Ana´lisis metilo´mico prenatal no invasivo

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Clinical Chemistry 59:11
1583–1594 (2013)
Diagnóstico Molecular y Genética
Análisis metilómico prenatal no invasivo mediante
secuenciación hologenómica por bisulfito del ADN en
plasma materno
Fiona M.F. Lun,1,2† Rossa W.K. Chiu,1,2† Kun Sun,1,2 Tak Y. Leung,3 Peiyong Jiang,1,2 K.C. Allen Chan,1,2
Hao Sun,1,2 y Y.M. Dennis Lo1,2*
ANTECEDENTES:
Los mecanismos epigenéticos desempeñan una función importante en el desarrollo prenatal
pero los tejidos fetales no son de acceso fácil. Las
moléculas de ADN fetal están presentes en el plasma
materno y pueden analizarse de forma no invasiva.
CONCLUSIONES: Analizamos de forma eficaz los metilomas fetales y placentarios a una escala hologenómica,
no invasiva y en serie. Este desarrollo ofrece un
poderoso método de investigación, detección de biomarcadores y pruebas técnicas para trastornos relacionados con el embarazo.
MÉTODOS:
© 2013 American Association for Clinical Chemistry
RESULTADOS: Debido a la naturaleza no invasiva de estos
métodos, pudimos realizar una evaluación en serie de
los perfiles de metilación del plasma fetal, materno y
placentario con muestras de sangre materna obtenidas
en el primero y el tercer trimestres y después del parto.
Se observaron cambios causados por la gestación. El
perfil de metilación fetal deducido a partir de de los
datos del plasma materno se asemejaron a aquellos del
metiloma placentario, tanto a nivel hologenómico
como en la localización de CpG (citosina fósforo
guanina). Se identificaron genes sellados y regiones
metiladas de manera diferenciada a partir de los datos
del plasma materno. Demostramos una posible aplicación clı́nica de la secuenciación por bisulfito en
plasma materno con la detección eficaz de la trisomı́a
21 fetal.
El desarrollo prenatal involucra una serie de sucesos
genéticos y epigenéticos altamente organizados. Las
anomalı́as en el control epigenético de los procesos de
desarrollo están implicadas en la esterilidad, abortos
espontáneos, anomalı́as en el crecimiento intrauterino
y consecuencias posteriores al nacimiento (1–3 ). La
metilación del ADN es un importante mecanismo epigenético y se lo conoce mejor en el contexto de la inserción de un grupo metı́lico al carbono 5⬘ de los residuos de citosina en dinucleótidos CpG. La metilación
de citosinas agrega una capa de control a la función del
ADN y se la conoce por su asociación con la represión
de la expresión génica.
La placenta humana exhibe una serie de
caracterı́sticas especiales que involucran la metilación
del ADN (4, 5 ). A un nivel general, los tejidos placentarios se hipometilan en comparación con la mayorı́a
de los tejidos somáticos (5, 6 ). Al nivel de los genes, el
estado de metilación del locus genómico particular es
una caracterı́stica distintiva especı́fica de los tejidos
placentarios (6, 7 ) y esta caracterı́stica distintiva muestra cambios que dependen de la edad gestacional (8 ).
Los genes sellados, llamados genes para los cuales la
expresión depende del origen parental de los alelos,
desempeñan funciones principales en la placenta (9 ).
El estudio del perfil de metilación del ADN de tejidos
Aplicamos la secuenciación hologenómica
por bisulfito mediante dos métodos a fin de analizar el
perfil de la metilación del ADN en plasma materno a
una resolución de nucleótido único. El primer método
utilizó muestras de sangre materna y las diferencias
polimórficas entre la madre y el feto para analizar el
metiloma fetal en el genoma. El segundo método utilizó el perfil de metilación de las células sanguı́neas maternas y la concentración de ADN fetal fraccionado en
plasma materno para deducir el perfil metilómico placentario a partir de los datos de secuenciación del ADN
en plasma materno.
1
Centre for Research into Circulating Fetal Nucleic Acids, Li Ka Shing Institute of
Health Sciences (Centro de Investigación de Ácidos Nucleicos Fetales Circulantes, Instituto de Ciencias de la Salud Li Ka Shing ) y Departments of 2 Chemical
Pathology and 3 Obstetrics and Gynaecology, The Chinese University of Hong
Kong (Departamentos de Patologı́a Quı́mica y Obstetricia y Ginecologı́a, La
Universidad China de Hong Kong), Shatin, Nuevos Territorios, RAE de Hong
Kong, China.
