85 Micropropagación: desinfección de los instrumentos PDF

MICROPROPAGACIÓN
DESINFECCIÓN DE LOS INSTRUMENTOS
Las técnicas de cultivo de tejidos vegetales consisten en la transferencia de un explante a un medio
de cultivo estéril, en condiciones asépticas. Evitar la contaminación microbiana del medio de cultivo
es una de las mayores dificultades técnicas, porque demanda tanto la desinfección de los explantes
como la esterilización de los instrumentos utilizados.
Se pueden comprar palillos empaquetados individualmente en comercios a bajo costo. Se
consiguen estériles y son descartables (Figura 1).
Figura 1. Palillos incubados en agar nutritivo, durante una semana a temperatura ambiente.
Los cuchillos y las pinzas envueltos en papel de aluminio deben esterilizarse mediante calor
húmedo (autoclave, 25 minutos en olla a presión), o mediante calor seco (en el horno, 3 horas a
360ºC). La elección de un método u otro depende de la presencia de partes de plástico que pueden
derretirse con el calor excesivo. Desde el punto de vista práctico, el uso de cuchillos y pinzas
estériles resulta inviable a lo largo del todo el procedimiento de transferencia de explantes.
Sin embargo, los instrumentos pueden ser reutilizados una vez que se desinfectan adecuadamente,
por inmersión en una solución con hipoclorito de sodio, alcohol o agua oxigenada.
Las concentraciones de esos productos pueden variar en función de las condiciones de
almacenamiento y no todos son eficientes en la eliminación de esporas bacterianas. Por tanto
consideramos indispensable testear la desinfección de los instrumentos antes de comenzar a
trabajar con cultivos de tejidos.
BIBLIOGRAFÍA
SMITH R. A. Plant Tissue Culture Studies. Reston, Virginia. National Association of Biology
Teachers, 1997.
Guía 85
María Antonia Malajovich / Guías de actividades
Biotecnología: enseñanza y divulgación
http://www.bteduc.bio.br
MICROPROPAGACIÓN / DESINFECCIÓN DE LOS INSTRUMENTOS
ACTIVIDAD PRÁCTICA
OBJETIVO
Comparar la eficiencia de los desinfectantes usuales de laboratorio, en la limpieza de los
instrumentos que serán utilizados en los cultivos de tejidos vegetales.
MATERIALES
Dos placas de Petri con agar nutritivo estéril, 1 tubo con caldo nutritivo inoculado con Bacillus
subtilis, 1 tubo con caldo nutritivo inoculado con Escherichia coli, 2 pinzas esterilizadas
previamente por calor húmedo o seco, dos vasos de precipitados con el desinfectante a evaluar
(uno para B. subtilis, otro para E.coli).
PROCEDIMIENTO
Seguir las normas de trabajo standard (Ver Guía Nº 67: trabajar en condiciones
seguras).
1. Dividir la placa de Petri en 3 sectores, como se indica en el
esquema adyacente (Control, 1 y 2).
2. Con la pinza estéril, hacer un trazo en el sector C.
2
3. Mojar la punta de la pinza en el cultivo de Escherichia coli y hacer
un trazo en el sector 1.
4. Dejar la pinza en uno de los vasos de precipitados con desinfectante,
durante 15 minutos.
1
C
5. Retirar la pinza, dejando escurrir el exceso de líquido, y hacer un trazo en el sector 2.
6. Repetir el procedimiento anterior en la segunda placa, con otra pinza estéril, el otro vaso de
precipitados con desinfectante y el cultivo de Bacillus subtilis.
7. Incubar ambas placas a temperatura ambiente, hasta que el crecimiento bacteriano en el sector
1 sea evidente.
8. Analizar los resultados.
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MICROPROPAGACIÓN / DESINFECCIÓN DE LOS INSTRUMENTOS
NUESTRO COMENTARIO
En función de la limitación de material y del alto número de contaminaciones que ocurren en el
laboratorio de enseñanza, podemos testear la eficiencia de varios desinfectantes con Escherichia
coli y con Bacillus subtilis, una bacteria que esporula.
