MICROPROPAGACIÓN DESINFECCIÓN DE LOS INSTRUMENTOS Las técnicas de cultivo de tejidos vegetales consisten en la transferencia de un explante a un medio de cultivo estéril, en condiciones asépticas. Evitar la contaminación microbiana del medio de cultivo es una de las mayores dificultades técnicas, porque demanda tanto la desinfección de los explantes como la esterilización de los instrumentos utilizados. Se pueden comprar palillos empaquetados individualmente en comercios a bajo costo. Se consiguen estériles y son descartables (Figura 1). Figura 1. Palillos incubados en agar nutritivo, durante una semana a temperatura ambiente. Los cuchillos y las pinzas envueltos en papel de aluminio deben esterilizarse mediante calor húmedo (autoclave, 25 minutos en olla a presión), o mediante calor seco (en el horno, 3 horas a 360ºC). La elección de un método u otro depende de la presencia de partes de plástico que pueden derretirse con el calor excesivo. Desde el punto de vista práctico, el uso de cuchillos y pinzas estériles resulta inviable a lo largo del todo el procedimiento de transferencia de explantes. Sin embargo, los instrumentos pueden ser reutilizados una vez que se desinfectan adecuadamente, por inmersión en una solución con hipoclorito de sodio, alcohol o agua oxigenada. Las concentraciones de esos productos pueden variar en función de las condiciones de almacenamiento y no todos son eficientes en la eliminación de esporas bacterianas. Por tanto consideramos indispensable testear la desinfección de los instrumentos antes de comenzar a trabajar con cultivos de tejidos. BIBLIOGRAFÍA SMITH R. A. Plant Tissue Culture Studies. Reston, Virginia. National Association of Biology Teachers, 1997. Guía 85 María Antonia Malajovich / Guías de actividades Biotecnología: enseñanza y divulgación http://www.bteduc.bio.br MICROPROPAGACIÓN / DESINFECCIÓN DE LOS INSTRUMENTOS ACTIVIDAD PRÁCTICA OBJETIVO Comparar la eficiencia de los desinfectantes usuales de laboratorio, en la limpieza de los instrumentos que serán utilizados en los cultivos de tejidos vegetales. MATERIALES Dos placas de Petri con agar nutritivo estéril, 1 tubo con caldo nutritivo inoculado con Bacillus subtilis, 1 tubo con caldo nutritivo inoculado con Escherichia coli, 2 pinzas esterilizadas previamente por calor húmedo o seco, dos vasos de precipitados con el desinfectante a evaluar (uno para B. subtilis, otro para E.coli). PROCEDIMIENTO Seguir las normas de trabajo standard (Ver Guía Nº 67: trabajar en condiciones seguras). 1. Dividir la placa de Petri en 3 sectores, como se indica en el esquema adyacente (Control, 1 y 2). 2. Con la pinza estéril, hacer un trazo en el sector C. 2 3. Mojar la punta de la pinza en el cultivo de Escherichia coli y hacer un trazo en el sector 1. 4. Dejar la pinza en uno de los vasos de precipitados con desinfectante, durante 15 minutos. 1 C 5. Retirar la pinza, dejando escurrir el exceso de líquido, y hacer un trazo en el sector 2. 6. Repetir el procedimiento anterior en la segunda placa, con otra pinza estéril, el otro vaso de precipitados con desinfectante y el cultivo de Bacillus subtilis. 7. Incubar ambas placas a temperatura ambiente, hasta que el crecimiento bacteriano en el sector 1 sea evidente. 