ANALISIS MOLECULAR DE LA LACASA DE Phanerochaete flavido

Universidad de Granada
Facultad de Farmacia
Departamento de Microbiología
ANALISIS MOLECULAR DE LA LACASA
DE Phanerochaete flavido-alba:
Caracterización del gen y regulación por fenoles y
metales.
Francisco Rodríguez Rincón
TESIS DOCTORAL
Granada, España
2006
ii
Editor: Editorial de la Universidad de Granada
Autor: Francisco Rodríguez Rincón
D.L.: Gr. 1026 - 2006
ISBN: 84-338-3850-4
ANALISIS MOLECULAR DE LA LACASA DE
Phanerochaete flavido-alba:
Caracterización del gen y regulación por fenoles y metales.
Memoria presentada por el Licenciado en Biología y Magíster Scientae
Francisco Rodríguez Rincón para optar al grado de Doctor en Ciencias
por la Universidad de Granada (España)
Los Directores:
Dr. José Martínez López
Prof. Titular de Microbiología
Universidad de Granada
Dra. Teresa de la Rubia Nieto
Prof. Titular de Microbiología
Universidad de Granada
Dr. Antonio Suárez
Prof. Titular de Microbiología
Universidad de Granada
El Doctorando: Francisco Rodríguez Rincón
Granada, Abril de 2006
iii
iv
“¿Cómo se debe enseñar correcta y completamente?.
Exactamente igual que como no se enseñaría correcta y completamente; por
tanto, se dice, enseñar correcta y completamente.
Como una estrella, una aberración visual, una lámpara, una ilusión, el
rocío, una burbuja, un sueño, un relámpago y una nube: considera así todos
los fenómenos compuestos”.
Lhasa Zhol
v
vi
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo ha sido realizado en el Departamento de Microbiología de la Facultad
de Farmacia de la Universidad de Granada, gracias a una Comisión de estudios
otorgada por la Universidad de Pamplona (Colombia) y con fondos del Contrato de
la Unión Europea INCO-ICA3-CT2002-10033 para materiales y equipos.
Agradecimientos especiales a mis directores por su apoyo, esfuerzo, orientación y
dedicación en la realización de esta tesis, por haberme permitido formar parte de su
grupo, por su confianza mostrada durante estos años, por poner a mi disposición
sus laboratorios y por brindarme la oportunidad de aprender de las lacasas, de los
hongos ligninolíticos y de la biología molecular.
Agradezco también a todos los compañeros del Departamento de Microbiología y
del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, especialmente a Fernando,
Inmaculada, Mathias, José María, Gloria, Belén, Carolina, Olga, Raúl, Yolanda
Carmen, José Antonio y Teresa por su inestimable ayuda en todo momento.
A mi querida esposa, Gloria, por compartir conmigo este tiempo, por su amor y
continuo apoyo. A mis padres y hermanos, ya que no hubiera llegado a este punto
de la vida sin ellos.
A todas aquellas personas que han contribuido en una u otra forma en la
elaboración de esta investigación. Gracias a todos.
vii
viii
INDICE
Página
RESUMEN
1
1. INTRODUCCIÓN
3
1.1. LIGNINA
1.2. DEGRADACIÓN DE LA LIGNINA POR LOS HONGOS DE
LA PODREDUMBRE BLANCA DE LA MADERA.
1.2.1. Peroxidasas ligninolíticas
1.2.2. Lacasas EC.1.10.3.2.
1.2.3. Otras oxidasas y reductasas
1.2.4. Metabolitos de bajo peso molecular
1.2.5. Actividad ligninolítica
1.3. LACASAS: UN TIPO DE MULTICOBRE OXIDASAS
1.4. PROCESAMIENTO Y SECRECIÓN DE LAS LACASAS
1.5. EVOLUCIÓN DE LAS LACASAS
1.6. ASPECTOS BIOTECNOLÓGICOS
1.7. GENÉTICA MOLECULAR DE LOS HONGOS DE LA
PODREDUMBRE BLANCA DE LA MADERA (WRF)
1.7.1. Hongos modelo
1.7.2. Regulación génica de las lacasas
1.8. PHANEROCHAETE FLAVIDO-ALBA
1.9. OBJETIVOS
5
8
9
11
11
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12
13
20
20
24
26
26
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29
34
2. MATERIALES Y MÉTODOS
35
2.1. MICROORGANISMOS Y VECTOR
2.1.1. Origen y mantenimiento del hongo
2.1.2. Cepa de Escherichia coli
2.1.3. Vector
2.2. MEDIOS DE CULTIVO
2.2.1. Medios de cultivo para el hongo
2.2.1.1. Medio YMPG
37
37
37
37
37
37
37
ix
2.2.1.2. Medio BL
2.2.2. Medio de cultivo de bacterias
2.3. CULTIVO Y MANIPULACIÓN DEL HONGO
2.3.1. Obtención de inóculos
2.3.2. Cultivos para aislamiento de DNA
2.3.3. Cultivos inducidos para aislamiento de RNA
2.3.3.1. Inducción por fenoles
2.3.3.2. Inducción por hierro y cobre
2.4. ANALISIS ENZIMÁTICOS
2.4.1. Cuantificación de proteínas
2.4.2. Cuantificación de la actividad lacasa
38
39
40
40
40
40
40
41
42
42
42
2.5.
MÉTODOS DE ANÁLISIS DE ÁCIDOS NUCLÉICOS
42
2.5.1. Aislamiento del DNA genómico
2.5.2. Aislamiento del DNA plasmídico de Escherichia coli
2.5.3. Aislamiento de RNA
2.5.4. Amplificación de DNA genómico
2.5.4.1. Amplificación por PCR
2.5.4.2. Amplificación por PCR Inversa
2.6. Síntesis del cDNA mediante RT-PCR
2.6.1. Transcripción Reversa (RT)
2.6.2. Amplificación del cDNA (cPCR)
2.7. Ligación de los productos de amplificación en pGEM®-T
2.8. Transformación de células de Escherichia coli XL1-Blue
2.8.1. Obtención de células electrocompetentes
2.8.2. Transformación de células electrocompetentes
2.9. Secuenciación de ácidos nucleicos
2.10. Cuantificación de la expresión del gen pfaL mediante
Real Time Q-PCR
2.10.1. Síntesis del cDNA
2.10.2. PCR
2.11. Métodos bioinformáticos
2.11.1. Identificación de secuencias en bases de datos
2.11.2. Comparación de secuencias
2.11.3. Diseño de cebadores
2.11.4. Identificación del promotor de pfaL
42
44
44
45
45
45
46
46
46
47
47
47
48
48
x
49
49
49
50
50
50
51
52
2.11.5. Identificación de la señal de secreción de PFAL
2.11.6. Análisis filogenético de la proteína deducida.
3.
RESULTADOS
52
53
55
3.1. CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA GÉNICA pfaL
3.2. AISLAMIENTO DEL cDNA pfaL
3.3. ANÁLISIS DEL cDNA Y DE LA PROTEÍNA DEDUCIDA
3.4. IDENTIFICACIÓN DE INTRONES DEL GEN pfaL
3.5. ANÁLISIS FILOGENÉTICO DE LA LACASA PFAL
3.5.1. Alineamiento con lacasas fúngicas
3.5.2. Alineamiento de PFAL con ferroxidasas fúngicas
3.5.3. Alineamiento con lacasas fúngicas y ferroxidasas
3.5.4. Identificación de Aminoácidos conservados en PFAL
3.5.4.1. Aminoácidos de PFAL conservados en lacasas de ascomicetos
3.5.4.2. Aminoácidos de PFAL relacionados con unión al Fe
3.6. IDENTIFICACIÓN DE LA SEÑAL DE SECRECIÓN
3.7. IDENTIFICACIÓN DEL PROMOTOR DE PFAL
3.8. REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE LA LACASA
POR FENOLES, HIERRO Y COBRE
3.8.1. Regulación por fenoles
3.8.2. Regulación por Metales
3.8.2.1. Regulación por deficiencia de Fe
3.8.2.2. Regulación por adición de Fe
3.8.2.3. Regulación por Cobre
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60
64
67
70
70
70
71
74
74
77
79
81
4.
89
DISCUSIÓN
4.1. ESTRUCTURA DEL GEN pfaL
4.2. FILOGENIA DE PFAL
4.3. ESTRUCTURA PRIMARIA DE PFAL
4.3.1. Aminoácidos conservados de PFAL
4.3.2. Glicosilación
4.3.3. Péptido señal
4.4. ELEMENTOS PUTATIVOS DE REGULACIÓN
TRANSCRIPCIONAL
4.5. REGULACIÓN TRANSCRIPCIONAL DE pfaL
84
84
86
86
88
88
91
92
93
93
94
94
95
xi
POR COMPUESTOS FENÓLICOS
4.6. REGULACIÓN TRADUCCIONAL/POSTRADUCCIONAL
DE PFAL POR VAINILLINA, Cu Y Fe.
4.6.1. Regulación por vainillina
4.6.2. Regulación por cobre
4.6.3. Regulación por hierro
97
99
99
102
105
5.
CONCLUSIONES
107
6.
BIBLIOGRAFÍA
113
RELACIÓN DE FIGURAS Y TABLAS
FIGURAS
Figura 1.
Figura 2.
Figura 3.
Figura 4
Figura 5.
Figura 6.
Figura 7.
Figura 8.
Figura 9.
Figura 10.
xii
Página
Enlaces comunes entre las unidades fenilpropano en la lignina
de maderas blandas.
Esquema de la estructura química parcial de la lignina de
coníferas.
Organización de los dominios y sitios activos del cobre en
MCBPs.
.A. Ciclo catalítico de las lacasas. B. . Ciclo catalítico del
sistema lacasa-mediador.
Esquema de la organización de las MCBPs.
Arbol filogenético de MCBPs de tres dominios.
Efecto de la adición de compuestos aromáticos sobre el crecimiento
y la actividad lacasa de P. flavido-alba.
Amplicón pp12 (cDNA y péptido) de la lacasa de P. flavidoalba
Secuencia F21 de DNA genómico (248 bp) de P. flavido-alba
Amplificación inversa (PCR-I) de productos religados con T4
DNA ligasa, tras digerir el gDNA con XbaI o XhoI.
6
7
15
17
21
23
32
33
57
58
Figura 11.
Figura 12.
Figura 13.
Figura 14.
Figura 15.
Figura 16.
Figura 17.
Figura 18.
Figura 19.
Figura 20.
Figura 21.
Figure 22.
Figura 23.
Estrategia para aislar y secuenciar el gen pfaL de
Phanerochaete flavido-alba.
cDNA de pfaL Amplicón del extremo 3´
cDNA de pfaL Amplicones internos
cDNA de pfaL Amplicón del extremo 5´.
Secuencia del cDNA (2108pb) del gen pfaL
Secuencias del gDNA y cDNA deducidos para el gen de la
lacasa de P. flavido-alba (pfaL)y de la proteina codificada
Árbol filogenético construido con las secuencias de PfaL, las
ferroxidasas y lacasas fúngicas seleccionadas.
Sitios de la región reguladora del gen pfaL de Phanerochaete
flavido-alba.
Actividad lacasa (A) y cantidad de RNAm (B) de pfaL
afectadas por adición de compuestos aromáticos.
Actividad lacasa (A) y cantidad de RNAm (B) de pfaL
afectadas por hierro y cobre.
Comparación de la distribución de exones/intrones entre el
gen pfaL de P. flavido-alba y los genes mco de P.
chrysosporium con mayor número de intrones (mco1 y mco4)
Flujo metabólico propuesto en P. chrysosporium en presencia
de vainillina.
Relación entre la homeostasis del cobre y del hierro en
levaduras.
59
60
61
62
63
64
72
82
85
87
92
101
104
TABLAS
Tabla 1.
Tabla 2.
Tabla 3.
Tabla 4.
Tabla 5.
Composición de fenoles de la Polimerina y comparación con la
fracción polimérica oscura (PMA) del OMW.
Compuestos aromáticos utilizados para inducir la actividad
lacasa en cultivos de P. flavido-alba.
Cebadores usados para amplificar secuencias del gen de la
lacasa de P. flavido-alba, PfaL.
Alineamiento (WU-Blastp, EMBL) de la secuencia deducida
para la lacasa PfaL con las proteínas de la base de datos
UNIPROT.
Oligopéptidos de la lacasa de P. flavido-alba purificada y
30
32
51
64
xiii
Tabla 6.
Tabla 7.
Tabla 8.
Tabla 9.
Tabla 10.
Tabla 10A-B.
Tabla 10C-D.
Tabla 11.
Tabla 12.
Tabla 13.
Tabla 14.
xiv
similitud con la secuencia aminoacídica deducida del cDNA
pfaL
Alineamiento de los intrones del gen pfaL.
Porcentajes de identidad de los intrones del gen pfaL.
Estructura génica de lacasas de hongos de la podredumbre
blanca de la madera y las proteínas que codifican
Secuencias seleccionadas de lacasas y ferroxidasas para
análisis filogenético de PFAL
Posiciones conservadas en los sitios del cobre. Comparación
de PFAL y MCOs de P. chrysosporium (Pc-MCOs) con
lacasas vegetales y lacasas fúngicas.
Secuencias L1-L2
Secuencias L3-L4
Aminoácidos de unión al hierro en la ferroxidasa Fet3
(gi2828219) de S. cerevisiae conservados en PfaL, MCOs de
P. chrysosporium, otras ferroxidasas y lacasas de ascomicetos
Aminoácidos de unión al Fe en Fet3 (gi2828219) de S.
cerevisiae conservados en PFAL y MCOs que están ausentes
en lacasas.
Predicción del péptido señal de PfaL
Regiones reguladoras identificadas en el gen pfaL.
Localización respecto al inicio de la traducción.
67
68
68
69
73
75
75
76
78
79
80
83
ABREVIATURAS
AAO
ABTS
BCS
BL
BLAST
BPS
cDNA
Clustal
cPCR
Ct
Cu
DHP
DMF
DNA
Fe
Fer
gDNA
IDCB
LB
Lip
MCBPs
MCOs
MnP
mRNA
OMW
PCR
PCR-I
pfaL
PfaL
PMA
QPCR
rDNA 18S
Aril alcohol oxidasa
2.2’-azinobis (3-etil-benzotiazolin-6-sulfonato)
Batocuproindisulfonato sódico
Medio basal para el cultivo de P. flavido-alba
programa de búsqueda de alineamiento básico local
Batofenantrolindisulfonato sódico
DNA complementario
Programa de Alineamiento múltiple de secuencias
Amplificación de la primera cadena de cDNA obtenida por RT
Ciclos umbral de PCR en tiempo real
Cobre
Polímero de coniferil alcohol deshidrogenado (Lignina sintética)
N,N-Dimetilformamida
Ácido desoxirribonucleico
Hierro
Ácido ferúlico
DNA genómico
Sitios Interdominios de unión al cobre
Medio de cultivo Luria Bertani
Lignin peroxidasa
Proteínas multicobre azules
Proteínas multicobre
Manganeso peroxidasa
RNA mensajero
Olive oil mill wastewater (alpechín)
Reacción en cadena de la polimerasa
PCR inversa
gen de la lacasa de P. flavido-alba
Lacasa de Phanerochaete flavido-alba
Pigmento polimérico del alpechín
PCR cuantitativa en tiempo real
Gen del RNA ribosomal 18S
xv
RNA
RT-PCR
Tir
Van
YMPG
xvi
Ácido ribonucleico
Transcripción reversa del mRNA y cPCR
Tirosol
Vainillina
medio de cultivo “Yeast-Malt-Peptone-Glucose”
RESUMEN
P. flavido-alba elimina la toxicidad del alpechín (OMW) mediante la oxidación de
sus componentes aromáticos monoméricos y poliméricos. Varias enzimas
ligninolíticas fueron identificadas como responsables de dicha transformación.
Entre ellas la lacasa fue la única enzima detectada en cultivos añadidos de
compuestos aromáticos monoméricos del alpechín, sugiriendo un papel importante
en su detoxificación.
En este trabajo se identificó y caracterizó el gen de lacasa de P. flavido-alba
(pfaL). Tiene un tamaño de 2755 pb, Está formado por una secuencia de
codificación de 1704 pb, 19 intrones y por una región reguladora UTR-3’ de 244
pb. Aguas arriba del gen se identificaron secuencias consenso putativas de
regulación general y típicas de lacasas, tales como una caja TATA, una caja CAAT
y elementos de respuesta a metales (MRE), a antioxidantes (ARE), a xenobióticos
(XRE), a regulación por nitrógeno (NIT2) y carbono (Mig1p). La estructura del
gen y de la proteína son similares a las de multicobre oxidasas de P.
chrysosporium, formando juntas una rama filogenética independiente de las
ferroxidasas y de las lacasas. Sin embargo, PfaL comparte con estas enzimas,
residuos característicos de unión al hierro y al cobre que la hacen particularmente
interesante. En la proteína deducida (567 amino ácidos) se identifica una señal de
secreción de 43 amino ácidos. El péptido extracelular debe tener un alto grado de
glicosilación para justificar el tamaño de la proteína purificada previamente.
Mediante QPCR en tiempo real se estableció que la regulación de la expresión es
compleja y puede estar determinada por múltiples mecanismos relacionados con
estrés químico y oxidativo. La expresión de pfaL se induce manera diferencial por
el pigmento polimérico del alpechín, el ácido ferúlico o la dimetilformamida. A
pesar de aumentar la cantidad de transcrito ninguna de estas sustancias modificó
significativamente la actividad lacasa extracelular. En cambio, la vainillina que
proporcionó cultivos con mayor actividad lacasa, disminuyó la cantidad de mRNA
acumulado, sugiriendo una regulación de tipo traduccional/postraduccional. De
manera similar, se encontró que el cobre y el hierro regulan la producción de lacasa
traduccional/postraduccionalmente, quizás a través de mecanismos de la
homeóstasis del cobre-hierro.
1. INTRODUCCIÓN
1. Introducción
4
1. Introducción
1.1. LIGNINA
El término lignina deriva del latin “lignum” que significa madera. Es uno de los
tres componentes escenciales de la madera junto con los carbohidratos y los
extraibles (Sjostrom, 1981) La lignina es un polímero heterogéneo compuesto por
unidades metoxiladas de fenilpropano que se encuentra formando parte de los
tejidos vasculares de las plantas superiores, a las que proporciona soporte
estructural, impermeabilidad y resistencia frente al ataque microbiano y al estrés
mecánico (Higuchi, 1990). Por su abundancia, representa una de las reservas más
importantes de carbono orgánico en los sistemas terrestres.
Aunque la estructura exacta de la lignina se desconoce, los nuevos métodos
analíticos de identificación de productos de hidrólisis y métodos espectroscópicos
han permitido conocer muchas características estructurales de este polímero. En la
Figura 1 se muestran algunas de las más comunes uniones encontradas en la
lignina de maderas blandas. De todas ellas la unión más abundante es la unión βO- 4 (Adler, 1977).
La síntesis de este polímero se produce por la unión de radicales fenoxi que se
originan en la oxidación enzimática de alcoholes precursores. Se han implicado
numerosas enzimas oxidativas en la síntesis de la lignina, fundamentalmente
peroxidasas y fenol oxidasas. La reactividad de los radicales fenoxi ha llevado a
asumir que la polimerización de estos precursores es un proceso que ocurre al azar
(Kirk y Farrell, 1987), sin embargo, una proteína puede dirigir esta polimerización
(Davin et al., 1997).
La Figura 2 muestra un esquema de un modelo de la lignina de confieras en donde
se muestran diversos tipos de subestructuras entre ellas la recientemente
descubierta en lignina de maderas blandas por Karhunen et al. (1995a,b) y
conocida como dibenzodioxocina.
5
1. Introducción
OCH 3
H 3C O
O
O
OCH 3
H 3 CO
O
O
OCH 3
OCH 3
O
O
β-O-4 [45-50]
α−Ο−4 [6−8%]
H 3CO
5-5 [18-25%]
OCH 3
O
O
H 3C O
O
OCH 3
H 3 CO
O
O
OCH 3
O
β−β [3%]
4-O-5 [4-8%]
β-5 [9-12%]
O
H 3 CO
OCH 3
o
H 3 CO
o
o
O
OCH 3
Dibenzodioxocina [18-25%]
β-1[7-10%]
Figura 1. Enlaces comunes entre las unidades fenilpropano en la lignina de maderas
blandas. Entre paréntesis la proporción aproximada de cada una de ellos.
6
1. Introducción
OH
HO
L ig n in -O
OH
L ig n in
OMe
OMe
O
HO
O
O
OMe
M eO
O
HO
OH
HO
OMe
OH
M eO
OH
OMe
O
O
OMe
OH
OMe
O
M eO
HO
OMe
HO
OH
O
HO
O
HO
HO
OH
O
OMe
HO
OH
O
HO
OH
HO
HO
HO
O
OH
M eO
OH
O
OMe
HO
OMe
HO
O
O
HO
HO
O
CHO
OMe
OMe
O
HO
O
OH
OH
OH
M eO
HO
O
OMe
O
OH
HO
OH
O
OMe
HO
HO
OMe
O
M eO
O
O
OMe
OH
OM e
OH
Figura 2. Esquema de la estructura química parcial de la lignina de coníferas. Las
unidades fenilpropano no se unen directamente sino a través de diferentes tipos de enlaces
que se muestran en la Figura 1.
7
1. Introducción
Aunque existen varios grupos de organismos capaces de degradar la lignina, son
los hongos ligninolíticos pertenecientes al grupo “de la podredumbre blanca de la
madera” ("white rot fungi", WRF),
los principales responsables de la
mineralización de este polímero. Tras la degradación de la lignina se acumulan
celulosa y hemicelulosa que son las responsables del color blanquecino
característico que aparece durante la degradación de la madera por estos hongos
(Cheng y Chang, 1985). Aunque Phanerochaete chrysosporium es el hongo mejor
conocido del grupo, no es el más selectivo en la degradación de la lignina (Broda et
al., 1996).
1.2. DEGRADACIÓN DE LA LIGNINA POR LOS HONGOS DE LA
PODREDUMBRE BLANCA DE LA MADERA.
La degradación de la lignina por estos hongos es un proceso oxidativo,
multienzimático e inespecífico, en el que participan enzimas ligninolíticas y otras
enzimas, junto con metabolitos aromáticos sintetizados por los hongos (Higuchi,
1990; 2004).
Se han identificado dos familias de enzimas ligninolíticas extracelulares, las
peroxidasas y las lacasas. Estas enzimas son capaces de oxidar una gran variedad
de compuestos aromáticos y se diferencian en sus requerimientos catalíticos,
potencial de oxido-reducción, y en su modo de acción que puede ser directo o
indirecto (mediante la cooperación de intermediarios; Daniel et al., 1989;
Sutherland et al., 1991).
8
1. Introducción
1.2.1. Peroxidasas ligninolíticas
Lignina peroxidasa (LiP) EC 1.11.1.14
Esta enzima fue descrita por primera vez en P. chrysosporium (Tien y Kirk, 1983;
Glenn et al., 1983). Es una glucoproteína monomérica que contiene un grupo
hemo.
El ciclo catalítico de esta peroxidasa comienza con la oxidación de la enzima por
peróxidos, dando lugar al compuesto I, que contiene un complejo oxo-Fe4+ radical
catiónico de la porfirina (Schoemaker et al., 1994) (1).. El compuesto I es reducido
en dos pasos consecutivos por compuestos aromáticos, para formar el Compuesto
II y la enzima nativa (2) (3). El exceso de peróxido da lugar a una reacción
irreversible en la que se forma el Compuesto III que es inactivo(4)..
LiP Fe 3+ + H2O2 LiP C-I Fe4+ = O (P).+ + H2O
LiP C-I Fe4+ = O (P).+ + RH LiP C-II Fe4+ = O (P) + R* + H+
LiP C-II Fe4+ = O (P) + RH + H+ LiP Fe3+ + R* + H2O
LiP C-II Fe4+ = O + H2O2 LiP C-III Fe3+O2.+
(1)
(2)
(3)
(4)
La LiP se diferencia de otras peroxidasas por su alto potencial de oxido-reducción,
lo que le permite oxidar directamente compuestos aromáticos no fenólicos, y por
tanto, la mayor parte de las unidades de la lignina (Tien, 1987).
En P. chrysosporium se han encontrado al menos 8 isoenzimas de esta enzima,
siendo la H8 la mejor caracterizada (Tien y Kirk, 1988). Tras clonar los genes de
varias isoenzimas (Pribnow et al., 1989), se ha comprobado que no responden de la
misma manera a los factores reguladores.
Peroxidasas que oxidan el manganeso (MnP) EC 1.11.1.13
Mas frecuente que la producción de LiP es la producción de peroxidasas que
oxidan el Mn2+ a Mn3+ en presencia de peróxidos. Estas peroxidasas manganeso
dependientes se han descrito en la mayoría de los hongos ligninolíticos de la
podredumbre blanca de la madera (Hatakka, 1994).
9
1. Introducción
El Mn3+ formado en la reacción es un fuerte oxidante, que estabilizado con ácidos
dicarboxílicos secretados por el hongo, actúa como intermediario en la oxidación
de compuestos fenólicos y no fenólicos (Hammel et al., 1989).
El ciclo catalítico de la MnP es semejante al de otras peroxidasas incluidas la LiP
y transcurre a través de la formación de intermediarios del enzima MnP C-I y MnP
C-II.
MnP Fe 3+ + H2O2 MnP C-I Fe4+ = O (P).+ + H2O
MnP C-1 Fe4+ = O (P).+ + Mn2+ MnP C-II Fe4+ = O (P) + Mn3+
MnP C-1 Fe4+ = O (P).+ + RH MnP C-II Fe4+ = O (P) + R*
MnP C-II Fe4+ = O (P) + Mn2+ MnP Fe3+ + Mn3+ + + H2O
MnP C-II Fe4+ = O + H2O2 MnP C-III Fe3+O2.+
(1)
(2a)
(2b)
(3)
(4)
El primer producto de la reacción de la MnP nativa con el peroxido de hidrógeno
es el compuesto I (1). La reducción monoelectrónica del compuesto I por Mn 2+
conduce al compuesto II que de nuevo se reduce por Mn2+ para generar el enzima
nativo. Mientras que el compuesto I puede ser reducido además de por el Mn2+
(2a), por otros donadores como los fenoles (2b), el compuesto II de la MnP solo
puede ser reducido por Mn2+ por lo que depende de este catión para cerrar su ciclo
(3).
Al igual que la LiP la MnP es sensible a altas concentraciones de H2O2 que
provocan la inactivación reversible del enzima al compuesto III que es un estado de
oxidación inactivo catalíticamente (4).
La mayoría de estas peroxidasas se caracterizan por depender del Mn2+ para cerrar
su ciclo catalítico (reducción del compuesto II de la enzima, Schoemaker et al.,
1994). Son enzimas que solo actúan de manera indirecta sobre la lignina. En P.
chrysosporium se han detectado varias isoenzimas codificadas por tres genes
(Pease y Tein, 1992).
Además de estas peroxidasas dependientes de Mn2+, se han encontrado más
recientemente en varios hongos del género Pleurotus (Martínez et al., 1996; Sarkar
et al., 1997) y en Bjerkandera adusta (Heinfling et al., 1998) otras peroxidasas que
oxidan eficazmente el Mn2+ y que no dependen de él para cerrar su ciclo catalítico.
10
1. Introducción
Son peroxidasas que pueden oxidar compuestos aromáticos de forma directa
(independientes de Mn2+) e indirectamente (con Mn2+).
En Pleurotus eryngii se ha purificado una de estas enzimas y se ha comprobado
que comparte propiedades catalíticas de la LiP y de la MnP de otros
basidiomicetos. Además es capaz de oxidar fenoles y colorantes que no pueden
oxidar directamente las LiPs ni las MnPs “convencionales” (Camarero et al., 1999).
1.2.2. Lacasas EC.1.10.3.2.
Las lacasas son fenoloxidasas ampliamente distribuidas en plantas, hongos de
diferentes clases (Gianfreda et al., 1999) y algunas bacterias (Diamantidis et al.,
2000).
Las lacasas se descubrieron en el látex de la planta Rhus vernicifera (Thurston,
1994), como la sustancia termolábil responsable del endurecimiento de la resina.
En las plantas la lacasa tiene una función protectora frente a lesiones sufridas por el
vegetal, pues la oxidación de fenoles del latex por la lacasa provoca radicales libres
que tienden a polimerizar lo que origina una cubierta protectora en la lesión.
