FACULTAD DE CIENCIAS

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
BUSQUEDA DE HONGOS DEGRADADORES DE 2,4,6-TRINITROTOLUENO (TNT) Y
PENTAERITRITOL TETRANITRATO (PETN) A PARTIR DE DIFERENTES AMBIENTES
JUAN PABLO ROSAS MORALES
JOHAN SEBASTIÁN SÁENZ MEDINA
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar el título de
MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL
Bogotá D.C.
2010
BUSQUEDA DE HONGOS DEGRADADORES DE 2,4,6-TRINITROTOLUENO (TNT) Y
PENTAERITRITOL TETRANITRATO (PETN) A PARTIR DE DIFERENTES AMBIENTES
JUAN PABLO ROSAS MORALES
JOHAN SEBASTIÁN SÁENZ MEDINA
APROBADO
_______________________
INGRID SCHULER Ph.D
Decana académica
______________________
JANETH ARIAS M. Sc
Directora de Carrera
2
BUSQUEDA DE HONGOS DEGRADADORES DE 2,4,6-TRINITROTOLUENO (TNT) Y
PENTAERITRITOL TETRANITRATO (PETN) A PARTIR DE DIFERENTES AMBIENTES
JUAN PABLO ROSAS MORALES
JOHAN SEBASTIÁN SÁENZ MEDINA
APROBADO
______________________
FABIO ROLDAN Ph.D
Microbiólogo
Director
_______________________
AURA MARINA PEDROZA Ph.D
Bacterióloga
Jurado
TABLA DE CONTENIDO
1. RESUMEN………………………………………………………………………………………………..6
2. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………………………………8
3. JUSTIFICACIÓN.........................................................................................................................9
4. MARCO TEORICO…………………………………………………………………...........................10
5. OBJETIVOS…………………………………………………………………………...........................14
5.1. Objetivo General……………………………………………………………………………………14
5.2. Objetivo Especifico ……………………………………………………………..........................14
6.
MATERIALES Y METODOS………….......................................................................................15
6.1. Origen de las muestras………………………………………………………...........................15
6.1.1. Muestras impactadas con explosivos…………………………………………………….15
6.1.2.Muestras no impactadas con explosivos…………………………………………………15
6.1.3.Cepas de colección…………………………………………………………………………15
6.2. Aislamiento de hongos de suelo……………………………………………………..………….16
6.3. Aislamiento de hongos a partir de muestras no impactadas…………………….….……....16
6.4. Conservación de las cepas………………………………………………………………………16
6.5. Pruebas de tolerancia a explosivos………………………………………………….………….16
6.6. Pruebas de degradación ………….……………………………………………………..………16
6.7. Extraccion de los explosivos y analisis cromatografico………………………………………17
7. DISCUSION Y RESULTADOS…………………………………………………………………..……18
7.1. Aislamiento de hongos a aprtir de muestras impactadas…………………………………….18
7.2. Aislamiento de hongos apartir de muestras no impactadas………………………………...20
7.3. Tolerancia a los explosivos……………………………………………………………………...20
7.4. Degradacion de los Explosivos………………………………………………………………….24
7.4.1.Degradacion de TNT………………………………………………………………………..24
7.4.2.Degradacion de PETN……………………………………………………………………...26
7.4.3.Degradacion de Pentolita…………………………………………………………………..27
8. CONCLUSIONES………………………………………………………………………………………29
9. RECOMENDACIONES……………………………………...…………………………………………30
10. BIBLIOGRAFIA………………………………………………………………………………………….31
11. ANEXOS………………………………………………………………………………………………...32
Anexo 1………………………………………………………………………………………………………………………………………32
Anexo 2………………………………………………………………………………………………………………………………………35
Anexo 3………………………………………………………………………………………………………………………………………36
Anexo 4………………………………………………………………………………………………………………………………………37
Anexo 5………………………………………………………………………………………………………………………………………38
4
Anexo 6………………………………………………………………………………………………………………………………………39
Anexo 7………………………………………………………………………………………………………………………………………40
1. RESUMEN
La fabricación de explosivos con fines militares y mineros, ha hecho que este tipo de
moléculas altamente persistentes lleguen al ambiente y sea necesario diseñar
estrategias con el fin de remediar sitios contaminados. Dentro de estas tecnologías se
encuentra la biorremediación con hongos, en especial de la podredumbre blanca, por
su capacidad de mineralizar eficientemente el TNT convirtiéndolo a CO2 y agua. Son
muy pocos los estudios que se han llevado a cabo con hongos de suelo y por esto el
objetivo del presente estudio fue aislar y evaluar hongos degradadores de TNT y
PETN a partir de diferentes ambientes. Se recolectaron muestras de suelo impactadas
con TNT y PETN, a las cuales se realizaron recuentos de hongos utilizando agar
Extracto de Malta (MEA) suplementado con TNT, PETN y Pentolita a 50, 100 y 300
mg/L. Se obtuvieron recuentos en el orden de 103 UFC/g para todas las
concentraciones de PETN evaluadas, para TNT se obtuvieron recuentos en el orden
de 10-102 UFC/g en las concentraciones probadas y para Pentolita se obtuvieron
recuentos en el orden de 101-102 en las concentraciones de 50 y 100 mg/L mientras
que en 300 mg/L no se observó crecimiento. Se seleccionaron 25 morfotipos
macroscópicamente diferentes que crecieron en las concentraciones evaluadas más
altas. Se aislaron 5 cepas a partir de muestras no impactadas con explosivos y se
obtuvieron 2 cepas de colección. A todos las cepas seleccionadas se evaluó la
capacidad de crecer en diferentes concentraciones (100, 300 y 500 mg/L) de TNT,
PETN y Pentolita, midiendo el crecimiento radial diariamente. Se observó que el TNT
causa una fuerte inhibición sobre el crecimiento, al igual que la pentolita; efecto que
no se observo con PETN. La formación de cristales con 500 mg/L de TNT permitió
observar la posible biotransformacion del explosivo por medio de la formación de
halos de solubilización y coloración del agar en la cepa H10. Se seleccionaron las
cepas S2, S3, S4 y H10 por presentar el menor porcentaje de inhibición y como los
mejores candidatos para las pruebas de degradación y la cepa S24 que presento altos
porcentajes de inhibición en TNT. A estas cinco cepas se les evaluó la capacidad de
degradar 100 mg/L de explosivo en el medio de cultivo YMG. Todas las cepas
removieron de 60 a 70% del TNT y 100% del TNT cuando estaba mezclado con PETN
(Pentolita 50 mgL1 de TNT y 50 mg/L de PETN). Durante el estudio se detecto la
6
formación de metabolitos de la degradación de TNT como aminodinitrotoluenos
(ADNTs) y dinitrotoluenos
(DNTs) lo que indicaría la habilidad de las cepas de
degradar el TNT por la vía Hidroxilaminodinitrotolueno (OHADNTs) y/o por la
formación del complejo Meisenheimer. No queda claro si las cepas evaluadas
degradan el PETN ya que los datos presentaron alta variabilidad al igual que los
controles, debido a la naturaleza del explosivo. En conclusión se aislaron 5 cepas
capaces de crecer en altas concentraciones de TNT, PETN y Pentolita, con la
capacidad de alcanzar altos porcentajes de degradación de TNT.
