueron seleccionados para la revisión, fueron realizados por
autores pertenecientes a grupos de investigación de grandes universidades
de renombre principalmente de Europa y África; esto puede deberse a que
estos institutos han venido desarrollando grandes avances en el área de
parasitología y enfermedades tropicales, actualmente se han maximizado los
estudios en esta área en las facultades de Medicina Veterinaria en casi todo
el mundo.
En cuanto a la técnica de Hibridación Reversa en Línea, se determino
finalmente que es altamente especifica, debido a que todos los resultados
del PCR positivos, mostraron reacciones positivas con su correspondiente
sonda general y específica, a excepción de algunas especies de Babesia que
no emitieron señal con las sondas especificas utilizadas, como en el estudio
de Altay et al (2008); esta situación indica la presencia de un nuevo genotipo
o de uno ya conocido, pero que no se incluyo en el estudio; se obtuvieron
resultados similares en los estudios realizados en especies salvajes de
Oosthuizen et al (2008) y en caballos de Sudáfrica por Bhoora et al (2009).
La técnica demostró además, ser efectiva para la detección de varios
agentes en una misma muestra; por ejemplo, Salih et al (2007), reporto que
de 600 muestras analizadas 406(67.7%) representaban infecciones mixtas y
Sparagano et al (2000), determino que la RLB es una herramienta útil para
demostrar la coinfección de especies de Babesia y Theileria en bovinos, pero
también en equinos como lo menciona Nagore et al (2004); las infecciones
mixtas fueron un resultado común en la mayoría de los estudios, (Salih et al,
2007; Ica et al, 2007; Sparagano et al, 2000).
En cuanto a la sensibilidad se concluyo que la técnica de RLB no es igual de
sensible cuando es aplicada a diferentes patógenos y sugiere que debe ser
determinada para cada hemoparásito. (Oura et al, 2004); como se realizo, en
el estudio en China de Quingli Niu et al (2009), realizado en sangre de
ovejas; en donde la sensibilidad fue diferente para cada agente asi: (10−6%
(Babesia motasi), 10−3% (Babesia sp. Kashi), 10−8% (T. luwenshuni), 10−8% (T.
uilenbergi).
42
La técnica demostró también ser más efectiva que el solo PCR o la
microscopia, debido a que se obtuvieron resultados positivos donde la PCR y
la examinación microscópica habían generado un resultado negativo; Salih
et al, (2007), sugieren que esto se debe a la presencia de parásitos viables
en niveles muy bajos en la muestra, lo que confirma la utilidad de esta
técnica para la detección de parásitos en animales aparentemente sanos o
con infección subclinica, esto se demostró también en el trabajo de Nagore et
al, (2004), en donde, se recolecto 181 muestras de sangre de caballos
clínicamente sanos con exposición a garrapatas, de estas 92 resultaron
positivas mediante RLB, pero la examinación microscópica resulto negativa
para todas las muestras.
También fue posible determinar a través del uso de la técnica en el estudio
realizado por Petrigh et al (2008), que las especies de Babesia y Theileria
pueden tener polimorfismos según la región del mundo en la cual sobreviven;
en este estudio utilizaron un kit de RLB que fue comercialmente disponible
durante un tiempo, pero la sonda incluida en este no detecto la B. bigemina
de origen Argentino. Actualmente no es disponible este kit, probablemente
esto se asocia al inconveniente generado por el polimorfismo presente entre
las especies de hemoparásitos, lo que dificulta el diseño de sondas
universales.
43
6. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
La técnica de RLB es una herramienta útil para el diagnóstico de
hemoparásitos en muestras de sangre en medicina veterinaria; con esta
técnica se hace práctico y menos costoso realizar estudios epidemiológicos
de enfermedades transmitidas por garrapatas, puesto que es posible detectar
y diferenciar múltiples agentes en una sola prueba, esto la convierte en una
técnica de gran utilidad para las regiones endémicas, por representar mayor
beneficio a nivel poblacional.
Esta tecnología aporta en cierta medida para disminuir el impacto de los
hemoparasitos, ya que con su utilización se logran diagnósticos más certeros
para poder realizar tratamientos oportunos y eficientes.