La función de la lacasa en los hongos no está clara, se ha relacionado con la
morfogénesis, con la pigmentación de los conidios, con la formación de
rizomorfos, con el desarrollo de cuerpos fructificantes (Thurston, 1994) con la
patogénesis (Lewis y Yamamoto, 1990) y en la protección frente a compuestos
fenólicos tóxicos liberados durante la degradación de la lignina (Bollag et al.,
1988).
1.2.3. Otras oxidasas y reductasas
En los WRF se han encontrado al menos dos oxidasas extracelulares: la glioxal
oxidasa (Kersten, 1990) y la aril alcohol oxidasa (AAO) (Asada et al., 1995). El
papel de estas enzimas en la degradación de la lignina es el de generar el peróxido
de hidrógeno necesario para la actuación de las peroxidasas.
Además ciertas reductasas de compuestos aromáticos, y oxidoreductasa de la
celobiosa, parecen estar involucradas en la degradación de la lignina (Constam et
al., 1991; Muhein y Leisola, 1991) . Sus funciones parecen ser la reducción de
11
1. Introducción
quinonas y radicales fenoxilos evitando su toxicidad y la tendencia a la
repolimerización, además de que al ser reducidos estos compuestos aromáticos, se
convierten en sustratos de las enzimas ligninolíticas con lo que continua la
degradación (Schoemaker et al., 1989).
1.2.4. Metabolitos de bajo peso molecular
Los hongos ligninolíticos se caracterizan por producir gran cantidad y variedad de
metabolitos extracelulares (Shimada e Higuchi, 1991). Algunos de estos
compuestos participan en la degradación de la lignina; como mediadores de las
enzimas ligninolíticas como el alcohol veratrílico o el ácido hidroxiantranílico
mediadores de la LiP (Cancel et al., 1993) y la lacasa (Eggert et al., 1996a); otros
como sustratos de las enzimas (como el glioxal o metilglioxal) para la glioxal
oxidasa o los ácidos dicarboxílicos que estabilizan al Mn3+ producido por la MnP
(Kishi et al., 1994).
Además de estos metabolitos aromáticos estos hongos producen también especies
reducidas del oxigeno como H2O2, anión superóxido (O2·-) y radical hidroxilo (OH.)
que es oxidante fuerte (Backa et al., 1993).
1.2.5. Actividad ligninolítica
P. chrysosporium produce el sistema enzimático ligninolítico durante el
metabolismo secundario, en respuesta a la limitación en nitrógeno, carbono o
azufre (Dosoretz y Grethelein, 1991; Faison y Kirk, 1985; Jeffries et al., 1981; Kirk
et al., 1978). Sin embargo, en otros hongos de la podredumbre blanca de la madera,
la degradación de la lignina se produce bajo condiciones de exceso en carbono y
nitrógeno (Périé y Gold, 1991). De forma general en los laboratorios, la producción
de enzimas ligninolíticas y la propia ligninolisis se producen bajo elevadas
tensiones de O2 (Faison y Kirk, 1985) aunque en cultivos de Ganoderma australis
la degradación selectiva de la lignina es estimulada por la limitación en nitrógeno y
la baja tensión de O2 (Ríos y Eyzaguirre, 1992). Otros factores que afectan a la
ligninolisis son la agitación de los cultivos, de forma diferente dependiendo del
hongo (Waldner et al., 1988), y la presencia de un surfactante.
12
1. Introducción
En los WRF, la acumulación de los enzimas extracelulares ligninolíticos puede
variar dependiendo no sólo de la especie de hongo, sino también de las condiciones
ambientales (Tuor et al., 1995). Además, aunque en ciertos hongos se detectan
secuencias génicas que hibridan con sondas de la LiP de P. chrysosporium, no se
detecta LiP en sus cultivos (Rüttimann et al., 1992).
La complejidad en la producción de las enzimas ligninolíticas se encuentra
ilustrada por la lacasa de P. chrysosporium. . Este hongo se consideró como una
excepción entre los hongos de la podredumbre blanca de la madera por su
incapacidad de producir lacasa (Gold y Alic, 1993). Sin embargo, en 1995, se
detectó lacasa en cultivos con celulosa como fuente de carbono (Srinivasan et al.,
1995) y más recientemente se purificaron parcialmente varias fracciones proteicas
con actividad lacasa (Dittmer et al., 1997). Dado que en el genoma de P.
chrysosporium no se han encontrado genes de lacasas, es probable que estas
actividades enzimáticas pudieran corresponder a alguna de las multicobre oxidasas
(MCOs) descritas mas recientemente (Larrondo et al 2003 y 2004)
En otras especies del mismo género, como en P. sordida, no se ha detectado lacasa
(Rüttimann-Johnson et al., 1994); en P. laevis no se detectó LiP, pero en cambio se
detectaron elevados niveles de MnP y lacasa (Bogan y Lamar, 1996). En P.
flavido-alba, hemos purificado una lacasa (Pérez et al., 1996) y descrito varias
MnPs y LiPs (Ben Hamman et al., 1997).
Este trabajo describe por primera vez el gen de la lacasa de P. flavido-alba y su
regulación por fenoles y metales. Así mismo incluye la posición filogenética de la
proteína en el contexto de la familia de las multicobre oxidasas (MCOs). Por ello
es necesario introducir algunos aspectos de estas proteínas.
1.3. LACASAS: UN TIPO DE MULTICOBRE OXIDASAS
Características estructurales y sitios de unión al cobre
Las lacasas (p-difenol:dioxígeno oxidoreductasa, EC 1.10.3.2) junto con las
ferroxidasas, ascorbato oxidasas, ceruplasmina y otras enzimas constituyen las
proteínas multicobre oxidasas (MCOs). Las MCOs poseen secuencias y estructuras
similares que intervienen en los sistemas redox relacionados con el ión cobre
13
1. Introducción
(Messerschimdt A, 1997). También se denominan proteínas multicobre azules
(MCBPs) por el hecho de que el ión cobre de tipo 1 (ver mas adelante), tiene un
máximo de absorción a 610 nm, y da el color azul a estas proteínas.
Históricamente, los átomos de cobre en proteínas multicobre han sido clasificados
en tres tipos (tipo 1, tipo 2 y tipo 3) por sus propiedades espectroscópicas
(Solomon et al., 1996). En el espectro UV–visible, el cobre tipo 1 (azul) muestra
máxima absorción cerca de 610 nm y el cobre tipo 3 muestra máxima absorción
cerca de 330 nm. Los cobre tipo 1 y tipo 2 son detectables por resonancia
electrónica paramagnética (EPR), mientras el cobre dinuclear tipo 3 no es
detectable.
Los aminoácidos de estos centros de unión al cobre están distribuidos en cuatro
regiones altamente conservadas (L1, L2, L3 y L4) típicas de lacasas que se
extienden desde 8 hasta 24 residuos a lo largo de la secuencia de la proteína e
incluyen tanto los aminoácidos específicos de unión al cobre como otros no
específicos (Kumar et al., 2003) ) (Figura 3). Los aminoácidos de unión del cobre
tipo 1 son dos histidinas, una cisteína y una metionina. Los primeros tres residuos
son esenciales para la unión del cobre azul, formando un trígono fuerte con el ión
cobre, mientras el enlace con el cuarto residuo (una metionina axial) es más
distante y débil, pudiendo ser reemplazado por otros aminoácidos, tales como
leucina o fenilalanina (Figura 3).
Generalmente, los sitios de unión del cobre tipo 1 se encuentran dentro de un
dominio. Pero las MCBPs poseen otros sitios de unión del cobre interdominios
(IDCB), diferentes de los del tipo 1, que consisten solo de residuos de histidinas.
En las MCOs, como las lacasas y las ceruplasminas, el sitio interdominio es
trinuclear, compuesto de un cobre tipo 2 y dos cobres tipo 3 coordinados por ocho
histidinas (cuatro de cada dominio) (Figura 3). En el caso de las nitrito reductasas,
el sitio interdominio es un cobre tipo 2 mononuclear coordinado por tres histidinas
(dos del primer dominio y uno del segundo dominio).
14
1. Introducción
D1
D2
D3
Dominio 3
Dominio 1
1 2 3
AoZu 57 VVIHWHGILQ
LcAb 60 VSIHWHGFFQ
MvBO 91 NSVHLHGSFS
DHGO 114 TAVHWHGIRL
YD56 97 TALHFHGVVP
YAK8 82 TSLHSHGLFQ
CopA 96 TSIHWHGIIL
CumA 102 TTIHWHGIRL
Fet3 78 TSMHFHGLFQ
Fet5 76 TSLHFHGLFQ
L-1
99
103
128
156
140
124
136
142
121
123
321
-1-1GTFFYHGHLGMQRSAGLYGSL
GTFWYHSHLSTQYCDGLRGAF
RTLWYHDHAMHITAENAYRGQ
GTSWYHSHFSLQYSNGLYGPL
GTFWYHSHSSVQYGDGMRGVL
GTYWVHSHDMSQYPDGLRTPF
GTYWYHSHSGFQEQVGVVYGP
GSYWYHPHVSSSEELGRGLVP
GTYWYHSHTDGQYEDGMKGLF
GTFWYHAHMGAQYGDGMRGAF
325
274
249
307
291
272
365
235
271
274
445
398
398
484
452
417
522
398
413
418
L-2
1 2 3
HPWHLHGHDF
HPFHLHGHNF
HPIHIHLVDF
HPIHLHGHDF
HPWHMHGHHF
HPFHLHGHTF
HPIHLHGMWS
HPIHLHGMSF
HPFHLHGHAF
HPFHLHGHNF
L-3
501
446
451
538
525
475
565
445
478
491
321
1
1
GVNAFHCHIEPHLHMGMGVVF
GAWFLHCHIDWHLEAGLAIVF
GVYMFHCHNLIHEDHDMMAAF
GAWLLHCHLQYHASEGMALQY
GKWWLHCHVEWHMMKGLGIVF
GAWVIHCHIEWHMESGLLATF
GRWAYHCHLLYHMEMGMFREV
GTWMFHCHVIDHMETGLMAAI
GVWFFHCHIEWHLLQGLGLVL
GVWYFHCHVDWHLQQGLASGF
L-4
Sitio mononuclear cobre tipo 1 (azul)
Sitio interdominio trinuclear cobre tipo2/tipo3
Figura 3. Organización de los dominios y sitios activos del cobre en MCBPs. Se muestra un
alineamiento de varias secuencias MCBPs alrededor de los sitios de unión al cobre en el primero y
último dominio. Estos sitio corresponden con las designaciones de L1-L4 de Kumar et al. (2003). Los
números 1, 2 y 3, arriba de los alineamientos indican posiciones consenso de los residuos de unión al
cobre tipo 1, tipo 2 y tipo 3, respectivamente. Los residuos en rojo son del sitio del cobre tipo 1(azul).
Los residuos en verde son los del sitio IDCB tipo 2/3. El número amarillo en la columna de la mitad es
el número de residuos entre el Segundo y tercer fragmento de las secuencias. La secuencia ID (SWISSPROT) o numero de acceso (NCBI), el nombre común (si lo hay), y el origen de cada secuencia son:
AoZu: ASO_CUCPM, ascorbato oxidasa de Cucurbita pepo var. melopepo; LcAb: LAC1_AGABI,
lacasa de Agaricus bisporus; MvBO: BLRO_MYRVE, bilirubin oxidasa de Myrothecium verrucaria;
DHGO: BAA08486, dihidrogeodin oxidasa de Aspergillus terreus; YD56: YD56_YEAST, YD56 de
Saccharomyces cerevisiae; YAK8: FIO1_SCHPO, YAK8 de Schizosaccharomyces pombe; CopA:
CPA1_PSESM, CopA de Pseudomonas syringae; CumA: NP_743195, CumA de Pseudomonas
putida; Fet3: FET3_YEAST, ferric reductasa de Saccharomyces cerevisiae; Fet5: P43561, ferric
reductasa de Saccharomyces cerevisiae. (Modificado de Nakamura et al, 2005).
15
1. Introducción
La lacasa fúngica mejor estudiada es la de Trametes versicolor (Bollag y
Leonowicz, 1984). Es una p-difenol O2 oxidoreductasa que se diferencia de la
mayoría de fenoloxidasas en que produce agua en lugar de peróxido en la
reducción del oxígeno. Son glucoproteínas con 4 átomos de cobre y de peso
molecular variable (D´Souza et al., 1996). Los átomos de cobre están clasificados
en tres tipos (1, 2 y 3) con diferentes propiedades (Shin et al., 1996; Yaropolov et
al., 1994):
Cobre tipo 1 (T1): es responsable del color azul de la proteína. Tiene una alta
absorbancia en la región del visible (605 nm) provocada por la unión covalente
cobre-cisteína. Debido al alto potencial redox de este cobre es el sitio donde ocurre
la oxidación del sustrato.
Cobre tipo 2 (T2): se caracteriza por no presentar absorbancia detectable en la
región del visible y por tener una alta afinidad por aniones (F-, CN-...) que actúan
como inhibidores de la actividad del enzima.
Cobre tipo 3 (T3): es un complejo binario formado por un par de iones Cu2+-Cu2+
unidos por puente hidróxido con un máximo de absorbancia a 330 nm y un
espectro de fluorescencia característico.
La reacción que cataliza la lacasa es la siguiente:
4 AH + O2
4 A + 2 H2O
[AH: Dador de electrones]
Los cobres T2 y T3 forman un cluster trinuclear que es el lugar donde se reduce el
oxígeno (Thurston, 1994). El cobre del centro T1 es el primer aceptor de electrones
del sustrato. Después los electrones se transfieren secuencialmente al centro T2-T3
que tras recibir cuatro electrones reducen una molécula de oxígeno a agua. Así la
oxidación monoelectrónica del sustrato va acoplada a la reducción por cuatro
electrones del oxígeno molecular (Figura 4A).
16
1. Introducción
A
H2O
Lacasaox
Medred
Substratoox
O2
Lacasared
Medox
Substratored
B
Figura 4. A. Ciclo catalítico de las lacasas (Yaropolov et al. 1994). B. Ciclo
catalítico del sistema lacasa-mediador.
17
1. Introducción
La lacasa presenta una amplia especificidad de sustrato puesto que cataliza la
oxidación de orto y para difenoles, amino fenoles, dímeros de lignina fenólicos e
incluso no fenólicos en presencia de algunos intermediarios, (Kawai et al., 1987;
Hatakka et al., 1991). La oxidación puede estar controlada por las diferencias en
potencial redox entre los sustratos reductores y el cobre tipo 1 de la lacasa
(Thurston, 1994). En general las lacasas tienen baja especificidad por estos
sustratos en relación al oxígeno. La oxidación monoelectrónica de un sustrato por
la lacasa implica la formación de un radical libre. Estos radicales posteriormente
pueden ser oxidados a quinonas por el enzima o bien sufrir reacciones no
enzimáticas variadas. La oxidación de fenoles frecuentemente produce reacciones
de acoplamiento carbono-carbono y carbono-oxígeno entre los radicales lo que
origina productos de mayor peso molecular que los sustratos es decir reacciones de
polimerización. La tendencia de esta enzima de provocar polimerización no es una
desventaja en biorremediación ya que la polimerización oxidativa de los
contaminantes puede ser un método aceptable para su eliminación.
Mientras que las lacasas solo pueden oxidar directamente subunidades fenólicas de
la lignina (más fáciles de oxidar pero menos abundantes), pueden reaccionar
indirectamente con componentes no fenólicos de la lignina mediante la
participación de mediadores redox que son compuestos de bajo peso molecular
fácilmente oxidados por estas produciendo radicales muy inestables y muy
reactivos que pueden a su vez oxidar sustratos más complejos (Figura 4B). Se han
citado mediadores sintéticos como el [2.2’-azinobis (3-etil-benzotiazolin-6sulfonato)] (ABTS) ó 1-hidroxibenzotriazol (Bourbonnais et al., 1997; Pickard et
al., 1999) y naturales como 4-hidroxibenzóico, 4-hidroxibenzol y 3hidroxiantranilato (Bourbonnais y Paice, 1990, Eggert et al. 1996, 1997).
En Panus tigrinus, se ha aislado una forma amarilla de la lacasa, probablemente
formada como consecuencia de la unión de la proteína a moléculas derivadas de la
lignina. Esta enzima, cataliza la oxidación del alcohol veratrílico y de compuestos
diméricos no fenólicos sin la participación de mediador (Leontievsky et al., 1997).
En cultivos de Pleurotus ostreatus se ha aislado una lacasa que no posee el color
azul característico debido a la falta del cobre tipo 1 (azul) (Palmieri et al., 1997).
Curiosamente, en lugar de los cuatro átomos de cobre por cadena, esta lacasa
blanca contiene dos iones de zinc, un ión de hierro y un ión de cobre, y a pesar de
ello exhibe actividad lacasa. Sin embargo, el análisis de la secuencia de
18
1. Introducción
aminoácidos reveló que todos los residuos de unión al cobre están conservados.
Otra lacasa blanca, extraída de Phellinus ribis, lleva dos iones de zinc y un ión
manganeso (Min et al., 2001). También otra lacasa blanca fue encontrada en
Volvariella volvacea (Chen et al., 2004).
La presencia de lacasa blanca plantea muchas dudas. Por ejemplo, es posible
cambiar los iones cobre por otros metales?; también, el cambio de ión cobre por
otro metal, haría perder la función de la enzima MCBP?. Para responder la primera
pregunta, Nakamura et al, (2005), propusieron que el cobre tipo 1 puede ser
reemplazado por Fe/Mn, así perdiendo el color azul; los cobres del tipo 3 serían
reemplazados por iones zinc, y el de tipo 2 permanecería igual.
La actividad es inhibida por interrupción de la transferencia electrónica (por
haluros, azida, cianuro e hidróxidos) o por quelación del cobre y por modificación
de los aminoácidos por cambios conformacionales (Gianfreda et al., 1999).
Diferentes lacasas tienen diferente tolerancia hacia estos inhibidores (Xu, 1996).
Para la utilización de la lacasa con fines biotecnológicos y medioambientales, así
como para el conocimiento de las propiedades de la enzima se requieren grandes
cantidades de la proteína, por lo que se han realizado muchos estudios para
identificar los mejores inductores y métodos de aislamiento y purificación.
La producción enzimática depende no solo del tipo de hongo sino de las
condiciones nutricionales empleadas, de la presencia o ausencia de inductor,
tiempo de inducción, naturaleza y composición del medio de cultivo y sobre todo
de la manipulación genética.
Los principales inductores de esta actividad incluyen compuestos fenólicos
relacionados con la lignina (Gianfreda et al., 1999) aunque también compuestos no
derivados de la lignina y diferentes extractos vegetales de diversa naturaleza han
demostrado ser buenos inductores (Salas et al., 1995). Pérez et al. (1998) y Ruiz
(1999) han demostrado la inducción de la lacasa de Phanerochaete flavido-alba
por alpechín.
19
1. Introducción
1.4. PROCESAMIENTO Y SECRECIÓN DE LAS LACASAS
Los genes de lacasas presentan secuencias en su extremo N-terminal que codifican
los llamados péptidos señal. Estos péptidos señal dirigen a las lacasas hasta el
espacio extracelular siguiendo una ruta de secreción en la que se suceden diferentes
eventos: un plegamiento cotraduccional en el retículo endoplásmico donde se
forman los puentes disulfuro (Freeman, 1989), la incorporación de una secuencia
precursora (Glucosa3-Manosa9-Glucosa-N-acetilglucosamina2) que se une a la
asparagina de la mayoría de las secuencias NXT/S de la proteína (Gavel y Von
Heijne, 1990), y la unión de iones calcio que estabilizan la estructura de la
apolacasa resultante. Luego, en el aparato de Golgi, tiene lugar la adición de los
iones cobre (Taylor, 2005) y un procesamiento adicional de los carbohidratos antes
de ser secretadas.
En ascomicetos, como Saccharomyces cerevisiae y Melanocarpus albomyces, se
han detectado procesamientos C-terminal (propéptidos), previos al procesamiento
N-terminal que parecen influir en la activación de la lacasa (Bulter et al., 2003;
Kiiskinen y Saloheimo, 2004).
1.5. EVOLUCIÓN DE LAS LACASAS
Ryden y Hunt (1993) propusieron una hipótesis evolutiva de las MCBPs, con base
en análisis de secuencias y de las estructuras cristalinas. Estos autores señalan que
las MCPBs poseen multidominios de unión al cobre correspondientes a secuencias
repetidas en tandem, que se originaron a partir de un solo dominio de unión al
cobre tipo 1. Las rusticianinas de la familia de cupredoxinas son las enzimas más
relacionadas con las MCBPs que poseen un solo dominio (Kanbi et al., 2002). Ello
ha permitido sugerir que el dominio de estas cupredoxinas se ha multiplicado y
modificado en el tiempo, creando sitios interdominios de unión al cobre (IDCB:
tipo 2 y tipo 3) y sitios de unión a sustratos, tal como se encuentran en las MCBPs
contemporáneas (Figura 5).
20
1
1. Introducción
2
1
2
1
1
2
1
Cupredoxina
1
1
de dominio
Sitio BCB perdido en el
segundo dominio
2
2
Creación
sitio tipo 2
2
2
Duplicación
[X]
a
id
rd
Pé o 3
tip
[Y]
1
Creación
sitio tipo 3
io
sit
Nitrito
reductasa
2
2
1
[C]
1
1
2
Cobre tipo 1 (azul)
1
2
2
Si
el tio B
se C
gu B p
nd er
o
d
do ido
m
in en
io
1
1
[A]
[B]
2
Cobre tipo 3
1
2
io
in
m
do 3
un ,2,
de 1
Ascorbato
n tios
ó
ci si
Lacasa
e r id a
s
In rd
Pé
oxidasa
3
Cobre tipo 2
2
Triplicación
pérdida sitio
tipo 2,3
2
4
1
5
1
2
2
1
2
o
io
id
in
m
rd
do
pe
B
do
BC
un
eg
tio
s
Si
el
en
6
Ceruplasmina
Figura 5. Esquema de la organización de las MCBPs. Los óvalos indican dominios BCB
(union de cobre azul). Puntos azules y verdes indican los átomos de cobre del tipo 1 y
tipo2/tipo3, respectivamente. Flechas sólidas indican la vía evolutiva propuesta y las
flechas entrecortadas indican vías evolutivas alternativas. Las MCBPs actuales se muestran
a la derecha. Cinco proteínas hipotéticas de dos dominios: [X], [Y] y [A] tienen sitios BCB
en ambos dominios, mientras [B] y [C] tienen un solo sitio BCB en el primero y segundo
dominio, respectivamente. Las MCBP hipotéticas [A], [B], y [C] tienen sitios IDCB
trinucleares, mientras [Y] tiene un sitio IDCB mononuclear. Esta figura es tomada de
Nakamura et al. (2005).
21
1. Introducción
En esta hipótesis, un par de dominios de la cupredoxina inicial se duplicó hasta
generar MCBPs de seis dominios, como en las ceruplasminas, y la adición de un
dominio para generar MCBPs de tres dominios, como en las ascorbato oxidasas y
lacasas. Debido a la similitud en estructura y función de los sitios IDCB del tipo 2
y del tipo 3 (sitio trinuclear) en las ceruplasminas, ascorbato oxidasas y lacasas,
Murphy et al. (1997) propuso una evolución dependiente. Así por ejemplo, las
ceruplasminas al perder tres dominios formaron proteínas tipo lacasas; o viceversa,
las lacasas al duplicar/adicionar dominios formaron las ceruplasminas.
Para explicar ambas relaciones filogenéticas, se propone la existencia de un
intermediario evolutivo de MCBPs con dos dominios que incluyen residuos IDCB
trinucleares de unión al cobre (Nakamura et al., 2003). Surge así, tres tipos de
MCBPs intermediarios con dos dominios (A, B y C en la Figura 5), cuya diferencia
radica en la localización de los residuos del dominio de unión al cobre azul (BCB).
El intermediario A tiene residuos en ambos dominios, mientras el B tiene los
residuos solo en el segundo dominio, y el intermediario C los tiene solo en el
primer dominio. Estas diferencias significan que los sitios de unión al cobre azul
evolucionaron de manera regresiva; es decir, el tipo A sería el más antiguo, pues
contiene residuos en ambos dominios; el tipo B y el tipo C perdieron residuos BCB
del primero y segundo dominio, respectivamente. En la figura 5, el intermediario
tipo C puede ser un ancestro directo de la nitrito reductasa, mientras que el
intermediario tipo B, lo sería de lacasas/ascorbato-oxidasas y ceruloplasminas.
Entre las MCBPs, las de tres dominios forman el grupo más diverso en término de
secuencias, funciones y distribución. Se encuentran en hongos, plantas, insectos
(Dittmer et al., 2004; Parkinson et al., 2003) y en bacterias (Alexandre y Zhulin,
2000; Claus, 2003). El árbol filogenético de las MCBPs de tres dominios se divide
en tres regiones, cada región corresponde a un taxón representativo de bacterias,
plantas y hongos (incluye insectos) (Figura 6).
22
1. Introducción
PLANTAS
Ascorbato oxidasa,
Lacasa
Sin cobre azul
INSECTOS
Lacasa
BACTERIA
Lacasa, CueO,
PcoA , PpoA,
CotA, CumA
Hongos
Lacasa
Fet3, Fet5
Figura 6. Arbol filogenético de MCBPs de tres dominios. Las ramas están separadas de
acuerdo a los grupos de organismos: plantas, hongos, bacterias e insectos. Las regiones
cuyas secuencias no poseen los residuos de unión al cobre azul tipo 1 están sombreadas.
Fet3 y Fet5 son ferroxidasas de Saccharomyces cerevisiae; CueO y PcoA son proteínas de
la homeóstasis del cobre en E. coli; PpoA es una polifenol oxidasa con actividad tirosinasa
de Marinomonas mediterranea; CotA es un componente de la endospora de Bacillus
subtilis; CumA es una proteína de la cubierta de la espora de Pseudomonas con actividad
Mn-oxidativa. El alineamiento de secuencias multiples y la construcción del árbol
filogenético fueron hechos usando el programa ClustalW (http://www.ebi. ac.uk/clustalw/).
Tomado de Nakamura et al (2005).
En el árbol filogenético de las MCBPs de tres dominios, las lacasas de insectos
forman un grupo independiente en medio de la región de lacasas de hongos (Fig.
2). Hasta el momento, han sido clonadas y caracterizadas dos lacasas del gusano
del tabaco (Manduca sexta) y una del mosquito de la malaria (Anopheles gambiae)
23
1. Introducción
(Dittmer et al., 2004). La principal diferencia entre estas lacasas y las de los hongos
y plantas es la extensión de la secuencia amino-terminal con varios residuos
conservados de cisteína, aromáticos y polares. La principal función de las lacasas
de insectos es la esclerotización de la cutícula en la epidermis (Binnington y
Barrett, 1988), donde se ha observado actividad oxidativa de estas enzimas sobre
sustratos catecólicos (Sugumaran et al., 1992; Sugumaran y Nellaiappan, 1990).
Estas enzimas también han sido encontradas en el intestino, en túbulos de
Malpighio y en la glándula colleterial, donde, sin embargo, su función es
desconocida. Recientemente, también se ha identificado una lacasa en el veneno de
avispas parasitoides (Parkinson et al., 2003).
1.6 ASPECTOS BIOTECNOLÓGICOS
Los organismos productores de lacasas han evolucionado para adaptarse a
diferentes condiciones ambientales. En tales condiciones cuando las lacasas son
secretadas, funcionan de manera inusual. Esta habilidad adaptativa es importante
en términos de aplicaciones industriales, como por ejemplo, en blanqueo de textiles
(Novozymes A/S, Dinamarca), y de pulpa de papel (Addleman y Archibald, 1993;
Reid y Paice, 1994), síntesis orgánica, bioremediación y detergentes de lavado.
También para desarrollar métodos con el fin de introducir características deseables
a otras enzimas, como lo puede ser la estabilidad térmica a altas temperaturas
(Suzuki et al., 2003) o en la durabilidad a altas condiciones ácido/básicas (Xu et al.,
1998; Shirai et al., 2001).
Las principales aplicaciones de las lacasas se encuentran en la industria del papel,
concretamente en el blanqueo biológico y en la detoxificación de efluentes.
Existen distintas patentes a base de lacasas inmovilizadas solas o con mediadores
como Pulp-Zyme®,Novo-Nordisk (que utiliza lacasa-ABTS).
En relación a la detoxificación de efluentes, existen procesos que se basan en la
decoloración y detoxificación en continuo del efluente con hongos inmovilizados,
tal como el cultivo inmovilizado en alginato de T. versicolor productor de lacasa
(Archibald et al., 1990).
24
1. Introducción
Otra aplicación de estas enzimas y de los hongos productores es la degradación de
contaminantes medioambientales. Los cultivos de T. versicolor inducidos para la
producción de lacasa, oxidan el antraceno y el benzo-[α]-pireno. Además, la lacasa
purificada oxida el benzo-[α]-pireno tras la adición de ABTS (Collins et al., 1996).