1. INTRODUCCIÓN
Los explosivos son compuestos químicos, que pueden liberar una gran cantidad de
energía en forma de gas, y por esta razón son ampliamente utilizados en la industria
militar y civil (1). El incremento de la producción de este tipo de sustancias se dio con
el inicio de la primera guerra mundial y la creación de fábricas únicamente dedicadas
a su producción. El 2,4,6-trinitrotolueno (TNT) y pentaeritritol tetranitrato (PETN) son
compuestos explosivos y altamente persistentes, que pueden llegar a contaminar
suelos y aguas subterráneas, en especial el TNT posee una toxicidad alta para la
mayoría de los organismos, debido su carácter citotóxico y mutagénico (1), por otro
lado no se ha podido establecer si el PETN es igualmente toxico (2). Se han
desarrollado diferentes estrategias con el objetivo de remediar sitios contaminados
con explosivos, como la adsorción a matrices de carbón activado, procesos de
oxidación avanzada, biorremediación, fitorremediación e incineración siendo ésta
ultima la más usada, sin embargo ha resultado altamente costosa debido a la
extracción, transporte y energía requerida (3-5). La biorremediación presenta ventajas
debido a su bajo costo, facilidad en las operaciones, y por ser ambientalmente
amigable, por lo que se han encaminado esfuerzos tanto por buscar cepas capaces
de degradar o transformar los explosivos como por elucidar las rutas metabólicas
encargadas de su degradación (6).
En bacterias se conoce las rutas metabólicas capaces de degradar TNT y PETN pero
con el gran limitante de que no los mineralizan completamente y en algunos casos con
la producción de compuestos más tóxicos que los propios explosivos, es por esto que
en la Unidad de Saneamiento y Biotecnología Ambiental (USBA) se han desarrollados
estudios con el fin de aislar bacterias capaces de degradar tanto TNT como PETN (78). Pero se ha despertado un interés en los hongos ya que se encuentran reportes de
la habilidad de estos organismos de transformar el TNT y en algunos casos llevar a
cabo mineralización de manera eficiente, además que no existen reportes en la
literatura de la degradación de PETN por hongos. Por esta razón el objetivo del
presente estudio fue aislar y evaluar hongos degradadores de TNT y PETN a partir de
ambientes contaminados y no contaminados.
8
2. JUSTIFICACIÓN
El TNT es un compuesto xenobiótico, posiblemente carcinogénico y mutagénico,
altamente persistente en el suelo y en el agua subterránea. Por otro lado, el PETN
además de ser usado como explosivo se ha empleado como medicamento para el
tratamiento de la angina; sin embargo, algunos autores lo consideran potencialmente
toxico a diferentes niveles tróficos lo que hace importante su estudio. La
biodegradación de estos compuestos es considerada como una de las mejores
alternativas para remediar ambientes contaminados con explosivos debido a su bajo
costo y a la posibilidad de llevar a cabo procesos de mineralización completa. Otras
tecnologías como la incineración, vertimientos a cuerpos de agua y confinamiento en
rellenos, son soluciones temporales y costosas que simplemente transfieren el
problema a un ambiente diferente. Se ha reportado ampliamente la capacidad de los
hongos para degradar el TNT, en especial hongos de la podredumbre blanca, los
cuales liberan enzimas extracelulares inespecíficas capaces de degradar compuestos
aromáticos similares a los encontrados en la lignina. La degradación de PETN por
hongos, en nuestro conocimiento no se encuentra reportada en la literatura, por lo que
su estudio despierta gran interés debido al desconocimiento del metabolismo
empleado para su degradación. Por lo anterior resulta pertinente la búsqueda de
hongos nativos degradadores de TNT y PETN que permitan futuras investigaciones
que promuevan el desarrollo de tecnologías para la remediación de suelos
contaminados y que sean económicamente sostenibles y ambientalmente amigables.
3. MARCO TEÓRICO
Un explosivo es un compuesto químico que bajo la influencia de un choque térmico o
químico se descompone rápidamente con la generación de grandes cantidades de
gas y energía térmica (1). Desde el surgimiento de la química orgánica en 1830 se
han logrado sintetizar algunos compuestos por nitración como el TNT y el PETN, que
por sus propiedades explosivas se han usado con propósitos militares y civiles.
El TNT es un compuesto nitroaromático producto de la nitración del tolueno. Esta
nitración se da mediante una reacción de sustitución electrofílica, la cual requiere la
presencia de ácidos nítrico y sulfúrico altamente concentrados (9). El PETN es un
compuesto, siendo el más estable de los esteres de nitrato, el cual es sintetizado en
dos pasos principales de condensación y esterificación (10). (Figura 1) (Tabla 1).
TNT
2,4,6-trinitrotoluneno
PETN
Pentaeritritol tetranitrato
Figura 1. Estructura química del TNT y PETN
El TNT es un compuesto química y térmicamente estable, con un bajo punto de fusión
y como la mayoría de nitroaromaticos presenta baja solubilidad en el agua, además de
una baja volatilidad expresada en los valores de presión de vapor y constante de
Henry (11). Por otro lado el coeficiente de partición octanol/agua muestra que no se
asocia fuertemente al suelo, por lo que presenta gran movilidad en el ambiente. El
PETN es un compuesto altamente hidrofóbico, insoluble en agua, presenta un valor de
log Kow de 1.6, lo que sugiere que se adsorbe débilmente al suelo con una
consecuente movilidad en el ambiente (10). (Tabla 1).
El TNT y PETN llegan al ambiente por las aguas residuales y desechos sólidos
producidos durante su fabricación, procesamiento, destrucción y reciclaje de
explosivos. Una vez en el ambiente estos compuestos pueden sufrir distintos procesos
en los que se incluyen, disolución, adsorción, volatilización, transformación,
10
degradación biótica o abiótica y bioacumulación (1). La permanencia en el ambiente
de estos explosivos o de sus subproductos puede generar un peligro potencial para
los diferentes niveles tróficos como para la salud humana, por lo que la Agencia de
Protección Ambiental (EPA del inglés Envinronmental Protection Agency) de los
Estados Unidos, incluye dentro de su lista de prioridades nacionales aquellos sitos en
los que exista contaminación con TNT. Adicionalmente clasifica al TNT en el grupo C:
(compuesto posiblemente carcinogénico) (12). Estudios con PETN muestran que es
un compuesto con una toxicidad baja y sin efectos cancerígenos en modelos
animales, además la EPA no lo clasifica como un compuesto potencialmente toxico,
ni tampoco incluye sitios contaminados con PETN dentro de la NPL.