†
F.M.F. Lun y R.W.K. Chiu contribuyeron de igual manera al trabajo y deberı́an
considerarse primeros autores.
* Dirigir correspondencia para estos autores a: Department of Chemical Pathology, The Chinese University of Hong Kong, Prince of Wales Hospital, 30 –32
Ngan Shing St., Shatin, New Territories, Hong Kong SAR, China. Fax ⫹85226365090; correo electrónico: loym@cuhk.edu.hk.
Recibido para la publicación el 2 de julio de 2013; Aceptado para la publicación
el 8 de julio de 2013.
Previously published online at DOI: 10.1373/clinchem.2013.212274
1583
placentarios ha proporcionado conocimientos sobre la
fisiopatologı́a de las enfermedades relacionadas con el
embarazo o el desarrollo (10 ) y la restricción en el crecimiento intrauterino (2 ).
Se ha utilizado una serie de métodos para investigar
el metiloma placentario (11, 12 ). Pese a los esfuerzos realizados, no se encuentra disponible ningún medio práctico para supervisar los cambios dinámicos en el perfil de
metilación fetal o placentario en una escala hologenómica
durante el embarazo y durante los procesos de la enfermedad. En este estudio, intentamos desarrollar una plataforma que permita a los investigadores cuestionar el perfil
de metilación fetal y placentario de forma no invasiva en
serie y a escala hologenómica. Aplicamos la secuenciación
genómica por bisulfito (13–17 ) al análisis de moléculas de
ADN fetal libre de células que se encuentran en la circulación de las mujeres embarazadas (18 ). Diseñamos dos
métodos para cuestionar el estado de metilación de las
moléculas del ADN fetal/placentario en plasma materno.
El primer método explota las diferencias polimórficas entre la madre y el feto para identificar las moléculas del
ADN especı́ficas del feto. El segundo método no depende
de los polimorfismos fetales. El metiloma placentario se
reúne de forma no invasiva al usar el perfil de metilación
de las células sanguı́neas maternas y la concentración de
ADN fetal fraccionado en el plasma materno.
Materiales y métodos
RECLUTAMIENTO Y TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS DEL CASO
Se reclutaron mujeres embarazadas que asistieron a la
clı́nica prenatal del Department of Obstetrics and Gynaecology, Prince of Wales Hospital (Departamento de Obstetricia y Ginecologı́a del Hospital Prince of Wales),
Hong Kong, con consentimiento informado por escrito y
la aprobación del comité de ética. Se obtuvieron muestras
de vellosidades coriónicas luego de una indicación clı́nica
para la realización de la prueba de aneuploidı́a. Se obtuvo
sangre periférica materna en tubos de AEDT antes del
muestreo de vellosidades coriónicas.
En el caso del embarazo único, se obtuvieron
muestras de sangre venosa periférica en el primer trimestre (edad gestacional, 13 semanas y 4 dı́as) antes del
muestreo de vellosidades coriónicas a las 37 semanas y
5 dı́as antes de una cesárea electiva y dentro de las 24
horas después del parto. Se obtuvo una porción de
muestra de vellosidad coriónica (MVC)4 y una porción
de la placenta inmediatamente después del parto. Se
confirmó que el feto era de sexo masculino y de cariotipo normal. Las muestras se procesaron según se in-
4
Abreviaturas no estándar: MVC, muestra de vellosidad coriónica; SNP, polimorfismo de nucleótido único; DMR, región metilada de manera diferenciada.
1584 Clinical Chemistry 59:11 (2013)
formó previamente (19 ) (consulte los Materiales y métodos complementarios en los Datos complementarios
que acompañan la versión en lı́nea de este artı́culo en
http://www.clinchem.org/content/vol59/issue11).
Se obtuvo plasma materno de otros 12 embarazos
en edades gestaciones entre las 13 y 14 semanas cuando
las mujeres se presentaron a la detección sistemática de
aneuploidı́as cromosómicas convencional del primer
trimestre. Se confirmó que los fetos de cinco de las
mujeres presentaban trisomı́a 21 y los casos restantes
involucraban fetos de cariotipo normal.