Las lacasas naturales no siempre son adaptables para aplicaciones industriales. Las
principales limitantes son: (i) la necesidad de usar un mediador redox para
oxidación indirecta de sustratos diferentes a fenoles y arilaminas, incluyendo
lignina. Los mediadores pueden actuar como agentes donadores de electrones
debido a los radicales libres formados con la lacasa, expandiendo el rango de
sustratos para la enzima, tales como compuestos no-fenólicos e hidrocarburos
aromáticos policíclicos. Y (ii) su actividad óptima es generalmente a pH ácido, lo
que impide su uso en ambientes neutros. Técnicas de ingeniería genética permitirán
obtener lacasas recombinantes modificadas con alto potencial de oxidación, amplio
rango de sustratos, o pH neutro. Ello implicaría realizar mutagénesis dirigida en
lacasas cuyas estructuras cristalinas hayan sido estudiadas, o DNA “shuffling”
(mutagénesis al azar in vitro, seguida de selección).
Sin embargo, estas metodologías requieren un sistema de expresión con alta
eficiencia de transformación y alta capacidad de secreción de metaloenzimas
activas. Aunque todas las lacasas fúngicas poseen una estructura conservada en los
sitios activos, exhiben una alta diversidad en el resto de la proteína y en su parte
polisacárida, además de las isoformas producidas por muchos hongos (Mayer y
Staples, 2002). Esta compleja situación, junto con la falta de un método eficiente
de transformación para basidiomicetos, ha estimulado la búsqueda de organismos
heterólogos de expresión para incrementar la producción de lacasas y estudiar su
estructura y propiedades catalíticas. Algunas lacasas han sido expresadas en
Saccharomyces cerevisiae (Cassland y Jonson, 1999; Kojima et al., 1990; Larsson
et al., 2001), Pichia pastoris (Gelo-Pujic et al., 1999; Jonsson et al., 1997;
Otterbein et al., 2000), Trichoderma reesei (Saloheimo y Niku-Paavola, 1991),
Aspergillus oryzae (Berka et al., 1997; Ducros et al., 1997; Xu et al., 1999; Yaver
et al., 1996 y 1999), Aspergillus niger (Record et al., 2002) y Yarrowia lipolytica
(Madzak et al., 2005). En la actualidad se han obtenido las estructuras cristalinas
de:
(i)
25
lacasa inactiva (desglicosilada y sin cobre) de C. cinereus (Ducros et
al., 1998 y 2001);
1. Introducción
(ii)
(iii)
(iv)
lacasas activas de los basidiomicetes Trametes versicolor y P.
cinnabarinus (Antorini et al., 2001 y 2002; Piontek et al., 2002);
lacasa activa glicosilada de T. versicolor conjugada con un sustrato
(Bertrand et al., 2002);
lacasa del ascomicete Melanocarpus albomyces (Hakulinen et al.,
2002).
Para el diseño de lacasas con fines de aplicación industrial, el desarrollo de
eficientes sistemas de expresión permiten llevar a cabo estudios de mutagénesis
dirigida (Gelo-Pujic et al., 1999; Xu et al., 1998 y 1999) o evolución in vitro.
Además, un experimento DNA shuffling del gen de una lacasa requiere el análisis
de al menos 104 transformantes para obtener un mutante con las propiedades de
interés (Madzak et al., 2005). Por otra parte, con el fin de comparar los efectos de
varias mutaciones es necesario seleccionar transformantes con el mismo número de
copias y loci integrados.
1.7. GENÉTICA MOLECULAR DE
LOS HONGOS
PODREDUMBRE BLANCA DE LA MADERA (WRF)
DE
LA
1.7.1. Hongos modelo
P. chrysosporium ha servido de organismo modelo para estudios en genética
molecular de los hongos de la podredumbre blanca. Ello ha permitido establecer
metodologías para el estudio de su biología y maquinaria ligninolítica, tales como
producción de auxótrofos (Gold et al. 1982), análisis de recombinantes (Alic y
Gold, 1985; Raeder et al., 1989b; Krejci y Homolka, 1991; Gaskell et al., 1994),
purificación rápida de DNA y RNA (Haylock et al., 1985; Raeder y Broda, 1985),
expresión diferencial (Birch 1998; Kurihara et al., 2002; Assmann et al., 2003),
cariotipificación mediante electroforesis en campo pulsado (Gaskell et al., 1991;
D’Souza et al., 1993; Orth et al., 1994), y transformación genética mediante
complementación de auxótrofos (Alic et al., 1989,1990,1991; Alic, 1990; Randall
et al., 1991; Akileswaran et al., 1993; Zapanta et al., 1998) y por resistencia a
antibióticos (Randall et al., 1989,1991; Randall y Reddy, 1992; Gessner y Raeder,
1994; Ma et al., 2003). La eficiencia de transformación es relativamente baja y la
26
1. Introducción
ruptura de genes es difícil (Alic et al., 1993), aunque se han descrito algunos
estudios de expresión génica (Gettemy et al. 1997; Birch et al. 1998; Ma et al.,
2001). Algunos aspectos de la biología molecular de P. chrysosporium han sido
descritos en las revisiones de Alic y Gold (1991), Pease y Tien (1991), Gold y Alic
(1993), Cullen y Kersten (1996) y Cullen (1997).
P. ostreatus es otro organismo modelo de WRF utilizado para establecer protocolos
de transformación (Yanai et al., 1996; Honda et al., 2000; Irie et al., 2001;
Sunagawa y Magae, 2002) y metodologías de mapeo físico (Larraya et al., 1999) y
genético (Eichlerova y Homolka, 1999; Eichlerova- Volakova y Homolka, 1997;
Larraya et al., 2000, 2002). T. versicolor ha sido también transformado con
vectores de resistencia a antibióticos (Bartholomew et al., 2001; Kim et al., 2002a)
y ha permitido demostrar mutación génica (Dumonceaux et al., 2001).
El principal avance de investigación fue el obtenido por el US Department of
Energy’s Joint Genome Institute (JGI), quien ha sequenciado el genoma total de P.
chrysosporium. El ensamble de las secuencias aleatorias (“shotgun sequencing”) ha
dado un tamaño de 30 Mpb del genoma, el cual se encuentra disponible libremente
en la web (www.jgi.doe.gov/ whiterot). La cepa utilizada para la secuenciación fue
un derivado homocariótico (Stewart et al., 2000) del dicarion BKM-F-1767. La
comparación con otros genomas de hongos (por ejemplo, Neurospora crassa;
Kupfer et al., 1997) predijo aproximadamente 8500 proteínas con significativos
alineamientos Smith-Waterman. Tales proteínas solo podrán ser verificadas
mediante el análisis del cDNA.
De este modo, junto con el ascomycete N. crassa (Galagan et al., 2003), P.
chrysosporium es uno de los primeros genomas disponibles de hongos
filamentosos. La importancia de conocer la genética molecular de estos genomas
eucarióticos abre nuevas áreas de exploración relacionadas con la degradación de
la lignocelulosa y con los procesos evolutivos implicados.
Como se mencionó anteriormente, el genoma de P. chrysosporium no contiene
secuencias codificantes de lacasas. Sin embargo, alguna evidencia bioquímica ha
permitido detectar actividad lacasa (Podgornik et al., 2001). Recientemente, se han
descrito varias secuencias levemente relacionadas con ferroxidasas transportadoras
de hierro (Fet3), con ascorbato oxidasas y con lacasas. Una de esas secuencias, la
27
1. Introducción
mco1, ha sido caracterizada como una ferroxidasa extracelular (Larrondo et al.,
2003) pero su función no ha sido aclarada con certeza.
La ausencia de lacasas convencionales en P. chrysosporium no descarta su papel en
la degradación de lignina por otros hongos. Además de su actividad oxidativa sobre
unidades fenólicas de lignina a radicales fenoxi, se ha demostrado que en presencia
de ciertos mediadores, la lacasa puede despolimerizar lignina sintética (Kawai et
al., 1999) y deslignificar pulpa de madera (Bourbonnais et al. 1997; Call y
Muncke, 1997), confirmando de este modo su actividad ligninolítica. De otra parte,
frecuentemente los genes de lacasas se presentan como familias multigénicas
(Cullen 1997) y se distribuyen ampliamente entre los hongos degradadores de
lignina (Thurston 1994; Youn et al. 1995; Mayer y Staples, 2002). Los WRF, tales
como Pycnoporus cinnabarinus degradan eficientemente la lignina, y al contrario
de P. chrysosporium, secreta lacasas pero no peroxidasas. Dos genes de lacasas han
sido identificados y caracterizados en este hongo (Eggert et al. 1998; Temp et al.
1999). Además, un mutante “lac- ” de P.cinnabarinus fue incapaz de degradar DHP
marcado con C14. Estos datos confirman la importancia degradativa de la lacasa
(Eggert et al. 1997).
1.7.2. Regulación génica de las lacasas
La actividad lacasa en los basidiomicetos en general está codificada por varios
genes (Jönsson et al., 1995; Saloheimo et al., 1991). Los estudios de secuenciación
génica y del cDNA han puesto de manifiesto que la mayoría de las lacasas
muestran secuencias que suelen codificar para 520-550 aminoácidos incluido el
péptido de secreción y que existen secuencias muy conservadas como las
correspondientes a la unión del cobre (Thurston, 1994).
Generalmente, se ha descrito que los genes de lacasas son regulados
diferencialmente y los patrones de regulación difieren substancialmente entre
especies (Wahleithmer et al. 1995; Yaver y Golightly 1996; Yaver et al. 1996;
Smith et al. 1998; Palmieri et al. 2000; Soden y Dobson, 2001). Los transcritos de
la lacasa de P. radiata son rápidamente detectados en condiciones limitadas en
nitrógeno (Saloheimo y Niku-Paavola, 1991). En Trametes villosa, lcc1 es
fuertemente inducido en cultivos añadidos de 2,5-xylidina, mientras los niveles de
28
1. Introducción
transcritos de lcc2 no cambian. Por el contrario, experimentos Northern blots no
detectaron transcritos lcc3, lcc4, y lcc5 en todas las condiciones (Yaver y
Golightly, 1996; Yaver et al. 1996). Tres lacasas de Rhizoctonia solani (lcc1, lcc2,
1cc3) son transcritas en bajos niveles constitutivos y pueden ser reprimidas en
cultivos adicionados de p-anisidina. Sin embargo, la lcc4 de R. solani es expresado
en niveles muy altos, inducibles por adición de p-anisidina. En R. solani, los genes
lcc1, lcc2, lcc3 están agrupados, separados de lcc4, lo que sugiere una relación
entre la organización genómica y la regulación transcripcional (Wahleithmer et al.
1995). También se ha establecido una regulación transcripcional de las lacasas
inducibles por cobre y por otros metales (Karahanian et al., 1998; Palmieri et al.,
2000; Soden y Dobson, 2001; Galhaup et al., 2002).
1.8. PHANEROCHAETE FLAVIDO-ALBA
De acuerdo a la página web del National Center for Biotechnology Information,
National Library of Medicine, Bethesda, MD, USA, P. flavido-alba es un
microorganismo del Reino Fungi, Phylum Basidiomycota, Clase Hymenomycetes,
Orden Aphyllophorales, Familia Corticiaceae.
P. flavido-alba fue seleccionado por nuestro grupo de investigación de entre otros
WRF por su capacidad de decolorar el 90% del color soluble en residuos de la
industria papelera frente al 80% de decoloración que alcanzó P. chrysosporium
(Pérez et al., 1997).
Hasta el momento se han detectado en cultivos de P. flavido-alba actividades
peroxidasas (LiP y MnP) y lacasa. Al menos se producen 5 isoenzimas de LiP de
pIs entre 3.2 y 3.9 y una masa molecular comprendida entre 30 y 40 kDa, muy
parecidas a las descritas en P. chrysosporium (Ben Hamman et al., 1997 y 1999a).
La lacasa resulta especialmente interesante por su masa molecular de 98,5 kDa y pI
menor de 3.5 (Pérez et al., 1996).
En cuanto a las aplicaciones biotecnológicas nuestro grupo ha demostrado la
capacidad de P. flavido-alba para eliminar la toxicidad del alpechín (Martínez et
al., 1998), transformar las mezclas aromáticas típicas del alpechín (Madrid et al.,
29
1. Introducción
1995) y decolorar tanto el pigmento mayoritario del alpechín como el propio
alpechín (Tabla 1) (Ben Hamman, 1998).
Tabla 1. Composición de fenoles de la Polimerina (Capasso et al., 2002) y comparación
con la fracción polimérica oscura (PMA) del OMW (Pérez et al., 1987), determinados por
oxidación con CuO y HPLC.
Fenoles
30
Polimerina
PMA
Hidroxitirosol
-
-
Acido 3,5-dihidroxibenzoico
+
-
Acido 3,4-dihidroxifenilacético
-
-
Catecol
+
-
p-tirosol
-
+
Acido p-hidroxibenzoico
+
+
Acido vainíllico
+
+
p-hidroxibenzaldehido
+
+
Acido siringico
-
+
Acido 2,3-dihidroxibenzoico
-
-
Vainillina
+
+
Acido p-hidroxipropiónico
-
+
Metilcatecol
-
-
Siringaldehido
+
+
Acido p-cumárico
+
+
Acido ferúlico
+
+
Acido salicílico
+
-
1. Introducción
Igualmente, se demostró que P. flavido-alba transforma eficazmente la mezcla de
ácidos fenólicos del alpechín. En la degradación de estos compuestos parecen estar
implicadas las peroxidasas ligninolíticas, ya que la transformación es más eficaz en
cultivos inducidos para la producción de LiP y en menor medida en los cultivos
que estimulan la producción de MnP. Sin embargo, los concentrados de LiP,
muestran un insignificante efecto degradador de esta mezcla, sugiriendo que
además de éstas pueden estar implicadas otras enzimas o metabolitos producidos
por el hongo (Madrid et al., 1995).
La decoloración del alpechín por P. flavido-alba está asociada a modificaciones en
la distribución de tamaños moleculares de los componentes del pigmento,
concretamente provoca la pérdida del componente o componentes de mayor
tamaño molecular (Ben Hamman et al., 1999b). Esto sugiere que la decoloración
por P. flavido-alba es un proceso en el que ocurre, bien la despolimerización de los
componentes de mayor tamaño o la repolimerización de los de menor tamaño
molecular, lo que a su vez provoca la acumulación de moléculas de tamaños
intermedios. También se comprobó que la decoloración del alpechín va
acompañada de una disminución del 90% en su contenido fenólico y de su
destoxificación (Martínez et al., 1998; Ben Hamman, 1998).
Pérez et al. (1998) han caracterizado las enzimas ligninolíticas presentes en los
sobrenadantes de cultivos de alpechín decolorados. Al comparar los patrones de
enzimas extracelulares en estos cultivos decolorados con los cultivos control no
adicionados del residuo, comprobaron que el alpechín modifica significativamente
las MnPs producidas. Así mismo, se puso de manifiesto que la lacasa es
fuertemente inducida por el residuo. En ningún caso detectaron actividad LiP ni
ninguna proteína de masa molecular entre 39-40 kDa, que es el tamaño molecular
aparente de las LiPs de P. flavido-alba. Parece por tanto, que las MnPs y la lacasa
podrían ser las enzimas ligninolíticas implicadas en este proceso de transformación
del alpechín.
La producción de lacasa de P. flavido-alba es afectada por compuestos aromáticos
(Figura 7, Tabla 2). Altas producciones de lacasa se obtuvieron en cultivos
añadidos de p-hidrobenzaldehido o vainillina, mientras que con otros inductores
(por ejemplo, veratril alcohol, guaicol o ácido ferúlico) los niveles de actividad no
fueron significativamente diferentes a los del cultivo control.
31
4H3MBA
4HBNZA
3,4DMB
4H3MB
4HBENZ
4H3MCIN
2-MPHE
3,4-DHCIN
3,4-DMO
BENZ
3,4,5-TMB
3,4-DHB
CONT
3,4,5-THB
4HCIN
Crecimiento
Actividad Lacasa
1. Introducción
Figura 7. Efecto de la adición de compuestos aromáticos sobre el crecimiento y la
actividad lacasa de P. flavido-alba. Crecimiento (columnas blancas) se expresa en % de
peso seco respecto al cultivo control (CONT). Actividad específica (columnas grises) se
expresa en proporción respecto al cultivo control. (Tomado de De la Rubia et al., 2002).
Tabla 2. Compuestos aromáticos utilizados para inducir la actividad lacasa (Fig. 7) en
cultivos de P. flavido-alba.
Símbolo
4HCIN
Símbolo
2MPHE
Aromático
guaiacol
4H3MCIN
ácido ferúlico
4HBENZ
4H3MB
ácido
p-hidroxibenzoico
ácido vainíllico
BENZ
Acido
protocatéquico
3,4,5-ácido
trimetoxibenzoico
ácido benzoico
3,4DMB
ácido verátrico
3,4DMO
veratril alcohol
4HBNZA
p-hidroxibenzaldehido
3,4DHCIN
ácido caféico
4H3MBA
vainillina
3,4,5THB
3,4DHB
3,4,5TMB
32
Aromático
Acido
p- cumárico
ácido gallito
1. Introducción
La proteína purificada mostró un espectro de absorción típico de proteínas tipo
multicobre y un rango de actividad oxidativa en ABTS a un pH óptimo común a
otras lacasas. Oxidó o-y p- difenoles (catecol, hidroquinona) y fenoxi-ácidos, pero
no oxidó tirosina; también mostró mayor afinidad a metilhidroquinona y derivados
dimetoxi (DMPs), no tanto para los monometoxilados. Las características físicoquímicas de la lacasa inducida son similares a la constitutiva en cuanto a pI (2.8–
3.5), secuencia N-terminal y masa molecular (98.7 kDa y 81.3 kDa desglicosilada),
pero poco similares a lacasas típicas, especialmente en su secuencia N-terminal,
alta masa molecular, alto porcentaje de glicosilación y altos Km. Igualmente,
algunas particularidades de esta lacasa han sido encontradas, tales como oxidación
de Mn II (De la Rubia et al., 2002) y oxidación de Fe II (Lucas et al., 2005), lo que
sugiere que esta enzima posee otras características especiales para su estudio y
aplicación biotecnológica.
En experimentos previos a la realización de este trabajo, nuestro grupo de
investigación obtuvo una sonda de cDNA de 141 pb (llamada sonda “pp12”).
(Figura 8). La secuencia “pp12” contiene los sitios de unión al cobre L3 y L4 de P.
flavido-alba que corresponden con los mismos sitios conservados de lacasas de
diferentes hongos basidiomicetos y que están ubicados cerca al dominio Cterminal. Con esta sonda se detectó por hibridación un fragmento XbaI de 4 kb de
gDNA de P. flavido-alba.
5`ACTAGTGATTCATCCTTTCCATTTTCATGTCATAGCCCCTGGATCCTCGGCTTCGACTCGACAACATA
CCAAGGCCAGACTCCTAACCCGACCAACCCGTTGAGGCGTGACACCTTCGTCGCCGAGCGTGGATGGCTT
ATGCTGCGCTACATCTCCGACAACCCCGGTCCCTGGATCCTGCACTGCCACATAGAATCCCGCGGCCATG
GCGGCGGAGCATGCGACGTCGGGCCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAATT-3`
HPLHFHGHSPWILGFDSTTYQGQTPNPTNPLRRDTFVVPSGGWLMLRYISDNPGPWILHCHI
Figura 8. Amplicón pp12 (cDNA y péptido) obtenido por RT-PCR de cultivos de P.
flavido-alba utilizando los “primers” correspondientes a los sitios consenso L3 y L4 de las
lacasas (Kumar et al 2003; aminoácidos subrayados).
33
1. Introducción
1.9. OBJETIVOS
En virtud del conocimiento actual de la lacasa de P. flavido-alba y dada su
potencial aplicación ambiental, el presente trabajo se propuso identificar y
caracterizar la secuencia génica que codifica dicha enzima. Dentro de este amplio
objetivo se planteó:
1. Caracterizar el gen de la lacasa tanto a nivel del genoma como del
transcriptoma del hongo;
2. Analizar la regulación de la expresión del gen en cultivos in vitro por
moléculas de interés medioambiental: el pigmento polimérico del alpechín,
fenoles monoméricos (vainillina, ácido ferúlico y tirosol) y metales (Fe y Cu).
Además la lacasa de P. flavido-alba y las proteínas mas semejantes (las
MCOs de P. chrysosporium) se han diferenciado filogenéticamente de lacasas
y ferroxidasas fúngicas.
34
2. Materiales y Métodos
2. Materiales y Métodos
36
2. Materiales y Métodos
2.1.
MICROORGANISMOS Y VECTOR
2.1.1. Origen y mantenimiento del hongo
En este trabajo se ha utilizado el hongo Phanerochaete flavido-alba FPL 106507,
cepa procedente de la colección del Forest Products Laboratory de Madison, WI,
USA.
El hongo fue cultivado a 30ºC durante 7 días en agar YMPG (“Yeast-MaltPeptone-Glucose) (Bonnarme y Jeffries, 1990) y conservado a 4ºC con resiembras
periódicas.
2.1.2. Cepa de Escherichia coli
La cepa de Escherichia coli utilizada en este trabajo fue XL1-Blue (Stratagene).
Esta cepa es de alta eficiencia para la transformación de DNA plasmídico y permite
la selección de clones recombinantes mediante la detección de actividad βgalactosidasa.
2.1.3. Vector
pGEM®-T (Promega): Plásmido de pequeño tamaño y elevado número de copias,
diseñado para clonar fragmentos de ADN procedentes de reacciones de PCR. Este
vector posee el gen que confiere resistencia al antibiótico ampicilina así como el
gen que codifica la β-galactosidasa de E.coli, la cual permite la identificación de
clones recombinantes.
2.2.
MEDIOS DE CULTIVO
2.2.1. Medios de cultivo para el hongo
2.2.1.1. Medio YMPG (Bonnarme y Jeffries, 1990)
Este medio se usó para el crecimiento del hongo en medio sólido, en la preparación
de inóculos y para aislamiento de DNA genómico. Su composición por litro es la
siguiente:
37
2. Materiales y Métodos
Glucosa
10 g
Extracto de malta
10 g
Peptona
2g
Extracto de levadura
2g
Asparagina
1g
KH2PO4
2g
MgSO4 7H20
1g
Tiamina hidrocloruro 1 mg
Agar
20 g
Ajustar el pH a 4,5 con HCl concentrado. Autoclavar a 121ºC 20 minutos.
2.2.1.2. Medio BL
El medio basal para la lacasa o medio BL es una modificación del medio basal
descrito por Kirk et al. (1986) en la concentración de la fuente de nitrógeno:
tartrato amónico 22mM; no se adicionaron aditivos como el Tween 20 y el alcohol
veratrílico, y se omitió el MnSO4 de la solución de elementos traza. La
composición por litro es la siguiente:
Glucosa
10 g
Tartrato amónico
2 g (22 mM)
Tartrato de sodio
20 mM (pH 4.5)
KH2PO4
2g
MgSO4.7H20
0,5 g
CaCl2 . 2H20
0,1 g
Tiamina hidrocloruro
1 mg
Solución de elementos traza sin MnSO4 70 ml
38
2. Materiales y Métodos
La composición de la solución de elementos traza (por litro):
Acido nitriloacético 1,5 g (pH 6,5)
MgSO4 .7H20
3,0 g
NaCl
1,0 g
FeSO4. 7H20
0,1 g
CoSO4
0,1 g
CaCl2. 2H20
0,1 g
ZnSO4 . 7H20
0,1 g
CuSO4 . 5H20
0,01 g
AlK(SO4)2 . 12H20
0,01 g
H3BO3
0,01 g
Na2MoO4 . 2H20
0,01 g
Las dos soluciones se autoclavaron por separado a 121ºC durante 20 minutos,
posteriormente se mezclaron en las cantidades señaladas. Finalmente se adicionó
1ml de solución de tiamina (stock de 1mg/ml) previamente esterilizada por
filtración.
2.2.2. Medio de cultivo de bacterias
Medio Luria-Bertani (LB) (Sambrook y Russell, 2001).
Se utilizó como medio de cultivo rutinario para el crecimiento de Escherichia coli
tras el proceso de transformación. La composición por litro:
Triptona
Extracto de levadura
10 g
5g
NaCl
10 g
Agar (para medio sólido)
15 g
El medio líquido y sólido se esterilizó en autoclave a 121ºC durante 20 minutos.
39
2. Materiales y Métodos
2.3.
CULTIVO Y MANIPULACIÓN DEL HONGO
2.3.1. Obtención de inóculos
Para la preparación de los inóculos, se utilizaron matraces Erlenmeyer de 1000 ml,
cada uno con 100 ml de medio YMPG líquido inoculado con micelio crecido en
YMPG sólido. Los cultivos fueron incubados en reposo a 30ºC. Tras 15 días de
crecimiento el micelio obtenido se trituró en esterilidad con una batidora (Waring
Blender) durante 10 seg. La suspensión obtenida fue utilizada como inóculo al 5%
en el volumen del medio a inocular.
2.3.2. Cultivos para aislamiento de DNA
Para el aislamiento del DNA genómico, se prepararon cultivos de 25 ml de YMPG
en matraces Erlenmeyer de 250 ml. inoculados como se describió en el apartado
anterior. Los cultivos se incubaron durante 7 días a 30 °C. El micelio de cada uno
de los matraces se obtuvo por filtración (filtros Nº 1238), se congeló rápidamente
en nitrógeno líquido y se almacenó a -80ºC hasta su uso.
2.3.3. Cultivos inducidos para aislamiento de RNA
2.3.3.1. Inducción por fenoles
Se prepararon cultivos en matraces de 250 ml con 25 ml de medio BL con los
inductores de la lacasa - aromáticos fenólicos simples y pigmento polimérico de los
residuos de las almazaras (PMA)- que fueron inoculados como en el apartado
anterior e incubados a 30ºC en reposo. A los tres días de incubación se adicionaron
los inductores a los cultivos.
De acuerdo con Ben Hamman (1998), el PMA (pigmento polimérico del alpechín)
se disolvió en agua destilada y se adicionó a una concentración final de 8,3 g/l (5
réplicas).
Los inductores fenólicos monoméricos usados fueron vainillina, ácido ferúlico y
tirosol (Fluka). Su elección se basó en estudios previos sobre la oxidación de
componentes fenólicos del alpechín por Phanerochaete flavido-alba (Ben Hamman
40
2. Materiales y Métodos
et al. 1999a y 1999b ; Pérez et al. 1996; de la Rubia, et al. 2002). Los fenoles
monoméricos se disolvieron en N,N-dimetilformamida: agua (3:7 v/v), se
esterilizaron en autoclave y se adicionaron separadamente a una concentración
final de 1mM (5 réplicas por solución).
Igualmente, se prepararon dos grupos de cultivos control (cultivos sin y con N,Ndimetilformamida) según los solventes usados en la preparación de las soluciones
del PMA y de inductores aromáticos.
Los cultivos con los inductores añadidos se incubaron a 30°C durante otros tres
días más. El micelio de cada uno de los cultivos se obtuvo por filtración rápida
(filtros Nº 1238), se congeló en nitrógeno líquido y se almacenó a -80ºC hasta su
uso. La actividad lacasa se determinó en los fluídos extracelulares en cada uno de
los cultivos.
2.3.3.2. Inducción por hierro y cobre
Para este estudio se utilizaron tres tipos de medios de cultivo BL (control de
metales), BL sin FeSO4 y BL sin CuSO4. La inoculación de estos cultivos fue
similar a la del ensayo anterior.
Al tercer día de crecimiento del hongo, tres cultivos en el medio BL sin FeSO4 se
les añadió quelante del hierro, ”BPS” (batofenantrolinadisulfonato sódico) a 1 mM
y a otros tres se les añadió sulfato ferroso amónico: (SO4)2Fe(NH4)2 a 25 µM.
Un lote de tres cultivos en medio BL sin CuSO4 se les añadió quelante de cobre
“BCS” (batocuproinadisulfonato sódico) a 1mM. Otro lote de tres cultivos se le
añadió CuSO4 24 µM.
Después de incubar con las sales a 30ºC durante tres días adicionales, el micelio de
cada uno de los cultivos se recuperó por filtración, se congeló en nitrógeno líquido
y se almacenó a -80ºC hasta su uso. La actividad lacasa se midió en los fluídos
extracelulares de cada uno de los cultivos.
41
2. Materiales y Métodos
2.4.
