Espectroscopía de Fluorescencia

Espectroscopía de Fluorescencia
Ana Denicola
DIAGRAMA DE JABLONSKI (1898-1980)
relajación vibracional
conversión interna IC
S2
relajación vibracional
cruce intersistemas ISC
T1
S1
kNR IC
hυA
hυF
kNR ISC
hυP
S0
fluorescencia
fosforescencia
LUMINISCENCIA
emisión de luz desde un estado electrónicamente excitado
Se alcanza el estado excitado por absorción de luz en:
FLUORESCENCIA
estado singulete excitado, transición permitida, ns
FOSFORESCENCIA
estado triplete excitado, transición prohibida, ms
QUIMIOLUMINISCENCIA se alcanza el estado excitado por una reacción química
10-8 s
10-15 s
10-3 s
LA CLAVE ES LA ESCALA DE TIEMPO DE LOS PROCESOS:
• ABSORCION: ~ 10-15 seg
• CONVERSION INTERNA: ~ 10-11-10-9 seg
• FLUORESCENCIA: ~ 10-10 a 10-7 seg
• FOSFORESCENCIA: ~ 10-6 a 1 seg (es una transición “prohibida” por
simetría)
• RELAJACION VIBRACIONAL: ~ 10-12-10-10 seg
Los pasos propiamente dichos de absorción y de emisión son extremadamente
rápidos, tanto que los núcleos no llegan a moverse (principio de Franck-Condon).
La absorción sólo da información del entorno inmediato a la molécula que
absorbe.
La relajación vibracional por lo general es mucho más rápida que la fluorescencia,
entonces la molécula se relaja completamente y (en general) sólo vemos la
emisión desde el estado S1.
La escala de tiempo de fluorescencia es la misma que la escala de tiempo de
movimientos moleculares, por eso el espectro de fluorescencia posee
información de un entorno más amplio que el de absorción.
FLUORESCENCIA
• 1er. paso: absorción o excitación
energía suficiente para llegar a nivel
electrónico superior S1 o S2
λexc
ESTADO EXCITADO
• 2do. paso: emisión de luz
energía radiativa emitida menor que la
absorbida, λem > λexc
Corrimiento de Stokes
RENDIMIENTO CUANTICO DE FLUORESCENCIA:
Q = # fotones emitidos / # fotones absorbidos
0 < Q < 1
en términos de las constantes cinéticas de cada proceso:
Q = kF / (kF + ∑ kNR)
donde kNR son todos los procesos de decaimiento no radiativos
TIEMPO DE VIDA: tiempo promedio que un fluoróforo pasa en el
estado excitado antes de volver al estado basal (por cualquier
vía)
τ = 1 / (kF + ∑ kNR)
TIEMPO DE VIDA NATURAL: es el tiempo de vida si sólo
volviera por fluorescencia
τn = 1 / kF
se puede calcular a partir de τ y Q:
τn = τ / Q
Rendimiento (Q) = fotones emitidos
fotones absorbidos
<1
= constante de velocidad de emisión
= constante de velocidad de decaimiento no radiativo
= tiempo de vida intrínseca o natural,
sin ningún proceso no radiativo
= tiempo de vida medida
Parámetros a medir en fluorescencia
•
Intensidad de fluorescencia (ISS)
•
Espectros de excitación y emisión (IF vs λ)
•
λmax(ex), λmax(em)
•
Rendimiento cuántico de fluorescencia (Q)
•
Vida media del fluoróforo (τ)
•
Anisotropía (r) (tiempo de correlación rotacional)
•
Eficiencia RET (E) (distancia de Föster)
Intensidad de fluorescencia
(estado estacionario) ISS
Iluminación continua
Intensidad resuelta en el tiempo (τ)
Pulso de luz
ESPECTROFLUORÍMETRO
ESPECTROFLUORÍMETRO
FUENTE DE LUZ
Xe, Hg-Xe, Hg (high- low-P), Diodo (lase, LED)
MONOCROMADORES excitación y emisión
ancho de banda
polarizadores
DETECTOR
vs FILTROS
tubo fotomultiplicador (PMT)
MUESTRA geometría de iluminación de la muestra
La medida de IF es relativa
a la geometría del equipo
Usar soluciones diluidas A < 0..05
Control con solo solvente
Usar adecuada λexc, filtro, conc. fluoróforo
Filtrar la solución
Intensidad de Fluorescencia y concentración
del fluoróforo
Efecto de filtro interno
Cuantificación del fluoróforo
midiendo Intensidad de fluorescencia IF
IF (λex, λem) = IA Φ Z
Z = factor instrumental
Φ= rendimiento cuántico de F
IA = IT - I0 = I0 (1 – exp(-2.3 ε c l)
ε = coef. Absortividad a λexc
c = concentración del fluoróforo
Si Aλ << 1
⇒
IA = I0 (2.3 ε c l)
IF (λex, λem) = I0 Φ Z 2.3 ε c l
IF es proporcional a la conc. Si trabajamos con conc. diluidas
Fluoróforos en bioquímica
• Fluorescencia intrínseca
fluorescencia natural, propia del sistema
• Fluorescencia extrínseca
agrego a la muestra un fluoróforo externo
(sonda fluorescente)
Fluorescencia en:
• Proteínas, fluorescencia intrínseca debido a residuos
aminoacídicos aromáticos, predomina el triptofano.
