fch711m - Tesis Electrónicas UACh

UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE
Facultad de Ciencias
Escuela de Ciencias
Modificaciones del órgano subcomisural y del órgano
supracomisural en los Ratones Mutantes Hyh con
Hidrocefalia crónica
Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al Grado de
Licenciado en Ciencias Biológicas.
Profesor Patrocinante: Dra. Sara Rodríguez Ceballos - Instituto de Histología
y Patología - Facultad de Medicina.
Claudia Hofmann Hernández
Valdivia Chile 2003
Profesores Informantes
Dr. Juan Roberto Jaramillo Soto - Instituto de EmbriologIa - Facultad de Ciencias - Dr.
Orlando Garrido Oñate - Instituto de Embriologia - Facultad de Ciencias.
Dedicatoria
Esta tesis está dedicada a mi mamá por ser un modelo de fortaleza y entrega. Sin ella no
habría cumplido ninguno de mis sueños.
A mis hermanos Ignacio y Andrea, por ser como son, los quiero.
Agredecimientos
Quiero comenzar agradeciendo a la Dra. Sary quien ha compartido conmigo todo
sus conocimientos. He podido disfrutar de su gran entrega al trabajo y el apoyo
incondicional a sus alumnos, entre ellos Yo, ya que sin su ayuda nunca hubiera sido posible
realizar este trabajo.
A mis profesores informantes Dr. Orlando Garrido y Dr. Roberto Jaramillo por sus
consejos y la gran disponibilidad para corregir esta tesis.
A todas las personas que trabajan en el instituto de Histología y Patología, de
manera especial agradezco la ayuda prestada por Don Ricardo Silva y Don Genaro.
A mi Directora de Escuela Dra. Gladys Ruiz y a todos los profesores que me
guiaron y acompañaron mi formación.
A mis compañeros y amigos de la carrera quiero agradecerles por haber compartido
tantos momentos ayudándome a crecer como persona. En especial a Rodrigo, Marcela y
Gisela por apoyarme en los momentos difíciles.
A mis lindas amigas Pilli, Yohani y Caro quienes me incentivaron a seguir adelante.
A todas mis tías del Departamento Registro Académico por su ayuda y apoyo
prestado en todos estos años de universidad.
A mi abuelita, a mis tíos y tías, primos y Anita por su apoyo incondicional ante las
decisiones que he tomado.
A Pato Rivera por la ayuda que me brindaste cuando lo necesité.
Y en especial a una persona maravillosa quien me enseño a que con amor la vida es
más bella.
1. RESUMEN
Al nacer los ratones mutantes hyh muestran una hidrocefalia moderada y un
acueducto cerebral patente, del cuarto al quinto día postnatal, el extremo distal del
acueducto cerebral se encuentra sellado y así la hidrocefalia se vuelve más severa.
Se pueden diferenciar dos fases de la hidrocefalia;
1.- Fase temprana, la cual se inicia en la vida embrionaria, extendiéndose al cuarto ó quinto
día postnatal. Se caracteriza por una hidrocefalia moderada y un acueducto cerebral patente.
2.- Fase tardía, comienza al quinto día postnatal cuando se oblitera el acueducto cerebral y
continua con una progresiva hidrocefalia.
El primer defecto que precede a la hidrocefalia, está en el linaje celular
ependimario; el cual se desprende siguiendo una progresiva y programada denudación
ependimaria. Este defecto en los ratones mutantes hyh involucra otros cambios
morfológicos a nivel cerebral.
En este trabajo de investigación se intenta dilucidar por qué los ratones hyh
hidrocefálicos crónicos son capaces de sobrevivir hasta el año. Nosotros pensamos que
deben ocurrir diversos cambios morfológicos. De estos cambios nos abocaremos a los
ocurridos en el complejo OSC-FR y al órgano supracomisural ó placa inmunorreactiva en
los ratones mutantes hyh de 3 meses postnatal hasta un año de vida. La microscopía óptica
realizada con diversas tinciones y la microscopía electrónica de barrido, permitió observar
que:
1.- La diferenciación de las células ependimarias que forman el órgano supracomisural,
continua en el tiempo. Estas células recientemente diferenciadas secretan un material
glicoproteico con características similares a las del OSC, pero nunca llegan a formar una
fibra de Reissner.
2.- Las células ependimarias cilíndricas del OSC siguen bajando su altura, constituyendo un
epitelio cúbico simple, manteniendo las características secretorias.
3.- Como un mecanismo de sobrevivencia, a pesar de su enorme dilatación ventricular
(hidrocefalia) los ratones presentan ventriculostomías que se forman espontáneamente, las
cuales son comunicaciones entre el sistema ventricular dilatado y espacio subaracnoideo.
4.- Otro mecanismo de sobrevivencia desarrollado en estos ratones hyh hidrocefálicos
crónicos es la ausencia de hemorragias.
1.1 SUMMARY
When the hidrocephalic hyh mutant mice are born they show a moderate hydrocephalus
and a normal cerebral aqueduct, from the fourth to the fifth postnatal day, the distal extreme
of the cerebral aqueduct is sealed and the hydrocephalus becomes severe.
Two phases of the hydrocephalus can be differentiated:
1. Early phase, which begins in the embrionary life, lasting until the fourth or fifth postnatal
day. A moderate hydrocephalus and a patent cerebral aqueduct characterize it.
2. Late phase, it begins the fifth postnatal day when the cerebral aqueduct is obliterated and
a progressive hidrocephalus continues.
The first defect that precedes the hydrocephalus is in the ependymary cellular
lineage, which is loosen following a progressive and programmed ependimary denudation.
This defect in the hyh mutant mice involves other morphological changes at a cerebral
level.
This research intents to elucidate the reasons why chronic hydrocephalic hyh mice
are able to survive until one year. We think that diverse morphological changes must occur.
These changes will be subject of study and the ones occurred in the complex OSC–FR and
the supra-commisural organ or immune-reactive plate in hyh mutant mice 3 months until
one year old. The optical microscopy made with different methods of dye and the scanning
electron microscope allowed to observe that:
1. The differentiation of the ependymary cells that form the supracommisural organ
continues in time. These cells recently differentiated secrete a glycoprotein material with
characteristics similar to the OSC, but they never form a Reissner fiber.
2. The cylindrical ependymary cells of the OSC continue lowering its height forming a
simple cubic epithelium, keeping the secretory characteristics.
3. Like a surviving mechanism, despite its ventricular dilation (hydrocephalus) the mice
present ventriculostomy which are spontaneously formed, these are communications
between the dilated ventricular system and the subarachnoid space.
4. Another surviving mechanism developed in these chronic hydrocephalic hyh mice is the
absence of hemorrhage.
2. INTRODUCCION
La hidrocefalia es una acumulación de líquido cefalorraquídeo (LCR) dentro de las
cavidades cerebrales, que resulta de un impedimento del flujo de éste líquido dentro del
sistema vascular (hidrocefalia no comunicante), o en el espacio subaracnoideo (hidrocefalia
comunicante) (McComb, 1997). Excepcionalmente puede también existir hidrocefalia por
una sobreproducción de LCR por parte de un papiloma de los plexos coroideos.