Los desinfectantes elegidos fueron los de uso habitual: solución de hipoclorito de sodio (água
sanitária, marca Globo), agua oxigenada 30%, etanol 92,8º, etanol 70º y CLOR-in 10
(dicloroisocianurato de sodio). Se adaptó el procedimiento detallado anteriormente a cada
desinfectante, como se indica a continuación:
1. Solución de hipoclorito de sodio
Inmersión de la pinza contaminada en una solución de agua sanitaria 50% (v/v) durante 20
minutos y posterior enjuague en una solución de agua sanitaria 5% (v/v).
La concentración puede parecer muy alta, especialmente en relación con aquellas
recomendadas en los protocolos de autores ingleses y norteamericanos. En sus países, la
concentración normal del hipoclorito de sodio comercial es del 5%. En Brasil esa concentración
es del 2 a 2,5%, de modo que adaptamos las recomendaciones de esos autores a nuestras
condiciones.
Aclaración: água sanitária es el nombre comercial de la solución de hipoclorito de sodio en
Brasil. En Argentina y otros países, es llamada lavandina, lejía en España y agua jano en Chile.
En Argentina la concentración de la lavandina es del 5%.
2. Agua oxigenada
Inmersión de la pinza contaminada en una solución de agua oxigenada 3% (v/v) durante 20
minutos
3. Etanol (92,8º y 70º)
Inmersión de la pinza contaminada en etanol 92,8º o en etanol 70º, durante 20 minutos
4. Clor-in 10 (Purificador de agua)
Inmersión de la pinza contaminada en una solución de Clor-in 10 (1 tableta/500 ml) durante 20
minutos.
Paralelamente, se realizó un control con agua destilada estéril (tiempo de inmersión, 20 minutos).
Los resultados esperados eran los siguientes:
Sector C: sin crecimiento microbiano a lo largo del trazo hecho con la pinza (Control del test de
esterilidad)
Sector 1: crecimiento de las bacterias inoculadas (Escherichia coli o Bacillus subtilis)
Sector 2: el crecimiento bacteriano indicaría la ineficiencia del desinfectante utilizado; la ausencia
de crecimiento mostraría su eficiencia.
Los resultados encontrados se muestran en la Figura 2 y en la Tabla 1. Los mejores desinfectantes
fueron la solución de hipoclorito de sodio (“água sanitária”), el agua oxigenada y el Clor-in 10.
Ninguna de las dos concentraciones de etanol mostró ser eficiente en relación con Bacillus subtilis.
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MICROPROPAGACIÓN / DESINFECCIÓN DE LOS INSTRUMENTOS
¿CÓMO MONTAR UN PROYECTO?
Estudiar la eficiencia de un desinfectante en función del tiempo de inmersión de los instrumentos
en el producto.
Figura 2: Eficiencia de varios productos en la desinfección de las pinzas contaminadas con
Escherichia coli (parte superior de la imagen) y con Bacillus subtilis (parte inferior de la imagen).
C=trazo con la pinza esterilizada; 1=trazo con la pinza contaminada; 2=trazo con la pinza
“desinfectada”.
Agua
“Água sanitária” 50%
Alcohol 700
Alcohol 92,80
Agua oxigenada 3%
Clor-in 10
Tabla 1: Eficiencia de varios productos en la desinfección de las pinzas.
CLOR-IN 10
OXIGENADA 3%
AÁGUA
ALCOHOL 92,80
ALCOHOL 700
“ÁGUA
SANITÁRIA”
AGUA
TRATAMIENTO
(+: tratamiento eficiente; -: tratamiento ineficiente)
B. subtilis
-
+
-
-
+
+*
E. coli
-
+
+
+
+
+
(*) Una colonia presente en el sector 2 se encuentra fuera del trazo causado por la pinza.
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