PREPARACIÓN DE GENOTECAS CON TRATAMIENTO DE
BISULFITO Y ANÁLISIS DE SECUENCIACIÓN
Las genotecas se prepararon con el kit para preparación de
muestras de ADN Paired-End DNA Sample Preparation
Kit (Illumina) y el uso de adaptadores metilados (Illumina). Después de 2 series de purificación con microesferas magnéticas Agencourt® AMPure XP (Beckman
Coulter), dividimos los productos de la unión en 2 porciones, uno de los cuales fue sometido a 2 series de modificación con bisulfito con un kit EpiTect Bisulfite Kit
(Qiagen). Las moléculas de ADN ligadas por el adaptador
(ya sea con o sin tratamiento con bisulfito de sodio) se
enriquecieron con 10 ciclos de RCP. La secuenciación de
las genotecas se realizó con o sin tratamiento con bisulfito
a 75 bp en un formato de extremos emparejados en instrumentos HiSeq 2000 (Illumina). Las lecturas de
secuenciación se procesaron en un dispositivo de tramitación de análisis de datos de metilación [Methy-Pipe
(20 )]. Consulte los Materiales y métodos complementarios para obtener detalles adicionales.
Resultados
ANÁLISIS METILÓMICO EN SERIE DE UN EMBARAZO
Realizamos la secuenciación hologenómica de las
genotecas con conversión con bisulfito (13 ) preparadas del embarazo con muestras obtenidas en serie, que
incluyeron células sanguı́neas de la muestra de sangre
materna del primer trimestre, la MVC, el tejido placentario obtenido a término y las muestras de plasma materno del primer trimestre, tercer trimestre y posparto.
También analizamos muestras de ADN en plasma y
células sanguı́neas obtenidas de 1 hombre adulto y 1
mujer adulta no embarazada. Generamos un total de
9.5 ⫻ 109 pares de lecturas de secuencias brutas. La
cobertura de secuenciación de cada muestra se muestra
en la Tabla 1 y en la Tabla 1 de los Datos complementarios. Las lecturas de secuenciación cuyo mapeo se realizó de forma única conforme al genoma humano de
referencia alcanzaron coberturas medias del genoma
haploide aumentadas 51 veces, 34 veces y 28 veces en las
muestras de plasma materno del primer trimestre, el
tercer trimestre y luego del parto, respectivamente. La
b
a
9.18
9.62
1.70
1.76
Plasma materno
(tercer trimestre)
Plasma materno
(luego del parto)
Células sanguı́neas de
hombres adultos
Células sanguı́neas de
mujeres adultas
2.31
3.65
8.52
8.22
28.08
33.80
50.69
18.68
16.67
22.48
Exhaustividad
hologenómica,
cantidad de
vecesa
Después de la eliminación de lecturas ambiguas y duplicadas.
sec, secuenciado; H es un nucleótido A, C o T en CHG o CHH.
0.53
27.10
Plasma materno
(primer trimestre)
Plasma de mujeres
adultas
5.82
Placenta a término
0.80
3.72
MVC
Plasma de hombres
adultos
4.90
Muestra
Células sanguı́neas
maternas (primer
trimestre)
Lecturas
mapeables
totales,
ⴛ108
3.59
5.38
12.07
12.36
37.72
46.00
66.35
25.53
23.39
26.13
Exhaustividad de
secuenciación de
CpG, cantidad de
vecesb
72.46
71.15
71.93
71.43
73.16
68.22
66.93
59.13
55.35
71.72
Densidad
de la
metilación
de CpG, %
2.17
3.39
7.44
7.40
24.91
30.85
42.13
17.67
15.18
16.21
Exhaustividad
de la
secuenciación
genómica C,
cantidad de
veces
5.87
5.54
5.71
5.85
5.45
5.05
5.18
4.36
4.30
5.64
Densidad
de la
metilación
genómica
C, %
2.91
4.59
9.81
9.90
32.90
40.72
55.20
22.04
19.71
21.74
Exhaustividad
de la
secuenciación
CHG, cantidad
de veces
0.11
0.10
0.10
0.10
0.12
0.14
0.11
0.24
0.17
0.08
Densidad
de la
metilación
CHG, %
Tabla 1. Resumen de los resultados de secuenciación hologenómica del ADN por bisulfito.
