AISLADOS DE Hirsutella thompsonii var

AISLADOS DE Hirsutella thompsonii var. thompsonii DEL ESTADO DE
GUERRERO, MÉXICO; CON POTENCIAL PARA COMBATIR ÁCAROS PLAGA
José Luis ROSAS-ACEVEDO1, Drion G. BOUCIAS2, Audel SÁNCHEZ INFANTE3,
Wheizhein LIU2, Ana Yolanda ROSAS-ACEVEDO3 y Shyhi HUNG2
1
Unidad de Ciencias de Desarrollo Regional. Universidad Autónoma de Guerrero,
Pino S/N. Col. El Roble. Acapulco, Gro. México. 39640. [email protected].
2
Departamento de Entomología. Universidad de Florida. Gainesville. Fla. 3Unidad
Académica No. 13. Zihuatanejo, Gro. México.
Palabras clave: toxina, fermentación líquida, ácaropatógeno, tetraníquidos,
eriófidos
RESUMEN
Los estudios de inspección y valoración de los hongos entomopatógenos,
han permitido la caracterización de diferentes metabolitos secundarios que son
potencialmente útiles, como alternativas amigables con el ambiente para el control
de insectos y ácaros. Seis aislados de Hirsutella thompsonii fueron analizados
utilizando la técnica de ELISA, Western blot (Dot blot®) y electroforésis en
poliacrilamida (SDS-PAGE), para detectar la producción de la toxina HtA
(Hirsutellina A) en medio líquido, por cada una de las cepas aisladas en el estado
de Guerrero, México. La concentración de HtA en el medio de cultivo fue de 10 a
14 μg/ml a las 120-144 hr (300 rpm) y a las 39-45 hr (500rpm). El pH en el medio
de cultivo disminuyó hasta 5.8 para posteriormente incrementarse a pH 8. Todos
los aislamientos de H. thompsonii secretaron HtA detectable en el medio de
cultivo, con variaciones de 3-10 μg/ml.
INTRODUCCIÓN
El hongo H. thompsonii, ha sido aislado de diversos ácaros en diferentes
regiones tropicales y templadas alrededor del mundo (Rosas-Acevedo, 2006), en
México tiene amplia distribución en las zonas tropicales (Rosas-Acevedo y
Sampedro, 1992; 2006), con potencial para utilizarlo como agente de control
biológico por sí solo o en programas de Manejo Integrado de Plagas (MIP) para
ácaros de importancia económica como por ejemplo: Tetranychidae: Tetranychus
urticae, Eriophyidae: Phyllocoptrupta oleivora, Aceria guerreronis, Tarsonemoidea:
Polyphagotharsonemus latus, Varroidae: Varroa spp., y otros más.
Por otro lado, se han aislado diferentes productos metabólicos secretados
en la fase vegetativa (Mazet y Vey, 1995; Vey et al., 1993, Krasnoff y Gupta, 1994)
y esporulativa (Rosas-Acevedo et al., 2003) de estos hongos. Uno de estos
metabolitos es la denominada Hirsutellina A (toxina proteíca con peso molecular
de 16.3 Kd). Con toxicidad no sólo a ácaros, sino que también a otros insectos:
Aedes aegypti, Plutella Xilostella, Drosophilla melanogaster y Galleria mellonella
(Mazet y Vey, 1995; Vey et al., 1993).
1
Los hongos producen metabolitos (micotoxinas) cuando crecen en
diferentes substratos incluyendo plantas vivas, mantillo y los desechos agrícolas
almacenados bajo diferentes condiciones. La producción de micotoxinas es
determinada por el aislamiento del hongo, los nutrimentos y las interacciones con
otros hongos; por el clima, resistencia al hospedero y disponibilidad por el
substrato; por las condiciones de almacenamiento y por el uso de agentes
antifúngicos. Sin embargo, independientemente estos factores raramente
funcionan. Probablemente los más importantes y que más afectan que los otros
factores, son la disponibilidad de agua y la temperatura (Lacey, 1985; Schefer,
1991).
Losusos potenciales de H. thompsonii como bio-acaricida o plaguicida amigable
con el ambiente, se han centrado en dos aspectos del hongo:
a) Al reproducirlo y utilizar su fase vegetativa y/o esporulativa (Rosas-Acevedo
et al., 1994,1995;2003), y
b) La purificación de los metabolitos secundarios (Mazet y Vey, 1995; RosasAcevedo et al., 2003), producidos en fermentación líquida, sólida o mixta.