Tabla 1. Algunas Propiedades Físico químicas del TNT y PETN
Propiedad fisicoquímicas
TNT
PETN
227.13
316.17
Punto de Fusión (ºC)
80.1
143.3
Solubilidad en agua a 25 ºC (mg.L-1)
130
43
coeficiente octanol/agua (Log Kow)
1.6
3.71
Constante de Henrry`s (Atm.m3. mol-1)
4.57 × 10–7
1.7 × 10–9
Presión de vapor a 25ºC (mm Hg)
1.99 × 10–4
5.38 × 10–9
Peso molecular (gmol-1)
Tomada de: Rivera y colaboradores, 2009
Los riesgos potenciales para los ecosistemas y el hombre, han creado la necesidad de
buscar métodos efectivos y ambientalmente amigables que permitan remediar
ambientes impactados con TNT y/o PETN. Algunos métodos usados frecuentemente
para el tratamiento de aguas residuales y suelos contaminados con explosivos
incluyen filtración, coagulación, fotolísis, adsorción a matrices de carbón activado e
incineración(3,
5,
13). El costo de estas tecnologías y el incremento de la
contaminación de algunas de ellas ha motivado a muchos investigadores en las
últimas décadas a buscar sistemas biológicos como una alternativa para la eliminación
de éstos contaminantes en el suelo y aguas (6), pues representa ventajas en cuanto a
costos, seguridad y efectividad frente a los otros métodos.
Durante los últimos 25 años se ha investigado sobre las rutas de degradación y los
organismos involucrados en la degradación de explosivos. La degradación de TNT en
condiciones aerobias ha sido ampliamente reportada por cepas del genero
Pseudomonas sp, mostrando la capacidad de reducir el TNT a ADNTs o por la
remoción de grupos NO2 por medio de nitroreductasas (14). Además se conocen
otras vías que pueden transformar el TNT de manera oxidativa produciendo acido 4amino-2,6- dinitrobenzoico. Por otro lado, en condiciones anaerobias es más frecuente
encontrar microorganismos que puedan llevar a cabo transformaciones del TNT
debido al carácter electronegativo de la molécula, siendo así el triaminotolueno el
principal producto de degradación (15).
Diferentes
estudios
cometabolismo
han
demostrado
que
los
hongos
degradan
TNT
por
siendo capaces primero de reducir uno o dos grupos nitro del
compuesto. El principal producto de esta reducción son los aminodinitrotoluenos
(ADNTs)
y
sus
intermediaros
son
nitrosodinitrotolueno
(NODNTs)
y
hidroxilaminadinitrotolueno (OHADNTs) (16-17). La subsecuente transformación de
los compuestos dependerá de la especie del hongo, las condiciones de cultivo y el
tiempo de incubación (18). Los productos de la reducción del TNT por hongos son
bien conocidos, pero los mecanismos por los cuales se lleva a cabo están aún en
discusión. Se ha propuesto que la membrana celular forma un sistema de reducción el
cual está relacionado con el sistema de secreción de protones (19). Por lo anterior se
plantea que las enzimas ligninolíticas no están involucradas en los primeros pasos de
la reducción del explosivo ya que hongos no ligninoliticos pueden llevar a cabo estas
primeras reducciones.
Las enzimas que por cometabolismo se encuentran relacionadas con la oxidación del
TNT son sintetizadas por los hongos con el fin de romper el polímero de la lignina y
sustancias húmicas, por eso son llamadas enzimas lignonolíticas. Estas enzimas son
la lignino peroxidasa (LiP), manganeso peroxidasa y lacasa, las cuales catalizan la
12
oxidación de un electrón de compuestos fenólicos y no fenólicos. La enzima lacasa
oxida moléculas con bajo potencial de reducción (E0= 780 Mv), a diferencia LiP y MnP
que tienden a oxidar compuestos con un alto potencial de reducción (E0= 1100-1500
Mv (20). Acorde con la estructura de diferentes sustratos, estas enzimas no son
específicas y pueden oxidar un amplio rango de moléculas. Basados en el producto de
las enzimas ligninolíticas estas se pueden clasificar en tres grupos de hongos de la
podredumbre blanca, grupo LiP-MnP, el más eficiente degradador de lignina, el grupo
LiP-Lacasa y el grupo MnP-Lacasa.
Recientemente se han propuesto diferentes técnicas de biorremediación de ambientes
con TNT, una de éstas es el uso de hongos ligninoíiticos, la cual se basa en la
combinación de bioaumentación y bioestimulación. Para este tipo de tecnologías se
ha usado Phanerochaete chrysosporium con el cual se ha demostrado en condiciones
de laboratorio y a escala piloto que la biorremediación de suelos contaminados es
posible.
Sin embargo, es importante distinguir entre la mineralización y la
transformación de los compuestos, ya que experimentos muestran que el 85% del
TNT inicial ha sido transformado durante un periodo de 30 a 90 días, pero sólo del 5 a
20% fue mineralizado (21-22) . Por lo tanto es necesario enfocar esfuerzos en aislar
organismos capaces de llevar eficientemente procesos de transformación y
mineralización de estos explosivos.
La degradación de PETN ha sido reportada por la cepa Enterobacter cloacae PB2, la
cual fue aislada de suelos contaminados con explosivos, es capaz de de usar el PETN
como fuente de nitrógeno ya que posee la enzima nitrato ester redusctasa que lleva a
cabo la remoción secuencial de dos grupos nitro (23). Sin embargo, en nuestro
conocimiento no existen estudios en la literatura sobre la degradación de PETN por
hongos, pero cabe mencionar los ensayos sobre la degradación del glicerol
tetranitrato (GNT) un explosivo con similares características estructurales debido a
que tiene el grupo ester de nitrato (C-O-NO2) al igual que PETN. Los hongos
Geotrichum candidum y P. chrysosporium han mostrado la remoción secuencial de
dos grupos nitro con la respectiva formación de gicerol dinitrato y glicerol mononitrato
(24-25).
4. OBJETIVOS
5.1 Objetivo general
Aislar hongos degradadores de TNT y PETN a partir de diversos ambientes.
5.2 Objetivos específicos
•
Establecer las condiciones para la recuperación de los hongos posibles
degradadores de TNT y PETN.
•
Seleccionar los hongos capaces de crecer en altas concentraciones de TNT y
PETN.
•
Evaluar la capacidad degradadora de TNT y PETN de los hongos
seleccionados.
14
5. MATERIALES Y METODOS
6.1 Origen de las muestras.
6.1.3
Muestras impactadas con explosivos
Se recolectaron tres muestras en una planta de fabricación de explosivos en Sibate,
Cundinamarca, Colombia. La muestras corresponden la zona de Fitorremediación
(M1), campo de prueba de la planta (M2) y al canal de cristalización de la misma (M3)
(7, 26).