La incidencia de la hidrocefalia en el humano es aproximadamente de 1 a 3 por cada 1000
niños nacidos vivos, sin embargo esta anomalía no es exclusiva del hombre ya que también
se presenta en algunos animales de laboratorio como la rata.
De acuerdo al período de vida en que se manifiesta la hidrocefalia, puede ser clasificada
como congénita, si se produce durante la gestación, o bien adquirida, si se manifiesta
postnatalmente. La hidrocefalia adquirida puede producirse por causas tan diversas como
infecciones virales o bacterianas, tumores o hemorragias, la hidrocefalia congénita puede
producirse también por mutaciones genéticas (Lawson y Raimondi 1973; Raimondi y col.
1973; Hollander, 1976; Kohn y col. 1981; Bronson y Lane 1990; Wong y col. 1995; PérezFígares y col. 1998), genes “knockout” (Dahme y col 1997; Fransen y col. 1998), sobreexpresión de genes (Galbreath y col. 1995) o inmunoneutralización de proteínas cerebrales
(Vio y col. 2000).
La hidrocefalia congénita pude ser causada por infecciones virales o por deficiencias
nutricionales de la madre, por lo que también se le denomina hidrocefalia congénita
adquirida; por otro lado la hidrocefalia congénita se puede producir por mutaciones
genéticas y por esto se denomina hidrocefalia congénita heredada.
La hidrocefalia congénita puede estar asociada al desarrollo de un acueducto cerebral
normal, estenosado u obliterado, de tal manera que una de las preguntas que surgen de
inmediato es ¿Cómo la estenosis y/o la completa obliteración del acueducto cerebral están
involucrados en la patogénesis de la hidrocefalia congénita?.
La mayoría de las investigaciones (Borit 1976; Bruni y col. 1988; Jones y col. 1987; Jones
y Bucknall 1988) sostienen que la estenosis del acueducto es un evento clave para el
desarrollo de la hidrocefalia congénita. Hay varias cepas mutantes de ratas y ratones que
desarrollan hidrocefalia congénita espontánea (Bronson y Lane 1990, Pérez-Fígares y col.
1998). En varios de estos animales, la estenosis acueductal precede y gatilla la hidrocefalia
(Bruni y col. 1988; Jones y col. 1987;
Jones y Bucknall 1988). Los mecanismos
subyacentes a la estenosis y/o a la obliteración del acueducto cerebral no están claros.
La estenosis u obliteración acueductal parece ser un fenómeno multietiológico, incluyendo
infecciones, desórdenes nutricionales y desórdenes genéticos. Así, una hidrocefalia
congénita
no
comunicante
puede
resultar
de
infecciones
virales
subclínicas
(cytomegalovirus, toxoplasmosis, paperas, rubéola, varicela, etc) de mujeres embarazadas
(McComb 1997; Margolis y Kilham 1969, Herndon y col. 1974), o de desórdenes
nutricionales, principalmente hipovitaminosis B12 (Overholser y col 1954; Newberne 1962)
y deficiencia de ácido fólico (Overholser y col. 1954).
Una hidrocefalia con estenosis del acueducto cerebral debido a la mutación del gen que
codifica para la molécula de adhesión N-CAM-L1, localizada en el cromosoma X, ha sido
reportada que ocurre en el hombre y en el ratón (Wong y col. 1995).
Ratones transgénicos con una mutación en el gen L1 presentan una hidrocefalia con un
acueducto cerebral cerrado (Dahme y col. 1997; Fransen y col. 1998), probablemente
causando la dilatación ventricular (Fransen y col. 1998).
Hay evidencias que el órgano subcomisural (OSC) que es una glándula cerebral ubicada en
el techo del  ventrículo cerebral, estaría involucrado en la producción de hidrocefalia, ya
que la disfunción de éste durante el desarrollo puede también conducir a una hidrocefalia
congénita.
Hay hipótesis que relacionan la función del OSC con la circulación del LCR. Existe una
relación anatómica clave entre el acueducto de Silvio (AS) y el OSC, donde el LCR que
circula desde el  ventrículo debe necesariamente estar en contacto con el OSC antes de
entrar al acueducto de Silvio (Rodríguez y col. 1998).
Por otro lado, los estudios realizados por Overholser y col. 1954 y por Newberne 1962
demostraron que crías de ratas mantenidas bajo una dieta deficiente en ácido fólico y
vitamina B12 presentaban alteraciones en el desarrollo del OSC y producían hidrocefalia.
Esto les permitió sugerir que la secreción del OSC liberada durante la vida fetal previene el
sellamiento del acueducto de Silvio; por lo que un mal desarrollo del OSC conduciría a la
estenosis del acueducto de Silvio e hidrocefalia congénita.
Esta hipótesis ha ganado apoyo por las investigaciones de Takeuchi y Takeuchi 1986,
según las cuales, las ratas sometidas a radiación durante la gestación, tuvieron crías con
malformaciones del OSC acompañadas de una estenosis del acueducto cerebral y desarrollo
de hidrocefalia congénita. Dentro de las cepas de ratas y ratones mutantes también se han
detectado evidencias que refuerzan la posible relación entre el OSC y la hidrocefalia
congénita.
Las ratas mutantes CWS/Idr (Takeuchi y col. 1988) y H-Tx (Jones y Bucknall 1988)
presentan un OSC de tamaño reducido. Los ratones de la cepa SUMS/np presentan
estenosis del acueducto de Silvio y un OSC poco desarrollado (Jones y col. 1987; Bruni y
col 1988), mientras que los ratones hidrocefálicos de la cepa MT/Hidr presentan ausencia
del OSC (Takeuchi y col. 1987).
En los ratones mutantes hyh (hydrocephalus with hop gait = hidrocefalia con marcha en
saltos) (Bronson y Lane 1990) que desarrollan hidrocefalia congénita, el complejo OSC-FR
presenta importantes alteraciones tanto prenatal (Jiménez y col. 2001), como
postnatalmente (Pérez-Fígares y col. 1998). Del mismo modo, se han descrito alteraciones
morfológicas severas del OSC de fetos humanos (Castañeyra–Perdomo y col. 1994) que
sugieren que en el hombre el OSC también podría estar involucrado en la patogenia de la
hidrocefalia congénita.
Todas estas evidencias apuntan a relacionar el complejo OSC-FR con la hidrocefalia, sin
embargo, no está totalmente claro si las alteraciones morfológicas del OSC se acompañan
de alteraciones funcionales. Por otro lado, existen controversias sobre si i) estas
alteraciones son previas al desarrollo de la hidrocefalia ó, por el contrario, ii) son
consecuencias del proceso hidrocefálico.
Recientemente se han obtenido evidencias muy significativas a favor de la primera de estas
hipótesis: ratas preñadas e inmunizadas con glicoproteínas de la FR producen anticuerpos
contra estas proteínas y las transfieren continuamente a los fetos a través de la placenta y a
las crías a través de la leche materna. Por la falta de desarrollo y maduración de la barrera
hematoencefalica durante todo este período, los anticuerpos llegan al LCR del feto/cría e
inmunoneutralizan las proteínas secretadas por el OSC, no se forma FR, se produce
estenosis del AS y más tardíamente hidrocefalia (Vio y col. 2000).