México posee una amplia gama de zonas ecológicas debido a su ubicación de
transición donde confluyen la zona neotropical y la templada. Esto implica
diversidad biológica en donde existe una comunidad rica de patógenos nativos de
ácaros e insectos, como la cepa HtM120I de H. thompsonii productora de
abundantes exudados rosados, con actividad biológica diferente al resto de los
metabolitos caracterizados para Hirsutella (Rosas-Acevedo et al., 2003).
De ahí la importancia de los estudios de inspección y valoración de los aislados
del hongo, para dilucidar la naturaleza de las toxinas y delimitar su potencialidad
en el control de plagas, que propicie el uso adecuado de insecticidas y el menor
impacto al ambiente, al reducir la utilización de productos químicos y utilizar como
alternativa amigable al ambiente a los entomopatógenos fúngicos.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se utilizaron seis cepas de H. thompsonii: (HtM120I(223), HtM52 (550);
HtM321 (582); HtM435 (32); HtM552 (13) y HtM747 (H8). Aisladas en la costa
grande de Guerrero (1999-2001), en la franja costera Tecpan-Zihuatanejo, sobre
cultivo de cocotero y cítricos (Tabla I). Como referencia se utilizó la cepa brasileña
HtJABO4 (1614), caraterizada por Mazet y Vey, (1995) y Vey et al., (1993) (Figura
1).
Los aislados fueron mantenidos en refrigeración en medio Extracto de Malta
Agar (EMA), posteriormente se transfirieron a matraces con 250 ml de medio
líquido de papa- dextrosa- extracto de levadura (PDY) y agitación a 300 y 500
rpm, pH 6 y 25°C. Para detectar a las proteínas solubles y a la toxina HtA durante
la fase de crecimiento, el sobrenadante del medio líquido fue precipitado antes de
cargarlos en geles de SDS-PAGE y realizar la electroforésis. Los volúmenes de
las muestras fueron mezclados con dos volúmenes de 0.1 N acetato de amonio +
metanol en tubos Eppendorf de 1.5 ml (Tan et al., 1984; Shiau y Chen, 1997). Se
2
almacenaron durante la noche a -20°C. Pasado este tiempo, los precipitados
fueron colectados por centrifugación a 12, 000 rpm durante 10 minutos y la pastilla
de proteínas precipitadas fue liofilizada. Los precipitados liofilizados fueron
disueltos en100 μl de agua destilada y dializados a 4°C durante dos horas, con
tres cambios de agua destilada (Mollier et al., 1994; Liu et al., 1995). Las muestras
así tratadas fueron usadas para los estudios de electroforésis (Bozarth y Harley,
1976) y la prueba de ELISA (Van Weemen, 1985).
Tabla I. Procedencia de los aislados guerrerences de H. thompsonii
Cepa
Hospedante
Lugar de colecta
HtM120I
Tretanychus sp
Ixtapa-Zihuatanejo, Méx. (1999)
HtM52
Aceria guerreronis
Tecpan, Gro. Méx. (2000)
HtM321
Phyllocoptrupta oleivora
Tecpan, Gro. Méx. (2000)
HtM435
T. urticae
Zihuatanejo, Gro. Méx. (2001)
HtM552
Tetranychus sp
Zihuatanejo, Gro. Méx. (2001)
HtM747
T. urticae
Zihuatanejo, Gro. Méx. (2001)
HtJAB04
P. oleivora
Jacoticabel, Brazil (1992)
Figura 1. cepas de H. thompsonii: (HtM120I(223), HtM52 (550); HtM321 (582);
HtM435 (32); HtM552 (13) y HtM747 (H8).Cepa brasileña HtJABO4 (1614) sirvió
de referencia.
A las muestras precipitadas en acetato de amonio como se describió
anteriormente, se les adicionaron aliquotas (2X) de buffer para lisis proteica (Lou,
1983; Shi et al., 1992) y se colocaron en agua en ebullición por 5 minutos, para
desnaturalizar las proteínas (Sambrook et al., 1989; Liu et al., 1995).