Tabla 2. Características fisicoquímicas de las muestras impactas.
Muestra
Con. TNT
(mg/Kg)
Con. PETN
(mg/Kg)
pH
Salinidad
(mg/L)
M1
N.D*
35,3± 30,7
7,42
0.47
M2
1,0 ± 0,1
3,1 ± 2,8
7,88
0.63
M3
5,2 ±1,2
0,0
7,34
0.22
*Concentración no determinada
6.1.2 Muestras no impactadas con explosivos
Se recolectaron de forma oportunista trozos de madera de arboles en estado de
descomposición en la hacienda la Victoria Ubicada en la Dorada, Caldas. Las
muestras se transportaron al laboratorio dentro de bolsas humedecidas y se
mantuvieron en refrigeración hasta el procesamiento de las muestras.
6.1.3
Cepas de colección
Dos cepas, Trametes sp y Earliella sp fueron suministradas por la doctora Amanda
Varela del laboratorio de Ecología de Suelos y hongos Tropicales (LESYHT) de la
Pontificia Universidad Javeriana.
6.2 Aislamiento de hongos de suelo
Se tomaron 10 g de suelo y se suspendieron en 90 mL de solución salina al 0,9%, y
se realizaron diluciones seriadas hasta 10-3. Se inocularon 0,1 mL de cada una de las
soluciones en Agar Extracto de Malta (MEA) (Oxoid) suplementado con 200 mg L-1 de
Penicilina G y 200 mg L-1 de Estreptomicina
sulfatada (Aldrich, Sigma) (27). Se
adicionaron TNT, PETN o Pentolita (TNT-PETN, 1:1) a concentraciones de 0, 50, 100
y 300 mg/L. Después de 8 días de incubación a 24±1,4°C se realizaron los recuentos
de UFC/g de cada muestra. Todos los experimentos se realizaron por duplicado.
6.3 Aislamiento de hongos a partir de muestras no impactadas
Las muestras de madera se desinfectaron con alcohol etílico (70%) y se sembraron en
MEA con antibióticos. Se incubaron a 24±1,4°C duran te 8 días. Posteriormente se
realizaron aislamientos con el fin de purificar los hongos obtenidos (28).
6.4 Conservación de las cepas
Las cepas fueron conservadas usando un disco de agar colonizado con micelio,
suspendido en 1 mL de agua estéril, mantenidos a una temperatura de 4°C (29) y
almacenados en el cepario de USBA.
6.5 Pruebas de Tolerancia a explosivos
La cepas seleccionadas se sembraron utilizando discos de agar colonizado con
micelio en MEA suplementado con antibióticos, más TNT, PETN o Pentolita (TNT –
PETN, 1:1) a concentraciones de 0, 100, 300, 500 mg/L y se incubaron durante 12
días a 24±1,4°C. Diariamente se realizó seguimiento del crecimiento radial de las
cepas en cada una de las concentraciones probadas, mediante la medición del
diámetro de la colonia en milímetros(27, 29). Todos los ensayos se realizaron por
duplicado.
6.6 Pruebas de degradación
Las cepas que presentaron la menor inhibición de crecimiento fueron seleccionadas
para evaluar su capacidad degradadora. Las cepas seleccionadas se inocularon
16
utilizando 4 discos de agar colonizados con micelio en 120 mL
de caldo YMG
(Extracto de Malta 10 g/L, Extracto de Levadura 4 g/L Y Glucosa 4 g/L) (Oxoid)
preparado por componentes y suplementado con antibióticos. Luego de 4 días de
incubación se adicionaron 100 mg/L de TNT, PENT o Pentolita. Los caldos de cultivo
se agitaron a 110 rpm, a 24±1,4°C en oscuridad. Se tomaron muestras de cada
unidad experimental a las 0, 4, 8, 22, y 30 h. se realizo control de adsorción bajo el
mismo procedimiento anterior, esterilizando la biomasa por autoclave a 121°C a 15 psi
durante 15 min antes de adicionar los explosivos y para el control abiótico se utilizo el
caldo de cultivo sin inocular. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
6.7 Extracción y análisis de los explosivos por HPLC
Para la determinación de los explosivos se siguió el método 8330B de la EPA (30).
Para la extracción se tomaron 5 mL del caldo de cultivo los cuales se mezclaron con 5
mL de Acetonitrilo a 200 rpm durante 15 min. Las muestras se pasaron por filtros de
Nylon (0.22µm) y se analizaron por cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC)
(Prominence 20-A, Shimadzu) utilizado una columna C-18 de fase reversa (5µm x
4,6mm x 250mm, Shimadzu Co.), fase móvil metanol-agua 1:1 con gradiente lineal,
flujo de 1,2 mL/min y temperatura de 40°C en la col umna. Los compuestos: TNT,
PETN, ADNT y DNT fueron monitoreados con un detector de Arreglo de Diodos
(PDA) a 210nm y sus tiempos de retención fueron comparados contra patrones
primarios (AccuStandard®). Se utilizaron curvas patrón para cuantificar los
compuestos. (Anexo 1).
7
RESULTADOS y DISCUSIÓN
7.1 Aislamiento de hongos a partir de muestras impactadas
No se observaron recuentos significativamente diferentes entre las muestras de suelo
con PETN (50, 100 y 300 mg/L) o control, encontrándose ambos en el orden de 103
UFC/g (Figura 2A, 2B, 2C). En presencia de TNT y Pentolita a las concentraciones
probadas, se observan diferencias significativas de los recuentos frente al control. A
una concentración de 300 mg/L de TNT y Pentolita se recuperó solo una colonia a
partir de la muestra M2 y
a concentraciones de 100 y 50 mg/L
se obtuvieron
recuentos entre el orden de 10-1 a 10-2 UFC/g de suelo para todas las muestras
(Figura 2A, 2B, 2C) (Anexo 2). La relación entre la concentración de TNT y el número
de colonias, muestra que a mayor concentración en el medio menor es el número de
colonias que es posible recuperar, posiblemente debido al carácter citotoxico y
mutagénico del TNT. Según Weber y colaboradores (2002), existe un mayor efecto
inhibitorio del TNT sobre la germinación de esporas fúngicas que sobre el crecimiento
miceliar, ya que de 71 cepas evaluadas 50 de ellas presentaron una fuerte inhibición
(27). Por otro lado, en el presente estudio la concentración de PETN no mostró un
efecto negativo sobre la recuperación de colonias respecto al control debido a su bajo
carácter toxico, aunque algunos autores lo consideran potencialmente toxico debido a
que se ha demostrado que afecta a bacterias pero no a células animales (2).