ANALISIS ENZIMÁTICOS
2.4.1. Cuantificación de proteínas
La concentración de proteínas de los sobrenadantes de los cultivos se midió por el
método de Bradford (1976) utilizando el reactivo y el procedimiento de Bio-Rad
Protein Asssay en un espectrofotómetro Cintra 10e a 595 nm, teniendo en cuenta la
capacidad de unión del colorante Azul de Coomassie a dichas moléculas. La
absorción a 595 nm se transformó en µg/ml de sobrenadante, utilizando la
extrapolación en una ecuación de regresión lineal estandarizada con albúmina de
suero bovino (Sigma).
2.4.2. Cuantificación de la actividad lacasa
La actividad lacasa se determinó mediante la oxidación del sustrato ABTS [2,2´azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato)]. La mezcla de reacción contenía 4,6
mM ABTS, tampón glicina/NaCl (50 mM /20 mM, pH 3,0), una alícuota de 200 µl
de la muestra y agua destilada hasta 1 ml. La oxidación del ABTS (CЄ = 29,3 mM-1
cm-1) se midió mediante el incremento en Absorbancia a 436 nm (Niku-Paavola et
al., 1988)
Una mU de actividad lacasa se definió como la cantidad de enzima requerida para
la oxidación de 1 nmol de ABTS por minuto a 30°C. La actividad específica se
determinó como mU`s de actividad por mg proteína o por mg de peso seco de
micelio. Las medidas de peso seco fueron obtenidas de tres micelios que se secaron
durante 24 h a 105ºC.
2.5.
MÉTODOS DE ANÁLISIS DE ÁCIDOS NUCLÉICOS
2.5.1. Aislamiento del DNA genómico
Siguiendo la metodología de Sambrook y Russell (2001) y González et al., (1992),
el DNA genómico de P. flavido-alba se aisló y purificó del siguiente modo:
400 mg de micelio de cultivos en medio YMPG congelado a -80ºC, se
trituraron con mortero y pistilo en nitrógeno líquido.
42
2. Materiales y Métodos
Adición de tampón de lisis HSE1 y 0,1 volúmenes de SDS 10%. La mezcla
se incubó a 65ºC durante 15 minutos.
Adición de 1 volumen de tampón TE2.
El lisado se mezcló con un volumen de fenol:cloroformo:alcohol
isoamílico (25:24:1) (Sigma), se centrifugó a 5000 rpm y se recuperó la
fase acuosa. El tratamiento con fenol se repitió hasta obtener una fase
acuosa limpia.
Adición de 0,1 volúmenes de acetato sódico 3M pH 5,2 y 2 volúmenes de
etanol absoluto.
Precipitación del DNA a -20ºC durante 30 minutos.
Centrifugación en frío a 15000 rpm durante 15 minutos.
Lavado del precipitado con 500 µl de etanol 70% y centrifugación a 15000
rpm durante 5 minutos.
Secado al vacío y resuspensión en 100 µl de agua MilliQ estéril.
Para eliminar restos de RNA se adicionó 1 µl de RNasa libre de DNasa de
una solución stock (10 mg/ml) y se incubó a 37ºC durante 20 min.
El DNA genómico se cuantificó espectrofotométricamente midiendo la absorbancia
(A260) de una dilución de la muestra en TE. La concentración se calculó teniendo
en cuenta que una unidad de absorbancia equivale a 50 µg/ml de DNA de doble
cadena. Valores entre 1,7 y 2 de la relación A260/A280 permitieron determinar la
pureza de la muestra. El DNAg se separo mediante electroforesis horizontal en gel
de agarosa al 0,7%. La muestra se mezcló con el tampón de carga3 en una relación
5:1 y el potencial aplicado fue de 50-90 voltios. Tras tinción del gel con una
solución de bromuro de etidio (0,5 µg/ml) durante 20 minutos, la banda del DNAg
intacto se visualizó y fotografió en un procesador de imágenes (Bio Rad) con luz
ultravioleta conectado a un ordenador, usando el programa Quantity One de Bio
Rad. Se utilizaron los marcadores de peso molecular de Roche DNA λ digerido con
Hind III (marcador II) y DNA λ digerido con Eco RI y Hind III (marcador III).
1
HSE: Hepes 10mM pH 6,9, Sacarosa 0,5M y EDTA 20mM
TE: Tris-HCl 50mM pH 8 y EDTA 20mM
3
Tampón de carga: azul de bromofenol 0.25%, sacarosa 40%
2
43
2. Materiales y Métodos
2.5.2. Aislamiento del DNA plasmídico de Escherichia coli
Cultivos de células crecidas en medio LB durante 16 horas, se precipitaron por
centrifugación a 13000 rpm, desechando el sobrenadante. El plásmido se aisló
mediante el kit “Quantum Prep® Plasmid Miniprep Kit” (Bio Rad), siguiendo las
indicaciones del fabricante. Tras electroforesis el plásmido se identificó por
comparación con el tamaño de los marcadores II y III (Roche) en un gel de
agarosa al 0,7%. La cuantificación y la pureza del DNA se determinaron como en
el apartado anterior.
2.5.3. Aislamiento de RNA
El RNA total fue extraído y purificado del micelio crecido en medio BL mediante
el “RNeasy Plant mini kit” (Qiagen), siguiendo las indicaciones del fabricante, que
se describen brevemente.
100 mg de micelio se congeló en nitrógeno líquido y se maceró hasta un
polvo fino con mortero y pistilo previamente tratados con NaOH (0,1 M),
EDTA (1 mM) y H2O libre de RNasas.
Adición de tampón lisis RLC®/β-mercaptoetanol (450 µl/5µl) y agitación
vigorosa.
Homogenización de la muestra a través de una columna “QIAshredder”y
centrifugación 2 minutos a velocidad máxima.
El filtrado se mezcló con 0,5 volúmenes de etanol.
Unos 700 µl del filtrado se colocaron en una minicolumna “RNeasy” y se
centrifugó 15 seg a 10000 rpm para adherir el RNA a la membrana de
silica-gel.
Lavado de la membrana dos veces con tampón RW1® (500 µl) y
centrifugación a 10000 rpm durante 15 segundos.
Lavado de la membrana con tampón RPE® (500 µl) y centrifugación a
velocidad máxima durante 2 minutos.
Una vez seca la membrana, el RNA se eluyó dos veces con 50 µl de agua
MilliQ libre de RNasas.
El RNA total se cuantificó por espectrofotometría a 260 nm y la concentración se
calculó teniendo en cuenta que 40 µg/ml equivalen a una unidad de absorbancia. La
integridad del RNA se verificó por electroforesis en gel de agarosa al 0,8%
seguida de tinción con bromuro de etidio. El RNA total se usó para la síntesis de
44
2. Materiales y Métodos
cDNA. El sistema de revelado fue el mismo que el utilizado para el DNA
genómico.
2.5.4. Amplificación de DNA genómico
2.5.4.1. Amplificación por PCR
Esta técnica se utilizó para la amplificación del DNA genómico (F21).Las
reacciones se realizaron en un termociclador Perkin Elmer 9600. Se preparó una
mezcla de reacción que contenía 1 µl de DNA genómico (10 ng/ µl), 5 µl de
tampón de PCR 10x (Biotools), 2 µl de MgCl2 (50 mM), 1 µl de cada uno de los
desoxinucleósidos trifosfatos (10 mM), 1 µl de cada uno de los cebadores (20 pM)
franLac1 y franLac3R (Tabla 3) diseñados a partir de la secuencia pp12 (Fig. 8), 1
µl de DNA polimerasa (1 U/ µl) (Biotools) y agua MilliQ hasta un volumen de 50
µl.
Las condiciones fueron las siguientes: un ciclo de desnaturalización a 95ºC durante
5 minutos, hibridación de los cebadores a 55ºC durante 30 segundos y elongación a
72ºC durante 20 segundos; 35 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30
segundos, hibridación de cebadores a 55ºC durante 30 segundos y elongación a
72ºC durante 20 segundos. La amplificación se concluyó con una incubación final
de 5 min a 72ºC.
Una alícuota de 5 µl de la reacción de PCR y 3 µl de un marcador de DNA de 100
pb de tamaño (Biotools) se sometieron a una electroforesis en gel de agarosa al
3%. La electroforesis se desarrolló a 80 V en tampón TAE4 durante 45 min. Los
amplicones se visualizaron con luz UV tras su tinción con bromuro de etidio.
2.5.4.2. Amplificación por PCR Inversa Ochman et al. (1990)
El DNA genómico (300 ng) se digirió con una de las enzimas de restricción
previamente seleccionadas (Xba I y Xho I, apartado 1.8) durante 3 h a 37°C en un
4
TAE: Tris-acetato 40mM pH 8 y EDTA 1mM
45
2. Materiales y Métodos
volumen de 25 µl. La enzima se inactivó a 65ºC durante 15 min. La muestra
digerida se circularizó en 100 µl de tampón 10x y T4 DNA ligasa según las
indicaciones del fabricante (New England Biolabs). La mezcla obtenida se dializó
en membranas de nitrocelulosa de 0,025 µm durante 15 minutos en agua MilliQ.
Para la amplificación se usó “GeneAmp XL PCR kit” (Applied Biosystems).
Siguiendo sus recomendaciones, en un tubo de 200 µl se agregó: 1 µl de DNA
religado, 15 µl de tampón de PCR 3,3x, 4µl de la mezcla de dNTPs 10 mM, 0,4 µl
de cada cebador 100 µM (AFPINV1 y AFPINV2) diseñados a partir del
fragmento F21 (Tabla 3, apartado 2.11.3) , 4 µl de acetato de Magnesio 25 mM, 1
µl de DNA polimerasa rTth (2U/µl) (Applied Biosystems) y agua MilliQ hasta un
volumen de 50 µl. La amplificación se realizó en un termociclador Mastercycler
(Eppendorff) con el siguiente programa: desnaturalización inicial a 95ºC durante 2
minutos, 16 ciclos de desnaturalización a 95ºC durante 30 segundos, hibridación y
extensión de cebadores a 68ºC durante 4 minutos; 12 ciclos de desnaturalización a
95ºC durante 30 segundos, hibridación y extensión de cebadores a 68ºC durante 4
minutos con aumentos de 15 segundos en cada ciclo; y una extensión final a 72ºC
durante 10 minutos. El resultado de la amplificación se comprobó por
electroforesis de una alícuota de 5 µl en agarosa al 0,7%, se tiñó con bromuro de
etidio y se visualizó con luz ultravioleta. El resto de la muestra se desalinizó en una
columna Microcon-100 (Amicon®).
2.6.
Síntesis del cDNA mediante RT-PCR
2.6.1. Transcripción Reversa (RT)
La RT se realizó con 25 U de “AccuScript RT” (Stratagene) a 42ºC durante 1 h en
20 µl de una mezcla con 1 µg de RNA total, 1x de tampón RT, 10 mM de
ditiotreitol (DTT), 1 mM de cada dNTP y 6 ng/µl de oligo-dT.
2.6.2. Amplificación del cDNA (cPCR)
La primera cadena de cDNA fue amplificada en alícuotas de 50 µl mediante tres
reacciones consecutivas de PCR con la DNA polimerasa Pfu Ultra HF®
(Stratagene), usando cebadores diseñados del gDNA (Tabla 3, apartado 2.11.3) y
en condiciones establecidas en el protocolo del “kit AccuScript High Fidelity RTPCR System” (Stratagene).
46
2. Materiales y Métodos
Los tres fragmentos amplificados fueron:
cDNA -3`: desde el sitio consenso L3 de la lacasa (Kumar et al., 2003)
hasta la cola poliA con los cebadores y Lacfin1 (directo) y dTCA
(reverso).
cDNA-5`: desde 5`-UTR hasta N-terminal de la proteína extracelular con
los cebadores In1 (directo) y Nup1 (reverso)
cDNA interno: desde el sitio N-terminal hasta el sitio L3 con los cebadores
LacN3 (directo) y Lac3up (reverso).
Los productos de amplificación se comprobaron en una electroforesis en agarosa al
2.0% usando alícuotas de 5 µl y se visualizaron como en el apartado 2.5.1. El resto
de los productos de cPCR se purificaron en columnas Microcon 100 (Amicon®).
2.7.
Ligación de los productos de amplificación en pGEM®-T
Alícuotas de los fragmentos de cDNA purificados se incubaron por separado en
una mezcla de ligación (Promega) con el vector de clonación pGEM®-T durante 12
horas a 4ºC. La mezcla contenía tampón de ligación 2x, 50ng de Vector pGEM®-T,
producto de cPCR, 1 µl de T4 DNA ligasa (Promega) y agua MilliQ en un
volumen final de 10 µl.
2.8.
Transformación de células de Escherichia coli XL1-Blue
2.8.1. Obtención de células electrocompetentes
El inóculo se obtuvo de un cultivo de la cepa crecido en 5 ml de LB adicionado con
10 µl de una solución de tetraciclina (10mg/ml). Tras 24 horas, 300 µl de este
cultivo se usó de inóculo a 30 ml de LB. Se incubó a 37º en agitación hasta que la
densidad óptica del cultivo a 600nm fue de 0,6.
Las células se recuperaron por centrifugación a 4000 rpm durante 15 minutos a 4º
C. Se desechó el sobrenadante y las células fueron resuspendidas en 30 ml de agua
MilliQ estéril y fría. Se repitió la centrifugación y el lavado.
47
2. Materiales y Métodos
Se recuperaron las células por centrifugación y se resuspendieron en 15 ml de agua
MilliQ, estéril y fría. Se centrifugaron y se desechó el sobrenandante. Las células
se resuspendieron en 600 µl de glicerol (10%) estéril y frío y se centrifugaron
nuevamente.
Finalmente, las células se resuspendieron en 100 µl de glicerol (10%) y se
transformaron.
2.8.2. Transformación de células electrocompetentes
100 µl de células electrocompetentes se mezclaron con 10 µl del vector en una
cubeta de eletroporación (Genotronics-F-620), la cual se colocó en un
electroporador (Bio-Rad) y se aplicó un pulso de 2500 voltios. Se sacó la muestra y
se colocó en un tubo eppendorff de 1,5 ml, donde se adicionó 890 µl de medio LB.
El minicultivo se incubó a 37°C durante 2 horas. Posteriormente, se tomaron
alícuotas de 20, 50 y 100 µl de las células transformadas, las cuales se sembraron
en placas de agar-LB añadido con 40 µl de ampicilina (100 mg/ml), 4 µl de IPTG5
(200mg/ml) y 40 µl de X-Gal (2%). Las placas se incubaron a 37°C durante 12
horas.
Los clones transformados fueron identificados por coloración y resistencia a la
ampicilina, y se seleccionaron siguiendo los procedimientos de Sambrook y
Russell (2001).
2.9.
Secuenciación de ácidos nucleicos
Los productos de amplificación o de clonación, previamente purificados y
cuantificados, se secuenciaron utilizando el producto comercial ABI PRISMTM
(Perkin-Elmer) que utiliza en la reacción de extensión la enzima AmpliTaq FS en
un secuenciador automático Applied Biosystems modelo 373 STRECHT por el
Servicio de Secuenciación del Instituto de Parasitología y Biomedicina López.Neyra (CSIC, Granada). La determinación de la secuencia se realizó mediante el
5
IPTG: isopropil tio-β-D-galactósido
48
2. Materiales y Métodos
método de terminadores de cadena marcados con fluorocromos (Sanger et al.
1997).
La extensión de secuencias clonadas en pGEM®-T se realizó en ambos sentidos
con los cebadores universales SP6 (5´-ATTTAGGTGACACTATAGAA-3´) y T7 (5´TAATACGACTCACTATAGGG-3´). Para el caso de productos de amplificación, la
extensión del DNA a secuenciar se realizó con el cebador específico (Tabla 3). La
muestra a secuenciar se añadió con 6,4 pMol del cebador y agua MilliQ (volumen
final de 12 µl).
2.10. Cuantificación de la expresión del gen pfaL mediante QPCR en Tiempo
Real
2.10.1. Síntesis del cDNA
La síntesis del cDNA se realizó a partir de 0,5 µg de RNA total usando la reversotranscriptasa “Multiscribe RT” (Applied Biosystems) según las condiciones del
fabricante, que se detallan a continuación: Mezclar en un tubo de microcentrífuga 5
µl de tampón RT 10x, 2 µl de dNTPs 25x, 5 µl de cebadores aleatorios 10x, 2,5 µl
de enzima 50 U/µl, 0,5 µg de RNA total y agua DEPC hasta 50 µl. La reacción se
incubó 10 min a 25ºC y 120 min a 37ºC.
2.10.2. PCR
Las PCRs cuantitativas a tiempo real se realizaron en el termociclador ABI PRISM
7700 Sequence Detection System. Cada reacción contenía 1 µl de cDNA (dilución
de 5ng/µl), 10 µl TaqMan Universal PCR Master Mix 2x, 1 µl de la mezcla de
cebadores específicos y sonda TaqMan marcada con FAM 20x, y agua DEPC
hasta un volumen de 20 µl. El programa de PCR consistió de 50ºC/2 min, 95ºC/10
min, 40 ciclos de 95ºC/15 seg y 60º/1 min.
La eficiencia de la amplificación se determinó mediante correlación lineal entre
diluciones seriales del molde desde 0,1 ng hasta 20 ng versus ciclos umbral de
PCRs, lo cual pudo representarse en una curva de regresión. Se consideran válidas
aquellas correlaciones por encima del 90% y valores E (E=10-1/pendiente) cercanos a
2.
49
2. Materiales y Métodos
Las cuantificaciones se realizaron a partir de cuatro reacciones de PCR
independientes. El ciclo umbral (Ct) es el ciclo en el que comienza a detectarse el
amplicón y fue calculado por el software de Applied Biosystems (MACRO) que
acompaña al equipo de PCR en tiempo real. Los resultados se normalizaron con los
niveles de Ct obtenidos para el gen control endógeno (rDNA 18S de Applied
Biosystems). Los niveles de expresión relativa de transcrito pfaL se calcularon
usando el método Delta-Delta (Livak y Schmittgen, 2001), que se resume en la
siguiente expresión matemática:
Niveles de expresión =
Donde:
Exp. gen/Exp.basal gen
Exp.endógeno/Exp.basal endógeno
= 2 -∆∆ Ct
∆ Ct = Ct (diana) – Ct (referencia)
∆∆ Ct = ∆ Ct – ∆ Ct (calibrador)
El calibrador fue la muestra que se usó para comparar.
2.11. Métodos bioinformáticos
2.11.1. Identificación de secuencias en bases de datos
Para la búsqueda de secuencias homólogas a las de la lacasa de P. flavido-alba,
depositadas en las bases de datos del Genbank, se usó el algoritmo de
alineamientos Blast, a través del servidor del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
y del EMBL (http://www.ebi.ac.uk/), y la base de datos del genoma de
Phanerochaete chrysosporium (http://genome.jgi-psf.org/whiterot).
2.11.2. Comparación de secuencias
Los productos de secuenciación se analizaron con el programa Chromas
(www.technelysium.com.au) y FASTA y se alinearon con múltiples secuencias de
las bases de datos mediante el software ClustalW (www.ebi.ac.uk/clustalw).
50
2. Materiales y Métodos
2.11.3. Diseño de cebadores
Los cebadores específicos (Tabla 3) para amplificación y secuenciación del gen de
la lacasa se diseñaron manualmente. Los cálculos de Tm, %GC, dimerización y
estructuras secundarias fueron determinados en el analizador de oligonucleótidos
de Sigma-genosys (http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp).
Tabla 3. Cebadores usados para amplificar secuencias del gen de la lacasa de
P. flavido-alba, PfaL
Cebador
Secuencia
Tm
(ºC)
Franlac1
5`-CGGCTTCGACTCGACAAC-3`
64.7
Franclac3
5`-AGTGCAGGATCCAGGGAC-3`
62.8
Lacfin1
5`-GACTCGACAACATACCAAG-3`
55.3
dTCA
5`-TAATACGACTCACTATAGGGTTTTTTTTTTTTCA-3`
66.9
Lac-N3
5`-ACACTGTCTCGCTTCCATC-3`
60.4
Lac3up
5`-AAGGTGTCACGCCTCAAC-3`
61.3
Hwhdwn
5`-ACTTTCCATTGGCACGGT-3`
63.0
Hwhup
5`-CCGTGCCAATGGAAAGT-3`
62.2
Pico17dwn 5`-AGACCCTGGTGTTCCTGAC-3`
61.6
In1
5`-GCCAGCGACCGCTTTGGTAT-3`
70.2
Nup1
5`-GATGGAAGCGAGACAGTGT-3`
60.4
AFPINV1
5`-TCAACGGGTTGGTCGGGTTAGGAGTC-3`
75.3
AFPINV2
5`-ATGGCTTATGCTGCGCTACATCTCCGAC-3`
75.7
AFP3
5`-CATTGGTACCGTATCTGTGG-3`
60.2
51
2. Materiales y Métodos
AFP4
5`-GTATGCGACTCTCCCTGGAT-3`
62.9
AFP5
5`-GCAGACGGGTGGATGATTAG-3`
64.3
AFP6
5`-CAAGGAGAGGGAATGCGGTA-3`
66.1
2.11.4. Identificación del promotor de pfaL
Con el fin de predecir la ubicación del promotor y de sitios generales de unión de
factores de transcripción y algunos motivos putativos de lacasas en las regiones no
codificantes hacia el extremo 5’ del gen pfaL, se emplearon los siguientes
programas:
Programa
Dirección de Internet
GenScan 1.0
http://genes.mit.edu/GENSCAN.html
FRUITFLY
http://www.fruitfly.org/cgi-bin/seq_tools/promoter.pl
DRAGON 1.5
http://research.i2r.a-star.edu.sg/promoter/promoter1_5/DPF.htm
Proscan 1.7
http://bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/
2.11.5. Identificación de la señal de secreción de PfaL
La identificación de la señal de secreción se realizó mediante el uso de los
algoritmos SignalP-NN (neural networks model) (Nielsen et al. 1997 a,b) y
SignalP-HMM (hidden Markov model) (Nielsen y Krogh 1998), a través del
servidor http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/. Los métodos incorporan una
predicción de los sitios de ruptura y la presencia o no de péptido señal.
52
2. Materiales y Métodos
2.11.6. Análisis filogenético de la proteína deducida.
Se reunieron por separado las secuencias de lacasas y de ferroxidasas disponibles a
través del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Lacasas y ferroxidasas se
analizaron filogenéticamente por separado con el paquete informático MEGA (v
3.0). Luego de varios ciclos de alineamientos múltiples y análisis preliminares de
distancias filogenéticas, estas secuencias fueron depuradas. Se eliminaron las
lacasas con identidad mayor del 95% y las secuencias menores de 486
aminoácidos. Las ferroxidasas que tuvieran identidad mayor del 90 % también se
eliminaron. Al final se obtuvo una colección de 41 secuencias de multicobre
oxidasas, con las que se definieron las relaciones filogenéticas de PfaL con MCOs
de P. chrysosporium, con lacasas y con ferroxidasas fúngicas. Tras alinear tales
secuencias, se generó un árbol filogenético con el modelo Neighborn-joining de
análisis de distancias evolutivas, usando el paquete MEGA versión 3.0 (Kumar et
al., 2004). La fiabilidad de la predicción fue evaluada mediante 1000 muestreos al
azar de los alineamientos (“bootstrap”). Finalmente, la presentación y selección de
las secuencias consenso fueron elaboradas manualmente a partir de los
alineamientos.
53
3. RESULTADOS
3.Resultados
56
3. Resultados
3.1. CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA GÉNICA pfaL
En experimentos previos, utilizando la secuencia de aminoácidos de unión al cobre
(L3-L4, Kumar, 2003) se diseñaron cebadores degenerados. Con ellos se había
obtenido un fragmento de cDNA de P. flavido-alba (pp12 de 141 pb). Con pp12 se
obtuvo una sonda marcada con digoxigenina. Esta sonda hibridó (Southern) con un
fragmento (4,2 kb) del gDNA digerida con XbaI y con dos fragmentos XhoI (de 2
kb y de 4kb) (Comunicación personal de José Romera López y Antonio Suárez).
A partir de la secuencia de cDNA pp12 de P.flavido-alba de 141 pb se diseñaron
dos cebadores, “franLAC1” y “franLAC3r” (A y B en la Figura 11), con los que se
amplificó el correspondiente fragmento de gDNA. Después de su clonación, el
análisis de la secuencia “F21” de 248 pb, confirmó la presencia de la secuencia
pp12 y de dos intrones (Figura 9).
5`TCGGCTTCGACTCGACAACATACCAAGGCCAGACTCCTAACCCGACCAACCCG
TTGAGgtatgtgtgccagtcgcgagctgttaccaatttcattctcatacattgat
gcagGCGTGACACCTTCGTCGTTCCGAGCGGTGGATGGCTTATGCTGCGCTACAT
CTCCGACAACCgtgagtctacccataccatagtttgattcacactcatgatcgtt
cgcccacagCCGGTCCCTGGATCCTGCACT-3
Figura 9. Secuencia F21 de DNA genómico (248 pb) de P. flavido-alba. La secuencia
contiene pp12 (en mayúscula) y dos intrones. Los cebadores utilizados corresponden a las
secuencias subrayadas.
La secuencia “F21” permitió diseñar cebadores en orientaciones opuestas,
AFPINV1 y AFPINV2, dirigidos hacia “arriba” de su extremo 5` y hacia “abajo”
de su extremo 3` respectivamente, para amplificar el gen pfaL mediante PCR
Inversa (PCR-I). El gDNA fue digerido con las enzimas de restricción Xba I y Xho
I. Estas endonucleasas fueron escogidas en ensayos previos de hibridación
Southern.
57
3.Resultados
Los productos de la digestión del gDNA con tales enzimas se circularizaron con la
enzima T4 DNA ligasa. Los fragmentos circulares formados (Ochman, 1990) se
usaron como moldes en la amplificación inversa. El tamaño de los amplicones
obtenidos (Figura 10) correspondió al tamaño de las señales detectadas en la
hibridación Southern del gDNA.
m
M
gDNA
Dig
PCR-I
Lig
4,2 kb XbaI
M
PCR-I
4 kb XhoI
2 kb XhoI
Figura 10. Amplificación inversa (PCR-I) de productos religados con T4 DNA ligasa,
tras digerir el gDNA con XbaI o XhoI. Amplicones XbaI de 4,2 kb (arriba a la derecha) y
XhoI de 4 kb y 2 kb (abajo a la derecha). gDNA: DNA genómico. Dig: perfil de digestión
del gDNA con endonucleasas de restricción. Lig: religación del digerido. M: Marcador de
peso molecular λ EcoRI/ HindIII. m: marcador de peso molecular de 1kb.
58
3. Resultados
La secuencia completa del gen de la lacasa de P. flavido-alba (pfaL) se obtuvo
mediante secuenciaciones parciales sucesivas de zonas solapadas del amplicón
XbaI y del amplicón XhoI de 2 kb (esquematizado en la figura 11). En la secuencia
reconstruida del gDNA (4,58 kb), se identificó el gen de la lacasa.
.
Extremo-5` - 219 pb
Interno – 1390 pb
H
G
E
F
Extremo-3` - 522 pb
D
C
L3
pp12 -141 pb
F21 - 248 pb
L4
A
B
XbaI - 4,2 kb
p1
p1
p2
p4
p2
p2
p3
XhoI - 2 Kb
p5
p6
p1
p2
p2
Figura 11. Estrategia para aislar y secuenciar el gen pfaL de Phanerochaete flavidoalba. Barras en azul corresponden al gDNA de los fragmentos de restricción XbaI y XhoI
amplificados por PCR-I con los cebadores AFPINV1 (p1) y AFPINV2 (p2), deducidos del
fragmento F21. Los amplicones XbaI y XhoI se secuenciaron con los oligonucleótidos p1p6 (AFPINV1, AFPINV2, AFP3, AFP4, AFP5 y AFP6 de la Tabla 3). Las barras en blanco
corresponden al cDNA amplificado en tres etapas mediante RT-PCR con los cebadores
(Tabla 3) Lacfin1 (C), dTCA (D), LacN3 (E), Lac3up (F), In1 (G) y Nup1 (H). pp12:
secuencia cDNA.
La caracterización del alelo del gen pfaL se describe a continuación en varias
etapas: aislamiento del cDNA total, identificación de los intrones, análisis de la
proteína deducida y predicción de los sitios de regulación.
59
3.Resultados
3.2. AISLAMIENTO DEL cDNA pfaL
El cDNA de la lacasa fue obtenido mediante tres amplificaciones consecutivas
(RT-PCR), como se detalla en las figuras 11-15, en las que se utiliza la misma
nomenclatura que en la figura 11. El fragmento CD (522pb correspondiente al
extremo-3`se amplificó con los cebadores dTCA-Lacfin1; el fragmento EF
(1390pb) del cDNA interno con los cebadores LacN3-Lac3up; y el fragmento GH
(219pb) del extremo-5` con los cebadores In1-Nup1. Los amplicones obtenidos se
clonaron en el vector pGEM-T y se secuenciaron.