1.86
2.91
6.32
6.22
21.77
27.03
36.68
14.80
12.78
13.65
Exhaustividad
de la
secuenciación
CHH, cantidad
de veces
0.10
0.10
0.10
0.10
0.12
0.16
0.11
0.29
0.19
0.08
Densidad
de la
metilación
CHH, %
Análisis Prenatal No invasivo Methylomic
Clinical Chemistry 59:11 (2013) 1585
Figura 1. Gráficos de barras de porcentajes de localizaciones de CpG metiladas dentro de las regiones repetidas y
sin repetir del genoma de referencia entre muestras obtenidas durante el embarazo.
cobertura de las localizaciones de CpG en el genoma
estuvo comprendida entre el 81% y el 92% en las muestras obtenidas durante el embarazo. Las lecturas de
secuenciación que abarcaron las localizaciones de CpG
alcanzaron coberturas haploides medias aumentadas
66 veces, 46 veces y 38 veces en las muestras de plasma
materno del primer trimestre, el tercer trimestre y luego del parto, respectivamente. La eficiencia media de
la conversión con bisulfito en todas las muestras fue de
99.96% (ı́ndice, 99.94%–99.98%).
PERFILES DE METILACIÓN HOLOGENÓMICA DE TEJIDOS
PLACENTARIOS Y CÉLULAS SANGUÍNEAS MATERNAS
Entre el 71% y el 72% de las localizaciones de CpG
secuenciadas se metilaron en el ADN extraı́do de las
células sanguı́neas obtenidas de mujeres embarazadas,
mujeres no embarazadas y hombres adultos (Tabla 1).
1586 Clinical Chemistry 59:11 (2013)
En forma coincidente con los informes sobre la naturaleza hipometilada de los tejidos placentarios, el 55% y
el 59% de las localizaciones de CpG se metilaron en la
MVC y el tejido placentario a término, respectivamente
(Tabla 1). También estudiamos el metiloma placentario con una plataforma de matriz de oligonucleótidos
que abarcó alrededor de 480 000 localizaciones de CpG
en el genoma humano (Illumina) (17, 21 ). Los datos de
las 2 plataformas coincidieron ampliamente (consulte
la Fig. 1 en los Datos complementarios en lı́nea). Nuestros datos de secuenciación también coincidieron con
aquellos informados por Chu y cols (22 ). (consulte la
Tabla 2 en los Datos complementarios en lı́nea). Los
ı́ndices de metilación no-CpG fueron ⬍1% de las células sanguı́neas maternas, las MVC y los tejidos placentarios (Tabla 1), coincidentes con los resultados informados de las células no pluripotentes (14, 15 ).
Análisis Prenatal No invasivo Methylomic
Tabla 2. Cifras de locus hipermetilados o hipometilados previstos a partir del análisis directo de los datos de
secuenciación por bisulfito del plasma materno.
Primer trimestre
Locus previstos, n
Tercer trimestre
Locus
hipermetiladosa
Locus
hipometiladosb
Locus
hipermetiladosa
Locus
hipometiladosb
3081
44 455
1746
14 930
Locus con densidades de metilación ⬎40% en el
tejido placentario, nc
1678
N/A
1525
N/Ad
Locus con densidades de metilación ⬍60% en el
tejido placentario, nc
N/Ae
23 468
N/Ae
13 475
Locus superpuesto con las DMR extraı́das del
tejido placentarioc y las células sanguı́neas
maternas, n
1457
21 812
1279
12 677
d
Locus en los cuales la placenta presenta una hipermetilación ⱖ20% en comparación con las células sanguı́neas maternas. La búsqueda de locus hipermetilados
comenzó por la lista de locus con densidades de metilación de ⬍20% en células sanguı́neas maternas.
Locus en los cuales la placenta presenta una hipometilación ⱖ20% en comparación con las células sanguı́neas maternas. La búsqueda de locus hipometilados
comenzó por la lista de locus con densidades de metilación de ⬎80% en células sanguı́neas maternas.
c
Los datos de secuenciación por bisulfito de las MVC y el tejido placentario a término se usaron para verificar los datos de plasma materno del primer trimestre
y del tercer trimestre, respectivamente.
d
No se aplica a la búsqueda de locus hipometilados.
e
No se aplica a la búsqueda de locus hipermetilados.
a
b
METILOMAS EN PLASMA
Las proporciones hologenómicas de las localizaciones
de CpG metiladas en el ADN de las muestras de plasma
obtenidas a partir de hombres y mujeres no embarazadas fueron prácticamente iguales a aquellas del ADN de
las células sanguı́neas correspondientes (consulte
Tabla 1; consulte la Fig. 2 en los Datos complementarios en lı́nea). A continuación, evaluamos la densidad
de metilación de cada depósito de 100-kb en el genoma
humano mediante la determinación de la cantidad total de citosinas no convertidas en las localizaciones de
CpG como una proporción de todas las localizaciones
de CpG cubiertas por las lecturas de secuenciación mapeadas conforme a dicha región de 100-kb. El coeficiente de correlación de Pearson (r) y el valor r 2 fueron
de 0.963 y 0.927, respectivamente, para la muestra de
ADN en plasma y la correspondiente muestra de ADN
en células sanguı́neas obtenidas de mujeres no embarazadas. Los valores para las muestras correspondientes de los hombres fueron 0.953 y 0.908 (consulte la
Fig. 3 en los Datos complementarios en lı́nea). Estos
datos coinciden con nuestras conclusiones anteriores
de que las células hematopoyéticas constituyen la fuente principal de ADN en el plasma humano (23 ).