5
5
B
4
4
3
3
Log UFC/g
Log UFC/g
A
2
2
1
1
0
0
0
50
100
mg / L
300
0
50
100
300
mg / L
Control
Pentolita
PETN
TNT
18
5
C
Log UFC/g
4
3
2
1
0
0
50
100
300
mg / L
Figura 2. Recuentos de hongos en TNT, PETN y Pentolita a concentraciones de 50, 100 y
300 mg/L para las muestras (A) Fitorremediacion (M1) (B) Campo de Prueba (M2) y (C) Canal
PC (M3).
Medios de cultivo ricos en nutrientes, como el agar Extracto de Malta (MEA)
suplementado con explosivos, han sido utilizado por casi todos los autores para la
búsqueda de hongos degradadores de TNT ya que permiten una mayor recuperación
de diferentes morfotipos en comparación con medios minerales (sin fuente de carbono
ni nitrógeno) debido que el mecanismo de degradación de TNT por hongos se da por
cometabolismo (27). Por lo tanto en el presente estudio se llevó a cabo la misma
aproximación para PETN y Pentolita ya que en nuestro conocimiento no existen
reportes de aislamiento de hongos degradadores de estos dos explosivos.
En total se aislaron 25 morfotipos denominados con la letra S, macroscópicamente
diferentes los cuales se recuperaron a partir de las concentraciones más altas
probadas de los tres explosivos en las que eran capaces de crecer. Se seleccionaron
7 cepas a partir de TNT a concentraciones de 50 y 100 mg/L, 13 corresponden a
PETN a 300mg/L y 5 a Pentolita a concentraciones de 50 y 100 mg/L (Anexo 3). De
manera similar Weber y colaboradores (2002) seleccionaron 52 morfotipos diferentes
a partir de suelos impactados con explosivos, utilizando únicamente 50 mg/L de TNT
en MEA. Bennett (1995) seleccionó 4 morfotipos diferentes a partir de un compostaje
contaminado con explosivos utilizando agar V8RBS (Jugo V8, Rosa de Bengala y
Estreptomicina) y SIRBD (medio para el aislamiento en suelo con rosa de bengala y
dicloran) suplementado con 100mg/L de TNT (6), al igual en el presente estudio
concentraciones de 50 y 100 mg/L de TNT permitieron la recuperación de hongos.
Por otro lado, en nuestro conocimiento no hay estudios en los cuales se hayan
recuperado hongos utilizando PETN y Pentolita por lo que el presente estudio es el
primer reporte en el que se aislaron y seleccionan hongos utilizando agar rico en
nutrientes suplementado con PETN y Pentolita.
7.2 Aislamiento de muestras no impactadas
De las 12 muestras de madera recolectadas en La Dorada, Caldas se aislaron 5
hongos los cuales se denominaron con la letra H. La metodología de aislamiento no
fue altamente selectiva para encontrar hongos de grupos fisiológicos específicos,
como lo son hongos de podredumbre blanca, café, hongos saprofitos, o
ectomicorrizicos debido a no se realizaron pruebas que confirmaran la producción de
enzimas implicadas en la degradación de madera. Aunque se pretendía encontrar
hongos relacionados con la degradación de madera debido a
que
han sido
reportados como capaces de mineralizar el TNT (18).
7.3 Tolerancia a los explosivos
En total 31 cepas fueron evaluadas por su tolerancia a los explosivos, de las cuales 24
correspondieron a aislamientos de muestras de suelo impactado, 5 de muestras no
impactadas y 2 cepas de colección (Trametes sp y Earliella sp). 15 de las cepas
evaluadas crecieron en la concentración de 100mg/L de TNT durante el tiempo que el
control (medio sin explosivo) logro su máximo crecimiento en caja de petri (85mm) y
solo 12 de éstas fueron capaces de crecer sobre los cristales del explosivo que se
forman a una concentración de
500 mg/L en el agar. Únicamente la cepa H10
presento solubilización de los cristales y la formación de un halo color café alrededor
de la colonia (figura 3A). Weber y col.
(2002) mostraron que de 71 cepas
seleccionadas y evaluadas, 33 presentaron crecimiento en una concentración de 100
mg/L, de las cuales 21 cepas poseen la capacidad de crecer sobre los cristales de
TNT que se forman a 1000 mg/L, donde se visualizó la biotransformación del
20
explosivo
losivo mediante la solubilizac
solubilización de los cristales y la aparición de un halo color café
en el agar , lo que fue asociado a los géneros Absidia, Cunninghamella, Acremonium,
Cylindrocarpon, Fusarium, Gliocladium y Trichoderma (27).. En el presente estudio se
observo
rvo biotransformacion de TNT en agar a una menor concentración que la
anteriormente reportada.
Las 31 cepas evaluadas presentaron crecimiento en las concentraciones de PETN
probadas,, en las cuales no se observo la formación de cristales, por lo que no fue
posible evidenciar visualmente la biotransformación del explosivo por la producción de
halos de solubilización,
n, ni la producción del color café en el agar.
A
B
Figura 3. Pruebas de tolerancia a explosivos de la cepa H10 (A) formación de halo de
solubilizacón en MEA suplementado con 500 mg/L de TNT (B) Crecimiento
recimiento radial en TNT,
PETN y Pentolita a 100, 300 y 500 mg/L.
El PETN no presento una inhibición significativamente diferente en el crecimiento
radial frente al control de los hongos ya que la m
máxima
áxima inhibición que se presentó fue
alrededor del 30% a una concentración de 500 mg/L (Anexo 4B). Por
or otro lado el TNT
mostró una inhibición significativamente mayor al control sobre el crecimiento radial ya
que se obtuvieron porcentajes de inhibición entre el 38 y 100%
a 500 mg/L del
explosivo (Anexo 4A),, el mismo efecto sobre el crecimiento radial
ial se observó con la
A
B
Pentolita, ya que las cepas se inhiben entre 41 y 100% a 500 mg/L de explosivo.
explosivo
(Anexo 4C) Se
e esperaba que la inhibición sobre el crecimiento radial por la Pentolita
fuera aproximadamente la mitad del causado por el TNT debido a la composición del
explosivo, por lo que no queda claro por qué en algunos de los hongos la inhibición a
altas concentraciones de Pentolita es más fuerte, posiblemente la mezcla de los dos
explosivos tiene un efecto sinérgico en la inhibición del crecimiento radial.