La cepa de ratones mutantes hyh presentan un gen mutado en el cromosoma 7 el cual se ha
caracterizado sólo fenotipicamente. Aunque no se han realizado estudios suficientes, se
supone que la mutación se transmite en forma autosómica recesiva por lo que los ratones
homocigotos recesivos son los que presentan la patología de la hidrocefalia. La descripción
clínica y neuropatológica hecha por Bronson y Lane 1990 es poco detallada.
Los principales aportes en este tema se han efectuado el Instituto de Histología y Patología
de la Universidad Austral de Chile en conjunto con el Instituto de Neurofisiología de la
Universidad de Málaga, España, únicos laboratorios que poseen la cepa ”hyh”. Las
investigaciones las han enfocado principalmente en a) las alteraciones morfológicas del
OSC (Pérez Fígares y col. 1998) y b) las alteraciones que se producen en el sistema
ventricular durante la etapa prenatal (Jiménez y col. 2001).
Al nacer todos los ratones mutante hyh muestran una hidrocefalia moderada y un acueducto
cerebral patente. En estos mismos ratones, 4 a 5 días después del nacimiento, el extremo
distal del acueducto de Silvio llega a estar completamente sellado y por lo tanto la
hidrocefalia se vuelve severa (Pérez-Fígares y col. 1998). Así se pueden distinguir dos fases
en la hidrocefalia desarrollada por los ratones hyh: i) una fase temprana que comienza
durante la vida embrionaria, la cual se extiende hasta 4 a 5 días después del nacimiento y
está caracterizada por una hidrocefalia moderada y un acueducto cerebral patente; ii) una
fase tardía que comienza al quinto día postnatal con la obliteración del acueducto de Silvio
y continúa con una progresiva hidrocefalia.
¿Cuál es el mecanismo de esta hidrocefalia que comienza durante la vida fetal y continúa
con un acueducto cerebral patente?.
La respuesta a esta pregunta ha sido contestada recientemente en el trabajo de Wagner y
col. 2003, cuya investigación ha demostrado que la hidrocefalia comienza en una etapa
temprana del desarrollo, y que el primer defecto que precede a la hidrocefalia reside en el
linaje de las células ependimarias;
los ependimocitos se desprenden y siguen
aparentemente una progresiva y programada denudación ependimaria. El defecto también
involucra alteraciones en el OSC como lo reporta Pérez-Fígares y col. 1998. Esta glándula
cerebral mostraba células ependimarias más bajas y una placa inmunorreactiva de
ubicación supracomisural. También se menciona (Pérez-Fígares y col. 1998) la existencia
de un denso plexo de fibras serotoninérgicas el cual se origina del mismo manojo
serotoninérgico que inerva al OSC. Este plexo de fibras serotoninérgicas se ubica debajo
del órgano supracomisural.
Pérez-Fígares y col. 1998 han postulado que las glicoproteínas secretadas por el OSC
presentarían características similares en cuanto a las glicoproteínas secretadas por el órgano
supracomisural.
Dado que en el transcurso del tiempo, los ratones hyh hidrocefálicos que presentan una
hidrocefalia severa mueren dentro de la primera semana de vida; otros viven hasta los tres
meses de vida (Batiz LF 2003).
Sorpresivamente hemos observado que un grupo de ratones hyh hidrocefálicos han
sobrevivido hasta el año de vida, desconociendo totalmente la causa de este suceso. Esto
nos condujo a plantear nuestra hipótesis de trabajo.
2.1. Nuestra hipótesis de trabajo plantea:
“que en los ratones mutantes hyh hidrocefálicos crónicos que sobreviven desde tres
meses hasta un año de vida, ocurrirían cambios importantes en el complejo OSC-FR y
órgano supracomisural “.
2.2. El objetivo general de este trabajo de Tesis es:
“estudiar los cambios morfológicos que ocurren en el complejo OSC-FR y en el
órgano supracomisural (placa AFRU inmunorreactiva) en los ratones mutantes hyh
hidrocefálicos crónicos, desde tres meses hasta un año de vida”.
2.3. Los objetivos específicos son:
1.- Obtención de ratones mutantes hyh de 3, 4, 5, 6, 10 meses y de 1 año de edad y de sus
respectivos controles hermanos.
2.- Estudio de cerebros y médula espinal de ratones hyh, a nivel de microscopía óptica.
3.- Estudio inmunocitoquímico, usando AFRU como primer anticuerpo, en corte
histológicos.
4.- Estudio de la inervación serotoninérgica del OSC y órgano supracomisural (Placa
AFRU inmunorreactiva, según Pérez Fígares y col. 1998), usando anticuerpos antiserotonina.
5.- Estudio de la porción glucídica de las glicoproteínas del OSC y del órgano
supracomisural mediante el uso de lectinas tales como LFA (Limax flavus agglutinin)
(lectina especifica para el ácido siálico) y PNA (Arachis hypogaea Peanut aglutnina)
(lectina especifica para la galactosa).
6.- Estudio de microscopía electrónica de barrido del OSC y del órgano supracomisural en
ratones de 1 año de edad.
3. MATERIALES Y METODOS
Ratones de la cepa C57BL/10J fueron obtenidos del Laboratorio Jackson (Bar Harbor, ME.,
U.S.A.) los cuales fueron cruzados dentro de la colonia en el Bioterio del Instituto de
Histología y Patología, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile. Los animales fueron
alimentados ad libitum con alimento para roedores y mantenidos bajo un período constante
de Luz-Oscuridad 12:12 h, a 25ºC de temperatura.
Para la presente investigación las hembras heterocigotas en proestro del ciclo estral se
cruzarán con machos heterocigotos durante toda la noche. Las hembras preñadas serán
separadas, y seguirán
bajo condiciones normales de luz - oscuridad y alimentación.
Después del parto se contarán las crías y se revisarán clínicamente para detectar signos que
identifiquen al mutante recién nacido, tales como tamaño corporal, cabeza en domo,
encogimiento de los miembros superiores cuando se los eleva o se los pone de espalda; tres
a cuatro días después del nacimiento el diagnóstico es más seguro, ya que el signo típico
que se manifiesta es andar a brincos. Sin embargo, el diagnóstico definitivo se realizará por
análisis a microscopía de las médulas espinales de las crías.
La manipulación, cuidado y procesamiento de los animales se llevará a acabo de acuerdo a
las regulaciones aprobadas por el Consejo de Sociedad Fisiológica Americana.
3.1. Microscopía óptica.
Ratones mutantes hyh hidrocefálicos y normales de 3, 4, 5, 6, 10 meses y de un año de
edad, fueron procesados para microscopía óptica.
Bajo anestesia profunda con éter, los ratones fueron fijados por medio de perfusión
vascular. Para ello se les inyecto 0,1 ml de heparina al ventrículo izquierdo, después se
corto la aurícula derecha para provocar el retorno venoso, luego se le inyecto 10 ml de
solución salina (NaCl al 0,9%) más heparina, la cual se usa para limpiar el sistema
circulatorio del animal, y para la fijación se inyectará 10 a 15 ml de solución Bouin.