En el caso del ADN de plasma materno, las proporciones generales de CpG metiladas fueron del 67%
y 68% para las muestras de plasma materno del primer
y tercer trimestres, respectivamente. A diferencia de los
resultados obtenidos en el caso mujeres no embarazadas, estas proporciones son menores que la proporción
correspondiente para la muestra de células sanguı́neas
maternas pero mayores que para las MVC y la muestra
de tejido placentario a término (Tabla 1). Es importante destacar que el ADN de la muestra de plasma
materno luego del parto presentó un porcentaje de
CpG metilada del 73%, que es similar al de los datos de
las células sanguı́neas (Tabla 1). Estas tendencias se observaron en las CpG distribuidas en todos los autosomas y el cromosoma X, y comprendieron las regiones
sin repetir y múltiples clases de elementos repetidos del
genoma humano (Fig. 1).
“General” hace referencia a los datos en las regiones repetidas y sin repetir del genoma (A), autosomas
(B) y el cromosoma X (C). Las diversas clases repetidas
se presentan conforme a lo definido por el navegador
genómico de la UCSC (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/
hgTrackUi?g⫽rmsk). Los datos que se muestran corresponden a las muestras del primer trimestre.
METILOMAS FETALES NO INVASIVOS
La moléculas de ADN fetal circulan en el plasma materno en un contexto de mayor concentración de ADN
materno (24 ). Utilizamos las diferencias del polimorfismo de nucleótido único (SNP) entre la madre y
el feto para identificar las moléculas de ADN fetal en
plasma materno. El objetivo era el de identificar el locus de SNP para el cual la madre era homocigótica y el
feto era heterocigótico. Se realizó la determinación de
genotipos del ADN genómico de las células sanguı́neas
maternas. La madre era homocigótica en el locus 1 945
516 en los autosomas. El análisis de las lecturas de
secuenciación del ADN en plasma materno demostró
Clinical Chemistry 59:11 (2013) 1587
Figura 2. Gráficos de cı́rculos de densidad de metilación por depósito de 1 Mb.
Continúa en la página 1589
la presencia de un alelo no materno en el locus 107 750;
estos locus se consideraron informativos. En cada SNP
informativo, el alelo no proveniente de la madre se denominó “alelo especı́fico del feto” y el otro alelo se denominó “alelo compartido”. Desde las diferencias alélicas, obtuvimos porcentajes de ADN fetal para las
muestras de plasma materno del primer trimestre,
tercer trimestre y luego del parto del 14.4%, 33.9% y
4.5%, respectivamente. Los porcentajes de ADN fetal
correspondientes calculados con las cifras de las lecturas del cromosoma Y fueron del 14.2%, 34.9% y 3.7%.
Reunimos el metiloma fetal a partir del plasma
materno mediante el uso de pares de lecturas
de secuenciación que comprendı́an ⱖ1 localización de
SNP fetal informativo y contenı́an ⱖ1 localización de
CpG. Las lecturas que demostraron alelos especı́ficos
del feto se incluyeron en el conjunto del metiloma fetal.
1588 Clinical Chemistry 59:11 (2013)
Las lecturas que demostraron el alelo compartido (es
decir, el alelo no especı́fico del feto) se incluyeron en el
conjunto del metiloma no especı́fico del feto, que principalmente incluyó moléculas de ADN materno. Las
lecturas especı́ficas del feto abarcaron 218 010, 263
611 y 74 020 localizaciones de CpG autosómicas en las
muestras de plasma materno del primer trimestre, el
tercer trimestre y luego del parto, respectivamente. Las
lecturas compartidas presentaron coberturas medias
de estas localizaciones de CpG aumentadas 33.3-, 21.7y 26.3 veces, respectivamente. Las lecturas especı́ficas
del feto presentaron coberturas medias de esas localizaciones de CpG aumentadas 3.0-, 4.4- y 1.8 veces en las
muestras de plasma materno del primer trimestre, el
tercer trimestre y luego del parto, respectivamente. La
cobertura de estos sitios de CpG mediante lecturas
especı́ficas del feto fue proporcional al porcentaje de
Análisis Prenatal No invasivo Methylomic
Figura 2. Continúa.