La RLB es altamente sensible en general, pero debe ser determinada para
cada hemoparásito, ya que los picos de parasitemia fluctúan y pueden
escapar a la detección por esta técnica; no obstante, resulto ser mucho más
sensible que los métodos tradicionales de diagnóstico y detecta niveles
extremadamente bajos de parasitemia (1-3 parásitos/µl sangre), lo que
posibilita la detección de animales con infecciones subclínicas; esto la hace
una herramienta de gran utilidad para evitar el transporte de animales que
puedan ser transmisores de la enfermedad a lugares no endémicos.
La amplificación de la región V4 del gen 18s RNA ribosomal, resulto ser
especifica en todos los casos, como fue descrito por Allsop et al (2006), este
descubrimiento ofrece una gran oportunidad para realizar estudios
importantes sobre la biología, taxonomía y detección de especies de Babesia
y Theileria.
La técnica es 100% específica, puesto que se implementan oligonucleótidos
diseñados de forma genero-especifica y especie-especifica, de modo que no
se han reportado reacciones cruzadas entre agentes en ninguno de los
estudios analizados.
Se demostró además que la técnica puede ser considerada como una
herramienta útil para detectar y conocer nuevas especies o variantes
genéticas de hemoparásitos. (Altay et al, 2008, Bhoora et al, 2009;
Oosthuizen et al, 2008 y 2009)
Las especies de Babesia y Theileria, como se expuso en el estudio realizado
por Petrigh et al, 2008, pueden tener polimorfismos según la región del
mundo en el cual se desarrollan, esto también fue determinado con el uso de
la técnica de RLB
44
BIBLIOGRAFIA
Alhassan A., Govind Y., Thanh Tam, Thekisoe, Yokoyama N., Inoue N. Igarashi I.;
Comparative evaluation of the sensitivity of LAMP, PCR and in vitro culture
methods for the diagnosis of equine piroplasmosis; Parasitology Reseach
(2007)100:1165–1168.
Allsop p M. and Allsop B; Molecular Sequence Evidence for the Reclassification of
Some Babesia Species; Ann. N.Y. Acad. Sci. 1081: 509–517 (2006).2006 New
York Academy of Sciences.
Asgarali Z., Coombs D. K., Mohammed F., Campbell D. M., Caesar E.; A
serological study of Babesia caballi and Theileria equi in Thoroughbreds in
Trinidad; Veterinary Parasitology 144 (2007) 167–171.
Battsetseg B., Xuan X., Ikadai H., Bautista J, Byambaa B., Boldbaatar D., Battur
B., Battsetseg G., Batsukh I, Ikuo Zay, Nagasawa H., Mikami T., Fujisaki K.;
Detection of Babesia caballi and Babesia equi in Dermacentor nuttalli adult ticks;
International Journal for Parasitology 31 (2001) 384-386.
Bekker P J, De Voz Sander, Taoufik A, Sparagano O, Jongejan F; Simultaneous
detection of Anaplasma and Erlichia species in ruminants and detection of erlichia
ruminantium in amblyoma variegatum ticks by revers line blot.; veterinary
microbiology 89(2002)223-238
Bhoora Raksha , Franssen Linda , Marinda C. Oosthuizen et al; Sequence
heterogeneity in the 18S rRNA gene within Theileria equi and Babesia caballi from
horses in South Africa; Veterinary Parasitology 159 (2009) 112–120.
Birkenheuer J., Neel J., Ruslander D., Levy M.G., Breitschwerdt E.B.; Detection
and molecular characterization of a novel large Babesia species in a dog;
Veterinary Parasitology 124 (2004) 151–160.
Bosman A. M., Venter E.H, Penzhorn B.L.; Occurrence of Babesia felis and
Babesia leo in various wild felid species and domestic cats in Southern Africa,
based on reverse line blot analysis; Veterinary Parasitology 144 (2007) 33–38.