Además marcado con sondas fluorescentes (FITC,
DNS). GFP y derivados.
• Ácidos nucleicos, sin fluorescencia intrínseca, se
agregan sondas fluorescentes catiónicas planares (EtBr,
DAPI) o fosfolípidos marcados
• Membranas, no fluorescentes, se agregan sondas
liposolubles con baja fluorescencia en agua (DPH, ANS)
Fluorescencia en:
• NAD(P)H
• FAD, FMN
• Piridoxal fosfato (PLP)
• Clorofilas
• Indicadores fluorescentes
(pH, Na+, Cl-, Ca2+, O2)
4.7 ns en solución
(2.3 ns FMN)
0.3-1 ns unido a prot.
0.4 ns en solución
1-5 ns unido a DH
Phe
Abundancia: 3.5%
λex = 260 nm, λem= 282 nm
(Q.ε ~ 5)
Insensible al entorno
Tyr
Abundancia: 3.5%
λex = 275 nm, λem= 303 nm
(Q.ε ~ 220)
Insensible al entorno,
quencheable
Ionizable, tirosinato emite (<Q)
Trp
Abundancia: 1.1%
λex = 295 nm, λem= 350 nm
(Q.ε ~ 770)
Sensible al entorno, quencheable
Varias τ
Sondas fluorescentes para proteínas
Fluoresceína (y Rodaminas) absorbe
y emite en el visible, alto rendimiento,
ε=80.000 M-1cm-1
DNS-Cl sensible a
polaridad del entorno,
fluorescencia polarizada
Compuestos de B (BODIPY) absorben y emiten en el visible, alto
rendimiento, ε=80.000 M-1cm-1, fotoestables, insensible al solvente y pH
Sondas fluorescentes para ácidos nucleicos
Bases modificadas fluorescentes
GFP = Green Fluorrescent Protein
Formación espontánea del fluoróforo al plegarse
Relajación por solvente
Transferencia de energía
X
hν
X*
hν’
Quenching
Transferencia de carga
Disociación de H+
τ (ns)
Formación de complejos
Formación de oligómeros
Efectos del solvente y del entorno local sobre la fluorescencia
H = hexano
CH = ciclohexano
T = tolueno
EA = acetato de etilo
Bu = butanol
Efectos del solvente y del entorno
k >> 1/τ
k ∼ 1/τ
Corrimientos de Stokes dinámicos
Ecuación de Lippert-Mataga
2Δf
hcΔν = 3 ( μ E − μG ) 2 + const
a
El fluoroforo es consideredo un dipolo en un medio
continuo de constante dieléctrica (permitividad)
uniforme
Materiales dieléctricos, conductores y medios biológicos
Solvatación de iones
Saturación dieléctrica en las cercanías del ión
Cambio en la emisión por cambio de solvente
o cambio del entorno (ej. unión a proteína)
HSA = albúmina humana
ANS = Anilinonaftalensulfonato (fluoróforo muy sensible a la polaridad entorno)
Cambio en la emisión por cambio de solvente
o cambio del entorno (ej. unión a proteína)
Determinar constantes de unión de un ligando si
este es fluorescente y su fluorescencia cambia
con la unión o si la fluorescencia intrínseca
cambia por efecto de la unión de un ligando
Emisión del triptofano es sensible al entorno
(ej. desnaturalización de proteína)
N = nativa
U = desplegada “unfolded”
Usos de fluorescencia en bioquímica
•
•
•
•
•
•
•
•
Localización subcelular
Cambios en la concentración
Interacciones moleculares
Cambios conformacionales
Distancias intra/intermoleculares
Difusión rotacional
Caracterización estructural
Actividad enzimática
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