ADN fetal en la muestra. Para la muestra de plasma
materno del primer trimestre, el porcentaje hologenómico de localizaciones de CpG metiladas en las
lecturas especı́ficas del feto fue del 47.0%, mientras que
el porcentaje para las lecturas compartidas fue del
68.1%. Para la muestra de plasma materno del tercer
trimestre, el porcentaje de localizaciones de CpG metiladas en las lecturas especı́ficas del feto fue del 53.3%,
mientras que aquel para las lecturas compartidas fue
del 68.8%.
Determinamos la densidad de metilación de cada
región de 1 Mb en el genoma. Los metilomas
especı́ficos y no especı́ficos del feto reunidos a partir de
las lecturas de secuenciación del plasma materno se
presentan en la Fig. 2. Tanto en las muestras de plasma
del primer trimestre como en las del tercero, los metilomas fetales presentaron una mayor hipometilación
que los metilomas basados en las lecturas compartidas.
El perfil de metilación general de los metilomas fetales
se asemejaron más estrechamente a aquel de la MVC o
las muestras de tejido placentario. Por el contrario, el
perfil de metilación de ADN de las lecturas compartidas de plasma, que fue principalmente ADN materno,
se asemejó más estrechamente a aquel de las células
sanguı́neas maternas. A continuación, comparamos de
forma sistemática las densidades de metilación por localización de CpG de las lecturas de ADN de plasma
materno y las lecturas de ADN de tejido fetal o materno. Se observaron correlaciones estadı́sticamente
significativas (consulte la Fig. 4 en los Datos complementarios en lı́nea).
Los ideogramas de cromosomas (anillo más externo) están orientados pter-qter en sentido horario
(los centrómeros se muestran en rojo). El segundo
tramo hacia adentro muestra la cantidad de localizaciones de CpG en las regiones de 1 Mb correspondientes, hasta 20 000 localizaciones. Las densidades de metilación de las regiones de 1 Mb correspondientes se
Clinical Chemistry 59:11 (2013) 1589
Figura 3. Gráficos de densidades de metilación y tamaños de moléculas de ADN en plasma.
(A): Plasma materno del primer trimestre. (B): Plasma materno del tercer trimestre. Los datos presentados corresponden a todas
las lecturas de secuenciación que abarcan ⱖ1 localización de CpG (curva azul), las lecturas que también incluyen un alelo del
SNP especı́fico del feto (curva roja) y las lecturas que también incluyen un alelo del SNP especı́fico de la madre (curva verde).
(C): Se indica el plasma de mujeres adultas (amarillo), células sanguı́neas de mujeres adultas (azul), células sanguı́neas maternas
(rojo), placenta a término (púrpura) y MVC (verde).
1590 Clinical Chemistry 59:11 (2013)
Análisis Prenatal No invasivo Methylomic
tos locus a partir de los datos del plasma materno. Las
lecturas fetales heredadas por vı́a materna, la lecturas
fetales heredadas por vı́a paterna y sus respectivos estados de metilación podrı́an deducirse a partir de los datos de secuenciación del ADN por bisulfito del plasma
materno (consulte la Fig. 5 en los Datos complementarios en lı́nea).
LOCUS METILADOS DE MANERA DIFERENCIADA EN TEJIDOS
PLACENTARIOS Y CÉLULAS SANGUÍNEAS MATERNAS
Figura 4. Gráfico de las densidades normalizadas de
metilación del cromosoma 21 a partir de muestras de
plasma materno obtenidas en embarazos euploides y
con trisomı́a 21.
muestran en los demás tramos de acuerdo con el esquema de colores presentado en el centro de cada gráfico. A: Resultados de las muestras del primer trimestre. Del interior al exterior: MVC, lecturas especı́ficas
del feto en plasma materno, lecturas compartidas en
plasma materno, lecturas fetales y no fetales combinadas en plasma materno, y células sanguı́neas maternas.
B: Resultados de las muestras del tercer trimestre. Del
interior al exterior: tejido placentario a término, lecturas especı́ficas del feto en plasma materno, lecturas
compartidas en plasma materno, lecturas fetales y no
fetales combinadas en plasma materno, plasma materno luego del parto y células sanguı́neas maternas (de
la muestra de sangre del primer trimestre).