Los animales fueron decapitados y después se extrajo el cerebro y un trozo de la médula
espinal los cuales fueron sumergidos en fijador Bouin durante 2 ó 3 días. Posteriormente se
realizo la inclusión la cual se hará en parafina.
La ubicación anatómica del complejo OSC-FR y órgano supracomisural fue determinado
por medio de cortes histológicos de 7 m de espesor teñidos con Hematoxilina y Eosina.
Secciones transversales de la médula espinal de todos los animales se teñirán con
Hematoxilina y Eosina las cuales serán usadas para diferenciar los ratones normales de los
hidrocefálicos por la presencia o ausencia de canal central, respectivamente. Luego los
cerebros de ratones hidrocefálicos y normales se cortaron frontalmente o sagitalmente, de
un espesor de 7 m y se montaron seriadamente 1 cada 5, obteniendo 5 seriados para
aplicar diversas tinciones.
3.1.1. Inmunocitoquímica.
Cortes vecinos a los teñidos con Hematoxilina y Eosina que contienen el complejo OSC-FR
y el órgano supracomisural son procesados por medio del método de Sternberger y col.
1970. Utilizando los siguientes anticuerpos:
a) AFRU (A= anticuerpo; FR = fibra de Reissner; U = urea). Estos anticuerpos fueron
obtenidos en conejo contra las glicoproteínas constitutivas de la FR (Rodríguez y col.
1984). El AFRU reacciona específicamente con las glicoproteínas secretadas por el OSC
dentro del LCR donde ellas se agregan para formar la fibra de Reissner (FR) (Nualart y col.
1991). El AFRU se utilizó a una dilución de 1:1000. La incubación en el primer anticuerpo
es de 18 horas. El segundo anticuerpo; una anti-IgG de conejo es obtenida en cabra
(Instituto de Histología y Patología Universidad Austral, Valdivia, Chile), se usó a una
dilución 1:10 y la incubación duró una hora. El complejo PAP-conejo (obtenido en el
instituto de Histología y Patología, Valdivia, Chile), se usó a una dilución 1:75, y se incubó
durante 30 minutos. La 3,3´diaminobenzidina tetraclórhidrica (DAB, Sigma, St. Louis,
MO, USA) es usada como dador de electrones, usando como sustrato el peroxido de
hidrógeno (H2O2). Las incubaciones se realizaron a 20ºC. Todos los anticuerpos fueron
diluidos en buffer Tris, pH 7.8, conteniendo 0,7% de gelatina de alga lambda carragina no
gelificada (Sigma, St. Louis, MO, USA) y 0,5% Tritón X 100 (Sigma, St. Louis, MO,
USA).
Otro set de preparados se incubaron con:
b) Antiserotonina (Pérez-Fígares y col. 1998) proveniente de dos diferentes orígenes: i) el
primero proviene de Sigma, que fue usado a una dilución de 1:1000, y se incubó durante 18
horas; ii) el segundo proviene de los laboratorios de Málaga y Valdivia, y es usado en una
dilución 1:50, y se incuba por una hora; el complejo PAP (Sigma) es usado a una dilución
1:200, y se incuba durante 30 minutos.
Como dador de electrones se usó la 3,3´diaminobenzidina tetraclórhidrica (DAB, Sigma,
St. Louis, MO, USA) con su respectivo sustrato H2O2. Las incubaciones fueron hechas a
20ºC. Todos los anticuerpos son diluidos en buffer Tris, pH 7.8, conteniendo 0,7% de
gelatina de alga lambda carragina no gelificada (Sigma, St. Louis, MO, USA) y 0,5%
Tritón X 100 (Sigma, St. Louis, MO, USA).
Una vez terminada la inmunotinción los cortes se tiñen con Hematoxilina para dar
contraste.
3.1.2. Unión de lectinas.
Las lectinas tienen la propiedad de unirse con afinidad específica a ciertos residuos del
árbol glucídico de las glicoproteínas. En el presente estudio utilizaremos dos lectinas:
1)
Limax flavus agglutinin (LFA: afinidad exclusiva por ácido siálico). La LFA no
marcada (Calbiochem, San Diego, CA, USA) se usó a una concentración de 7 g/ml
en buffer Tris 0.1 M, pH 7.3. El sitio de unión de lectina se revelará por el método de
la inmunoperoxidasa usando suero de anti-LFA (obtenido en Instituto de Histología y
Patología Universidad Austral, Valdivia, Chile).
2)
Lectina de Arachis hypogaea Peanut aglutinina (PNA: se une a la galactosa como
residuo terminal). Las secciones serán incubadas en PNA marcada con peroxidasa
(Sigma, St. Louis, MO, USA), 20 g/ml en buffer Tris 0.1 M, pH 7.8.
3.2. Microscopía Electrónica de Barrido.
Se procesaron los cerebros de ratones hyh hidrocefálicos de un año de edad con sus
correspondiente hermanos. Bajo profunda anestesia con éter, se les prefundió
vascularmente con solución de Karnovsky. Se extrajo el cerebro y un trozo de médula
espinal, luego, bajo una lupa de disección se le inyecto suavemente fijador fresco dentro de
los ventrículos cerebrales expuestos usando una de microjeringa, y se completo un período
de post-fijación de dos horas por inmersión.
El cerebro fue disecado bajo una lupa y se prepararon los siguientes bloques de tejido:
1)
Corte sagital para poder tener una visión lateral del tercer ventrículo, acueducto de
Silvio (AS) y cuarto ventrículo.
2)
Se levantó el techo del AS para visualizar el piso del cuarto ventrículo, y el órgano
supracomisural ó placa inmunorreactiva. (Pérez-Fígares y col. 1998).
Posteriormente, los bloques de tejido fueron lavados en buffer fosfato 0.1 M; se post-fijaron
en OsO4 al 1% en buffer fosfato 0.1 M, pH 7.4 durante dos horas, a 4ºC. Después de la
deshidratación y secado a punto crítico del CO2, los bloques de tejido se cubrieron con una
capa de oro mediante ionización, se observaron en un microscopio electrónico de barrido
LEO-420 y se obtuvieron imágenes digitalizadas.
4. RESULTADOS
4.1. Selección de animales hidrocefálicos:
La selección de los animales hyh hidrocefálicos se hizo sin problema desde los 15 días
postnatal en adelante, mediante las manifestaciones clínicas: menor tamaño respecto a sus
hermanos normales, cabeza en domo, caminar dificultoso, etc.
Todos los animales estudiados presentaron la marcha típica de “hop gait” (un
caminar a saltos, tipo conejo), caracterizada por la falta de alternancia en las patas traseras
y presentaron además el signo de “forehand grip”, que se caracteriza porque al suspender
los ratones desde su cola, los ratones hyh hidrocefálicos tienden a tomarse las cuatro patas,
adoptando una posición de tipo fetal (Fig. 1). En los animales hidrocefálicos crónicos no
era muy notoria la cabeza en “domo”, (aquellos que presentaban una fuerte macrocefalia
morían tempranamente) sin embargo, todos presentaban una actividad espontánea
disminuida (quedándose en un rincón de la jaula, casi inmóvil).
