Introducción - Facultad de Ciencias Veterinarias

EVALUACIÓN DE VIABILIDAD EN CÓRNEAS PORCINAS CONSERVADAS
EN UN MEDIO BIOCOMPATIBLE. RESULTADOS PRELIMINARES.
Reutemann, Sofía1,a; Lavaroni, Onelia 2,a Vera, Estela; 3,a; Zukas, Pedro4,b.
1
Pasante alumno. 2Profesora asociada. 3Auxiliar.4 Bioquímico.
a
Universidad Nacional del Litoral (UNL). Facultad de Ciencias Veterinarias
(FCV). Departamento de Clínicas. Cátedra de Inmunología II.
b
Organización no gubernamental DONAR
[email protected]
Proyecto: Evaluación de la viabilidad de córneas porcinas conservadas en un
medio biocompatible desarrollado para su empleo en queratoplastía humana
(CAID 2006)
INTRODUCCIÓN
El transplante corneal o queratoplastía es una técnica quirúrgica mediante la cuál el
tejido corneal anormal de un individuo (receptor) es sustituido por el tejido corneal
normal de otro individuo (donante). Los medios de conservación corneal preservan las
células endoteliales desde la ablación corneal hasta el trasplante. El número de células
endoteliales que conservan su viabilidad en la córnea destinada a trasplante no debe ser
menor a un 50%, éste porcentaje está influido directamente por el tipo de medio de
conservación utilizado1. Actualmente en nuestro país se utilizan medios importados
(Optisol® TM-GS, Bauch & Lomb, Cat. Nº 50006-OPT, Likorol® D-X) sujetos a
trámites de importación extensos, determinando que no se disponga en forma inmediata
de los mismos lo que implica un inadecuado funcionamiento de los bancos de ojos y la
pérdida de innumerables córneas potencialmente trasplantables y a un costo superior.
OBJETIVOS
General
- Elaboración de un medio para la conservación de córneas a mediano plazo (3-7 días) y
evaluación de la eficacia del mismo en córneas porcinas para su posterior aplicación en
córneas humanas.
Específicos
- Formulación y desarrollo de un medio que permita una óptima conservación corneal
desde la ablación hasta la queratoplastía sin alterar las características morfológicas y
fisiológicas de sus células.
- Evaluación de la eficacia de conservación “In Vitro” del medio desarrollado por
medio de la determinación del porcentaje de viabilidad y recuento de células
endoteliales en ensayos con córneas porcinas conservadas durante 72, 96 y 105 horas.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se procedió a la formulación de dos medios de conservación corneal (MCR1 Y MCR2)
compuestos por: solución de aminoácidos, dextrosa, condroitín sulfato, regulador de
pH, y gentamicina. Los medios presentan diferencias de porcentajes en la composición
básica de dextrosa y condroitín sulfato.
Fueron preparados y fraccionados en alícuotas de 5 ml en recipientes de vidrio con tapa
a rosca estériles, de ese modo se conservaron a 4 ºC hasta su utilización. La
metodología de trabajo consistió en: 1) enucleación post mortem inmediata de globos
oculares de cerdos de frigoríficos. 2) ablación de córneas a las 2 hs post enucleación y
colocación del botón corneoescleral en medios de conservación MCR1 y MCR2. 3)
almacenamiento a 4 ºC durante 72, 96 y 105 hs. 4) estabilización a temperatura
ambiente (24ºC) de las córneas conservadas. 5) evaluación de las características del
endotelio corneal mediante tinción con azul tripán al 1% en solución salina al 5%
(proporción 1:4) y 6) valoración de la integridad del tejido post tratamiento con alcohol
96º. Se observaron por M.O a 4x, 10x y 40x.
En todos los casos se tomaron como parámetros de muerte celular: retracción celular,
aumento del espacio intercelular y cambios de forma con aumento del redondeamiento.
RESULTADOS
Fueron evaluados 94 botones corneoesclerales porcinos conservados en MCR1 y
MCR2 a las 72 – 96 y 105 hs, obteniéndose los siguientes resultados:
Córneas ablacionadas 6 hs post mortem: monocapa de células cuboides con
núcleos grandes formando un mosaico hexagonal. Citoplasma uniforme en forma y
tamaño. Recuento y viabilidad endotelial alta. Pleomorfismo endotelial no abundante.
Ausencia de edema, vasos y leucomas. Ausencia de signos de colonización
bacteriana. Ausencia de pliegues en Descemet (Figuras 1 y 2).
Córneas ablacionadas y conservadas por 72 hs: las células endoteliales
presentaron (observación a 40x en M.O) núcleos alargados, límites celulares definidos,
indicio de una membrana plasmática intacta, denotando de esta manera buena
viabilidad endotelial (Figura 3 y 4).
Córneas ablacionadas y conservadas por 96 hs: indicios de deterioro endotelial.
Las células endoteliales presentaron (observación a 200x en M.O) núcleos picnóticos,
vacuolización citoplasmática, mala definición de los bordes celulares y aumento de los
espacios intercelulares (Figura 5 y 6).
Córneas ablacionadas y conservadas por 105 hs: indicios de deterioro endotelial
mas marcados. Las células endoteliales presentaron (observación a 200x en M.O):
Núcleos picnóticos, Vacuolización citoplasmática, Mala definición de los bordes
celulares y Aumento de los espacios intercelulares (Figura 7 y 8).
Tiempo de
conservación
72 hs
96 hs
105 hs
Nº de
muestras
48
34
12
% de viabilidad promedio
MCR1
MCR2
62,70 (±11,97)
66,04 (±10,93)
70,0 (±13,41)
70,9 (±12,21)
73,33 (±17,51)
75,0 (±7,74)
CONCLUSIONES
Las córneas conservadas en MCR1 y MCR2 durante 72, 96 y 105 hs no presentaron
alteraciones significativas en sus características morfológicas y la viabilidad endotelial
presento valores ≥ 62 %.
La formulación de los medios MCR1 y MCR2 no mostraron diferencias significativas,
dando un buen porcentaje de viabilidad, dado que el 60-80% de células endoteliales
viables es capaz de restituir de manera completa la monocapa de células endoteliales
post cirugía.
Los resultados obtenidos aportan bases para el desarrollo de pruebas “in vivo” en
porcinos con el objetivo final de posteriores ensayos en córneas humanas.
AGRDECIMIENTOS
Al Frigorífico Rafaela Alimentos S.A por permitirnos realizar los muestreo en sus
instalaciones. Al Dr. Eduardo Picco y Méd. Vet. Antonio Baravalle por su colaboración.
Finalmente al equipo de trabajo del Laboratorio de Biología celular y Molecular de la
FCV (UNL) por su desinteresada colaboración y apoyo en distintas etapas de este
trabajo.