CARACTERÍSTICAS DISTINTIVAS DE LA METILACIÓN DEL ADN
ESPECÍFICO DEL FETO EN LOCUS SELLADOS
Realizamos la clasificación de la lista de locus sellados
informados por Woodfine y cols (25 ). para aquellos
con SNP dentro de las regiones de control por sellado.
Cuatro locus cumplimentaron los criterios: H195
[H19, transcripción con expresión y sellado materno
(codificación no proteica)], KCNQ1OT1 [KCNQ1 hebra opuesta/transcripción no codificante 1 (codificación no proteica)], MEST (transcripción especı́fica
del mesodermo) y GNAS (GNAS locus complejo). Al
estudiar los alelos del SNP y el estado de metilación de
estos locus en la muestra de las células sanguı́neas maternas, podemos interpretar el estado del sellado de es-
5
Genes humanos: H19, H19 transcripción con expresión y sellado materno
(codificación no proteica); KCNQ1OT1, KCNQ1 hebra opuesta/transcripción no
codificante 1 (codificación no proteica); MEST, transcripción especı́fica del
mesodermo; GNAS, GNAS locus complejo (consulte editorial en la página 1547).
La placenta es conocida por sus caracterı́sticas distintivas de metilación especı́ficas de los tejidos (7, 26, 27 ).
Se desarrollaron marcadores de metilación del ADN
especı́ficos del feto para su detección en el plasma materno y para aplicaciones de diagnóstico prenatal no
invasivo. Estos marcadores se basan en locus metilados
de manera diferenciada en tejidos placentarios y células
sanguı́neas maternas (22, 28, 29 ). Realizamos la extracción de nuestros datos de manera hologenómica en
las regiones metiladas de manera diferenciada (DMR).
La clave para el éxito en el desarrollo de los marcadores
de metilación del ADN especı́ficos del feto en plasma
materno es que el estado de metilación de las células
sanguı́neas maternas sea lo más alto o lo más bajo posible (28 ). Por tanto, nos concentramos en los locus en
los cuales las densidades de metilación del ADN de células sanguı́neas maternas fueron ⱕ 20% o ⱖ80%. Luego, se identificaron las DMR entre los subconjuntos
de locus para los cuales las densidades de metilación en
las MVC o la muestra de tejido placentario a término
eran diferentes en ⱖ20% de las densidades de metilación de las células sanguı́neas maternas. Identificamos 11 729 locus hipermetilados y 239 747 hipometilados en el primer trimestre e identificamos 11 920
locus hipermetilados y 204 768 hipometilados en el
tercer trimestre (consulte la Tabla 3 en los Datos
complementarios en lı́nea). Utilizamos 33 locus sobre
los cuales se habı́a informado previamente (26, 28 –30 )
metilación diferencial en células sanguı́neas maternas y
tejidos placentarios en el primer trimestre para validar
nuestra lista de candidatos del primer trimestre. Nuestro algoritmo pudo identificar el 79% de los 33 locus
como DMR (consulte la Tabla 4 en los Datos complementarios en lı́nea).
IDNTIFICACIÓN DIRECTA Y NO INVASIVA DE REGIONES CON
METILACIÓN DIFERENCIADA A PARTIR DE LOS DATOS DE
SECUENCIACIÓN DE PLASMA MATERNO
La placenta es la fuente principal de ADN fetal en
plasma materno (31 ). En este estudio, demostramos
que el estado de metilación del ADN especı́fico del feto
en el plasma materno se correlaciona con el metiloma
placentario. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de
que podrı́a desarrollarse un algoritmo para predecir la
densidad de metilación de las moléculas de ADN plaClinical Chemistry 59:11 (2013) 1591
centario a partir de los datos de secuenciación del ADN
de plasma materno, al que denominamos el “valor previsto”. Nuevamente, nos concentramos en los locus
con metilación ⱕ 20% o ⱖ80% en las células
sanguı́neas maternas. Para deducir los locus hipermetilados en tejidos placentarios en relación con las células sanguı́neas maternas, clasificamos los locus que presentaban ⱕ 20% de metilación en las células
sanguı́neas maternas y ⱖ60% de metilación conforme
al valor previsto, con una diferencia ⱖ50% entre la
densidad de metilación de las células sanguı́neas y el
valor previsto. Para deducir los locus hipometilados en
tejidos placentarios en comparación con las células
sanguı́neas maternas, clasificamos los locus que presentaban ⱕ 80% de metilación en las células
sanguı́neas maternas y ⱖ40% de metilación conforme
al valor previsto, con una diferencia de al menos ⱖ50%
entre la densidad de metilación de las células
sanguı́neas y el valor previsto. La Tabla 2 muestra las
cifras de locus deducidos como hipermetilados o
hipometilados en tejidos placentarios. Utilizamos los
datos de secuenciación del ADN por bisulfito para los
tejidos placentarios y células sanguı́neas maternas a fin
de verificar la validez de los locus deducidos a partir de
los datos de secuenciación del ADN en plasma materno. La mayorı́a de los locus deducidos de forma no
invasiva (Tabla 2; consulte la Tabla 5 en los Datos
complementarios en lı́nea) demostraron el patrón de
metilación previsto en los tejidos y se superpusieron
con las DMR extraı́das de los datos de tejidos y descriptos en la sección anterior.