FIGURA 1. Forehand grip, al suspender los ratones de la cola, el hyh hidrocefálico tiende a
tomarse las cuatro patas (posición fetal).
4.2. Aspectos generales del complejo OSC-FR:
Ratón hyh normal
El corte sagital del cerebro de un ratón hyh normal, teñido con Hematoxilina y
Eosina mostró la presencia de un OSC normal, el cual está formado por las típicas células
ependimarias ubicadas bajo la comisura blanca posterior; un tercer ventrículo cerebral
normal con un acueducto de Silvio comunicante, cuya porción rostral involucra al OSC,
una porción medial con su típica forma piramidal y una porción caudal que se comunica
con un cuarto ventrículo normal.
Toda la pared del tercer ventrículo está tapizada por células ependimarias típicas. En la
porción ventral del tercer ventrículo se observa la eminencia media (EM), comisura blanca
anterior (Ca), enfrentado a ésta, el tálamo óptico (Ta). En la porción más dorsal del tercer
ventrículo cerebral se aprecia el órgano subfornical (OSF), los plexos coroideos (PC), la
comisura habenular (CH) (Fig. 2A).
Un corte inmunoteñido con AFRU, revela la presencia de un OSC muy
inmunorreactivo,
cuyas
células
ependimarias
presentan
prolongaciones
basales
inmunorreactivas que van a terminar sobre el espacio subaracnoideo (ESA). En el
acueducto de Silvio rostral (ASR) se observan las ultimas células que conforman el OSC
(Fig. 2B).
No se observa la presencia de una placa inmunorreactiva (u órgano supracomisural)
(Fig. 2B).
El corte transversal de la médula espinal presenta un canal central (cc) abierto, cubierto por
células ependimarias ciliadas (Fig. 3).
FIGURA 2. A Corte sagital de hyh normal de 6 meses de edad, teñido con
Hematoxilina/Eosina. Mostrando el órgano subcomisural (OSC); tercer ventrículo (IIIventrículo); Eminencia media (EM); Comisura blanca anterior (Ca); Tálamo óptico (Ta);
Órgano subfornical (OSF); Plexos coroideos (PC); Comisura habenular (CH).
FIGURA 2. B Corte sagital de ratón hyh normal de 6 meses inmunoteñido con AFRU. Se
observa el órgano subcomisural (OSC) muy reactivo; la entrada del acueducto de Silvio
Rostral (AS) totalmente abierta; tercer ventrículo cerebral (III-V) y Comisura Blanca
Posterior (CP)
FIGURA 3. Corte transversal de médula de hyh normal, teñido con Hematoxilina/Eosina,
muestra el conducto del epéndimo abierto (CC).
OSC de ratón hyh hidrocefálico desde tres meses hasta un año postnatal.
En un corte sagital medial de cerebro de un ratón hyh hidrocefálico de tres meses de edad,
inmunoteñido mostró que el tamaño del OSC está bastante disminuído al ser comparado
con ratones hyh normales sin embargo, la inmunorreactividad no disminuyó pues tanto el
OSC normal como el OSC del ratón hidrocefálico siguen siendo inmunorreactivos (Figs. 4
y 5). En el corte sagital del OSC del ratón hidrocefálico puede observarse el órgano
supracomisural muy reactivo con el anticuerpo AFRU (Fig. 4). El acueducto de Silvio en su
porción rostral está obliterado pero aparentemente permeable pues en su región más caudal
puede observarse material inmunorreactivo (Fig. 4). El OSC de ratones hyh hidrocefálicos
se redujo de tamaño a partir de los 6 meses y hasta 1 año de vida (Fig. 6).
En los ratones hyh hidrocefálicos desde postnatal 2 (PN-2) hasta un año de edad se observa
una hidrocefalia en los ventrículos laterales,  ventrículo y en la región caudal del
Acueducto de Silvio. En la región más rostral del Acueducto de Silvio de ratones hyh
hidrocefálicos crónicos de un año de edad existe una estenosis (Fig. 7 A). La porción media
del acueducto de Silvio (ASM) se encuentra muy dilatada y la porción caudal del acueducto
de Silvio (ASC) totalmente obliterada sin comunicación con el cuarto ventrículo (Figs. 7
B).
Las paredes ventriculares se encuentran denudadas con excepción de algunas zonas; como
el AERD (área ependimaria resistente a la denudación) en el ASM, la región del piso del
acueducto que se opone al OSC (Fig. 8 A), y los órganos circunventriculares. (Compare la
Fig. 8 A con la Fig. 8 B de Microscopía electrónica de barrido, cuya barra roja muestra la
zona ependimaria resistente al denudamiento).
El corte transversal de la médula espinal de ratones hyh hidrocefálicos de una año,
no presenta el canal central, al igual que los ratones desde PN-1 en adelante (Fig. 9).
FIGURA 4. Corte sagital por la región medial del cerebro de un ratón hyh hidrocefálico de
tres meses de vida, inmunoteñido con AFRU. Se observa el órgano subcomisural (OSC)
inmunorreactivo; el órgano supracomisural ó placa inmunorreactiva indicado con las
flechas negras cortas y las flechas negras delgadas muestran la zona más dorsal y posterior
de la placa inmunorreactiva; un acueducto de Silvio (AS) en su porción rostral obliterado;
material inmunorreactivo indicado por la fecha roja y el III ventrículo cerebral (III-V).
IV-
FIGURA 5. Corte sagital por la región medial de cerebro de un ratón hyh normal de tres
meses de edad, inmunoteñido con AFRU. Se observa el órgano subcomisural (OSC)
V
inmunorreactivo; un acueducto de Silvio (AS) abierto que está comunicando al tercer
ventrículo (III-V) con el cuarto ventrículo (IV-V). No se observa la presencia del órgano
supracomisural.
FIGURA 6. A i Corte sagital de cerebro de ratón hyh hidrocefálico de un año de edad,
teñido con Hematoxilina/Eosina, la flecha roja indica el órgano supracomisural; y la flecha
negra indica el órgano subcomisural (OSC).
FIGURA 6. A ii Corte sagital de órgano subcomisural (OSC) de un ratón hyh hidrocefálico
de un año de edad, teñido con Hematoxilina/Eosina. Se observan las células propias del
OSC muy bajas indicadas por la flecha negra. También se muestra el tercer ventrículo
cerebral ( III-V).
FIGURA 6. B Corte sagital de cerebro de ratón hyh hidrocefálico de seis meses de edad,
teñido con Hematoxilina/Eosina. Las flechas negras indican el órgano supracomisural; se
indica el tercer ventrículo cerebral (III-V).