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 C
Carril
Directo
Reverso
1
2
3
4
5
Lacfin1
Lacfin1
Lacfin1
Lacfin1
Lacfin1
dTCC
dTCG
dTA
dTCA
dTG
Tamaño
amplicón
0
0
0
522pb
0
6
7
8
9
10
11
“
“
“
“
“
“
dTCC
dTCG
dTA
dTCA
dTG
dTCC
0
0
0
0
0
0
12
13
“
“
dTCG
dTA
0
0
Figura 12. cDNA de pfaL Amplicón del extremo 3´: el carril 4 muestra el amplicón (CD
en Fig. 11) de 522 pb obtenido con los cebadores Lacfin1/ dTCA. Carriles 1-5 mezcla de
PCR con 2 ul de cDNA; carriles 6-10 mezcla de PCR con 5 ul de cDNA; carriles 11 y 12
mezcla de PCR sin cDNA; M: marcador de 100 pb ; C: control positivo con el cDNA
(500pb) de la subunidad γ del receptor ácido nicotinico-acetilcolina de músculo de ratón
(Stratagene).
60
3. Resultados
A
B
M 1
1
2
2
3
4
3
5
4
6
7
5
8
9 10 11 m M
6
7
Carril
Directo
Reverso
Tamaño del
amplicón
1390pb (1 µl cDNA)
1
Lac-N3
Lac3up
2-3
“
“
0
4
Lac-N3
dTCA
0 (1 µl cDNA)
5
“
“
300pb
6
Hwhdwn
Lac3up
0 (1 µl cDNA)
7-8
“
“
1160
9-10
Hwhdwn
dTCA
0 (1 µl cDNA)
11
Hwhdwn
Lac3up
1160 (=8; 2 µl
Polim)
m
Carril
Directo
Reverso
Tamaño del amplicón
1
Pico17
Lac3up
429pb (1 µl cDNA)
2
“
“
0
(2 µ l)
3
“
“
0
(3 µ l)
4
“
“
0
(4 µ l)
5
“
“
0
(5 µ l)
6
“
“
0
(6 µ l)
7
“
“
0
(7 µ l)
Figura 13. cDNA de pfaL Amplicones internos. A. Carril 1: amplicón de 1390 pb
delimitado por el extremo N-terminal y la secuencia consenso L3 *; Carriles 7, 8 y 11:
B. Carril 1:
amplicón de 1160 pb delimitado por las secuencias consenso L3* y L4*.
amplicón de 429 p delimitado por el oligopéptido interno P17 (Tabla 5). Marcadores : M
(1kb); m (100pb). *Nomenclatura de Kumar et al. (2003).
61
3.Resultados
1
2
3
4 5 M 6 7
8 9 M 10 11 12 C
carril
directo
reverso
Amplicón de
interés
RT con Nup1
1
In1
Nup1
220 pb
+
1 µl
2
“
“
220 pb
+
2 µl
3
“
“
220 pb
+
5 µl
4
“
“
0
-
1 µl
5
“
“
0
-
2 µl
6
“
“
0
-
5 µl
reverso
Amplicón
7
In1
Nup1
220 pb
+
1ul
8
“
“
220 pb
+
2 ul
9
“
“
220 pb
+
5 ul
10
“
“
0
-
1 ul
11
“
“
0
-
2 ul
12
“
“
0
-
5 ul
carril
directo
RT con Hwhup
Figura 14. cDNA de pfaL Amplicón del extremo 5´. Carriles 1-6: amplicones obtenidos a
partir de reverso transcripción con el cebador Nup1 (Tabla 3). Carriles 7-12 : amplicones
obtenidos a partir de reverso transcripción con el cebador Hwhup (Tabla 3). El amplicón de
220pb fue purificado y clonado en pGEM-T. Control negativo: Carriles 4-6 y 10-12
amplificaciones a partir de muestras de reverso transcripción negativa (control sin reversotranscriptasa). C: control positivo: fragmento de cDNA 500pb de la subunidad γ del
receptor ácido nicotínico-acetilcolina de músculo de ratón (Stratagene).
62
3. Resultados
In1
GCCAGCGACCGCTTTGGTGTCCTACACTCCTTCCTTCCTCAAGGACATGGTTCTCCACTCCTTCACTCGCATGCG
TATTGCGCTCGCTGCACTCCCCGCCTTGCTCACCGTCATGGTTGGGCTGCATGGTGGCGAAGTGCACGC
LacN3 o Nup1
TGGACCGCACGGCCAGTATGCAGGTGTCTCTGCTAGGTCCGAGCTCCACGCTCGCGACACTGTCTCGCTTCCAT
CCAGCTCCGACATTATCCTGAACGGCCTCCAAGGCCAGGCTCCTCAGACAAGGAACTACGACTTCGTCGTCTCC
GAAATGACCGGTGCTCCCGACGGGTTCTCCAAGTCCATGCTCGTCGTGAACGGTCAGTTCCCTGGACCAACCAT
CGAGGCCAACCAGGGCGACCGCCTTGTCATCAAGGTCACCAAC
Hwhdwn o Hwhup
CAGCTCACAACTAACCGCACCACTATCCATTGGCACGGTTTGTATCAGAACGGCACCGTCTGGTACGACGGTAC
CGCTTCGGTCACGGAGTGCGGTATTCCGCCgGGCGAGTCGCTTACCTATGATTTCGAGCCGGGGAGCTTCTCAG
GAACGACCTGGTGGCATTCTCATTACGATACGCAATACACGGACGGCGTtACTGGTGCCCTAATCATCCACCCGT
CTGCTGACCCTCCGGCCGATTTCCCGACTTACGACGAAGATtTTGTCGTCCAGCTGACCGACATTTATCACACCC
TCAGCCCGGCAATTGTGCAAAACTACTTGTCTGGGACCGGCCCAACTGCACCCATTATCCTCGAGACTCCGGAT
AGTGGCTCAATCAACGGTGTGGGGCAATACGGTGGGGAAGGCGATTACTTCAACTTCACTCTGGAGGCAAACA
AGACCTACCGTCTCCGTCTCATCCACACCGGCTCCGCCGCTCAGATCAGGTTCTCTGTTGATTATCACGCGTTGA
CCGTTATCGAAGCCGATGGTACCCTCGTCGAGCCGTACTCCGTCACCGGTGTCAACCTGAACGTCGCGCAGAGG
TACTCGGTGCTTCTCACCACGAACCAGACGGAAGGAAATGGAACGTACTGGATGAGGGCTGGGCTTACCTCCG
TCGTTGCTGTGGAAGGTAcTACCAGCGATAtccGTGGCGTCATCAGATACGGTACCAATGATACCAG
Pico17dwn
CCTCCCCACTGCCGACACAGACCCTGGTGTTCCTGACTCTGGCCTCGCGGACATGGATGTGTCATTGCTCACCC
CAGCCATTGTTGACACTCCTCCCGACCGCTCCAGGTTTTATCAGGTTGGTTTCAACATCTCGACTACCTCTACCG
GAGGAACCATTGCCTACGTGAATGGCACTAGCTGGGCGCCGTTGGTGGGCACAAACAGCTTGCTGCAAATCAA
CCAAAACAGCAGCTATGCTGGAGAGGGTGAGAGCGTGGACTCCGGAGATCAGTTCATCATCACAGAGGACACA
ATCGAGACTGTTGATATTCTCTTGATCAACCAGGGTG
Lacfin1
CCGGAGACCACCCATTCCACCTGCACGGCCATAGCCCCTGGATCCTCGGCTTCGACTCGACAACAT
Lac3up
ACCAAGgCCAGACTCCTAACCCGACCAACCCGTTGAGGCGTGACACCTTCGTCGTTCCGAGCGGTGGATGGCTT
ATGCTGCGCTACATCTCCGACAACCCCGGTCcCTGGACtATGCACTGCCACATTGCCTGGCACATGGCCGCTGGG
CTCCTTATGCAGGTCAACAGCTTGCCCTCGGTGGTTGCGGGCTGGACCATTCCTCAGGATGTCGTGGATCAATG
CTCGGCCTGAGCGTGTTTCAGCGAACAATTTTATCTGCTCCCAGATTTTTCTTCTCCCTCTTGTTACAACTTCTAT
CAGCCAATATTTTTTACTAtTATTATCTCCCTCGCCTCTTGTCGAAAGTAAAAAGCAAGTACATATGTTTTGGGG
ATTAGGATTGTTCGTTTGTTCACTTGGGCTTCAGTACTTAATAAATCTTCGCTAGCCAGTATTTACGCGAAATCT
TCGATCAAATTATACGATATTTGTTGTGAAAAAAAAAAAACCCTATAGTGAGTCGTATTA
dTCA(rc)
Figura 15. Secuencia del cDNA (2108pb) del gen pfaL deducida de los amplicones (de
522pb, 1390pb y 219 pb (Figuras 12-14) obtenidos luego de tres amplificaciones
consecutivas (RT-PCR) con las parejas de primers dTCA/Lacfin1, LacN3/Lac3up,
In1/Nup1 respectivamente (Tabla 3). En rojo posición de los intrones (19).
63
3.Resultados
3.3. ANÁLISIS DEL cDNA Y DE LA PROTEÍNA DEDUCIDA
ATGCGTATTGCGCTCGCTGCACTCCCCGCCTTGCTCACCGTCATGGTTGGGCTGCATGGTGGCGAAGTGCACGCTGGACCGCACGGC
M R I A L A A L P A L L T V M V G L H G G E V H A G P H G
CAGTATGCAGGTGTCTCTGCTAGGTCCGAGCTCCACGCTCGCGACACTGTCTCGCTTCCATCCAGCTCCGACATTATCCTGAACGGCCTCCAAGGCCAGGCTCCTCAGACAAGGAACTACGACTTCGTC
Q Y A G V S A R S E L H A R D T V S L P S S S D I I L N G L Q G Q A P Q T R N Y D F V
GTCTCCGAAATGACCGGTGCTCCCGACGGGTTCTCCAAGTCCATGCTCGTCGTGAACGGTGTGTCCATCGACGCAACGATACAACTTGTATTGATGTTCACACAGGTCAGTTCCCTGGACCAACCATCG
V S E M T G A P D G F S K S M L V V N G
I1
Q F P G P T I E
AGGCCAACCAGGGCGACCGCCTTGTCATCAAGGTCACCAACCAGCTCACAACTAACCGCACGTAAGTGCTATGCCCGTCGCAAGACCGTATAAGCAGCACCTAACTTAACCCGCATGGCTGACAGCACT
A N Q G D R L V I K V T N Q L T T N R T
I2
T
ATCCATTGGCACGGTTTGGTGGGTGTTTCGATGACTTGATGCGTCCGGACATTCTAACGCCTCAACGTCAACAGTATCAGAACGGCACCGTCTGGTACGACGGTACCGCTTCGGTCACGGAGTGCGGTA
I H W H G L
I3
Y Q N G T V W Y D G T A S V T E C G I
TTCCGCCGGGCGAGTCGCTTACCTATGAGTAAGTAGAGGTCGAGATGTCGAATGCATCACGATTCTTATTCGATATTAGTTTCGAGCCGGGGAGCTTCTCAGGAACGACCTGGTGGCAGTGAGTAAAAT
P P G E S L T Y D
I4
F E P G S F S G T T W W H
TGAGCCGCTTGTAGAACTTACACCACTAACATACCCCTCCTAGTTCTCGTAAGTATACAACGGTTCCATGATAGCTTTGGCACTGATCATCTGATGATCGTGTTGAACAGATTGTGAGGCATTCATTTT
I5
S H
I6
Y
TTTCTCAATATTAGCTCTCCCCTCATCTTCGACTTTGACAGACGATACGCAATACACGGACGGCGTTACTGGTGCCCTAATCATCCACCCGTCTGCTGACCCTCCGGCCGATTTCCCGACTTACGACGA
I7
D T Q Y T D G V T G A L I I H P S A D P P A D F P T Y D E
AGATTTTGTCGTCCAGCTGACCGACATTTATCACACCCTCAGCCCGGCAATTGTGCAAAACTACTTGTCTGTGAGTAGCGAACCGTTCGTCTGTTACCTTCGTTTTCTGAAAGCATCATTAGGGGACCG
D F V V Q L T D I Y H T L S P A I V Q N Y L S
I8
G T G
GCCCAACTGCACCCATTATCCTCGAGACTCCGGATAGTGGCGTGCGTACCTCTGTTTGTTAGCCGTGCATAGGCTCACTAATTCATCAATGTATTCTAGTCAATCAACGGTGTGGGGCAATACGGTGGG
P T A P I I L E T P D S G
I9
S I N G V G Q Y G G
GAAGGCGATTACTTCAACGTGAGCCTTGCGTCATTGAGCCGTCTCATCTTGTCTCACGCTTGTCTCTTTACAGTTCACTCTGGAGGCAAACAAGACGTGAGTACGATCCTTATGAATAAGCGCGCCCGG
E G D Y F N
I10
F T L E A N K T
I11
TCTGAATCTCGCCCGCCAGCTACCGTCTCCGTCTCATCCACACCGGCTCCGCCGCTCAGATCAGGTTCTCTGTTGATTATCACGCGTTGACCGTTATCGAAGCCGATGGTACCCTCGTCGAGCCGTACT
Y R L R L I H T G S A A Q I R F S V D Y H A L T V I E A D G T L V E P Y S
CCGTCACCGGTGTCAACCTGAACGTCGCGCAGAGGTACTCGGTGCTTCTCACCACGAACCAGACGGAAGGAAATGGAACGTACTGGATGAGGGCTGGGCTTACCTCCGTCGTTGCTGTGGAAGGTACTA
V T G V N L N V A Q R Y S V L L T T N Q T E G N G T Y W M R A G L T S V V A V E G T T
CCAGCGATATCCGTGGCGTCATCAGGTTTGCTCTCAAGTATCATGCGGTGAATGAGGGGCTTACGTCTTTGTACCCACAGATACGGTACCAATGATACCAGCCTCCCCACTGCCGACACAGACCCTGGT
S D I R G V I R
I12
Y G T N D T S L P T A D T D P G
GTTCCTGACTCTGGCCTCGCGGACATGGATGTGTCATTGCTCACCCCAGCCATTGTTGACACTCCTCCCGACCGCTCCAGGTGAGTCAACGCTTTAGACTAACTCGAGTCGCGTGGCTAATGGAATACA
V P D S G L A D M D V S L L T P A I V D T P P D R S R
I13
GGTTTTATCAGGTTGGTTTCAACATCTCGACTACCTCTACCGGAGGAACCATTGCCTACGTGAATGGCACTGTGAGTAAAGACTGCACATCCTCGATGTATTCTGGTGCTAACAACAACCCATTTTATC
F Y Q V G F N I S T T S T G G T I A Y V N G T
I14
AGAGCTGGGCGCCGTTGGTGGGCACAAACAGCTTGCTGCAAATCAACCAAAACAGCAGCTATGCTGGAGAGGGTGAGAGCGTGGACTCCGGAGATCAGTTCATCATCACAGAGGACACAATCGAGACTG
S W A P L V G T N S L L Q I N Q N S S Y A G E G E S V D S G D Q F I I T E D T I E T V
TTGATATTCTCTTGGTGCGTACATCATATATTAATTGTCCTCTGATATCTGAGCCTAATACTGGCTCTCAGATCAACCAGGGTGCCGGAGACCACCCATTCCACCTGCACGGCCATAGCCCCTGGATGT
D I L L
I15
I N Q G A G D H P F H L H G H S P W I
GAGTGGTCCTGGTTTCTATTATAGCGTGTGGGAGTGCTTACCCCATGTCTTAGCCTCGGCTTCGACTCGACAACATACCAAGGCCAGACTCCTAACCCGACCAACCCGTTGAGGTATGTGTGCCAGTCG
I16
L G F D S T T Y Q G Q T P N P T N P L R
CGAGCTGTTACCAATTTCATTCTCATACATTGATGCAGGCGTGACACCTTCGTCGTTCCGAGCGGTGGATGGCTTATGCTGCGCTACATCTCCGACAACCGTGAGTCTACCCATACCATAGTTTGATTC
I17
R D T F V V P S G G W L M L R Y I S D N P
I18
ACACTCATGATCGTTCGCCCACAGCCGGTCCCTGGACTATGCACTGCCGTAAGCACCTTACTTACTATTGTATCTCAAAGGCGAAATCTCTGACTTGTGCTTTCTAGACATTGCCTGGCACATGGCCGC
G P W T M H C H
I19
I A W H M A A
TGGGCTCCTTATGCAGGTCAACAGCTTGCCCTCGGTGGTTGCGGGCTGGACCATTCCTCAGGATGTCGTGGATCAATGCTCGGCCTGAGCGTGTTTCAGCGAACAATTTTATCTGCTCCCAGATTTTTC
G L L M Q V N S L P S V V A G W T I P Q D V V D Q C S A
TTCTCCCTCTTGTTACAACTTCTATCAGCCAATATTTTTTACTATTATTATCTCCCTCGCCTCTTGTCGAAAGTAAAAAGCAAGTACATATGTTTTGGGGATTAGGATTGTTCGTTTGTTCACTTGGGC
TTCAGTACTTAATAAATCTTCGCTAGCCAGTATTTACGCGAAATCTTCGATCAAATTATACGATATTTGTTGTG
Figura 16. Secuencias del gDNA y cDNA deducidos para el gen de la lacasa de P. flavido-alba (pfaL) y de la
proteína codificada. Intrones (I1-I19) secuencias marcadas en gris. En azul se destacan los oligopéptidos
identificados en la lacasa pura de P. flavido-alba (Tabla 5), en verde los amino ácidos envueltos en la unión al Fe (E,
Y, D) en las ferroxidasas fúngicas (Bonaccorsi di Patti et al., 2000) y en amarillo la posible secuencia señal de
secreción (25 residuos ) identificada con el programa SignalP3.0. AATAAA señal de poli adenilación. Secuencia de
567 amino ácidos codificados por la ORF (desde ATG a TGA) según GeneScan 1.0
(http://genes.mit.edu/GENSCAN.html).
64
3. Resultados
La secuencia completa del cDNA fue deducida por solapamiento de las tres
secuencias obtenidas y alineamiento con el gDNA esquematizado en la Fig
11. Se identificó un marco abierto de lectura (ORF, 1704 pb desde el codón
de iniciación hasta el de terminación (ATG/TAA) de la traducción, en la
secuencia de cDNA resultante (2018 pb) El tamaño deducido corresponde a
un polipéptido de 567 aminoácidos (Fig. 16).
Mediante un análisis BLASTp (Tabla 4) en la base de datos del EMBL, se encontró
que la secuencia deducida para la lacasa PfaL es muy semejante (identidad del
59%) a las proteínas putativas MCO4A y MCO4B de Phanerochaete
chrysosporium, y a lacasas de hongos basidiomicetos (identidades cercanas al
35%). Estos resultados indican que efectivamente el cDNA aislado de
Phanerochaete flavido-alba correspondería al de una proteína de la familia
multicobre-oxidasas
Las multicobre oxidasas contienen los cuatro secuencias conservadas de unión al
cobre (L1-L4) descritas por Kumar et al. (2003) para las lacasas. Las
subsecuencias de aminoácidos L1-L4 en la proteína PfaL alineadas con proteínas
recogidas en el BLAST (Tabla 4) mostraron la mayor identidad con las proteínas
MCOs de Phanerochaete chrysosporium, y en menor grado con las lacasas y las
ferroxidasas (Tablas 4 y 10).
Los péptidos identificados de la lacasa de P. flavido-alba purificada (De La Rubia
et al 2002; Lucas et al 2005) coinciden con la proteína PfaL de 567 aminoácidos
(Fig. 16) deducida del cDNA. Tales oligopéptidos se muestran en la Tabla 5.
65
3.Resultados
Tabla 4. Alineamiento (WU-Blastp, EMBL) de la secuencia deducida para la lacasa PfaL
con las proteínas de la base de datos UNIPROT.
Nº
Identificación
Organismo
Proteína
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Q6QNN1
Q6QNN2
Q6QNP2
Q875H3
Q6QNN9
Q6QNM9
Q6RYA3
Q6QNN4
Q6CGD4
Phanerochete chrysosporium
Phanerochete chrysosporium
Phanerochete chrysosporium
Phanerochete chrysosporium
Phanerochete chrysosporium
Phanerochete chrysosporium
Auricularia auricula-judae
Phanerochete chrysosporium
Yarrowia lipolitica
10
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
Q4P261
Q4HWQ4
Q5ARB0
Q6VMB9
Q3KRP1
LAC2
Q7S4C0
LAC2
Q8TFE4
LAC4
Q6VMB7
Q96WM9I
Q00292
LAC2
Q6E124
Q8TFE1
28
30
31
Q6E0Y2
Q6VMB8
Q8TFD9
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
49
50
Q5A503
Q8X1W3
Q8TFE3
Q9ZR59
Q8TG93
COPA1
Q68LM4
Q8WZI0
Q9P861
O13456
LAC3
Q4HZG2
Q5B233
Q7SDL8
Q8J0L7
FIO1
Q5I7J0
Q50JG3
Ustilago maidis
Giberella zeae
Aspergillus nidullans
Coprinopsis cinerea
Criphonectria parasitica
Agaricus bisporus
Neurospora crassa
Thanathephorus cucumeris
Gaeumannomyces graminis-tritici
Thanathephorus cucumeris
Coprinopsis cinerea
Botrytis cinerea
Aspergillus terreus
Podospora anserina
Auricularia polytricha
Gaeumanomyces graminisgraminis
Auricularia polytricha
Coprinopsis cinerea
Gaeumanomyces graminisgraminis
Candida albicans
Lentinula edodes
G. graminis var. tritici
Cucumis melo
Trametes pubescens
Trametes villosa
Lentinula edodes
Lentinula edodes
Arxulla adeninivorans
Trametes versicolor
Thanathephorus cucumeris
Gibberella zeae
Aspergillus nidulans
Neurospora crassa
Claviceps purpurea
Schizosaccharomyces pombe
Trametes sp AH28-2
Trametes versicolor
66
%Identidad
Multicobre oxidasa 4B. (MCO4B)
MCO4A
MCO2A.
MCO Extracelular.
MCO3B.
Variante splice MCO4B-I13
MCO
Variante splice MCO3B-I10
Similar a ferroxidasa de membrane YMR058w FET3
de Saccharomyces cerevisiae sp|P38993
Proteina hipotetica
Proteina hipotetica
Proteina hipotetica
Lacasa 5 (EC 1.10.3.2).
Lacasa 3.
precursor Lacasa II (EC 1.10.3.2)
Proteina hipotetica
precursor Lacasa 2 (EC 1.10.3.2)
precursor Lacasa (EC 1.10.3.2).
precursor Lacasa 4 (EC 1.10.3.2)
Lacasa 7 (EC 1.10.3.2).
Lacasa 2 (EC 1.10.3.2).
Dihydrogeodin oxidasa
precursor Lacasa II (Laccase C).
Lacasa. lac1
precursor Lacasa (EC 1.10.3.2).
Aminoác
idos
591
591
617
559
613
444
595
462
695
59
59
55
57
54
59
44
54
39
695
566
570
533
567
520
588
599
608
531
549
581
605
621
619
607
34
34
38
34
33
35
35
41
34
36
33
34
37
34
35
33
Lacasa.
Lacasa 6 (EC 1.10.3.2).
precursor Lacasa (EC 1.10.3.2).
620
532
578
36
33
34
Potencial MCO ferro-O2-oxidoreductasa.
Lacasa.
precursor Lacasa (EC 1.10.3.2).
L-ascorbate oxidase (EC 1.10.3.3).
Lacasa 1A (EC 1.10.3.2).
precursor Lacasa 5 (EC 1.10.3.2)
Lacasa 1 BVT (EC 1.10.3.2).
Lacasa 2.
precursor Ferro-O2-oxidoreductasa.
precursor Lacasa (EC 1.10.3.2).
precursor Lacasa 3
Proteina hipotetica
Proteina hipotetica
Proteina hipotetica
Putativa MCO
precursor fio1-MCO de transporte de Fe
Lacasa B (EC 1.10.3.2).
Lacasa4.
620
533
578
687
526
527
533
533
615
526
572
572
664
549
623
622
525
527
32
34
34
34
34
34
34
34
32
34
40
33
33
32
33
31
34
32
3. Resultados
Tabla 5. Secuencias contenidas en la proteína PfaL deducida que coinciden con las
de los péptidos de la lacasa de P. flavido-alba purificada y similitud entre ellas con
la secuencia aminoacídica deducida del cDNA pfaL
Secuencia de aminoácidos
Oligopéptido
PfaLop-Nt
PfaLop-m82
(N-terminal a C-terminal)
Método
DTVSLPSSSDIILNGLQGQAP
Degradación
QTRNYDFV
Edman
EGTTSDIR
Espectrometría
% Identidad
de
100
de
100
de
100
de
100
de
91
de
100
masas Maldi- tof
PfaLop-P17
PfaLop-
YGTNDTSLPTADTDPGVPDSG
Degradación
LADM
Edman
NPLR
Espectrometría
m24b
PfaLop-P18
masas Maldi- tof
*
FVVPSGGWI ML
Degradación
Edman
PfaLop-23I1
VDQ
Espectrometría
masas Maldi- tof
*
EL aminoácido identificado en el oligopéptido (I) no corresponde al deducido en la proteína (L)
3.4. IDENTIFICACIÓN DE INTRONES DEL GEN pfaL
Tras el alineamiento manual del gDNA con el cDNA del gen pfaL se identificaron
un mayor número de intrones (19 intrones) que en los genes de las lacasas (Tabla
8). Su longitud promedio es de unos 58±4 nucleótidos. Al compararlos mediante
ClustalW, presentaron secuencias consenso al inicio y al final de los sitios de
“splice”, 5`-GTA/G...y ...T/CAG-3` (Tabla 6). Estas secuencias conservadas para
los sitios donador y receptor se corresponden con el patrón general de los hongos,
así como con los identificados en los intrones de varios genes de lacasas fúngicas,
como por ejemplo en Coprinopsis cinerea (Seitz et al. ,1996 y Hoegger et al.,
67
3.Resultados
2004). Las secuencias de los intrones de pfaL presentan alta variabilidad, aunque
identidades entre 19% y 38% (mostrada en la Tabla 7) podría indicar la presencia
de elementos conservados, importantes para la maquinaria de “splicing”.
Tabla 6. Alineamiento de los intrones del gen pfaL. Se usó el programa
MegAlign del DNAstar
+ Majority
Majority
G T G A G T T A T G C G T C G T T C T T A A T G T T G T A T T T G C G T C C T A A C G C C T A A T C - - C - - - T T T - - C A G
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
G
G
A
G
A
G
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G
G
G
G
G
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G
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A
C
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G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
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G
G
G
G
G
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T
T
T
T
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C
C
T
T
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T
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G
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C
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C
T
G
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C
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T
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T
C
T
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C
G
-
A
T
A
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A
T
G
C
G
G
C
C
G
C
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A
T
C
T
C
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C
C
A
T
C
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G
A
T
C
T
C
G
G
G
T
A
A
A
C
G
A
C
C
C
G
-
C
A
C
A
T
A
T
C
T
T
T
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T
T
T
T
C
C
A
C
C
T
G
C
T
C
G
C
C
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T
G
A
G
C
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G
A
G
T
G
T
A
C
A
T
C
C
G
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A
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G
G
T
T
T
T
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T
G
-
T
C
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A
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C
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T
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T
T
T
T
G
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T
T
T
T
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C
C
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T
C
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C
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T
A
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T
G
G
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T
G
T
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C
C
G
C
T
C
C
T
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C
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T
T
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T
C
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C
C
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A
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G
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A
G
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C
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A
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A
A
A
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T
T
C
G
C
A
C
A
T
T
T
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T
T
G
T
T
G
G
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C
C
T
G
C
C
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T
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G
G
T
A
A
C
G
A
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T
G
G
A
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G
G
C
C
C
T
A
T
T
C
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T
A
T
A
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T
C
T
T
C
C
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A
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T
T
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C
T
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A
T
-
C
A
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G
G
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G
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C
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G
G
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G
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T
T
T
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T
-
T
A
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C
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C
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C
G
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C
T
T
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C
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C
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G
C
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C
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G
G
G
G
C
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T
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G
G
G
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T
G
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T
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T
C
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C
G
G
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C
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A
C
C
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C
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C
A
C
C
C
A
T
C
G
G
G
G
G
T
A
T
T
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C
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G
C
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T
C
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T
T
T
G
T
T
T
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G
T
T
A
G
C
A
G
A
A
T
A
C
G
T
A
A
A
C
C
C
60
50
40
30
20
10
I15-pfaL.SEQG
I1-pfaL.SEQ G
I2-pfaL.SEQ G
I3-pafL.SEQ G
I4-pafL.SEQ G
I5-pfaL.SEQ G
I6-pafL.SEQ G
I7-pafL.SEQ G
I8-pfaL.SEQ G
I9-pfaL.SEQ G
I10-pfaL.SEQG
I11-pfaL.SEQG
I12-pfaL.SEQG
I13-pfaL.SEQG
I14-pfaL.SEQG
I19-pfaL.SEQG
I16-pfaL.SEQG
I17-pfaL.SEQG
I18-pfaL.SEQG
G
A
T
A
A
A
T
T
A
A
T
A
A
A
T
T
A
A
C
T
A
C
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T
C
C
C
T
C
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G
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C
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T
T
C
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G
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C
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T
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T
T
A
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C
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C
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C
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G
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A
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A
T
-
G
A
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T
T
G
A
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G
A
-
T
C
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C
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C
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T
C
-
G
A
A
G
G
A
G
G
G
G
A
-
G
T
T
T
A
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T
C
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T
T
-
C
G
G
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T
C
T
-
T
G
G
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T
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T
C
C
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G
G
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C
T
C
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T
T
T
T
G
C
T
T
T
A
C
T
T
C
T
G
T
T
C
T
C
C
T
T
C
T
C
Tabla 7. Porcentajes de identidad de los intrones del gen pfaL.