Al mismo tiempo, se prepararon geles discontinuos de SDS-PAGE que
contenían 15% de gel separador y 4% de gel de empaquetamiento (Bio-Rad Lab,
3
Richmond Ca), que se basa por lo descrito por Laemmli (1970). Los geles fueron
teñidos con azul de Commassie R250, por 30 minutos y desteñidos en 40%
MeOH+ 10% HOAC por una hora. Los geles fueron fotografiados con scanner
Hewllet Packard Scand Jet.
El micelio fue colectado por filtración al vacío después de 10 días y el pH se
midió con un potenciómetro (Accumet Modelo 325, Research Scientific Co.)
Las concentraciones de HtA, fueron determinadas por ELISA con Anti-HtA
MAB-4A3 y Western blot (Dot blot) como prueba final, usadas con anterioridad por
Liu et al (1995) para otras cepas de H. thompsonii de otras regiones del mundo.
Se usaron para este efecto, placas de microtitulación con base delgada
(Corning Glass Works, Ithaca, NY) que fueron prebañadas (100μl /orificio) de una
solución preparada con 5μg de antígeno (HtA) diluido en buffer de bicarbonato de
sodio 50 mM, pH 7.5 e incubado a 4°C durante la noche. La toxina purificada (HtA)
a 10 μg/ml y los sobrenadantes a 1.25 μg/ml fueron adicionados, el buffer de
bicarbonato de sodio sirvió de control. La placa de microtitulación fue incubada a
37°C por una hora y después lavadas cinco veces con 1XPBS+0.05% Tween-20 y
se hicieron reaccionar con 100 μl de una dilución 1:3,000 de antisuero de ratón
IgG conjugado en fosfatasa alcalina (Sigma Chemical). La densidad óptica (D.O.)
fue determinada por una longitud de onda de 405 nm usando un lector de
microplacas Dynatech 600.
La técnica de Western blot (con microfiltración Dot blot®), fue usada para
determinar si el sobrenadante desnaturalizado podría transferir el antígeno de la
toxina (HtA) a las membranas y ser identificada su presencia (Towbin et al., 1979).
Para la transferencia del antígeno a las membranas, se utilizó el aparato de
microfiltración Bio-Dot® (Bio-Rad). Las membranas fueron Imobilin-P® de
Millipore, las cuales se rehidrataron previamente en metanol y en una solución de
1XPBS (Hoffert et al., 1995). Diluciones de la toxina (HtA) purificada, fueron
aplicadas en la membrana como control interno para estimar los niveles de toxina
(Liu et al., 1995).
RESULTADOS
En la Tabla II se muestran las concentraciones de HtA producidas por las
cepas aisladas en el estado de Guerrero. Los niveles elevados de HtA (hasta 7
μg/ml) los presentaron las cepas: HtM435, HtM552, HtM747 y HtJAB04, y los
niveles bajos (cercanos a 3 μg/ml) la HtM52 y HtM321. La cepa HtM120I resulto
en el nivel medio (5 μg/ml). De los siete aislamientos, los que presentaron conidios
poliblásticos (Figura 2) produjeron los niveles más elevados de HtA.
Tabla II Crecimiento micelial, pH y producción de HtA de seis aislados de H.
micelio
pH
HtA (μg/ml)
thompsCepa
onii var. thompsoniPeso
i en medio
líquido (producción
sumergida)
seco (mg/ml)
HtM120I
3.07
5.5
5.07
HtM52
5.3
5.45
3.39
4
Figura 2. Aislamientos de hongos entomopatógenos. A las cepas de H.
thompsonii con estructuras poliblásticas (Derecha), se les detectó por Dot blot
mayor concentración (μg/ml) de la toxina HtA.
La concentración de HtA en el medio de cultivo fue de 10 a 14 μg/ml a las
120-144 hr (300 rpm) y a las 39-45 hr (500rpm). El pH en el medio de cultivo
disminuyó hasta 5.8 para posteriormente incrementarse a pH 8. Todos los
aislamientos de H. thompsonii secretaron HtA detectable en el medio de cultivo,
con variaciones de 3-10 μg/ml.
La banda HtA (16.3 Kd) se dio fuertemente en las cepas HtM435, HtM552,
HtM747 y HtJAB04 (Figura 3), lo que se correlacionó con las concentraciones que
se detectaron por ELISA (cuantificación en μg/ml de HtA).