FIGURA 7. A Corte sagital de cerebro de ratón hyh hidrocefálico de 1 mes de vida. Se
observa la estenosis del acueducto de Silvio rostral indicado por la flecha negra; y la
comunicación que existe entre el acueducto de Silvio (AS) y el cuarto ventrículo (4º V)
indicado por la flecha azul; la flecha negra con borde blanco muestra el área ependimaria
resistente a la denudación (AERD) del acueducto de Silvio medio (ASM).
FIGURA 7. B Corte sagital de cerebro de ratón hyh hidrocefálico de 3 meses de vida. Se
observa la porción rostral del acueducto de Silvio completamente estenosado indicado por
la flecha naranja; un acueducto de Silvio Medio dilatado y un acueducto de Silvio Caudal
obliterado indicado por la flecha azul, bloqueando la comunicación con el cuarto ventrículo
(4ºV); se muestra también la denudación ependimaria: flechas rojas y el área ependimaria
resistente a la denudación AERD indicada por la flecha negra con borde blanco.
FIGURA 8. A Corte sagital del acueducto de Silvio medio (ASM) de un ratón hyh
hidrocefálico de un año de edad, teñido con Hematoxilina/Eosina. La flecha negra indica el
epitelio cilíndrico simple del área ependimaria resistente a la denudación (AERD).
FIGURA 8. B Corte sagital de un ratón hyh hidrocefálico de un año de vida, imagen a
microscopía electrónica de barrido del área ependimaria resistente a la denudación (AERD)
de un ratón hyh hidrocefálico, se muestra la superficie del epéndimo cilíndrico (línea roja)
de esta área ependimaria (e) que presenta muchas microvellosidades; se observa también el
piso del acueducto denudado (D) que presenta muchos macrófagos indicado por la flecha
blanca.
FIGURA 9. Corte transversal de médula espinal de ratón hyh hidrocefálico de un año de
edad, teñido con Hematoxilina/Eosina. Se observa la ausencia de canal central lo cual esta
siendo indicado por la flecha negra.
En los ratones hyh hidrocefálicos, de 3 meses, 5 meses, 8 meses, un año de edad que fueron
analizados no se observó ningún tipo de formación de FR pero si secreción de material
inmunorreactivo de las células secretorias del OSC, que en algunos ratones cuyo ASR era
aún permeable se pudieron observar masas de material inmunorreactivo (Fig. 4).
4.3. Microscopía óptica del órgano supracomisural o placa
inmunorreactiva.
Un corte frontal en la región medial del cerebro de un ratón hyh hidrocefálico de un año de
edad, inmunoteñido con AFRU, muestra que el OSC continúa siendo muy inmunorreactivo,
se observa la presencia de la placa inmunorreactiva u órgano supracomisural (Fig. 10), a
medida que el ratón envejecía (desde PN-2 hasta un año postnatal) esta placa iba creciendo
en sentido dorso caudal, mostrando que la parte del órgano supracomisural que se
encontraba cerca del OSC estaba constituida exclusivamente por células inmunorreactivas.
En los ratones hyh hidrocefálicos de un año de edad estudiados, el órgano supracomisural ó
placa inmunorreactiva se hace más evidente extendiéndose en forma dorsal y lateralmente,
también se observa un OSC inmunorreactivo con un tercer ventrículo bastante disminuido
formando una pequeña cavidad (Fig. 10). La imagen a un mayor aumento reveló zonas
inmunorreactivas y zonas no inmunorreactivas de este órgano supracomisural (Fig. 11).
FIGURA 10. Corte cerebral frontal de ratón hyh hidrocefálico de un año de edad,
inmunoteñido con AFRU y hematoxilina de fondo. Se observa la placa inmunorreactiva u
órgano supracomisural que está indicado por las flechas negras; el órgano subcomisural
(OSC) el cual se indica con el asterisco y el tercer ventrículo cerebral (III-V) indicado por
la flecha larga (cavidad).
FIGURA 11. Corte frontal caudal de cerebro de ratón hyh hidrocefálico de un año de edad,
inmunoteñido con AFRU y Hematoxilina de fondo. Las flechas negras muestran las zonas
de la placa AFRU positiva y las flechas rojas muestran las zonas de la placa AFRU
negativas.
4.3.1. Lectinas y Serotonina.
Las células ependimales que constituyen el órgano supracomisural son LFA positivas (LFA
es una lectina específica para el ácido siálico) lo que está revelando que el árbol glucídico
de las glicoproteínas tienen ácido siálico como residuo terminal (Fig. 12), y PNA negativas
(PNA lectina específica para la galactosa terminal) (Fig. 13), lo cual indica que el material
glicoproteico que contiene la placa AFRU inmunorreactiva es similar al que contienen las
células del OSC.
Se sabe que bajo el órgano supracomisural se extiende un denso plexo de fibras
serotoninérgicas; este plexo se origina desde el mismo manojo serotoninérgico que inerva
al OSC en ratones hyh hidrocefálicos, en los ratones estudiados de un año de edad se
observó que son negativos a la antiserotonina, este resultado será analizado en la discusión
(Fig. 14).
El órgano supracomisural o placa inmunorreactiva es drenada por el mismo vaso sanguíneo
que drena al OSC (Fig. 15).
Dado que la placa inmunorreactiva tiene capacidad secretoria y la naturaleza del producto
secretorio es similar a la del OSC, parece ser que las células de la placa inmunorreactiva
son semejantes a las del OSC.
FIGURA 12. Corte cerebral frontal de cerebro de ratón hyh hidrocefálico de un año de
edad, mostrando el órgano supracomisural (flechas rojas) LFA positivo y el III ventrículo
cerebral (flecha negra), no se observa el OSC.
FIGURA 13. Corte vecino al de la Fig. 12, teñido con PNA. El órgano supracomisural
(flechas rojas) es PNA negativo; III ventrículo cerebral: flecha negra; no se observa el
OSC.
FIGURA 14. Corte vecino al de la Fig. 13, mostrando el órgano supracomisural: flechas
rojas; serotonina negativo; III ventrículo cerebral: flecha negra; no se observa el OSC.
FIGURA 15. Corte frontal de cerebro de ratón hyh hidrocefálico de un año de edad, teñido
con Hematoxilina/Eosina. El órgano subcomisural (OSC) esta indicado por la flecha
amarilla; el tercer ventrículo cerebral (cavidad) está siendo indicado por el asterisco; el
órgano supracomisural es mostrado por las flechas negras; y el vaso sanguíneo por la flecha
roja.
4.4.
Microscopía
electrónica
de
barrido
del
órgano
supracomisural.
En los ratones hyh hidrocefálicos de un año de edad se observó que la placa
inmunorreactiva ubicada por sobre el OSC (Fig. 16 A y B), el órgano supracomisural
presenta una forma triangular, con uno de sus vértices apuntando hacia la entrada de la
porción rostral del acueducto de Silvio (ASR). Se puede observar bien la delimitación de
las células que constituyen la placa inmunorreactiva con respecto a las células de las
paredes ventriculares (Fig. 17), las cuales son multiciliadas (Fig. 20).
El órgano supracomisural o placa inmunorreactiva está constituida por células que son
monociliadas con microvellosidades y protrusiones (Fig. 18), son semejantes a las células
secretorias del OSC pero más bajas en altura, más caudalmente las células están dispuestas
en forman de mosaico las cuales presentan microvellosidades (Fig. 19).