Excepto para la cepa S5, S10 y S11, el aumento en la concentración de PETN no
mostró un efecto significativo sobre el porcentaje de inhibición de todas las cepas
(Anexo 4B, 6). Para TNT, a una concentración de 300 y 500 mg/L
no existen
diferencias significativas en los porcentajes de inhibición, sin embargo entre 0, 100 y
300 mg/L existen diferencias significativas sobre los porcentajes de inhibición de las
cepas evaluadas, otras pruebas de tolerancia a los explosivos realizadas con los
hongos más resistentes corroboraron que este efecto no se presenta en el rango de
300 a 1000 mg/L de TNT (Figura 4). Un tendencia similar se observó en pentolita,
posiblemente porque la concentración teórica agregada no es representativa a la que
se encuentra disuelta en el agar debido a la baja solubilidad de estos explosivos, de
este modo el microorganismo no estará en contacto con la concentración total teórica
(27). Bayman y Radkar (1996) reportaron que el TNT causa una inhibición del
crecimiento radial mayor al 50% a una concentración de 100mg/L del explosivo (29), a
diferencia en el presente estudio 5 de las cepas evaluadas (S2, S3, S4, S23 y H10) se
inhiben menos del 60% a una concentración de 500 mg/L (Figura 4) (Anexo 4), lo que
hace que estas cepas sean de gran interés ya que toleran mayores concentraciones
de los explosivos que las cepas anteriormente reportadas (29). El hecho de que las
cepas S2, S3, S4 y S23 hayan sido aisladas de muestras contaminadas con
explosivos no está relacionado con su capacidad de tolerar o transformar el TNT, pues
la cepa H10 que posee esta misma capacidad fue aislada de muestras no impactadas
con el explosivo. Algunos estudios han demostrado que no hay diferencia con
respecto a la tolerancia del TNT de actinomycetes aislados de suelo contaminados y
no contaminados (31)
22
120
120
B
100
80
80
%inhibicion
% inhibicion
A
100
60
40
60
40
|
S2
S 24
S4
S3
H10
20
20
0
0
100
300
500
700
900
1100
100
300
mg / L
500
700
900
1100
mg / L
120
100
% inhibicion
80
60
40
20
C
0
100
300
500
700
900
1100
mg / L
Figura 4. Inhibición del crecimiento radial de las cepas S2, S3, S4, S24 y H10 por (A) TNT,
(B) PETN y (C) Pentolita a 100, 300, 500 y 1000 mg/L.
Se confirmó la tolerancia a los explosivos de 5 cepas
(S2, S3,S4, S24 y H10)
aumentando la concentración hasta 1000 mg/L, únicamente con los hongos
considerados más resistentes, con excepción de la cepa S24 utilizada como control,
debido a su baja tolerancia a TNT (100% de inhibición a 300 mg/L) (Figura 4), se
observó una tendencia similar a la primera prueba para todos los explosivos. Se
considero que la cepa S2 era la más tolerante a TNT en las diferentes
concentraciones, seguida de S4, H10, S3 y S24 consecutivamente. (Tabla 3).
Tabla 3. Porcentajes de inhibición de 5 hongos seleccionados para pruebas de
degradación
% de Inhibición a 500 mg/L
Cepa
TNT
PETN
Pentolita
S2
43,7
0
100
S3
75
19,4
88,3
S4
64,3
0
85
S24
100
32,2
100
H10
73
26
66,7
7.4 Degradación de los Explosivos
7.4.1 Degradación de TNT
Se mostró la capacidad de degradación de TNT, PETN y Pentolita de las 5 cepas, 4
de ellas fueron seleccionadas por presentar la menor inhibición de su crecimiento (S2,
S3, S4 y H10) y una usada como control (S24), durante 30 horas en medio YMG a
una concentración inicial 100 mg/L-1 del explosivo. Todas las cepas fueron capaces de
degradar el TNT, obteniendo porcentajes entre el 58 -71%. Igualmente se observo la
producción de metabolitos, detectándose ADNTs y DNTs, en donde la concentración
final de ADNTs fue considerablemente mayor que la concentración de DNT´s para
todas las cepas (Tabla 4) (Anexo 5).Durante las primeras 8 horas se obtuvo una alta
tasa de degradación de TNT, mientas que en las horas siguientes no se evidenciaron
cambios significativos en la concentración, encontrándose alrededor de 38 mg/L-1 para
la cepa H10 (Figura 5.), resultados similares se presentaron para las demás cepas.
La reducción de TNT estuvo acompañada por la producción de ADNTs , lo que
sugiere que la reducción de este explosivo se da por medio de la vía propuesta por
Michael y Gottschalk, (1994) en donde el TNT es reducido a NODNT, OHADNT,
ADNT y DNT secuencialmente (32), siempre y cuando el micelio se encuentre intacto,
por una nitroreductasa asociada a la membrana (33) y/o una oxidoreductasa
intracelular dependiente de NADPH (19). Esto último se confirmo con los controles de
absorción, en donde no fue detectada la producción de metabolitos originados durante
la reducción de esta molécula, ni un cambio significativo en la concentración de TNT
(Figura 5).
24
Tabla 4. Degradación de TNT por los 5 hongos seleccionados en medio YMG después de
30 h. de incubación. Concentración inicial de TNT 100 mg/L.
Cepa
% remoción TNT
Concentración ADNT
(mg/L)
Concentración DNT
(mg/L)
S2
S3
S4
S24
60.2
71.2
57.5
59.6
36.14
7.74
30.57
51.50
9.35
12.75
9.79
9.27
H10
64.1
23.36
9.51
140
Concentración (mg / L)
120
100
TNT
ADNTs
DNTs
Control Adsorción
Control Abiotico
80
60
40
20
0
0
5
10
15
20
25
30
35
tiempo (horas)
Figura 5. Degradación de TNT y formación de metabolitos en medio de cultivo YMG con 100
mg/L del explosivo por la cepa H10.
Durante las primeras 8 h las cepas S2, S4 y H10 produjeron una coloraciòn roja
oscura que luego desapareció en los siguientes muestreos. Este fenómeno y la
detección de DNTs durante el ensayo podría sugerir que la degradación de TNT no
solo se da por la vía OHADNTs sino también por la formación del complejo
Meisenheimer, en donde se remueve un grupo nitro y se observan estos pigmentos.
Estos resultados son muy interesantes ya que ésta vía de degradación ha sido
ampliamente reportada en bacterias pero únicamente en el hongo Irpex lacteus (19,
34).
Después de 30 horas no se logro una degradación completa del TNT, posiblemente a
que cuando la transformación de TNT se realiza de manera reductiva con la formación
ADNTs, algunos intermediarios como NODNTs y OHADNTs, pueden llegar a inhibir la
degradación de TNT (36).
La cepa S24, que presento altos porcentajes de inhibición en concentraciones de 300,
500 y 1000 mg/L de TNT, mostró una remoción del 56.9% y la mayor producción de
ADNTs al cabo de 30h, por otro lado la cepa S2, que presento los menores
porcentajes de inhibición a las mismas concentraciones (Tabla 3), no tuvo el mayor
porcentaje de remoción del explosivo ni la mayor producción de ADNTs, mientras que
la cepa S3 que se inhibe más del 80% a 500 mg/L del explosivo es la que mayor
porcentaje de remoción alcanza. No queda claro si existe una relación entre la
capacidad de tolerar altas concentraciones del explosivo con la habilidad de
degradarlo.