C
32 13
435 552
550 582
52 321
H8 223
747 120I
1614
HtJ AB04
HtM5
5
16.3
Kd
Figura 3. Proteínas solubles producidas por las cepas guerrerences de H.
thompsonii en medio líquido con agitación de 300 rpm, 26°C y 200 cc/minuto de
aereación durante 10 días. C= Marcador de referencia. HtJAB04 cepa brasileña
caractirzada por Correia et al., 1992 y Liu et al., 1995; HtM5 cepa guerrerence,
caracterizada por Maimala et al., 2002.
Las cepas HtM52, HtM321 y HtM120I tuvieron una débil banda de 16.3 Kd
de proteína, lo que demuestra la menor producción de la HtA.
DISCUSIÓN
Las seis cepas de H. thompsonii en crecimiento en medio líquido, causaron
que el pH del medio de cultivo se tornara más alcalino, de la misma manera que la
cepa HtJAB-04 que sirvió de referencia (Correia et al., 1992). En otros hongos, los
cambios en el pH pueden ser influidos por la composición de los nutrientes, por
ejemplo, Penicilium notatum Westl. puede virar el pH en direcciones opuestas en
diferentes medios de cultivo (Diamond y Peltier, 1945). Si la curva de pH
observada para las cepas de H. thompsonii en el sobrenadante del medio líquido
PDY es válido para otros medios de cultivo, aún falta por determinarse. El pH de
H. thompsonii en este medio (PDY), mostró un descenso inicial durante los
primeros dos días y un incremento posterior durante los próximos ocho días hasta
que se terminó la toma de muestras. El pH inició su incremento a las 60 y 30
horas a las 300 y 500 rpm respectivamente. Latgé et al. (1988) encontraron que
ligeras variaciones en el pH (6.0 - 6.5) durante el crecimiento de H. thompsonii en
fermentador (600 rpm, 25°C), durante cinco días en medio PDY. El incremento del
pH durante el tiempo de agitación-fermentación, pudo haber sido causado por la
utilización de los aminoácidos como fuente de carbono, más que de los aminos
nitrogenados cuando el medio carece de azúcar (Garraway y Evans, 1984). La
elevada concentración de dextrosa (4%) usada por Latgé et al. (1988), pudo haber
causado mayor acumulación de ácidos orgánicos que en este estudio.
6
Las cepas de H. thompsonii, crecieron exclusivamente como micelio cuando
produjeron la toxina Hirsutellina A (HtA) como principal metabolito extracelular.
HtA fue detectada inicialmente en los filtrados del medio de cultivo a las 24 horas a
300 rmp y 15 horas a las 500 rpm, de esta forma, la producción de HtA fue
directamente correlacionada con el crecimiento micelial. Como promedio, el
micelio de las seis cepas, secretó HtA en concentraciones de 1 μg por mg de peso
de micelio seco.
Cuando el cultivo entró a la fase estacionaria, los niveles de HtA dejaron de
incrementarse, lo que sugiere que la biosíntesis de HtA estuvo ligada al
crecimiento activo del hongo y no está asociado con lisis celular o al estrés por
nutrientes. Esto concuerda con los resultados de Vey et al. (1993), quiénes
reportaron que los niveles de toxina en filtrados crudos de matraces de cultivo
fueron proporcionales al micelio cosechado.En todos los filtrados crudos del medio
de cultivo en que se hicieron crecer cada una de las cepas, se detectaron niveles
variables de HtA (3-10 μg/ml).
La localización geográfica de los aislamientos no afectó la producción de la
toxina HtA.
Por lo anterior, se considera que los metabolitos, además de los conidios y
material vegetativo de H. thompsonii, incrementan el potencial de este hongo
para controlar de manera amigable con el ambiente a plagas de importancia
económica como son:
a)ácaros: Tetranychus urticae Koch, Aceria guerreronis Keifer, Brevipalpus spp.,
Phyllocoptrupta oleivora Ashmed, Tarsonemus inornatus Attiah, Lorryia formosa
Cooreman, Varroa spp, entre otros.
b) insectos: Pulgón de los cítricos (Toxoptera citricida Kirkaldy) y larvas de
mosquito (Aedes aegypti L.) y Galleria mellonella L.
AGRADECIMIENTOS
Se agradece a PROMEP (UAGUER-7), Syngenta Corporation, Universidad de
Florida y Universidad Autónoma de Guerrero, las facilidades y el apoyo para
realizar el presente trabajo.
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