En la superficie del órgano supracomisural en su porción más dorsal pueden observarse
abundantes macrófagos adheridos (Fig. 19).
La microscopía electrónica de barrido de la médula espinal de ratones hyh hidrocefálicos
crónicos muestra la ausencia del canal central de la médula, a diferencia de la médula de los
ratones hyh normales (Figs. 21 y 22).
FIGURA 16. A Corte frontal de un ratón hyh normal de un año de edad. Imagen a
microscopía electrónica de barrido del órgano subcomisural (OSC); las flechas rojas
indican la zona donde se ubicaría el órgano supracomisural en ratones hyh hidrocefálicos.
Y la flecha negra muestra material Pre-Fibra de Reissner.
FIGURA 16. B Mayor aumento de la Fig. 16 A. Se observa la zona desde donde nacerá el
órgano supracomisural o placa inmunorreactiva, la cual está indicada por la flecha roja.
FIGURA 17. Microscopía electrónica de barrido del órgano supracomisural, la cual
muestra su forma triangular con uno de sus vértices apuntando a la entrada del acueducto
de Silvio rostral (ASR): flecha roja; se observa bien la delimitación de la placa
supracomisural: flechas negras.
Fig. 17
Fig. 18
Fig. 16
FIGURA 18. Un mayor aumento de la superficie de la placa, mostrando células
monociliadas y con protrusiones.
FIGURA 19. Zona superficial caudal de la placa mostrando las típica células en mosaico y
macrófagos adheridos.
FIGURA 20. Pared ventricular vecina a la zona del órgano supracomisural, mostrando las
células multiciliadas.
Hidrocefálico
FIGURA 21. Corte de Médula espinal de ratón hyh normal indicando el canal central por
la flecha negra.
FIGURA 22. Corte de médula espinal de ratón hyh hidrocefálico en la cual se observa
indicado por flecha negra el canal central medular totalmente obliterado.
4.5. Ventriculostomías espontáneas.
Los ratones hyh hidrocefálicos crónicos no presentaron hemorragias severas como los
animales que hicieron una hidrocefalia rápida y progresiva, que terminaban con una muerte
temprana. Estos animales crónicos desarrollaron grandes ventriculostomías basales o
basolaterales. Las ventriculostomías corresponden a comunicaciones anómalas entre el
sistema ventricular y el espacio subaracnoideo.
Se pueden identificar dos tipos de ventriculostomías espontáneas: a) las que se
desarrollaron en puntos débiles del sistema ventricular como en el extremo ventral del asta
inferior de los ventrículos laterales (Fig. 23) (límite entre el tejido nervioso y los plexos
coroideos) o la porción ventrolateral del receso preóptico del tercer ventrículo (Fig. 24); y
b) las que se produjeron cuando la corteza cerebral se encontraba muy adelgazada.
El primer tipo de ventriculostomías se produjo tempranamente en algunos animales,
mientras que todos los animales con hidrocefalia crónica presentaron grandes
ventriculostomías de este tipo. Estas ventriculostomías se desarrollan progresivamente al
producirse la dilatación de los ventrículos laterales (VL) (Fig. 26).
El otro tipo, ocurrió más tardíamente cuando se adelgaza la corteza, y del mismo modo que
el anterior tendía a localizarse en las paredes ventrales o basales de la corteza cerebral
(regiones más adelgazadas).
Ambos tipos se desarrollan exclusivamente en zonas denudadas. Las zonas del sistema
ventricular que mantenían el epéndimo, no desarrollaban ventriculostomías. Un claro
ejemplo de esto se observó en el techo del III ventrículo y del ASM, donde a pesar de las
hiperdilataciones con paredes extremadamente delgadas, no se observan ventriculostomías
espontáneas. Tanto el techo del III ventrículo como el del ASM mantienen la cubierta
ependimaria.
Una de las principales características de ambos tipos de ventriculostomías fue que sus
bordes eran netos y romos, y el tejido nervioso subyacente no mostraba signos de
alteraciones.
La microscopía electrónica de barrido, demostró las comunicaciones entre el sistema
ventricular dilatado y el espacio subaracnoideo a través de estas ventriculostomías (Figs.
26) lo que posibilitó la supervivencia de estos ratones hyh hidrocefálicos crónicos hasta un
año de edad.
FIGURA 23. A Corte frontal de un ratón hyh normal de tres meses, teñido con
Hematoxilina/Eosina. Lugar donde ocurrirían las ventriculostomías espontáneas en los
ventrículos laterales (VL). Fig. 23 B Ampliación de lo anterior, se observa la “zona débil”
(asterisco) de los ventrículos laterales por donde se producen las ventriculostomías en los
animales hyh hidrocefálicos.
FIGURA 24. Ventriculostomías en el tercer ventrículo, corte frontal de un ratón hyh
hidrocefálico de tres meses de vida, teñido con hematoxilina y eosina, muestra la gran
dilatación de los ventrículos laterales (VL) y tercer ventrículo (III). Las cisternas basales
del espacio subaracnoideo (ESA) están muy dilatadas; en la región ventro-lateral del receso
preóptico se han formado dos ventriculostomías que generan dilataciones peri quiasmáticas
del espacio subaracnoideo (P) por acumulación del Liquido cefalorraquídeo (LCR)
(flechas) a ambos lados del quiasma óptico (Q).
FIGURA 25. Representación esquemática de cortes frontales que muestran la progresión
de la dilatación de los ventrículos laterales (VL) de un ratón normal (1), al dilatarse los
ventrículos laterales (2), el hipocampo adopta una posición más vertical y aparecen las
ventriculostomías basales (flechas negras) en la zona de los “puntos débiles” de los
ventrículos laterales; al ser las dilataciones muy severas (3), la corteza se adelgaza y
aparecen las ventriculostomías en la pared (flecha negra en 3).
FIGURA 26. Ventriculostomías espontáneas en los ventrículos laterales, imagen a
microscopía electrónica de barrido de un ratón hyh de 1 año de vida (para la ubicación ver
las flechas largas, eje Rostro-Caudal y Latero-Medial). El asterisco muestra la
ventriculostomía medial, la cual se produce en la zona débil del ventrículo lateral, y el
círculo muestra una ventriculostomía más lateral. Nótese la amplitud de las comunicaciones
anómalas. Se observa el espacio subaracnoideo (ESA), trabéculas (flechas negras) que
atraviesan el ESA, y las meninges (Me).