I15
***
68
I1
27.7
***
I2
28.1
29.8
***
I3
23.2
34.0
26.8
***
I4
29.4
31.9
33.3
25.5
***
I5
20.4
23.4
31.5
20.4
19.6
***
I6
24.6
34.0
24.2
25.0
29.4
20.4
***
I7
35.1
19.1
28.1
30.4
27.5
25.9
33.3
***
I8
26.9
25.5
25.0
23.1
31.4
23.1
30.8
28.8
***
I9
28.1
27.7
24.1
26.8
31.4
25.9
27.6
29.8
21.2
***
I10
25.5
27.7
25.5
29.1
25.5
24.1
25.5
30.9
28.8
25.5
***
I11
38.5
19.1
30.8
28.8
27.5
26.9
30.8
23.1
21.2
28.8
26.9
***
I12
25.5
29.8
27.3
27.3
25.5
24.1
25.5
23.6
21.2
25.5
34.5
23.1
***
I13
28.0
27.7
30.0
26.0
32.0
30.0
24.0
26.0
24.0
26.0
24.0
26.0
22.0
***
I14
31.6
34.0
21.7
25.0
25.5
29.6
30.0
21.1
30.8
31.0
23.6
23.1
18.2
32.0
***
I19
35.1
27.7
22.0
23.2
21.6
22.2
25.4
28.1
26.9
32.8
27.3
36.5
27.3
30.0
27.1
***
I16
29.1
29.8
27.3
30.9
21.6
29.6
32.7
29.1
23.1
30.9
29.1
28.8
25.5
30.0
27.3
20.0
***
I17
27.8
34.0
33.3
24.1
29.4
24.1
29.6
25.9
28.8
29.6
25.9
19.2
24.1
32.0
25.9
22.2
24.1
***
I18
24.5
34.0
28.3
26.4
31.4
26.4
34.0
24.5
25.0
26.4
35.8
28.8
28.3
28.0
24.5
30.2
24.5
24.5
***
I15
I1
I2
I3
I4
I5
I6
I7
I8
I9
I10
I11
I12
I13
I14
I19
I16
I17
I18
G
A
A
A
G
T
C
A
A
G
C
A
A
A
A
A
A
A
T
A
C
C
C
C
T
C
C
T
C
C
C
C
C
T
C
C
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
3. Resultados
Tabla 8. Estructura génica de lacasas de hongos de la podredumbre blanca de la
madera y las proteínas que codifican
Especie de
Basidiomiceto
gen
gDNA
cDNA
Nº de
intrones
Aminoácidos
del Peptido
señal
Número de
aminoácidos
Referencia
Trametes sp. I-62
lcc1
ND
1563
ND
ND
520
Gonzalez T, et al 2003. Mycol Res. 2003 ;107(Pt
6):727-35.)
Trametes sp. I-62
lcc2
ND
1563
ND
ND
520
Gonzalez T, et al 2003. Mycol Res. 2003 ;107(Pt
6):727-35.)
Trametes sp. I-62
lcc3
ND
1575
ND
ND
524
Gonzalez T, et al 2003. Mycol Res. 2003 ;107(Pt
6):727-35.)
Trametes versicolor
X84683
lcc1
2800
1560
10
22
498
Guo M, et al 2005. Appl Microbiol Biotechnol.
2005
Jonsson L, et al. Biochim Biophys Acta. 1995 Sep
6;1251(2):210-5
Pycnoporus
cinnabarinus I-937
lac1
3331
1557
10
21
518
Otterbein L, et al Eur J Biochem. 2000
Mar;267(6):1619
Trametes trogii
precursor protein
Lcc1
2431
1554
10
21
517
Colao MCh, et al 2003 Appl Microbiol
Biotechnol. 2003 Dec;63(2):153-8
Trametes pubescens
lap2
3578
1563
8
ND
520
Galhaup C, et al 2002 Microbiology. 2002
Jul;148(Pt 7):2159-69.
Trametes pubescens
Lap1
A
2554
1581
11
ND
526
Galhaup C, et al 2002 Microbiology. 2002
Jul;148(Pt 7):2159-69.
C. cinereus
lcc1
2243
1620
7
ND
539
Yaver DS, et al 1999.Appl Environ Microbiol.
1999 Nov;65(11):4943-8.
C. cinereus
lcc2
2993
1555
13
ND
517
Yaver DS, et al 1999.Appl Environ Microbiol.
1999 Nov;65(11):4943-8.
C. cinereus
lcc3
2801
1551
13
ND
516
Yaver DS, et al 1999.Appl Environ Microbiol.
1999 Nov;65(11):4943-8.
Volvariella volvacea
lac4
1689
ND
ND
ND
562
Chen S, et al 2004.. FEMS Microbiol Lett. 2004
Jan 30;230(2):171-6
Marasmius
quercophilus
lac1
ND
ND
ND
ND
517
Dedeyan B, et aal . 2000. Appl Environ Microbiol.
66(3):925-9
Fome lignosus
Lcc
2201
1557
11
21
518
Liu W, et al 2003 Appl Microbiol Biotechnol.
2003 Dec;63(2):174-81. Epub 2003 Jul 24.
ND : No determinado
69
3.Resultados
3.5. ANÁLISIS FILOGENÉTICO DE LA LACASA PFAL
La conservación del sitio activo de las diversas oxidasas que contienen cobre
sugiere que la actividad enzimática, relacionada con cuatro sitios del cobre en la
misma molécula, puede ser un evento biológico temprano (Solomón et al 1996).
Por lo tanto, las lacasas son consideradas enzimas antiguas desde el punto de vista
evolutivo (Messerchmidt et al 1990).
Con objeto de definir la relación de la secuencia deducida para la lacasa de P.
flavido-alba (PfaL), se realizaron sucesivos alineamientos de la secuencia de PfaL
con las de las proteínas multicobre (incluyendo a lacasas y ferroxidasas) de las
bases de datos. Se construyó un arbol filogenético utilizando el programa MEGA3
sobre las secuencias fúngicas alineadas. Se demuestra que PfaL y las MCOs de P.
chrysosporium forman un linaje separado entre las multicobre oxidasas, separado
de ferroxidasas y lacasas fúngicas.
A esta conclusión se ha llegado tras comparar la secuencia de PfaL con: a) lacasas
fúngicas (de basidiomicetos y de ascomicetos); b) ferroxidasas fúngicas; y c) con
las lacasas y ferroxidasas más próximas filogenéticamente detectadas en a) y b).
3.5.1. Alineamiento de PfaL con lacasas fúngicas
El alineamiento (Clustal) de PfaL con las lacasas obtenidas del NCBI (búsqueda
por lacasas) mostró un filograma (construido con MEGA 3), donde PFAL queda
incluida en un “clade” independiente (no mostrado). Después de eliminar las
secuencias con identidad mayor del 95%, el análisis filogenético de PfaL con las
lacasas fúngicas mostró cinco grupos principales de lacasas. Sorprendentemente,
PfaL fue alineada con lacasas de ascomicetos y no con las de basidiomicetos.
3.5.2. Alineamiento de PfaL con ferroxidasas fúngicas
Siguiendo el mismo proceso se construyó un nuevo árbol filogenético (MEGA 3)
con las ferroxidasas, que se refinó eliminando las secuencias con identidad superior
al 90%.
70
3. Resultados
Aproximadamente la mitad de las ferroxidasas formaron un grupo claramente
diferenciado del resto de secuencias comparadas. Este grupo, mostró dos ramas
principales por el número de proteínas que las forman. Una rama incluyó las
ferroxidasas animales.
La otra rama incluyó a PfaL entre las ferroxidasas procarióticas y fúngicas. En este
agrupamiento sólo se encontraron tres proteínas de basidiomicetos: PfaL, la MCO1
de P. chrysosporium y una proteína de Cryptococcus noeformans (NCBI
gi57226018). En esta rama filogenética PfaL se alineó en un grupo diferenciado del
resto de ferroxidasas fúngicas junto a la proteína MCO1 de P. chrysosporium y dos
proteínas putativas (gi|50545481| y gi|49646143|) de un ascomiceto (Yaworria
lipolytica), similares a la ferroxidasa de membrana FET3 (YMR058w) de
Saccharomyces cerevisiae.
3.5.3. Alineamiento de PfaL con lacasas y ferroxidasas fúngicas
Después de alinear PfaL con las lacasas fúngicas y las ferroxidasas se hizo un
nuevo análisis filogenético (Fig. 17). PfaL, las MCOs de P. chrysosporium, una
proteína putativa de Yarrowia lipolytica y otra proteína de Cryptococcus
neoformans, se incluyeron en un grupo filogenético separado tanto de ferroxidasas
como de lacasas.
En conclusión, las multicobre oxidasas de las dos especies de Phanerochaete
forman un grupo separado de las lacasas fúngicas y de las ferroxidasas. Por otro
lado, en este árbol filogenético algunas multicobre oxidasas identificadas como
lacasas en las bases de datos, por ejemplo la de una cepa de Stagonospora
(gi23305799, Lyons et al., 2003) fueron así mismo ubicadas en el grupo de
ferroxidasas.
71
3.Resultados
Podosan-lac-gi|1729781|
98
Melalbo-Lac-gi|22218674|
63
87
Ncras-lac-gi|168828|
Cryphopar-lac-gi|167469|
Neucras-lac-gi|28881397|
93
Collelag-lac-gi|12862766|
Gaeugrat-lac-gi|19171198|
58
lac-marine-gi|23305795|
Mycos-lac-gi|23305809|
Buersparti-lac-gi|23305813|
99
76
Botryf uc-lac-gi|15787446|
100
Phaehal-lac-gi|23305805|
Phaespar-lac-gi|23305801|
85
Phae-hal-lac-gi|23305793|
100
Lacasas
Phaespar-lacgi|23305789|
Hortac-lacIII-gi|66969928|
Fuspro-lac3-gi|14718439|
99
77
59
Hortaci-lacI-gi|63146072|
Gaeu-Gram-lac2-gi|19309740|
50
98
Glomercin-lac-gi|57232530|
Crypar-Lac3-gi|69047730|
Hortaci-lacII-gi|67773582|
89
89
Gaeu-Gram-lac1-gi|19309738|
76
Botryf uc-Lac2-gi|15022489|
61
Botci-LAC1-gi|2833229|
100
Botry-f uc-Lac1-gi|15022487|
Fuspro-lacRT1-gi|14581397|
Stag-lac-gi|23305799|
Ncras-f err-gi|18376329|
76
A spef um-Feo-gi|50845196|
A rx-f eO2-gi|7798835|
100
Deba-han-gi|50422577|
Fet3-Canal-pre-gi|2493323|
72
Fet3-Flula-prec-gi|62901518|
71
Ferroxidasas
Cryneo-Feo-gi|57226018|
99
f et3-pre-Canga-gi|62901519|
100
95
Fet3-yeast-prec-gi|2828219|
Cryneof -lac-gi|57228040|
Y arli-gi|49646143|
69
Pf aL
56
100
Pchry-MCO1-gi|28416421|
MCOs
Phanerochaete
0 .2
Figura 17. Árbol filogenético construido (“Neighborn-joining”) con las secuencias de PfaL y de
las ferroxidasas y lacasas fúngicas seleccionadas (Tabla 9). PfaL, las MCOs de P. chrysosporium
y la proteína putativa de Y. lipolytica forman un grupo filogenético independiente de ferroxidasas y
lacasas fúngicas. Se indican los valores “boostrap” >50
72
3. Resultados
Tabla 9. Secuencias seleccionadas de lacasas y ferroxidasas para análisis
filogenético de PFAL
Código
Cryneof-lac
Ncras-lac
Neucras-lac
Podosan-lac
Melalbo-Lac
Cryphopar-lac
Gaeugrat-lac
Nº gi
gi|57228040|
gi|168828|
gi|28881397|
gi|1729781|
gi|22218674
gi|167469|
gi|19171198|
GaeuGramlac2
Gaeu-Gramlac1
Lac-marine
Collelag-lac
Buersparti-lac
Botryfuc-lac
Mycos-lac
Phaehal-lac
Phae-hal-lac
Phaespar-lac
gi|19309740|
gi|19309738|
gi|23305795|
gi|12862766|
gi|23305813|
gi|15787446|
gi|23305809|
gi|23305805|
gi|23305793|
gi|23305801|
Phaespar-lac
gi|23305789|
Stag-lac
Glomercin-lac
Crypar-Lac3Hortaci-lacII
Hortaci-lacI
Hortac-lacIII
Botci-LAC1Botryfuc-Lac2
Botryfuc-Lac1
FusprolacRT1
Fuspro-lac3
PfaL-V8
Pchry-MCO1fet3-preCangaFet3-yeastprecFet3-FlulaprecFet3-CanalpreDeba-han
Ncras-ferr
Aspefum-Feo
Arx-feO2
Cryneo-Feo
gi|23305799|
gi|57232530|
gi|69047730|
gi|67773582|
gi|63146072|
gi|66969928|
gi|2833229|
gi|15022489|
gi|15022487|
gi|14581397|
Yarli-
gi|49646143|
gi|14718439|
Especie
Crytococcus neoformans
Neurospora crassa-TS
Neurospora crassa
Podospora anserina
Melanocarpus albomyces
Cryphonectria parasitica
Gaeumannomyces graminisvar.tritici
Gaeumannomyces-graminisvar graminis
Gaeumannomyces graminis
var. graminis
Ascomicete marino SAP162
Colletotrichum lagenarium
Buergenerula spartinae
Botriotinis fuckeliana
Mycosphaerella sp.2 SAP136
Phaeosphaeria halima SAP159
Phaeosphaeria halima SAP140
Phaeosphaeria spartinicola
SAP151
Phaeosphaeria spartinicola
SAP149
Stagonospora sp. SAP143
Glomerella cingulata
Cryphonectria parasitica
Hortaea acidophila
Hortaea acidophila
Hortaea acidophila
Botrytis cinerea
Botryotinia fuckeliana
Botryotinia fuckeliana
Fusarium proliferatum
Base de datos
gb|AAW44497.1|
gb|AAA33592.1|emb|CAD70438.1|
emb|CAA70061.1|
pdb|1GW0|B
gb|AAA33105.1|
|emb|CAD10749.1
emb|CAD24842.1
emb|CAD24841.1|
gb|AAN17287.1|
dbj|BAB32575.1|
gb|AAN17296.1|
gb|AAL06114.1|
gb|AAN17294.1|
gb|AAN17292.1|
gb|AAN17286.1
gb|AAN17290.1
gb|AAN17284.1|
gb|AAN17289.1|
gb|AAW47924.1|
gb|AAY99671.1
gb|AAY33971.2
gb|AAY33970.1
gb|AAY60098.1|
sp|Q12570
gb|AAK77953.1|
gb|AAK77952.1|
gb|AAG23872.1|
gb|AAK72901.1|
gi|28416421|
gi|62901519|
Fusarium proliferatum
Phanerochaete flavida-alba
Phanerochaete chrysosporium
Candida glabrata
gb|AAO42609.1|
sp|Q96WT3|
gi|2828219|
Saccharomyces cerevisiae
sp|P38993|
gi|62901518|
Kluyveromyces lactis
sp|Q6CII3|
gi|2493323|
Candida albicans
sp|P78591|
gi|50422577|
gi|18376329|
gi|50845196|
gi|7798835|
gi|57226018|
Debaryomyces hansenii
Neurospora crassa
Aspergillus fumigatus
Arxula adeninivorans
Cryptococcus neoformans var.
neoformans JEC21
Yarrowia lipolytica
ref|XP_459860.1|
emb|CAD21075.1
gb|AAT84595.1|
emb|CAB90817.1|
gb|AAW42479.1|
emb|CAG84216.1|
73
3.Resultados
3.5.4. Identificación de aminoácidos conservados en PfaL
Para definir posibles secuencias conservadas en las multicobre oxidasas de las
dos especies de Phanerochaete (P. chrysosporium y P. flavido-alba), se
realizaron alineamientos de secuencias específicas: 1) con lacasas de
ascomicetos, y 2) con ferroxidasas y lacasas de ascomicetos.
3.5.4.1. Aminoácidos de PfaL conservados en lacasas de ascomicetos
Se compararon las posiciones de PfaL y MCOs de P. chrysosporium conservadas
en las secuencias L1-L4 (Kumar et al., 2003) de lacasas fúngicas y lacasas
vegetales (Tabla 10).
Cuando se alinearon las secuencias consenso de unión al cobre (L1-L4 , Kumar
et al. 2003) de las proteínas de mayor identidad con PfaL seleccionadas (Tabla
4), la mayor identidad de PfaL se obtuvo para las MCOs de P.
chrysosporium(Tabla 10A-D).
74
3. Resultados
Tabla 10. Posiciones conservadas en los sitios de union al cobre. Comparación
de PFAL y MCOs de P. chrysosporium (Pc-MCOs) con lacasas vegetales y
lacasas fúngicas.
Tabla 10A. Secuencia L1
Enzima
Inicio *
Longitud
Lacasas
vegetales
Lacasas
fúngicas
96
24
64
24
Mco4
PfAL
MCO1B
MCO2A
MCO3B
Consenso
H-W-H-G-
(X)9- D-G-P(X)3-TQCPI
H-W-H-G-
(X)9- D-G-(X)5
H-W-H-GLYQNSTNYYD-G
H-W-H-GLYQNGTVWYD-G
H-W-H-GIPQNGTAYYD-G
H-W-H-GLFQNQTNYYD-G
H-W-H-GLFQNGTNYYD-G
* * * ** **:* ** *
TAGVT
TASVT
TAGIT
TAGIT
TAAIT
** *
QCPI
ECGI
ECGI
ECGI
ECGI
ECGI
****
166
146
125
178
172
Tabla 10B. Secuencia L2
Lacasas 136
vegetales
8
G-T-L-X-W---H-A-H
Lacasas 104 22
G-T-(X)-W-Y-H-S-H-(X)3-Q-Y-C-X-D-G-L-X-G-X-(FLIM)
fúngicas
Mco4A
PFAL
MCO1B
MCO2A
MCO3B
G
G
G
G
G
*
T
T
T
T
T
*
T
T
T
T
T
*
W-W-H
W W H
W W H
W W H
W W H
* * *
A
S
S
A
A
H
H
H
H
H
*
YDT
YDT
YDT
YST
YST
*:*
Q
Q
Q
Q
Q
*
Y
Y
Y
Y
Y
*
T T TTT*
D
D
D
D
D
*
G
G
G
G
G
*
V
V
V
I
I
T
T
T
T
T
*
G
G
G
G
G
*
A
A
A
A
A
*
L
L
L
L
L
*
203
183
163
215
209
*La posición de inicio de la subsecuencia se muestra con relación a la
Secuencia de la proteina de P. taeda para lacasas vegetales y C. cinereus
para lacasas fúngicas. La secuencia consenso se muestra como una
expresión regular según el patrón de PROSITE (Bucher and Bairoch, 1994;
Hoffmann et al., 1999).
75
3.Resultados
Tabla 10. Posiciones conservadas en los sitios del cobre.
Comparación de PFAL y MCOs de P. chrysosporium (Pc-MCOs)
con lacasas vegetales y lacasas fúngicas
Tabla 10C. Secuencia L3
Lacasas
vegetales
Lacasas
fúngicas
Mco4A
PFAL
MCO1B
MCO2A
MCO3B
478
8
396
8
H-P-X-H-L-H-G-(FYH)
H-P-X-H-L-H-G-H
H P F H L H G H
H P F H L H G H
H P F H L H G Y
H P F H L H G H
H P F H L H G H
* * * * * * * *
503
479
468
521
516
Tabla 10D. Secuencia L4
Inicio:535 Longitud:21
Lacasas
vegetales G-V-W-(FLI)-(FML)-HCH-(FMLI)-(DE)-X-H-X2-W-G-L-X-M-X-(WF
Inicio:446 Longitud:23
Lacasas
fúngicas G-X-W-(FIL)-(FLM)-HCH-I DAE-X-H-X3-G(LMF)X3-(LFM)
Mco4A
PFAL
MCO1B
MCO2A
MCO3B
76
G
G
G
G
G
*
I
P
A
L
L
W
W
W
W
W
*
T
T
T
A
A
L HCH I AWM HCH I AWL HCH I SWF
HCH L AWF
HCH L AW***
*
-
H
H
H
H
H
*
MAAG
MAAG
MSAG
MAAG
MAAG
*:**
LMMQ
LLMQ
LLMQ
LLMQ
MLMQ
::**
ISSLPSKAAQLDIPRDIVRQCSA- 591
VNSLPSVVAGWTIPQDVVDQCSA- 567
FVTLPSVAATLPIPQVIANMCSAA 559
INSLPSKAAQLDIPQSIVSQCAATVDGAGAR- 617
VNSLPTRAAQLDIPQTIVDQCQVDVGGAGARR 613
.:**: .* **: :. * .
3. Resultados
3.5.4.2. Aminoácidos de unión al Fe en las ferroxidasas conservados en PfaL y
en las MCOs de P. chrysosporium
Las lacasas y ferroxidasas (excepto MCOs de P chrysosporium) más próximas a
PfaL en los alineamientos previos, fueron depuradas de nuevo eliminando lacasas
menores de 486 aminoácidos.
Los aminoácidos de unión al Fe conservados en PfaL, en las MCOs de P.
chrysosporium y en lacasas y ferroxidasas de ascomicetos se muestran en la Tabla
11, tomando como referencia las posiciones en la ferroxidasa Fet3 (gi2828219) de
Saccharomyces cerevisiae (Bonaccorsi di Patti et al., 2000).
77
3.Resultados
Tabla 11. Aminoácidos de unión al hierro en la ferroxidasa Fet3 (gi2828219)
de S. cerevisiae conservados en PfaL, MCOs de P. chrysosporium, otras
ferroxidasas y lacasas de ascomicetos
A-Sitio E 185 de Fet3
B-Sitio Y354 de Fet3
C- Sitio D 409 de Fet 3
Fet3-yeast-prec
Fet3-pre-Canga
Fet3-Flula-prec
Fet3-Canal-pre
Arx-feO2
Deba-han
Ncras-ferr
Asp-fum-Feo
Yarli-
-----PTGAEPIPQN
-----PTGAEPIPQN
-----PTGAEPIPQN
-----PTGAEPIPQN
-----PTGAEPVPQA
-----PTGAEPIPQN
-----PTGAEPVPKS
-----PTGAEPVPKA
------ENDEPVPQA
190
190
195
190
116
188
187
190
316
---VNYAFFNNITYTAPKVPTLMTVLSSG------VNYAFFNNITYTTPKVPTLLTVLSAG------VNYAFFNNLTFTAPKVPTLMTALSAG------INYAFFNNISYKAPKVPTLLTVLSAG------VNYAFFNNITYTAPKVPTLMTALSAG------VNYAFFNNISYVLPKVPTLMTVLSSG------ANYAFFNDITYVPPRVPTLYTVLSSPNSSS
---ANYAFFNGITYVMPKVPTLYSVLTTG------IKRGVFNATTWNPAKEATLSQFLR----EK
377
377
382
377
306
382
377
376
542
DLIVNNQDTGK--------------------EIVLNNQDTGT--------------------EIVLNNNDTGK--------------------DIVLNNFDTGK--------------------EIVVNNNDAGF--------------------EIVLNNMDDGK--------------------QIVLNNLDSGR--------------------DIVLNNDDAGK--------------------DLVINNLDDGA---------------------
412
412
417
412
341
417
416
411
581
PfaL
Pchry-MCO4A
Pchry-MCO1
>Pchry-MCO2A
Pchry-MCO3B
-PTAPIIL-ET-PDS
GPLTGLQL-ET-PDS
-PIGGSAGDEPVPDS
--IDGTAGDEPVPDA
--IDGVPGDEPVPDA
238
258
219
271
265
---GTIAYVNGTSWAPLVGTNSLLQIN----QN
---GAFATMNGTSWQPLQGTTTLLQIVDAARNG
---ASRAYMNGTSWDPLPKTNILLEIQRAYNAG
---LFLGFMNGTSWTPLQGTTTLLQARAAFQGG
---VMLGFLNTTSWEPLRGTTTLLRVREAFRAG
434
458
423
476
470
DILLINQGAGD--------------------DVLLVNTGPGD--------------------DLVLENNDNGD--------------------DLLISNLDDGD--------------------DLVIDNIDDGD---------------------
471
495
460
513
508
Podosan-lac
Melalbo-Lac
Ncras-lac
Crypho-lac
Neucras-lac
Gaeugrat-lac
Collelag-lac
Botryfuc-lac
GaeuGram-lac2
Crypar-Lac3
Gaeu-Gram-lac1
Botryfuc-Lac2
Botci-LAC1Botryfuc-Lac1-
--------GPPPSDT
--------APPFSDN
--------GPPPSNN
--------APPASDN
-FLKGVPGSPPPSNN
------PGVPPPSDN
-------GPPPDSDN
------QAGPPSGDN
-------GP-PTLEN
-------GP-PTMAN
-------GAGPLPAN
-------GAPPALEN
-------GAPPTLLT
-------GAPPTLLT
242
197
248
230
235
222
232
134
232
220
238
228
125
222
---LFVWKVNGSSINVDWDKPIVDYVIA-------LFVWKVNGSDINVDWGKPIIDYILT--------FVWRVNGTAININWNKPVLEYVMT---------KWTINGSTLDVDWGHPITQYVIN----GISKVLWSVDGSAIDVQWDKPTLEYVVE----GRQRVYWEINGSDMNITWDEPTLEYLVK-----EKIYRWRVNGSSMDVQWDKPTLQYIAE------PIVTWGINLSAIDVDWKKPILQYVLD----GNGVFRWYLNSTTMELDWSNPTVSQLASN---LAGRVDWAMGNTTFINEWGYPSIQQVYD----GQNWFQWTLNNSSLVLDWHDPTLERIFD------NYFTWTINSSSLLLDWSSPTTLKIFN---------QWLFNGSSLLLNWTDPTLLTVLN---------QWLFNGSSLLLNWTDPTLLTVLN-----
439
394
440
425
437
422
429
332
429
420
446
426
312
409
YWLIENDPTGP--------------------YWLIENDPEGP--------------------YWLIENDPDGA--------------------YWLIENDPTATG-------------------FWVIQNNSPSP--------------------FWIIQNPTVAP--------------------WWVIENTGALP--------------------YWVIQEVPGNVNG---------------NPVS
YVIIQTDFG----------------------YWIVQTTMG----------------------QAMVHTGDSEQRPPTDPLPS-----------EWVVYV--------IEDLTG-----------GWAVLAISGPNGXAFYHYPPILLISNHTDNLF
GWAVLAISGPNG--------------------
471
426
472
458
469
454
461
370
459
450
487
459
365
442
La Tabla 12 resume los aminoácidos implicados en la unión al Fe en Fet3 de
S.cerevisiae que ocupan posiciones conservadas en PFAL y Pc-MCOs (de la Tabla
11). Estas posiciones no están conservadas en lacasas. Estos aminoácidos son:
•
78
E-234, ácido glutámico en la posición 234 de PFAL, conservado en PcMCOs;
3. Resultados
•
•
Y-413 (tirosina en la posición 413), conservado también en MCO1B
(Y398);
G-468 (glicina)/D471 (ácido aspártico), G presente también en MCO4,
pero ausente en MCO1, MCO2 y MCO3. D, conservado en todas las PcMCOs. Uno de los dos (G o D) podría sustituir la función de D-409 de
Fet3.