Brıgido C, Fonseca da P I., Parreira R., Fazendeiro I, E. do Rosário V., CentenoLima S; Molecular and phylogenetic characterization of Theileria spp. parasites in
autochthonous bovines (Mirandesa breed) in Portugal; Veterinary Parasitology 123
(2004) 17–23.
45
Buitrago Daniel, Pachon Hector; Epidemiologia de la Rikettsiosis* una revisión
narrativa, aportes para la vigilancia epidemiológica; especialización en
epidemiologia, Universidad de Antioquia, 2008.
Costa Josep; Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a tiempo real; Enferm
Infecc Microbiol Clin 2004; 22(5):299-305.
Georges K., Loria G.R., Riili S., Greco A., Caracappa S., Jongejan F., Sparagano
O.; Detection of haemoparasites in cattle by reverse line blot hybridisation with a
note on the distribution of ticks in Sicily; Veterinary Parasitology 99 (2001) 273–
286.
Goris J., Salas Á, Ferrandis E; el articulo de revisión; revista iberoamericana de
enfermería comunitaria, en prensa, 2007.
Gubbels J. M.,A. P. De Vos, M. Van Der Weide, J. Viseras, l. M. Schouls, E. de
vries, and f. jongejan; simultaneous detection of bovine theileria and babesia
species by reverse line blot hybridization; journal of clinical microbiology, june
1999, p. 1782–1789.
Homer M., Delfin Irma, Telford Sam, krause Peter j. and Persing David;
Babesiosis; clinical microbiology reviews, july 2000, p. 451–469
Hunfeld K.-P, A. Hildebrandt b, J.S. Gray; Babesiosis: Recent insights into an
ancient disease; International Journal for Parasitology (2008).
Ica A., Inci A., Yildirim A. Parasitological and Molecular Prevalence of Bovine
Theileria and Babesia Species in the Vicinity of Kayseri; Turk. J. Vet. Anim. Sci.
2007; 31(1): 33-38
Isogen Life Science; Reverse line blot hybridisation in the detection of tick-borne
diseases; Based on the work of Amar Taoufik, Ard Nijhof, Radi Hamidjaja and
Frans Jongejan of the Division of Parasitology and Tropical Veterinary Medicine,
Utrecht University, The Netherlands; September 2004.
Kursat Altay, M. Fatih Aydin, Nazir Dumanli, Munir Aktas; Molecular detection of
Theileria and Babesia infections in cattles; Veterinary Parasitology 158 (2008)
295–301.
Letelier M, Manriquez J, Rada G; Revisiones sistematicasy metaanalisis: ¿son la
mejor evidencia?; Rev Méd Chile 2005; 133: 246-249
M’ghirbi Y. ,Hurtado A., Brandika J., Khlif K. ,Ketata Z., Bouattour A.; A molecular
survey of Theileria and Babesia parasites in cattle, with a note on the distribution of
ticks in Tunisia; Parasitol Reseach (2008) 103:435–442.
46
Nagore Daniel, G. Josune , Garcia P. Ana, Ramón A. Juste, Hurtado Ana;
Detection and identification of equine Theileria and Babesia species by reverse line
blotting: epidemiological survey and phylogenetic analysis; Veterinary Parasitology
123 (2004a) 41–54.
Nagore Daniel, Josune Garcıa-Sanmartın, Ana L. Garc´ıa-Pérez, Ramón A. Juste,
Ana Hurtado; Identification, genetic diversity and prevalence of Theileria and
Babesia species in a sheep population from Northern Spain; International Journal
for Parasitology 34 (2004b) 1059–1067.
Netherlands Institute of Ecology (NIOO-KNAW); manual reverse line blot
hybridization; November 2002.
Nijhof A M., Penzhorn B. L., Lynen G., Mollel J. O., Morkel P., Bekker C.P.,
Jongejan F.; Babesia bicornis sp. nov. and Theileria bicornis sp. nov.: Tick-Borne
Parasites Associated with Mortality in the Black Rhinoceros (Diceros bicornis);
Journal Of Clinical Microbiology, May 2003, p. 2249–2254
OIE; Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals; Updated;
20.12.2005; http://www.oie.int/fr/normes/mmanual/a_00084.htm.