5. DISCUSION
La cepa del ratón mutante hyh que está en reproducción en nuestro laboratorio, está
siendo motivo de varias investigaciones; es la única cepa en la que se han estudiado
algunos de los cambios que ocurren en el embrión hidrocefálico (Wagner y col. 2003). En
el proceso hidrocefálico que opera en el ratón hyh se pueden distinguir dos etapas, una
temprana ó embrionaria y otra tardía ó postnatal. La temprana comienza al día 12 de la vida
embrionaria y se extiende hasta la primera semana postnatal. Es la etapa embrionaria estos
ratones hyh presentan una hidrocefalia moderada y un acueducto de Silvio (AS) permeable
(Jiménez y col. 2001; Wagner y col. 2003; Batiz LF 2003). La fase postnatal comienza en
la primera semana de vida, cuando se produce la obliteración del extremo distal del AS, lo
que es seguido por el desarrollo de una hidrocefalia grave que culmina con la muerte del
ratón alrededor de un mes de vida (Pérez-Fígares y col. 1998). El ratón mutante hyh está
caracterizado por una hidrocefalia de los ventrículos laterales, del tercer ventrículo y de la
región medial del AS. Estas mismas características morfológicas las presentó el ratón hyh
hidrocefálico de tres meses hasta un año, sin embargo, los animales pudieron sobrevivir
debido a que no presentaban hemorragias en los ventrículos o hemorragias subaracnoideas.
Complejo OSC-FR:
Ya a los 20 días postnatal Pérez- Fígares y col. 1998 había demostrado la presencia de un
OSC compuesto por células ependimarias bastante más bajas que en el OSC normal, estas
células eran fuertemente inmunorreactivas frente al anticuerpo AFRU y la presencia de una
placa AFRU inmunorreactiva que nosotros denominamos como órgano supracomisural.
Hay evidencias que en los ratones hyh hidrocefálicos al día 1 postnatal no presentan el
órgano supracomisural o placa inmunorreactiva; la cual si se hace presente a partir del
quinto día postnatal (Pérez-Fígares y col. 1998; Wagner y col. 2003).
Se sabe que la hidrocefalia progresa con la edad, junto a esta patología las células
ependimarias empieza a elongarse y situarse por sobre el OSC; se hacen reactivas con el
AFRU y constituyen la placa ependimal AFRU-inmunorreactiva (AFRU-ir) u órgano
supracomisural, lo que marca otra diferencia muy importante en los animales
hidrocefálicos, esta población adicional de células ependimales se ubicaban sobre la
comisura blanca posterior.
En los ratones hyh hidrocefálicos desde tres meses hacia delante, este órgano
supracomisural se extendía aún más en sentido dorsocaudal, presentando zonas fuertemente
inmunorreactivas y zonas no inmunorreactivas, las que fueron más evidentes en los
animales muy crónicos, donde el tercer ventrículo cerebral estaba enormemente dilatado, al
igual que el acueducto de Silvio medial (ASM).
El OSC y el órgano supracomisural secretan activamente material glicoproteico hacia el
LCR, pero no logran formar una FR, probablemente este material quede soluble en las
cavidades ventriculares. ¿Cuál es el significado funcional de la presencia de este órgano
supracomisural? ¿Por qué sólo está presente en los animales hidrocefálicos? Esto es un
enigma y habría que estudiarlo a futuro.
El reciente estudio de Wagner y col. 2003, demostró que el OSC de los ratones hyh
normales e hidrocefálicos eran: fuertemente inmunorreactivos con el anticuerpo antiFR;
reaccionó con la antiserotonina, con lectinas: LFA positiva indicando que el árbol
glucosidico contenía ácido siálico como residuo terminal, PNA negativo, pero al hacer una
hidrólisis ácida este se hacia positivo. Nuestros resultados están de acuerdo con los
presentados por Wagner, sin embargo, en los animales hidrocefálicos en los que se estudió
el OSC y el órgano supracomisural (placa inmunorreactiva), esta compartía la
inmunorreactividad respecto al AFRU pero no respecto a la antiserotonina. Una de las
posibles causas podría ser: 1.- pérdida de la inmunorreactividad del anticuerpo; 2.- que la
hidrocefalia “per se” podría producir un daño a nivel de los núcleos serotoninergicos del
RAFE, que son los que inervan al OSC.
El origen del órgano supracomisural ó placa inmunorreactiva no está aún dilucidado, se
sugiere que ella proviene de la diferenciación de las células ependimarias o de células stem.
La presencia de zonas AFRU positivas y AFRU negativas en el órgano supracomisural
estaría indicando que no todas las células se diferencian al mismo tiempo ó la otra
posibilidad, como lo propuso Batiz 2003, las células ependimarias estarían sufriendo
mitosis, luego maduración y posteriormente diferenciación.
El presente trabajo trató de dilucidar ¿Cuál sería el ó los mecanismos por los cuales estos
ratones mutantes hyh hidrocefálicos podrían sobrevivir hasta un año?.
El trabajo de Batiz LF 2003 han demostrado que los ratones hyh que presentan una
hidrocefalia progresiva mueren a los 30 días. La autopsia de estos animales mostraron
grandes hemorragias en los ventrículos cerebrales y también en el espacio subaracnoideo,
lo cual hacía mucho más grave la hidrocefalia y terminaba con la muerte del animal. Los
ratones hyh hidrocefálicos crónicos presentaban las típicas características patogénicas, es
decir, “hop gait”, el “forehand grip” y la cabeza en domo moderada; al examinar los
cerebros el día del sacrificio no mostraban hemorragias y lo más sobresaliente fue la
presencia de las ventriculostomías lo que facilitaba la salida del LCR y desagüe en la vía
sanguínea. Nosotros creemos que estas ventriculostomías y la carencia de hemorragias son
las que posibilitaban la sobrevida de estos animales, aún tomando en cuenta que la corteza
cerebral presentaba su mínima expresión, como también el cerebelo estaba bastante
disminuido.
El significado de la presencia de este órgano supracomisural, el material secretorio soluble
y las ventriculostomías merecen un estudio más acucioso y será tema de otra investigación
futura.
6. CONCLUSIONES
Por medio de la presente investigación se puede concluir que:
1.- El órgano supracomisural ó placa inmunorreactiva se sigue extendiendo dorsocaudalmente hasta un año de edad en los ratones hyh hidrocefálicos, que es el tiempo
máximo de nuestro estudio.
2.- El tamaño de las células del OSC de un ratón hyh hidrocefálico en comparación con un
ratón normal va disminuyendo. A medida que el ratón hyh hidrocefálico va envejeciendo
las células del OSC van disminuyendo en su altura.
3.- Este órgano supracomisural sigue secretando glicoproteínas hacia el LCR, sin embargo
el destino, y la función de estas glicoproteínas se desconocen.
4.- La sobrevivencia de estos animales hasta el año de vida se debería a la generación de las
ventriculostomías presentadas a nivel de ventrículos laterales y áreas basales del cerebro.
5.- Estas ventriculostomías estarían vaciando el LCR hacia el sistema circulatorio, razón
por la cual la presión intracerebral disminuye y el animal puede dificultosamente
sobrevivir.
6.- La inmunorreactividad del OSC se mantiene a lo largo del tiempo al menos hasta un
año. El OSC sigue secretando glicoproteínas hacia el LCR del tercer ventrículo pero no
logra formar la FR.
7.- El órgano supracomisural no reacciona con la Serotonina.
8.- El órgano supracomisural es LFA positivo lo que indica que el material secretorio
contiene ácido siálico como residuo terminal en su árbol glucídico y PNA negativo lo que
indica que la galactosa no es residuo terminal.
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