Tabla 12. Aminoácidos de unión al Fe en Fet3 (gi2828219) de S. cerevisiae
conservados en PFAL y MCOs que están ausentes en lacasas.
Proteína
Residuos análogos
Referencia
PFAL
E234
Y413
G468 o D471
Este trabajo
Fet3 de
E185
Y354
D409
Bonacorssi di Patti
S. cerevisiae
et al., 2000
3.6. IDENTIFICACIÓN DE LA SEÑAL DE SECRECIÓN
Consistente con la función extracelular de la lacasa PfaL y establecida para otras
lacasas (Yaver et al. 1999), se trató de identificar la secuencia señal de secreción de
PfaL con SignalP versión 3.0. El análisis propuso dos posibles péptidos señal de
secreción (A y B , en Tabla 13). Nos parece más probable que la señal de secreción
sea la correspondiente a la predicción B. El péptido que contiene los primeros 70
aminoácidos (predicción A) produjo diferentes sitios de corte dependiendo del
modelo usado por SignalP: el modelo “neural networks” predijo un sitio de corte
en G28 y el modelo “hidden Markov” en A33.
79
3.Resultados
Tabla 13. Predicción del péptido señal de PfaL (Predicciones A y B), por SignalP
versión 3.0 (http://www.cbs.dtu.dk/cgi-bin/nph-webface?jobid=signalp). NN:
“neural networks model”; HMM: “hidden Markov model”.
Predicción A
Predicción B
MVLHSFTRMRIALAALPALLTVMVGLHG-GEVHA-GPHGQYAGVSARSELHAR
MRIALAALPALLTVMVGLHG GEVHA-GPHGQYAGVSARSELHAR
Predicción B>Sequence
SignalP-NN
SignalP-HMM
length = 62
# Measure position
Value
>Sequence length = 62
Cutoff
signal Prediction: Signal peptide
………………………………………………………………………………………….peptide?
max. C
26
0.478
0.32
YES
Signal
max. Y
26
0.522
0.33
YES
Signal
max. S
3
0.990
0.87
YES
mean S
1-25
0.754
0.48
YES
D
1-25
0.638
0.43
YES
peptide
probability:
anchor
probability:
site
probability:
1.000
0.000
# cleavage site between pos. 25/26: VHA-GP
cleavage
0.685 between 25/26:
Predicción A- SignalP-NN
>Sequence
#
Measure
VHA-GP
SignalP-HMM
length = 70
Position
Value
Cutoff
signal >Sequence length = 70
………………………………………………………………………………………….peptide?
max. C
34
0.256
0.32
NO
Prediction: Signal peptide
max. Y
29
0.416
0.33
YES
Signal
max. S
9
0.991
0.87
YES
Signal
peptide
probability:
anchor
probability:
site
probability:
0.996
0.003
mean S
1-28
0.892
0.48
YES
D
1-28
0.654
0.43
YES
# cleavage site between 28/29: LHG-GE
cleavage
0.610 between 33/34:VHA-GP
80
3. Resultados
La predicción B (62 residuos) es la obtenida eliminando los primeros 8 residuos de
la predicción A. La predicción B indica el mismo punto de corte en ambos modelos
(A25). Este sitio es el mismo que ofrece el modelo SignalP-HMM en la predicción
A. Por lo tanto, la señal de secreción tendría una longitud de 25 residuos (Fig. 16 y
Tabla 13) y un sitio de ruptura de la peptidasa señal en VHA-GP.
La secuencia amino terminal DTVSLPSSSDIILNGLQGQAPQTRNYDFV de la
proteína madura purificada (Pérez et al. 1998 y De La Rubia et al. 2002), se
encontraría 18 aminoácidos corriente abajo de la secuencia de secreción
extracelular. Para explicar este hecho sería necesario asumir que la secreción de
PFAL en el fluido extracelular involucra al menos dos procesos proteolíticos: el
primero, liberando la señal de secreción y, el segundo, liberando los 18
aminoácidos de la secuencia de intervención.
La predicción B de la secuencia señal (Tabla 13) define el extremo N- terminal del
producto de traducción de PfaL como :
MRIALAALPALLTVMVGLHGGEVHAGPHGQYAGVSARSELHARDTVSLP.
El programa PeptideCutter (http://www.expasy.org/tools/peptidecutter/peptidecutter_enzymes.html)
identificó un único sitio de corte (posición 43/44, HAR-DTV) para una Asp-N
endopeptidasa (Peptidil-Asp metalo-endopeptidasa). Esto sugeriría que el segundo
procesamiento proteolítico produciría la secuencia N-terminal identificada en la
lacasa de P. flavido-alba purificada.
De este modo, parece más que posible que el mecanismo de secreción extracelular
de PfaL, sea a través de dos procesamientos proteolíticos en el extremo N-terminal.
3.7. IDENTIFICACIÓN DEL PROMOTOR DE pfaL
En la secuencia genómica caracterizada se han identificado un promotor putativo y
sitios de unión de factores de transcripción, especialmente algunos motivos
putativos de lacasas aguas arriba del extremo 5’ del gen pfaL (Fig. 18 y Tabla 14).
81
3.Resultados
-1591 tctagacatgcagtcgtggatggcacgctttcgtttacgacattgcaacgaatccacttg
-1531 tttgctttggcgatcccgagctgccgagtagcagactaacccccaaccggatgctcttgg
-1471 cctgaggagaggactctctcttgcatgtcctttcactttcaacatgtcaagagtccgcct
MRE
-1411 taacgcaccttcatgcacttccgggcgtggtaacgagttgcatgcacaccgctcggggct
NIT2
-1351 cacagcaccgcgcagctcccatttcgacgatattcattcctccttctaattgttgatgta
-1291 ggttagcatttttctccccgacggtctgatgctgtccgaaatggaccgctgtgcactgcc
-1231 gctgcgaaggccgacgcgacgcgaacgaagcgaagcggtaacccttcgccagctcgcgaa
Ap1
-1171 ttcgtccagccccgtcgcagcgaaccgggatgccatggtgggcgatgcatcctcatgagt
-1111 aatgtccttcggtcatttaccgagcgtatgcgactctccctggattcggctccgggagat
PRE
NIT2
-1051 gctgctctgggtgagtatcataccgggtttataactttcattcccaagggaccataatca
-991 ctcatactgattaccagttcttgtcaggccttgtattggaggtggcgcacgattcgcggc
PRE
ARE
NIT2
-931 tccgccaaacccaagtgacccgcgaacagttcggatagaaggctcgaaaatgcctctccg
-871 gtggtgatgcgttcatcgtgcgaatggggctgctgcggtaacagaaattgatagaccgcc
-811 tctgtttatgtaagttttgagccgcttcttcaacagaaagctctgttactgcttagagag
-751 gagttatcaggcctcaccgctccgatgaaggatgccggcactaagctttcctcctaatca
-691 gcgggtaccttacctccatgtgcccgggttgatcagcgtacccctccgccgcgtcgtgtg
-631 agtttaggttttgttcgtccacaaagggatgcgctaatgtgatcccaggtgaagtggacg
-571 cctaccagaacacgttctacgacgccgcctgacgctacccctcggcctcgcagtccacgg
MRE
XRE
-511 ctattgaacgtgggaggccgtacttacgcacgcaagcggctgcgtccctatcccgcagtt
Mig1p
-451 agcgcccttccataccctgtcagttaggcggagacggcctatgaataccatggttaacgg
-391 gttcgatttgttgcagtgcggcacggcacagggcactcgtcagcaatgcagtacgcgtcc
ARE
-331 tgacaaggagagggaatgcggtatcctcaggccctcgcgcacggttccatattgggccac
-271 acttactgctctatgcgactaattccaattccataaaccagatggaagaccatgcgaaga
MRE
PRE
-211 gccgacataccggcaagatcttattgctacgtgcgtacccaaatgtgcgcatctctacat
-151 gggtccgcgccgtgtagtccaggccagcgaccgctttggtatgtgcgaatggtataaaac
PRE
-91 ccttggtttcttgactaacatttcttcacaacccaggtgtcctacactccttccttcctc
-31 aaggacatggttctccactccttcactcgcATGCGT
+1
Figura 18. Sitios de la región reguladora del gen pfaL de Phanerochaete flavido-alba.
El promotor putativo en cuadro gris y las cajas TATA y CCATT están subrayadas. El
codón de inicio ATG en mayúscula (sitio +1). Varios elementos de respuesta están
identificados para metales (MRE), xenobióticos (XRE), antioxidantes (ARE y Ap1),
putativo (PRE), nitrógeno (NIT2) y carbono (Mig1p). El inicio de la transcripción dentro
del promotor putativo es “C”, de acuerdo a GenScan 1.0 (apartado 2.11.4).
82
3. Resultados
El promotor se ubica en el sitio -113 respecto al codón ATG de inicio de la
traducción.
Tiene
un
tamaño
de
49
pb,
según
GenScan1.0
(http://genes.mit.edu/GENSCAN.html). La caja TATA (TATAAAA) y un posible
inicio de la transcripción (TSS) se localizan en las posiciones -99 y -68
respectivamente.
Tabla 14. Regiones reguladoras identificadas en el gen pfaL. Localización
respecto al inicio de la traducción.
Regiones
identificadas
TATA box
CCATT box
PRE
MRE
XRE
ARE
Mig1p
NIT2
Ap1
Secuencia consenso
TATAAAA
CCAATT, ATTGG
ACCCA, TGGGT
TGCACAC, ACGTGGG,
ACGTGCG
CACGCA
TGACCCGC,
TGACAAGG
GCGGAG
CGGATA, TATCAT,
ACGATA
TGAGTAA
Localización
-99
-247, -281, 957
-61, -175, -923,
1044
-183, -504, -1369
-483
-331, -916
-424
-900, -1036, -1325
-1116
Además, se identificaron varias secuencias consenso de elementos reguladores de
la transcripción de lacasas de basidiomicetos (Soden y Dobson, 2003). En concreto
se identificaron:
•
•
•
•
•
Cuatro elementos PRE (TGGGT y ACCCG), elementos de respuesta
putativos de lacasas;
Tres cajas CCATT, de regulación constitutiva de lacasas de
basidiomicetos;
Tres elementos de respuesta a metales (MRE),
Un elemento de respuesta a xenobióticos (XRE),
Dos elementos de respuesta a antioxidantes (ARE) y un elemento putativo
a antioxidantes (Ap1);
83
3.Resultados
•
•
Un elemento de respuesta al carbono, GCGGAG (Mig1p), homólogo a
CreA (elemento de respuesta a cAMP); y
Tres elementos de respuesta a nitrógeno (NIT2).
No se encontraron sitios consenso conservados en otros genes de lacasas, como son
los elementos de respuesta a choque térmico (HSE) ni el elemento potenciador de
la transcripción de mamíferos (Sp1).
3.8. REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE LA LACASA POR FENOLES,
HIERRO Y COBRE
En esta sección se presentan resultados que ilustran los mecanismos moleculares
que regulan la producción de lacasa PFAL en P. flavido-alba. Se muestra cómo
compuestos aromáticos y cationes metálicos divalentes pueden regular la expresión
del gen pfaL, con o sin aumento de la actividad extracelular.
Los inductores mencionados (fenólicos y metálicos- apartado 2.3.3.) se añadieron a
cultivos de P. flavido-alba de tres días. Tras 72 horas con los inductores se midió la
actividad lacasa y se cuantificó (QPCR en tiempo real) el mRNA pfaL y el rDNA
18S, que se utilizó como control.
3.8.1. Regulación por fenoles
Los resultados muestran que el transcrito pfaL es sobre-expresado en cultivos
suplementados con el pigmento polimérico del alpechín (PMA) (Figura 19). Sin
embargo, la adición de esta mezcla compleja de aromáticos no incrementó
significativamente la actividad lacasa en los sobrenadantes (Fig. 19A), lo que
sugiere la traducción ineficiente del mRNA pfaL, cambios postraduccionales
deficientes de la lacasa PFAL, o simplemente la inactivación de la lacasa
extracelular producida.
Antes de contemplar la inducción por aromáticos simples (ácido ferúlico, tirosol y
vainillina) conviene estudiar el efecto del disolvente empleado para incorporarlos
al cultivo (1 ml de una solución 3:7 de DMF/agua en cada 25 ml de medio de
84
3. Resultados
Actividad lacasa
20000
A
mU / mg de proteina
18000
16508
16000
14000
12000
10000
8000
6000
4000
1803
2000
1283
810
BL
PMA
1425
967
0
DMF
Fer
Van
Tir
mRNA pfa L cuantificado
4,5
B
Niveles de expresión
4,0
3,5
3,0
3,6
2,5
3,3
2,8
2,0
1,5
1,8
1,0
0,5
1,0
0,2
0,0
BL
PMA
DMF
Fer
Van
Tir
Figura 19. Actividad lacasa (A) y cantidad de RNAm (B) de pfaL afectadas por
adición de compuestos aromáticos. BL: medio basal; PMA: BL con pigmento polimérico
del alpechin (8,3 g/l); DMF: BL con dimetilformamida; Fer: BL con ácido ferúlico (1mM);
Van: BL con vainillina (1mM); Tir: BL con tirosol (1mM).; Los resultados representan
valores promedio y desviación estándar de cinco repeticiones para la actividad y de 4
repeticiones para cuantificación del mRNA.
85
3.Resultados
cultivo). A diferencia del PMA, la DMF aumentó la expresión génica y la actividad
lacasa extracelular (Fig. 19).
El ácido ferúlico, disuelto en la solución de DMF, incrementó la transcripción,
demostrando un efecto aditivo de la mezcla. Por otro lado, el ácido ferúlico no
modificó significativamente la actividad extracelular. En conclusión el ácido
ferúlico, como el PMA, aumentan la transcripción de pfaL, pero no la actividad
extracelular.
Por su parte el tirosol, que no modificó la actividad lacasa pero sí disminuyó la
cantidad de mRNA, podría reprimir la transcripción o activar la degradación del
mRNA.
En cambio, los cultivos suplementados con vainillina proporcionaron el máximo
incremento en la actividad lacasa total y por mg de proteína (12.9 veces la
actividad de los cultivos control). Sorprendentemente, el micelio contenía la
cantidad más baja de mRNA pfaL. Esto sugiere que, al contrario de PMA y ácido
ferúlico, la vainillina facilitó la traducción de mRNA pfaL y/o provocó posibles
modificaciones post-traduccionales del péptido PFAL.
Los resultados obtenidos en los cultivos con adición de ácido ferúlico o vainillina
permiten concluir que la actividad extracelular de la lacasa de P. flavido-alba está
regulada tanto a nivel transcripcional como traduccional/postraduccional.
3.8.2. Regulación por Metales
3.8.2.1. Regulación por deficiencia de Fe
La ausencia de Fe II, o que no esté disponible en los cultivos al adicionar el
quelante del Fe (Fig. 20), hizo que la actividad extracelular de la enzima PFAL
disminuyera, sin afectar los niveles de transcrito. Esto indica que la disponibilidad
de hierro regula la traducción del mRNA o la activación de la proteína y sugiere,
por tanto, una regulación traduccional o postraduccional de la proteína.
86
3. Resultados
Actividad lacasa
700
A
mU / mg de proteína
600
500
588
400
300
200
279
293
219
Fe
BCS
Cu
0,4
0,9
0,1
Fe
BCS
Cu
100
69
0
BL
BPS
mRNA pfa L cuantificado
1,8
B
1,6
Nivel de Expresión
1,4
1,2
1,0
0,8
1,3
1,2
0,6
0,4
0,2
0,0
BL
BPS
Figura 20. Actividad lacasa (A) y cantidad de RNAm (B) de pfaL afectadas por hierro
y cobre. BL: medio basal; BPS: medio basal sin FeII con batofenantrolindisulfonato-sódico
(1mM); Fe: medio basal sin FeII con sulfato de hierro amónico (25 mM); BCS: medio basal
sin CuII con batocuproinadisulfonato-sódico (1 mM); Cu: medio basal sin CuII con sulfato
de cobre (24 mM). Valores de actividad son el promedio de tres réplicas; los niveles de
expresión son el promedio de cuatro qPCR en tiempo real.
87
3.Resultados
3.8.2.2. Regulación por adición de Fe
Al adicionar a los cultivos, desarrollados con déficit de Fe II, concentraciones de
Fe similares a las del cultivo control (25 µM), PFAL recuperó su actividad y, al
mismo tiempo, disminuyó los niveles de mRNA. Es posible, por tanto, una
regulación a varios niveles: 1) traduccional, pues el hierro puede hacer más
disponible el mRNA para la síntesis de PFAL, 2) transcripcional, reduciéndolo, 3)
aumentado la inestabilidad del mRNA de pfaL.
3.8.2.3. Regulación por Cobre
Como en los cultivos a los cuales se les añadió vainillina, la suplementación con
Cu II (8,5 veces la concentración del medio BL) aumentó la actividad lacasa
extracelular y disminuyó la cantidad de mRNA. El déficit de Cu II no modificó
significativamente ninguno de los dos parámetros.
En conclusión, los dos metales estudiados regulan la producción de la lacasa en P.
flavido-alba en forma análoga como lo hace la vainillina. La indisponibilidad de Fe
probablemente impide los cambios postraduccionales que permiten la acumulación
extracelular de la lacasa activa. De esta forma, como se ha explicado, el
restablecimiento de los niveles de Fe restablecen la actividad extracelular
(aumenta) y disminuye la cantidad de mRNA (como en el caso de la vainillina).
88
4.
DISCUSIÓN
4. Discusión
90
4. Discusión
P. flavido-alba produce las tres enzimas oxidativas características de los hongos
ligninolíticos Lip, MnP y lacasa (Ben Hamman, 1998).
P. flavido-alba degrada los componentes recalcitrantes y tóxicos del alpechín. La
lacasa de P. flavido-alba oxida varios de sus fenoles monoméricos y algunos
inducen su producción. Varias de las propiedades de esta lacasa se han deducido de
la proteína inducida por 4-hidroxi-3-metoxibenzaldehido (vainillina) (De La Rubia
et al., 2002; Lucas et al., 2005).
Este trabajo ha permitido conocer otros aspectos de la lacasa de P. flavido alba: la
secuencia génica que la codifica, la regulación de su expresión por componentes
orgánicos e inorgánicos y su parentesco filogenético con las lacasas y otras
multicobre oxidasas fúngicas .
La lacasa de P. flavido-alba posee los atributos típicos de una enzima de este tipo
(De la Rubia et al., 2002, Lucas et al 2005, Pérez et al., 1996). Sin embargo la
organización genética de pfaL y la secuencia peptídica deducida (PfaL) se
corresponden mas a los de la ferroxidasa MCO1 de P. chrysosporium (Larrondo et
al., 2003).
4.1. ESTRUCTURA DEL GEN pfaL
En el presente trabajo, se ha identificado un gen (pfaL) de la lacasa de P. flavidoalba) PfaL en una región de 4589 pb. El gen tiene un tamaño de 2755 pb,
incluyendo 19 intrones.
En general, el número de intrones en las lacasas de hongos es muy variable, pero
inferior al encontrados en el gen pfaL (Tabla 8). Por otra parte, y dada la alta
identidad de PfaL (Tabla 4) con las proteínas codificadas por los genes mco de P.
chrysosporium, es presumible también una gran similitud en la organización
genética. Efectivamente el gen pfaL de P. flavido-alba posee un número de
intrones muy similar a los genes mco de P. chrysosporium, (18 intrones en mco4,
19 en mco1 y 14 en mco2 y en mco3; Larrondo et al. 2003 y 2004). Además,
también es muy similar la posición de los intrones, en especial en zonas
conservadas tales como los exones que codifican las histidinas de los tres centros
del cobre en mco1, exones V, VI, VII, XVI, XIX y XX (Fig.21). No obstante, en la
91
4. Discusión
expresión de pfaL no hemos encontrado las variantes de “splicing” descritas en la
transcripción de los genes mco de P. chrysosporium (Larrondo et al 2004). PfaL
está delimitado por una región reguladora de 1590 pb en 5´ y por una UTR-3’ de
244 pb.
I
II
III IV
V VI VII
VIII
IX
X
XI
XII
XIII
XIV
XV
XVI XVII XVIII XIX XX
mco1
2704 pb
pfaL
2755 pb
I
II
III
IV
V VI VII
VIII
IX
X
XI
XII
XIII
XIV
XV XVI XVII XVIII XIX
mco4
2768 pb
Figura 21. Comparación en la distribución de exones/intrones entre los genes pfaL de P.
flavido-alba (descritos en este trabajo) y mcos de P. chrysosporium (descritos en Larrondo
et al., 2004). Los exones se representan desde I hasta XX.
El mRNA (1704 nucleótidos) codifica un polipéptido de 567 aminoácidos, que
incluye una señal de secreción de 43 aminoácidos. La secuencia peptídica deducida
(PfaL) contiene los seis oligopéptidos ya caracterizados en la lacasa purificada (De
la Rubia et al. 2002; Lucas et al. 2005), por lo que se concluye que el gen
identificado corresponde efectivamente a la lacasa de P. flavido-alba.
4.2. FILOGENIA DE PFAL
La mayoría de las lacasas fúngicas se distribuyen filogeneticamente en dos
“clades” principales según el tipo de hongo: lacasas de ascomicetos y lacasas de
basidiomicetos (Valderrama et al., 2003). PfaL no se alinea filogenéticamente con
las lacasas de los basidiomicetos, sino con las de los ascomicetos.
Además una lacasa de un basidiomiceto (Cryptococcus neoformans, gi 627028) y
otra de un ascomiceto (Aspergillus nidulans gi1346405) forman un tercer grupo
92
4. Discusión
independiente (Valderrama et al., 2003) Actualmente esta lacasa de A. nidulans no
se encuentra disponible, pero sí lo esta la de Cryptococcus neoformans.
PfaL, MCO1 de P. chrysosporium , una MCO de Yarrowia lipolytica y una lacasa
de C. neoformans (que muestra una identidad del 99% con la utilizada por
Valderrama et al., 2003, la de C. neoformans gi627028) formaron un grupo
filogenético independiente de ferroxidasas y lacasas. Así, además de robustecer el
significado de la subfamilia propuesta por Larrondo et al. (2003) para alojar las
MCOs de P. chrysosporium, estos resultados refuerzan el interés por el “tercer”
grupo de lacasas descrito por Valderrama et al. (2003).
4.3. ESTRUCTURA PRIMARIA DE PfaL
4.3.1. Aminoácidos conservados de PfaL
En la secuencia deducida para PfaL se encuentran los residuos típicos que
participan en la unión al cobre en las lacasas, diez histidinas y una cisteína (Kumar
et al., 2003).PfaL tiene varias características que son únicas para MCOs. Algunas
secuencias tienen residuos conservados de ferroxidasas, pero no de lacasas. Otras
son más propias de lacasas que de ferroxidasas.
Los aminoácidos de PfaL que forman los motivos L1-L4 de unión al cobre
(Kumar et al., 2003) están conservados, más en las MCOs de P. chrysosporium,
menos en las ferroxidasas y menos aún en lacasas fúngicas. Posiblemente, por
extensión y por número de sustituciones, L-3 es el motivo de unión al cobre más
conservado entre todas las multicobre oxidasas analizadas. La mayor variación se
encuentra en los motivos L-1 y L-4. Quizás es por eso que PFAL sea la única
multicobre oxidasa analizada que en L1 posea valina, triptófano y serina. Val y
Trp son más hidrófobos que los aminoácidos que ocupan esta posición en las PcMCOs (Asp y Tyr). En las ferroxidasas el Trp está sustituido por la Met, otro
aminoácido hidrofóbico.
La ferroxidasa Fet3 de S. cerevisiae participa en la homeóstasis del hierro.
Curiosamente, a la lacasa de C. neoformans (gi57228040) se le atribuye cierta
actividad y rasgos estructurales de ferroxidasas (Liu et al., 1999; Williamson,
1994), que se correlacionan con la posición filogenética intermedia que ocupa junto
93
4. Discusión
a PfaL, entre los linajes de lacasas y ferroxidasas, en el árbol mostrado en la Fig..
17).
Se han identificado varias zonas de las ferroxidasas responsables de la oxidación
del FeII. (Askwith and Kaplan, 1998; Bonaccorsi di Patti et al. 2000 y 2001). Tres
amino ácidos participan en la unión al FeII en la Fet3 de S. cerevisiae: Glu-185,
Tyr-354 y Asp-409.Estos residuos están conservados en ferroxidasas y ausentes en
lacasas. Sin embargo, PfaL presenta Glu-234 y Tyr-413 como los equivalente a
Glu-185 y Tyr-354 de Fet3 de S.cerevisiae. La localización de Asp-409 en PFAL
es más dudosa, puesto que es sustituido por Gly-468, aunque quizá su función
podría ser asumida por Asp-471. Estos aminoácidos de PfaL se conservan en PcMCOs, aunque Larrondo et al. (2003) describió solo el equivalente de Glu-185 en
MCO1, sugiriendo que es el residuo esencial para la oxidación de FeII.
4.3.2. Glicosilación
El análisis de la proteína deducida permitió determinar varias características
particulares de PFAL.
En primer lugar, la masa molecular deducida del péptido PfaL maduro (sin la
secuencia señal) es de 56,5 kDa, un 70% de la masa molecular experimental (81,3
kDa) de la lacasa de P. flavido-alba desglicosilada (De la Rubia et al, 2002).
Asumiendo que la digestión de N-glucanos fuera completa la diferencia en masa
molecular sería atribuida a O-glucanos presentes en la proteína madura. Por lo
tanto, PfaL sería una proteína más glicosilada que el común de las lacasas fúngicas
(Farnet et al. 2000; Muñoz et al. 1997).
4.3.3. Péptido señal
El extremo amino de la lacasa pura (De La Rubia et al., 2002) se corresponde con
la secuencia de PfaL a partir del aminoácido 44. De acuerdo a SignalP3.0, pfaL
presenta una secuencia señal de secreción de 25 aminoácidos. Por tanto la señal de
secreción está incluida en un pre-péptido de 43 aminoácidos. El péptido codificado
por pfaL, debería sufrir al menos dos procesamientos proteolíticos en el extremo
N-terminal antes de producir la lacasa extracelular. Este mecanismo es diferente al
que ocurre generalmente en la secreción de las lacasas.
94
4. Discusión
En varias lacasas de ascomicetos se ha reconocido un procesamiento posttraduccional complejo (Bulter T, et al . 2003; Kiiskinen y Saloheimo 2004). Por
ejemplo, la lacasa de Myceliophthora thermophila (MtL) tiene una pre-prosecuencia que necesita ser procesada en el extremo amino y en el extremo
carboxilo para ser secretada (Alcalde et al., 2005). En otras proteínas ocurre algo
similar, como en el precursor del factor sexual α de S. cerevisiae. Dicho factor
sufre tres procesamientos proteolíticos antes de su exportación: uno en el extremo
carboxilo y dos en el extremo amino. El primer procesamiento proteolítico en el
extremo N-terminal (Fujimura-Kamada, et al., 1997) lo ejerce una Zn-metaloproteasa de membrana (STE24). En las lacasas de basidiomicetos, son menos
frecuentes estos mecanismos: Yaver et al. (1999) describió por vez primera la
necesidad de un procesamiento similares en la biosíntesis de la lacasa de C.
cinereus.
Nuestros resultados, sugieren un doble procesamiento en el extremo N-terminal de
PfaL, en el que se ubican al menos dos sitios putativos de corte por Nendopeptidasas. Actualmente, no es muy abundante la información sobre
endopeptidasas de hongos filamentosos, especialmente las involucradas en la
secreción de lacasas en hongos de la podredumbre blanca: solo dos familias de
proteasas han sido reconocidas en el genoma de P. chrysosporium (base de datos
MEROPS http://merops.sanger.ac.uk/).
4.4. ELEMENTOS PUTATIVOS DE REGULACIÓN TRANSCRIPCIONAL
El análisis de la región promotora de pfaL, amplificada con el gen mediante PCR
inversa, permitió identificar varios elementos consenso de potencial regulación
transcripcional, los cuales pueden afectar la producción de la lacasa de P. flavidoalba. Los elementos encontrados son: elementos de respuesta putativos (PRE),
elementos de respuesta a metales (MRE), a xenobióticos (XRE), a antioxidantes
(ARE y Ap1), a nitrógeno (NIT2) y a carbono (Mig1p) (Figura 18, Tabla 14).