7.4.2 Degradación de PETN
Los resultados obtenidos para PETN presentaron una alta variabilidad que se refleja
en una alta dispersión de los datos. Este fenómeno fue asociado a la baja solubilidad
del explosivo y que es posible observar en las curvas de degradación. Los datos que
se presentan son los datos crudos y no permitirían asegurar que los hongos
evaluados poseen la capacidad de degradar PETN bajo las condiciones del
experimento. La extracción del control abiótico muestra un porcentaje de recuperación
alrededor del 60% (Figura 6), debido posiblemente a la baja solubilidad del explosivo
(43 mg/L) (11), a pesar que este fue previamente disuelto en acetonitrilo, solvente
miscible con el agua, lo que permite una mayor solubilidad . Sin embargo, no se
observò una degradación significativa a través del tiempo ni variabilidad en el control.
Tanto el tratamiento como el control de adsorción para todas las cepas presentaron
una alta variabilidad entre las unidades experimentales, posiblemente porque el
explosivo es adsorbido o presenta otros procesos de sorción y desorción con la
biomasa (Anexo 6). La cepa S24, tanto en caja como en medio líquido presento la
mayor producción de micelio, adicionalmente se observó la mayor pérdida de PETN
26
posiblemente por adsorción tanto en el control como en el tratamiento, lo que indicaría
que la biomasa es un interferente para la recuperación del explosivo (Figura 6).
140
PETN
Control Adsorción
Control Abiotico
120
mg/L
100
80
60
40
20
0
0
5
10
15
20
25
30
35
tiempo (horas)
Figura 6. Degradación de PETN en medio de cultivo YMG suplementado con 100mg/L del
explosivo por la cepa H10.
7.4.3 Degradación de Pentolita
La concentración inicial de los explosivos afecta la capacidad de los hongos para
degradarlos, ya que en los experimentos realizados a una concentración inicial de
100 mg/L de TNT, ninguna de las cepas evaluadas degradaron el 100% del explosivo
en un periodo de 30 h, mientras que a una concentración inicial de 50 mg/L de TNT,
todas las cepas evaluadas degradan el 100% (Tabla 5) del explosivo durante el
mismo periodo de tiempo, con la subsecuente producción de ADNTs, posiblemente
porque la biomasa obtenida en los 4 días de inoculo no alcanza a ser lo
suficientemente abundante para evitar la inhibición que causa el TNT en la respiración
de los hongos, como habían reportado anteriormente Stahl y Aust (1993) (37). No se
detecto la presencia de DNTs durante las 30 horas a pesar que se produjo una
coloración roja oscura en las cepas S2, S4, H10, posiblemente porque la
concentración de DNTs es inferior al límite de detección (≤ 5 mg/L) (Anexo 7), ya que
en los experimentos con TNT a 100 mg/L, la máxima concentración de DNTs está
alrededor de 9 mg/L para todas las cepas evaluadas.
Tabla 4. Degradación de Pentolita (TNT + PETN*) por 5 hongos en medio YMG a las 30 h. de
incubación. Concentración inicial de Pentolita 100 mg/L.
Cepa
% remoción TNT
Concentración ADNT (mg/L)
Concentración DNT (mg/L)
S2
100
23,85
0
S3
100
8,23
0
S4
100
44,15
0
S24
100
51,3
0
H10
100
18,63
0
*Los datos para PETN no fueron calculados
140
140
A
B
120
TNT
ADNTs
ADNT
Control Adsorsión
Control Abiotico
100
80
Concentración (mg/L)
Concentración (mg/L)
120
60
40
PETN
Control Adsorsión
Control Abiotico
100
80
60
40
20
20
0
0
5
10
15
20
tiempo (horas)
25
30
35
0
0
5
10
15
20
25
30
35
tiempo (horas)
Figura 6. Degradación de (A) TNT en presencia de (B) PETN y sus metabolitos en medio de
cultivo YMG suplementado con 50 mg/L de los explosivo por la cepa H10.
28
8
CONCLUSIONES
•
El uso de un agar rico en nutrientes como el agar Extracto de Malta (MEA)
suplementado con 50 y 100 mg/L de TNT o Pentolita permitió la recuperación de
hongos con capacidad de degradar TNT.
•
El rango de concentraciones de lo explosivos (TNT y Pentolita) evaluado en la
prueba de tolerancia permitió seleccionar los hongos con menor inhibición sobre su
crecimiento. Por otro lado, para PENT no se observo inhibición del crecimiento
radial en el rango seleccionado
De las 31 cepas evaluadas provenientes de ambientes impactados y no
impactados con explosivos se seleccionaron las 5 cepas (S2, S3, S4, S23 y H10)
que presentaron la mayor tolerancia (menor inhibición). Estas cepas fueron
aisladas principalmente en suelos impactados (4 de 5) y en medios con TNT y
Pentolita
•
Todas las cepas seleccionadas mostraron degradación de TNT con la consecuente
producción de ADNTs y DNTs, mientras que la degradación de PETN no se logro
determinar bajo las condiciones experimentales empleadas. Factores como la
solubilidad y la metodología de extracción pueden estar afectando la correcta
determinación de este explosivo. Es necesario realizar un análisis de los
resultados en mayor detalle.
9
RECOMENDACIONES
•
Evaluar concentraciones más elevadas de PETN tanto para la recuperación
de cepas y pruebas de tolerancia.
•
Buscar una metodología que permita aumentar la solubilidad del PETN en
los medios de cultivo (p.e:uso de surfactantes).
•
Evaluar si la degradación es llevada a cabo por enzimas asociadas a la
membrana o por enzimas extracelulares
•
Evaluar la capacidad de degradar explosivos en liquido de hongos de la
podredumbre blanca como Trametes sp y Earliella sp. Realizar curvas de
calibración para la cuantificación de metabolitos relacionados en la
degradación de PETN.
•
Implementar una metodología de extracción para muestras con bajas
concentraciones de explosivos, para realizar la cuantificación de metabolitos
que se producen en baja proporción.
30
10
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
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ANEXO 1
Curvas patrón para (A) TNT, (B) PETN, (C) 2,6-DNT, (D) 2,4-DNT, (E) 2,4-ADNT
8743291.5
A
ABS a 210mn
7451278.2
5648910.9
3662553.3
1962965.3
336295.0
f(x) = 2.7782e -005 * x - 1.58685
130373.8
R 2 = 0.9971130
5.000
20.000 50.000 100.00 150.000 200.000 250.000
Concentración TNT (mg/L)
3937858.1
B
ABS a 210mn
3142652.7
2507374.8
1608802.1
873389.0
256070.6
f(x) = 6.27409 e -005 x - 0.201485
48727.3
R 2 = 0.9978325
5.000
20.000 50.000 100.00 150.000 200.000 250.000
Concentración PETN (mg/L)
34
C
7949122.5
ABS a 210mn
6736287.0
5093297.9
3302858.0
1774392.7
281124.7
f(x) = 3.06038e -005 x - 1.131
118506.8
R 2 = 0.9975525
5.000
20.000 50.000 100.00 150.000 200.000 250.000
Concentración 2,6-DNT (mg/L)
D
ABS a 210mn
7791258.4
6368327.2
4459109.5
3231581.8
141568.2
f(x) = 3.19856e -005 x + 0.597591
R 2 = 0.9977671
5.000
100.00
150.000
200.000
Concentración 2,4-DNT (mg/L)
250.000
9244107.8
E
ABS a 210mn
7613821.9
5322639.3
3827733.2
1973352.6
310176.8
f(x) = 2.68625e-005 * x + 0.0806649
165459.6
R 2 = 0.9982847
5.000
20.000 50.000 100.00 150.000 200.000 250.000
Concentración 2,4-ADNT (mg/L)
36
ANEXO 2.