8. Analizar los resultados. Guía 85 María Antonia Malajovich / Guías de actividades Biotecnología: enseñanza y divulgación http://www.bteduc.bio.br MICROPROPAGACIÓN / DESINFECCIÓN DE LOS INSTRUMENTOS NUESTRO COMENTARIO En función de la limitación de material y del alto número de contaminaciones que ocurren en el laboratorio de enseñanza, podemos testear la eficiencia de varios desinfectantes con Escherichia coli y con Bacillus subtilis, una bacteria que esporula. Los desinfectantes elegidos fueron los de uso habitual: solución de hipoclorito de sodio (água sanitária, marca Globo), agua oxigenada 30%, etanol 92,8º, etanol 70º y CLOR-in 10 (dicloroisocianurato de sodio). Se adaptó el procedimiento detallado anteriormente a cada desinfectante, como se indica a continuación: 1. Solución de hipoclorito de sodio Inmersión de la pinza contaminada en una solución de agua sanitaria 50% (v/v) durante 20 minutos y posterior enjuague en una solución de agua sanitaria 5% (v/v). La concentración puede parecer muy alta, especialmente en relación con aquellas recomendadas en los protocolos de autores ingleses y norteamericanos. En sus países, la concentración normal del hipoclorito de sodio comercial es del 5%. En Brasil esa concentración es del 2 a 2,5%, de modo que adaptamos las recomendaciones de esos autores a nuestras condiciones. Aclaración: água sanitária es el nombre comercial de la solución de hipoclorito de sodio en Brasil. En Argentina y otros países, es llamada lavandina, lejía en España y agua jano en Chile. En Argentina la concentración de la lavandina es del 5%. 2. Agua oxigenada Inmersión de la pinza contaminada en una solución de agua oxigenada 3% (v/v) durante 20 minutos 3. Etanol (92,8º y 70º) Inmersión de la pinza contaminada en etanol 92,8º o en etanol 70º, durante 20 minutos 4. Clor-in 10 (Purificador de agua) Inmersión de la pinza contaminada en una solución de Clor-in 10 (1 tableta/500 ml) durante 20 minutos. Paralelamente, se realizó un control con agua destilada estéril (tiempo de inmersión, 20 minutos). Los resultados esperados eran los siguientes: Sector C: sin crecimiento microbiano a lo largo del trazo hecho con la pinza (Control del test de esterilidad) Sector 1: crecimiento de las bacterias inoculadas (Escherichia coli o Bacillus subtilis) Sector 2: el crecimiento bacteriano indicaría la ineficiencia del desinfectante utilizado; la ausencia de crecimiento mostraría su eficiencia. Los resultados encontrados se muestran en la Figura 2 y en la Tabla 1. Los mejores desinfectantes fueron la solución de hipoclorito de sodio (“água sanitária”), el agua oxigenada y el Clor-in 10. Ninguna de las dos concentraciones de etanol mostró ser eficiente en relación con Bacillus subtilis. Guía 85 María Antonia Malajovich / Guías de actividades Biotecnología: enseñanza y divulgación http://www.bteduc.bio.br MICROPROPAGACIÓN / DESINFECCIÓN DE LOS INSTRUMENTOS ¿CÓMO MONTAR UN PROYECTO? Estudiar la eficiencia de un desinfectante en función del tiempo de inmersión de los instrumentos en el producto. Figura 2: Eficiencia de varios productos en la desinfección de las pinzas contaminadas con Escherichia coli (parte superior de la imagen) y con Bacillus subtilis (parte inferior de la imagen). C=trazo con la pinza esterilizada; 1=trazo con la pinza contaminada; 2=trazo con la pinza “desinfectada”. Agua “Água sanitária” 50% Alcohol 700 Alcohol 92,80 Agua oxigenada 3% Clor-in 10 Tabla 1: Eficiencia de varios productos en la desinfección de las pinzas. CLOR-IN 10 OXIGENADA 3% AÁGUA ALCOHOL 92,80 ALCOHOL 700 “ÁGUA SANITÁRIA” AGUA TRATAMIENTO (+: tratamiento eficiente; -: tratamiento ineficiente) B. subtilis - + - - + +* E. coli - + + + + + (*) Una colonia presente en el sector 2 se encuentra fuera del trazo causado por la pinza. Guía 85 María Antonia Malajovich / Guías de actividades Biotecnología: enseñanza y divulgación http://www.bteduc.bio.br