MRE (TGC(G/A)CNC) y XRE (TCACGC) han sido descritos en regiones
promotoras de diferentes genes de lacasa y de manganeso peroxidasa de hongos
WRF (Coll et al., 1993; Gold y Alic, 1993; Giardina et al., 1995). Inicialmente, los
MRE fueron identificados en promotores de genes de metalotioneinas en diferentes
95
4. Discusión
eucariotes superiores (Imbert et al. 1990). Se sabe que tales genes son inducidos
por metales pesados como Cd, Cu y Zn (Hamer, 1995).
En Pleurotus sajor-caju, cuatro genes de lacasa fueron expresados
diferencialmente por la presencia o no de elementos de regulación. Así por
ejemplo, los niveles de mRNA del gen lac4, inducidos por adición de MnSO4, se
correlacionan con la presencia de una secuencia MRE (Soden y Dobson 2001). Los
genes lac1 y lac4, que poseen secuencias XRE, son regulados transcripcionalmente
por adición 2,5-xilidina y ácido ferúlico, mientras los genes lac2 y lac3, sin
secuencias XRE, son constitutivamente expresados bajo las mismas condiciones
(Soden y Dobson 2001). De este modo, los elementos MRE y XRE pueden estar
involucrados en la inducción de la expresión del gen lac4 por manganeso y 2,5xilidina, respectivamente. Además, la presencia de elementos ARE (TGACN
NNGC) en el gen lac4, identificados inicialmente en células de mamíferos
(Rushmore et al. 1991), indican una función potencial en su expresión por
antioxidantes fenólicos.
De otra parte, elementos reguladores tales como Mig y NIT2, involucrados en la
regulación del carbono y del nitrógeno en la expresión de genes fúngicos, se
encuentran también en regiones promotoras de los mismos genes de P. sajor-caju
(Soden y Dobson, 2001) y en otros de diferentes especies de hongos. Mig1p es un
regulador clave en la represión por glucosa en S. cerevisiae (Trumbly, 1992); en A.
nidulans, se ha descrito un homólogo de Mig1p llamado CreA; en Trichoderma
harzianum, T. reesei (Strauss et al. 1995; Takashima et al. 1996) y en Metarhizium
anisopliae (Screen et al. 1997) se han identificado proteínas cre1 y crr1 que actúan
sobre elementos reguladores similares a CreA. Estos hallazgos han sugerido que el
mecanismo regulador ejercido por Mig o similares está conservado entre los
hongos. La unión de los represores de levaduras y de hongos Mig1p, Mig2p y
CRE requieren una caja GC con secuencias consenso 5`-SYGGGG-3` y 5`SYGGRG-3` (S¼C o G, Y¼C o T y R¼A o G), respectivamente (Cubero y
Scazzochio 1994; Lundin et al. 1994). Sólo una de estas secuencias fue identificada
en la región promotora del gen pfaL, indicando su posible represión por glucosa a
través de proteínas reguladoras en P. flavido-alba.
La potencial regulación de la transcripción del gen de la lacasa por nitrógeno
depende de motivos similares a NIT2 presentes a 900, 1036 y 1325 nucleótidos
aguas arriba del gen pfaL (Fig. 18). Un gran número de genes estructurales
96
4. Discusión
involucrados en la asimilación de nitrato, metabolismo de purinas, metabolismo de
aminoácidos, catabolismo de proteínas y utilización de acetamida requieren una
proteína NIT2 (areA o gln3) para su expresión (Marzluf, 1997). De esta forma, es
posible que homólogos de NIT2 regulen la expresión de pfaL en respuesta a
nitrógeno en P. flavido-alba.
En conclusión, los mecanismos por los cuales el carbono, nitrógeno, cobre, hierro y
compuestos aromáticos regulan la transcripción de genes de la lacasa PfaL se
desconocen. Tal como se ha demostrado en otros genes, las secuencias consenso
putativas PRE, MRE, XRE, ARE, Mig y NIT2 identificadas aguas arriba de este
gen pueden estar involucradas en dicho mecanismo. La ausencia o presencia de
estos elementos puede indicar que un gen en particular responda o sea inducido por
la presencia o ausencia de diferentes condiciones fisiológicas, metales o
compuestos aromáticos.
4.5. REGULACIÓN TRANSCRIPCIONAL DE pfaL POR COMPUESTOS
FENÓLICOS
Trabajos previos sobre la degradación del alpechín (OMW), han determinado que
el PMA es un complejo de compuestos fenólicos de alto peso molecular, que
constituyen el color marrón oscuro del OMW. Su decoloración (cerca del 70%) por
P. flavido-alba, está asociada a disminución en contenido fenólico total y a
disminución de los efectos fitotóxicos y antibacterianos. Concretamente la
decoloración se atribuye a manganeso peroxidasa y a lacasa, que despolimerizan
los componentes de alto peso molecular del PMA y repolimerizan y/o mineralizan
componentes de bajo peso molecular (Ben Hammam, 1998). Recientemente, se
determinó que la inducción de la lacasa de P. flavido-alba por el alpechín, se debe
más probablemente a los fenoles monoméricos que al PMA del OMW (Ruiz et al.
2002). La vainillina y el p-hidroxibenzaldehído son los inductores más eficaces (De
la Rubia et al, 2002).
Nuestros resultados confirman la inducción de la lacasa de P. falvido-alba por
vainillina. Además, muestran que la regulación de la expresión de la lacasa pfaL es
compleja y depende del inductor. En basidiomicetos la acumulación de lacasa
extracelular está asociada a la acumulación del mRNA intracelular, como se ha
97
4. Discusión
demostrado por ejemplo en Volvariella volvacea (Chen et al., 2003) o en Trametes
(Terrón et al., 2004). La situación es diferente para la lacasa de P. flavido-alba: hay
sustancias, como la vainillina, que aumentan la actividad lacasa de los cultivos,
pero no aumentan la cantidad de transcrito acumulado intracelularmente, sino que
lo disminuyen. Por otro lado el PMA, el ácido ferúlico y la DMF, que no aumentan
la actividad lacasa, parecen inducir la transcripción del gen pfaL de P. flavido-alba
puesto que los cultivos aumentan casi tres veces la cantidad de mRNA. Parece pues
que en estos casos la traducción y/o postraducción quedaron bloqueadas, pues la
actividad lacasa extracelular en los tres casos fue semejante a la de los cultivos
control sin inductores (Figura 19). Como se observa en los resultados,
paradójicamente la vainillina parece regular la lacasa a nivel de la
traducción/postraducción.
Las lacasas de Trametes sp. I-62 son inducidas de manera diferencial por
compuestos aromáticos. El ácido ferúlico induce la expresión de lcc3, el guaiacol
y el ácido p-cumárico la de lcc1 y de lcc2, mientras que el ácido 3,5dihidroxibenzoico no altera la transcripción de ningún gen de lacasas (Terrón et al.,
2004).
El incremento de la cantidad de transcrito de pfaL observado con algunas
sustancias, puede resultar del incremento de la transcripción de pfaL y/o del
incremento de su estabilidad. Frecuentemente la inducción de la expresión de los
genes de lacasa de basidiomicetos se ha relacionado con las secuencias reguladoras
ubicadas en 5´. Cerca del promotor de pfaL, a -483 pb del codón ATG, se ha
localizado un elemento putativo de respuesta a xenobióticos (XRE) y dos
elementos putativos de respuesta a antioxidantes (ARE), a -331 y -916 desde ATG
(Fig. 18). Ambos podrían estar relacionados con la inducción de la expresión por
PMA, ácido ferúlico y DMF. XRE y ARE han sido encontrados en promotores de
genes que degradan xenobióticos o hidrocarburos aromáticos, tales como genes de
lacasas fúngicas (Soden y Dobson, 2003), genes de citocromos P450, glutation-Stranferasas y NAD(P)H:quinona oxidoreductasas de eucariotas (Kuramoto et al.,
2002; Nguyen et al., 2003). Las secuencias XRE y ARE aumentan (en cis) la
transcripción de genes relacionados con el estrés oxidativo . Los genes regulados
por XRE y ARE codifican proteínas que ayudan a controlar el estado redox de la
célula y la defienden contra el daño oxidativo (Nguyen et al., 2003)
98
4. Discusión
En conclusión, el PMA, el ácido ferúlico, o la DMF, pueden cambiar el estado
redox celular de P. flavido-alba e inducir la expresión diferencial de mRNA pfaL,
a través de factores transcripcionales que se unen a secuencias consenso XRE y/o
ARE. También es posible la presencia o ausencia de otros factores desconocidos
que estabilizan el mRNA, evitando la traducción y procesamiento de la proteína, lo
que explicaría por qué no se detectó actividad lacasa PfaL a pesar de la sobreexpresión génica. Estos mecanismos serán aclarados en futuros estudios de
regulación de pfaL.
4.6. REGULACIÓN TRADUCCIONAL/POSTRADUCCIONAL DE PfaL
POR VAINILLINA, Fe Y Cu.
4.6.1. Regulación por vainillina
La vainillina es un metoxifenol de tipo aldehídico (4-hidroxi-3metoxibenzaldehído) que se encuentra en la naturaleza como intermediario de la
degradación de la lignina (Tai et al, 1990) y como componente del alpechín
(Martínez-Nieto et al, 1992). Se sabe que induce la actividad lacasa de P. flavidoalba, pero se desconocen los mecanismos moleculares de degradación por esta
enzima. En varias lacasas fúngicas, se ha descrito que la inducción de la actividad
se corresponde con el aumento de la transcripción del mRNA por compuestos
fenólicos (Chen et al, 2003; Collins y Dobson, 1997). En nuestro caso, la adición
exógena de vainillina a cultivos de P. flavido-alba incrementó la actividad lacasa
de PfaL, pero disminuyó aparentemente la transcripción del gen. Estos resultados
sugieren que la vainillina regula la producción de lacasa a nivel traduccional y/o
postraduccional (Figura 19).
No se conoce el efecto de la vainillina sobre las MCOs de P. chrysosporium, pero
sí sobre otras enzimas relacionadas con la oxidación de moléculas aromáticas. En
P. chrysosporium, la vainillina produce cambios en las enzimas de la biosíntesis
del grupo hemo a nivel mitocondríal (Figura 22). El resultado es la acumulación de
hemoproteínas citoplasmáticas y extracelulares como peroxidasas, citocromo P450
oxigenasas y catalasas (Shimizu et al, 2005). Estas peroxidasas fueron relacionadas
con la degradación de aromáticos (Kirk y Farell, 1987; Gold et al, 1989; Ichinose et
al, 2002a y 2002b; Hiratsuka et al., 2001; Masaphy et al., 1996).
99
4. Discusión
También se ha descrito que P. chrysosporium metaboliza la vainillina en vainillinalcohol y ácido vainíllico a través de aril-alcohol deshidrogenasa y aldehido
deshidrogenasa (Shimizu et al., 2005). El ácido vainíllico a su vez se descarboxila a
metoxihidroquinona y posteriormente es convertido a 1,2,4-trihidroxibenzeno
(Rieble et al, 1994). La ruptura del anillo puede ser catalizada por 1,2,4trihidroxibenzeno-1,2-dioxigenasa (Rieble et al, 1994) u homogentisato 1,2dioxigenasa (Shimizu et al., 2005). Aunque la 1,4-benzoquinona reductasa (una
flavoproteina) puede mantener las quinonas, derivadas de la vainillina, en sus
correspondientes hidroquinonas (Shimizu et al., 2005). Estudios posteriores
determinarán el papel de la lacasa de P. flavido-alba y su relación con estas
enzimas de P. chrysosporium en la degradación de la vainillina.
De otra parte, la adición de vainillina también puede sobre-expresar proteínas
antioxidantes y proteínas de choque térmico, pues la oxidación fúngica de
compuestos relacionados con la lignina o hidrocarburos aromáticos incrementa la
formación de radicales superóxido (Guillen et al, 2000) y expresan respuestas a
estrés químico (Kim et al., 2002b). En cultivos de P. chrysosporium con vainillina,
se han identificado proteínas de estrés oxidativo, tales como Mn-superóxido
dismutasa, glutatión S-transferasa, tiorredoxina peroxidasa, tiorredoxina reductasa,
glutatión peroxidasa, glutatión reductasa y catalasa; y proteínas de choque térmico
como HSP70 y HSP80 (Shimizu et al., 2005).
100
4. Discusión
Figure 22. Flujo metabólico propuesto en P. chrysosporium en presencia de
vainillina. Las enzimas sobre-expresadas se muestran en cuadros (ACO aconitasa;
ALA5 sintetasa del ácido 5-aminolevulinico; CIT citrato sintetasa; ENO enolasa;
GPD gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa; ICL isocitrato liasa; IDH isocitrato
deshidrogenasa; ODH 2-oxoglutarato deshidrogenasa; TPI triosa-fosfato
isomerasa). (Tomado de Shimizu et al, 2005).
La regulación traduccional/postraduccional de la lacasa PfaL por vainillina puede
requerir la acción de uno o varios metabolitos de la vainillina. También es posible
que la biosíntesis de la lacasa esté relacionada con la biosíntesis de enzimas del
101
4. Discusión
grupo hemo (regulado a su vez por la disponibilidad de Fe), con la inducción de
enzimas antioxidativas o con la inducción de enzimas de estrés químico (proteínas
de choque térmico). Estudios futuros podrán definir cómo la vainillina o sus
metabolitos permiten que el mRNA pfaL esté disponible para la traducción en la
proteína y cómo intervienen en el procesamiento, secreción y/o activación de la
lacasa PfaL.
4.6.2. Regulación por cobre
La lacasa de P. flavido-alba no parece estar regulada transcripcionalmente por
cobre, puesto que la suplementación en Cu disminuye la cantidad de transcrito
(Fig. 20B). Dos argumentos apoyan esta hipótesis:
En condiciones de exceso de cobre, el aumento de actividad observado en cultivos
de varios hongos se debe a la sobre-expresión de los genes acumulando mRNA
(Soden y Dobson, 2003; Karahanian et al, 1998; Coll et al. 1993); sin embargo, el
mRNA pfaL disminuyó al añadir Cu. Por lo que deducimos que el aumento de
actividad lacasa que provoca la suplementación de Cu estaría relacionado con
eventos traduccionales y postraduccionales.
La expresión de los genes de varias metaloenzimas fúngicas, incluyendo lacasas,
en presencia de exceso de cobre está regulada por un factor de transcripción
(Ace1p, Buchman et al, 1989; Welch et al, 1989; Soden y Dobson, 2003), cuyo
consenso de unión no se ha localizado en pfaL (Fig. 18), reforzando la hipótesis de
la regulación traduccional/postraduccional de PfaL por cobre.
El cobre podría aumentar la síntesis de la proteína (no cuantificada), que podría
reflejarse en el aumento de la actividad lacasa y en la disminución de la cantidad de
mRNA (Fig. 20). Es la primera vez que se describe este evento de tipo traduccional
en lacasas y desconocemos los mecanismos que regulan la traducción del mRNA
de pfaL. Futuros estudios permitirán aclarar el efecto del cobre en la traducción de
PFAL.
Por el contrario, existen fundamentos para la regulación postraduccional de la
biosíntesis de MCOs que se pueden proponer para la biosíntesis de la lacasa de P.
flavido-alba. La inserción de los cuatro iones de cobre en las MCOs es un
102
4. Discusión
fenómeno de postraducción (Taylor, 2005; Guo et al., 2005). Este hecho refuerza
nuestra hipótesis de regulación postraduccional por cobre:
El aumento de la actividad lacasa que se produce al añadir cobre (Fig. 20). puede
deberse a la incorporación de éste a la apoproteína acumulada. Por lo tanto, la
actividad lacasa dependería de la disponibilidad de cobre y de la presencia de
apoproteina inactiva.
En cuanto a la quelación de cobre (por adición de BCS) no se observaron cambios
en la actividad lacasa de PfaL (ni en los niveles de mRNA) respecto a los del
control (Fig. 20). Una posibilidad es que las células posean mecanismos de
regulación controlada del cobre (evento postraduccional), en los que el metal sea
transportado y esté disponible de acuerdo a las necesidades del hongo. Durante el
crecimiento de levaduras con escasez de cobre, las células lo importan por
transportadores de alta afinidad Ctr1p y Ctr3p en estado reducido Cu(I)
(Kampfenkel et al., 1995). En condiciones normales de cobre –menos de un átomo
de cobre libre por célula (Rae et al., 1999)-, éstos transportadores de membrana
requieren la acción conjunta de reductasas férrico/cúpricas Fre1p y Fre2p (Dancis
et al., 1992 y 1994; Georgatsou et al., 1994 y 1997). En el citoplasma las
metalochaperonas del cobre facilitan su transporte a diferentes destinos (O'Halloran
y Culotta, 2000). En exceso de cobre, se expresan metalotioneinas Cup1p y Crs5p,
las cuales unen el cobre libre en el citoplasma (Winge et al, 1985;Jensen et al,
1996), y también se expresa la superóxido dismutasa Sod1p, la cual está
involucrada en el secuestro de los radicales libres generados en las reacciones
redox (Gralla et al, 1991).
En S. cerevisiae existe un solapamiento entre homeóstasis del cobre y metabolismo
de radicales de oxígeno (Culotta et al., 1995; Tamai et al., 1993). El gen que
codifica la metalochaperona del cobre Atx1p (anti-oxidante) fue originalmene
descrito como un gen que confiere protección contra estrés oxidativo (Lin y
Culotta, 1995). Atx1p es una chaperona de cobre citoplasmática que une cobre y lo
libera a la ATPasa tipo-P de cobre “Ccc2p” ubicada en la Red Trans de Golgi de la
vía secretora (Pufahl et al., 1997). Ccc2p bombea cobre al lumen de Golgi, donde
el cobre es luego insertado a enzimas dependientes de cobre que van a ser
secretadas, como lacasas, o donde se activa la forma apo de la Fet3 (Fig. 23). Los
factores involucrados en la homeóstasis del cobre están conservados entre
eucariotas: metalochaperonas homólogas a Atx1p y a ATPasas tipo-P que
103
4. Discusión
Figura 23. Relación entre la homeóstasis del cobre y del hierro en levaduras.
Cu(II) y Fe(III) son substratos de la metaloreductasa Fre1p. Cu(I) entra a la célula
vía Ctr1p y es transportado a post-Golgi por la chaperona Atx1p. Este Cu(I) es
transferido a la ATPasa tipo-P Ccc2p, la cual lo transporta al lumen de Golgi donde
activa la forma apo de Fet3p. En asociación con la permeasa de alta afinidad al
hierro Ftr1p, Fet3p pasa a la membrana plasmática. Ahí, su actividad ferroxidasa
absorbe Fe via Ftr1p. A las células que les falta cobre también les falta hierro
debido a la ausencia de Fet3p activo. Tomado de Taylor et al (2005).
104
4. Discusión
transportan cobre han sido descritas también en plantas, nemátodos, mamíferos y
recientemente en basidiomicetos (Himelblau et al., 1998; Hung et al., 1997; Klomp
et al., 1997; Payne y Gitlin, 1998; Wakabayashi, 1998; Uldschmid et al, 2002). En
conclusión, hay una relación recíproca entre PfaL y el cobre: PfaL está relacionada
en la homeóstasis del cobre, siendo este metal determinante en su actividad lacasa
y ferroxidasa.
4.6.3. Regulación por hierro
La regulación traduccional/postraduccional es similar a la observada con el cobre
(Fig 20), es decir, que la adición del hierro aumentó la actividad lacasa (por
aumento de la traducción, o por activación de la proteína o por activación de
factores de la homeóstasis del Fe), mientras que los niveles de mRNA pfaL
disminuyeron. Los resultados de este trabajo sugieren que, al igual que el cobre, el
hierro no induce la transcripción de pfaL, pero interviene en la regulación
traduccional y postraduccional de PfaL. Ello indicaría que PfaL estaría involucrada
en la homeóstasis del cobre y del hierro en P. flavido-alba.
De hecho, estos dos metales están interrelacionados en el metabolismo celular de
eucariotas, tal como se detalló anteriormente en la homeóstasis del cobre (Fig. 23).
En S. cerevisiae la ferroxidasa Fet3 se activa en el aparato de Golgi por inserción
de los cuatro átomos de Cu (cedidos por dos metalochaperonas), antes de participar
en el transporte de Fe en la membrana citoplasmáticas.
Se sabe que la lacasa de P. flavido-alba tiene actividad ferroxidasa. Puede que su
activación postraduccional por cobre también dependa del Fe a través de
mecanismos específicos de la homeóstasis de Cu-Fe, que no necesariamente son
comunes para diferentes
organismos. Por ejemplo, Atx1p es activada
transcripcionalmente por hierro en levaduras, pero por cobre en Trametes
versicolor y es reprimida por Cu en Arabidospsis thaliana (Uldsmid et al., 2002).
Por otro lado en P. chrysosporium se ha identificado una proteína de membrana,
ortóloga de Fet3 de levaduras (Larrondo et al., 2004). PfaL y MCO1 de P.
chrysosporium son proteínas extracelulares, no proteínas de membrana, por lo que
difícilmente participarían en el transporte de Fe como ferroxidasas típicas. Mas
bien se ha propuesto el papel detoxificador de MCO1 de P. chrysosporium,
evitando la formación de radicales hidroxilo (Larrondo et al 2003): al oxidar FeII a
105
4. Discusión
FeIII, el hierro presente no puede participar en la reacción de Fenton, origen de los
radicales oxidantes.
Sea como fuere, este análisis confirma la estrecha relación entre las MCOs de las
dos especies de Phanerochaete, que como se mencionó anteriormente constituyen
una nueva rama filogenética entre las multicobre oxidasas.
106
5. CONCLUSIONES
5. Conclusiones
108
5. Conclusiones
5.1. Se ha caracterizado el gen de la lacasa de P. flavido-alba (pfaL) y una región
reguladora de su expresión
5.1.1. Se identificó y caracterizó un locus del gen de la lacasa de P. flavido- alba
(pfaL). Su tamaño es de 2755 pb, de los cuales 1704 pb codifican un polipéptido de
567 aminoácidos. Este polipéptido contiene los seis oligopéptidos caracterizados en
la lacasa pura, confirmando la autenticidad del gen. El resto son secuencias no
codificantes: 19 intrones, una región reguladora UTR-3’ de 244 pb y la región 5`
que incluye al promotor.
5.1.2. Junto con la secuencia génica, se ha amplificado una región “upstream”- 5`
de 1590 pb que contiene un promotor tipico de eucariotas con una caja TATA y
sitios potenciales de regulación propios de lacasas, como son secuencias consenso
para .PRE, elementos de respuesta a metales (MRE), a antioxidantes (ARE), a
xenobióticos (XRE), a nitrógeno (NIT2) y a carbono (Mig).
5.2.
El gen de la lacasa de P. flavido-alba y su proteína parecen estar
filogenéticamente menos emparentado con los de lacasas de basidiomicetos que
con los de lacasasa de ascomicetos. Aún mas, filogenéticamente están mas
próximos a los genes de multicobre oxidasas (MCOs) de ascomicetos que a sus
lacasas.
5.2.1. El gen pfaL es similar en tamaño y organización de intrones a los genes
multicobre oxidasas de P. chrysosporium: pfaL tiene la misma distribución y
número de intrones que mco1B; es destacable especialmente la coincidencia en las
secuencias que codifican los aminoácidos de unión al cobre.
5.2.2 Los intrones de pfaL poseen sitios conservados de corte/unión, (donador y
aceptor), típicos de hongos. Las secuencias internas de los intrones de pfaL tienen
poca identidad con la de los genes mco de P. chrysosporium.
109
5. Conclusiones
5.2.3 La secuencia deducida para PfaL presenta un 59% de identidad para las
proteínas deducidas MCO4A y MCO4B de P. chrysosporium.
5.2.4. PfaL es evolutivamente cercana a las MCOs de P.chrysosporium, y junto a
dos lacasa de C. neoformans (basidiomiceto) y una ferroxidasa de Y. lipolytica
(ascomiceto) forman una rama independiente de las multicobre oxidasas, separada
de ferroxidasas y lacasas.
5.3. La secuencia deducida para la lacasa de P. flavido-alba conserva posiciones
características de lacasas y de ferroxidasas de ascomicetos.
5.3.1. Como lacasa típica, PFAL posee los residuos de unión al cobre tipo1
mononuclear y tipo 2/3 trinuclear distribuidos en las regiones conservadas L1-L4.
5.3.2. A diferencia de las lacasas de ascomicetos, PfaL conserva el Glu equivalente
al Glu-185 de la ferroxidasa Fet3 de S. cerevisiae, que se ha implicado en la unión
al FeII. Ni las lacasas de ascomicetos, ni PfaL, ni las MCOs de P.. chrysosporium
consevan la Tyr equivalente a la Tyr-354 que también se une al FeII en Fet 3 de S.
cerevisiae. Sin embargo, a diferencia de las lacasas, PfaL y MCO1B conservan esta
Tyr, dos posiciones mas adelante (Tyr-413 en Pfal y Tyr-398 en MCO1). La
presencia de estos aminoácidos de unión al hierro justificarían la actividad
ferroxidasa de PfaL y de MCO1 de P. chrysosporium y se correlacionan con el
análisis filogenético obtenido.
5.4. PfaL se sintetizaría como una preproteína que requiere al menos dos
procesamientos proteolíticos para su secreción.
5.4.1. Probablemente, se sintetiza como una pre-proteína con una secuencia señal
de secreción, (de extensión poco común, 43 aminoácidos) seguida de la proteína
madura de 524 aminoácidos.
5.4.2. Los resultados sugieren que la pre-proteína PfaL sufriría dos procesamientos
proteolíticos en el extremo N-terminal, poco frecuente en las lacasas de
110
5. Conclusiones
basidiomicetos. Además, PfaL sufririá mayor glicosilación que el común de estas
lacasas.
5.5. La regulación de la producción de la lacasa de P. flavido-alba es diferente a
la aceptada para las lacasas de los basidiomicetos. En presencia de inductores no
hay correlación entre actividad extracelular y cantidad de mRNA intracelular.
Probablemente el cobre y el hierro regulan la producción de la lacasa a nivel
traduccional/postraduccional.
5.5.1. La complejidad de la regulación de la expresión de pfaL (transcripcional,
traduccional y/o postraduccional) puede justificar la falta de correlación entre
actividad lacasa y cantidad de transcrito observada en cultivos añadidos del PMA,
del ácido ferúlico o de la vainillina. Esto se reflejó cuando el pigmento PMA del
alpechín y el ácido ferúlico indujeron la expresión del mRNA pfaL, pero la
actividad lacasa no cambió. Mientras que la vainillina indujo la
traducción/postraducción del mRNA solamente, determinada en un aumento de
actividad y en disminución del mRNA respecto al control sin inductor.
5.5.2. Los inductores aromáticos ensayados (PMA, ácido ferúlico., tirosol y
vanillina), al igual que la dimetilformamida, podrían regular positivamente la
expresión del gen pfaL, a través de alguna de las regiones reguladoras
identificadas que participan en la respuesta al estrés oxidativo (XRE y ARE).
Aunque los mecanismos celulares se desconocen, el mRNA pfaL se expresa
diferencialmente, dependiendo del tipo de inductor adicionado: la más alta
inducción de la transcripción se produce con la mezcla polimérica PMA y con la
dimetilformamida, menos con el ácido ferúlico y probablemente inhibida con el
tirosol.
5.5.3. En P. chrysosporium, la degradación de vainillina implica a enzimas del
estrés oxidativo. La extrapolación de este sistema a P. flavido-alba, conecta la
regulación de la traducción y/o postraducción de PfaL, tanto con la degradación de
la vainillina como con el proceso mas general de la respuesta al estrés oxidativo.
111
5. Conclusiones
5.5.4. El cobre y el hierro parecen no inducir la transcripción del mRNA pfaL. Es
más probable que la regulación sea a nivel traduccional/postraduccional, bien por
aumento de la síntesis de PFAL, o por activación de la proteína o por activación de
factores involucrados en los mecanismos homeostáticos del Cu /Fe.
5.5.4.1. A nivel postraduccional la actividad lacasa dependería de la disponibilidad
de cobre y de la presencia de apoproteina inactiva.
5.5.4.2. A nivel traduccional, se desconocen los mecanismos de la regulación por
estos metales.
5.5.4.3. PfaL carece de dominios transmembrana y por tanto no participa en el
transporte de hierro a nivel de membrana, papel de la ferroxidasa Fet3 de
levaduras. Sin embargo, son varias las características que la definen como
ferroxidasa: la cercanía filogenética, la conservación de residuos de unión al hierro
y la regulación por hierro.
112
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