OIE; Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004; Babesiosis bovina, capitulo
2.3.8.
Oosthuizen M. C., Allsopp B., Troskie M., Collins N. E., Penzhorn B. L. ;
Identification of novel Babesia and Theileria species in South African giraffe
(Giraffa camelopardalis, Linnaeus, 1758) and roan antelope (Hippotragus equinus,
Desmarest 1804); Veterinary Parasitology 4791(2009) xxx–xxx
Oosthuizen M. C., Zweygarth E., Collins N., Troskie M., Penzhorn B. L.;
Identification of a novel Babesia sp. from sable 1 antelope (Hippotragus niger,
Harris 1838); journal clinical of microbiology 1128(2008).
Oura C.A.L., R.P. Bishop, E.M. Wampandea, G.W. Lubegaa, A. Tait; Application of
a reverse line blot assay to the study of haemoparasites in cattle in Uganda;
International Journal for Parasitology 34 (2004) 603–613.
Petrigh R., Ruybal P., Thompson C., Neumann R., Moretta R., Wilkowsky S.,
Draghi G., Echaide I., Torioni de Echaide S. and Farber M.; Improved Molecular
Tools for Detection of Babesia bigemina; Annals NewYork Academy of Sciences.
1149: 155–157 (2008)
Prichard R., Tait A.; The role of molecular biology in veterinary parasitology;
Veterinary Parasitology 98 (2001) 169–194
Qingli Niu, Jianxun Luo, Guiquan Guan , Miling Ma , Zhijie Liu , Aihong Liu ,
Zhisheng Dang , Jinliang Gao ,Qiaoyun Ren , Youquan Li, Junlong Liu, Hong Yin;
47
Detection and differentiation of ovine Theileria and Babesia by reverse line blotting
in China; Parasitology Reseach (2009) 104:1417–1423.
Salih D. A, Hussein A., Seitzer U., Ahmed J. S.; Epidemiological studies on tickborne diseases of cattle in Central Equatoria State, Southern Sudan; Parasitol
Reseach (2007) 101:1035–1044.
Sanmartín J., Nagore D., García P. A, A Juste R., Hurtado A.; Molecular diagnosis
of Theileria and Babesia species infecting cattle in Northern Spain using reverse
line blot macroarrays; BMC Veterinary Research 2006.
Sparagano O., Allsopp M., Mank R., Rijpkema S., Figueroa J. And F. Jongejan;
Molecular detection of pathogen DNA in ticks (Acari: Ixodidae): A review;
Experimental and Applied Acarology 23: 929–960, 1999.
Sparagano O., Loria G.R, Gubbels M.-j., Caracappa A. P. de Vos S., F Jongejan;
Integrated Molecular Diagnosis of Theileria and Babesia Species of Cattle in Italy;
Annals New York Academy of Sciences 2000.
Tomassone L., Nuñez P., Gürtler R. E., Ceballos L.A., Orozco M. M., Kitron U. D.,
Farber M.; Molecular Detection of Ehrlichia chaffeensis in Amblyomma parvum
Ticks, Argentina; Emerging Infectious Diseases Vol. 14, No. 12, December 2008.
Uilenberg Gerrit; Babesia—A historical overview; Veterinary Parasitology 138
(2006) 3–10
Vargas Danilo, Bonet Rafael, Oliva Paulina y Campano Sergio; Implementación de
la técnica de PCR en la identificación de Babesia ssp en equinos; Parasitol
Latinoam 59: 179 - 182, 2004 FLAP.
Vivas R. I. Rodríguez, Cob-Galera L.A., Domínguez A. José L.; Hemoparásitos en
bovinos, caninos y equinos diagnosticados en el laboratorio de Parasitología de la
Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Autónoma de
Yucatán (1984-1999); Rev. Biomed 2000; 11:277-282.
Zobba R, Ardu M., Niccolini, S., Chessa B., Manna L., Cocco R, Parpaglia M;
Clinical and Laboratory Findings in Equine Piroplasmosis; Journal of Equine
Veterinary Science Vol 28, No 5 (2008)
48