Recuentos de hongos en agar MEA Suplementado con antibióticos de las muestras
M1, M2 y M3.
Muestra
Explosivo
Replica
50 mg/L
100 mg/L
300mg/L
A
5x10 1
1x101
0
B
3x10 1
1x101
0
A
5x103
4x103
4x103
B
4x103
4x103
5x103
A
1x102
0
0
B
7x102
1x101
0
A
3x102
1x101
0
B
1x102
0
1x101
A
7x103
6x103
5x103
B
9x103
11x103
6x103
A
2x101
1x101
0
B
2x102
2101
0
A
1x101
0
0
B
1x101
0
0
A
2x103
1x103
1x103
B
4x103
3x103
1x103
A
1x101
0
0
B
3x101
1x101
0
TNT
MI
PETN
Pentolita
TNT
M2
PETN
Pentolita
TNT
M3
PETN
Pentolita
0 mg/L
6x103
9x103
11x103
7x103
1x103
3x103
Anexo 3.
Origen de las cepas S1-S25, aisladas de muestras impactadas con explosivos.
Muestra
Explosivo
S1
M2
PENTOLITA
Concentración
(mg/L)
100
S2
M1
PENTOLITA
100
S3
M1
PENTOLITA
50
S4
M3
PENTOLITA
100
S5
M2
PENTOLITA
100
S6
M1
PETN
300
S7
M1
PETN
300
S8
M1
PETN
300
S9
M2
PETN
300
S10
M2
PETN
300
S11
M1
PETN
300
S12
M1
PETN
300
S13
M2
PETN
300
S14
M3
PETN
300
S15
M3
PETN
300
S16
M3
PETN
300
S17
M3
PETN
300
S18
M3
PETN
300
S19
M3
TNT
50
S20
M2
TNT
300
S21
M1
TNT
100
S22
M1
TNT
50
S23
M3
TNT
50
S24
M2
TNT
100
S25
M1
TNT
50
Cepa
38
ANEXO 4.
Graficas integradas de las pruebas de tolerancia representadas en porcentaje de
inhibición, para todas las cepas evaluadas
120
100
% inhibiciòn
80
60
40
20
0
0
A
100
200
300
400
500
600
400
500
600
500
600
mg / L
120
100
% inhibiciòn
80
60
40
20
0
0
100
200
B
300
mg / L
120
100
% inhibiciòn
80
60
40
20
0
C
0
100
200
300
mg / L
400
Anexo 5.
140
140
120
120
Concentración (mg/L)
Concentración (mg/L)
Cinéticas de degradación de TNT, para los 5 hongos evaluados, (A) S2, (B) S3, (C)
S4, (D) S24 (E) H10
100
80
60
40
20
80
60
40
20
0
0
0
5
A
10
15
20
25
30
35
0
5
D
tiempo (horas)
140
140
120
120
Concentración (mg / L)
Concentración (mg/L)
100
100
80
60
40
20
10
15
20
25
30
35
30
35
tiempo (horas)
100
80
60
40
20
0
0
0
5
B
10
15
20
25
30
35
0
E
tiempo (horas)
5
10
15
20
25
tiempo (horas)
140
TNT
ADNTs
DNTs
Control de Adsorción
Control Abiotico
Concentración (mg/L)
120
100
80
60
40
20
0
0
C
5
10
15
20
25
30
35
tiempo (horas)
40
Anexo 6.
140
140
120
120
Concentración (mg/L)
Concentración (mg/L)
Cinéticas de degradación de PETN, para los 5 hongos evaluados, (A) S2, (B) S3, (C)
S4, (D) S24 (E) H10
100
80
60
40
20
80
60
40
20
0
0
0
5
10
A
15
20
25
30
35
0
5
10
D
tiempo (días)
140
140
120
120
Cocentracion (mg/L)
Concentracion (mg/L)
100
100
80
60
40
20
15
20
25
30
35
25
30
35
tiempo (días)
100
80
60
40
20
0
0
0
5
10
15
20
25
30
35
tiempo (días)
B
0
E
5
10
15
20
tiempo (horas)
140
PETN
Control Adsroción
Control Abiotico
Concentración (mg/L)
120
100
80
60
40
20
0
0
C
5
10
15
20
tiempo (días)
25
30
35
Anexo 7.
Cinéticas de degradación de Pentolita, para los 5 hongos evaluados, (A) S2, (B) S3,
(C) S4, (D) S24 (E) H10. Columna derecha TNT, columna izquierda PETN.
140
140
TNT
ADNTs
DNTs
Control Adsorción
Control Abiotico
100
80
60
40
20
80
60
40
0
0
5
A
10
15
20
25
30
35
0
5
10
tiempo (horas)
140
140
120
120
100
80
60
40
20
20
25
30
35
25
30
35
25
30
35
100
80
60
40
20
0
0
0
5
B
10
15
20
25
30
35
0
5
10
tiempo (horas)
15
20
tiempo (días)
140
120
120
Concentracion (mg/L)
140
100
80
60
40
20
100
80
60
40
20
0
0
0
C
15
tiempo (días)
Concentracion (mg/L)
Concentración (mg/L)
100
20
0
Concentración (mg/L)
PETN
Control Adsorción
Control Abiotico
120
Concentracion (mg/L)
Concentración (mg/L)
120
5
10
15
20
25
tiempo (horas)
30
35
0
5
10
15
20
tiempo (días)
42
140
140
100
80
60
40
20
100
80
60
40
20
0
0
0
5
10
D
15
20
25
30
35
0
5
10
tiempo (horas)
15
20
25
30
35
25
30
35
tiempo (días)
140
140
120
120
Concentración (mg/L)
Concentración (mg/L)
PETN
Control Adsorción
Control Abiotico
120
TNT
ADNT
Control Adsorsión
Control Abiotico
Concentracion (mg/L)
Concentración (mg/L)
120
100
80
60
40
20
100
80
60
40
20
0
0
0
E
5
10
15
20
tiempo (horas)
25
30
35
0
5
10
15
20
tiempo (horas)