VARIACIÓN GESTACIONAL EN METILOMAS PLACENTARIOS
Y FETALES
La proporción general de CpG metiladas fue del 55%
en las MVC y del 59% en la placenta a término (Tabla
1). Podrı́an identificarse más DMR hipometiladas a
partir de las MVC que de la placenta, mientras que los 2
tejidos fueron similares en relación con la cifra de DMR
hipermetiladas. Por lo tanto, resulta evidente que las
MVC presentaron mayor hipometilación que la placenta a término. Esta tendencia gestacional también
fue aparente en los datos del plasma materno. La proporción de CpG metiladas entre las lecturas especı́ficas
del feto fue del 47.0% en el ADN del plasma materno
del primer trimestre pero del 53.3% en el ADN del
plasma materno del tercer trimestre. El ADN de las
muestras de plasma materno del primero y el tercer
trimestres presentaron cifras similares de locus hipermetilados validados (1457 y 1279 locus, respectivamente), pero la muestra del primer trimestre presentó
una cifra considerablemente mayor de locus hipometilados (21 812 locus) que la muestra del tercer trimestre
(12 677 locus; Tabla 2).
1592 Clinical Chemistry 59:11 (2013)
RELACIÓN ENTRE EL ESTADO DE METILACIÓN Y EL TAMAÑO DE
LAS MOLÉCULAS DE ADN EN EL PLASMA MATERNO
Utilizamos la secuenciación de extremos emparejados para determinar las longitudes de las moléculas
de ADN en plasma (23, 32 ). En un estudio previo,
demostramos que las moléculas de ADN en plasma
presentaban aproximadamente el tamaño de los
monocucleosomas y que las moléculas de ADN fetal
eran más cortas que las del ADN materno (32 ). En
este estudio, exploramos si el estado de metilación de
la moléculas de ADN en plasma tuvieron alguna relación con sus tamaños. En el caso de las lecturas de
secuenciación que abarcaron ⱖ1 localización de
CpG, determinamos las densidades de metilación de
las moléculas de ADN del mismo tamaño. Luego,
trazamos la relación entre los tamaños de las
moléculas de ADN y sus densidades de metilación
(Fig. 3). Consideramos una lectura con un alelo del
SNP especı́fico del feto como una molécula de ADN
fetal y una lectura con un alelo del SNP especı́fico de
la madre como una molécula de ADN materno. En
general, las moléculas de ADN con altas densidades
de metilación fueron más extensas. Esta tendencia se
presentó en las moléculas de ADN fetal y materno en
el primero y tercer trimestres. Los tamaños generales
de las moléculas de ADN fetal fueron más reducidos
que los de las moléculas de ADN materno, como se
informó anteriormente (32, 33 ). La muestra de
ADN en plasma de mujeres adultas no embarazadas
también demostró la misma relación entre el tamaño
y el estado de metilación de las moléculas de ADN
(Fig. 3C). Por otra parte, las muestras de ADN
genómico se fragmentaron mediante un paso de exposición a ondas ultrasónicas antes del análisis de
secuenciación masiva en paralelo y no demostró la
misma tendencia.
DETECCIÓN DE TRISOMÍA 21 MEDIANTE EVALUACIÓN DE LA
DENSIDAD DE METILACIÓN DEL CROMOSOMA 21
Como demostración de una posible aplicación clı́nica
del análisis del metiloma de plasma materno, evaluamos la densidad de metilación del cromosoma 21 en
12 embarazos. En cada muestra de plasma materno,
normalizamos la densidad de metilación de las
moléculas de ADN en plasma con origen en el cromosoma 21 respecto de la densidad de metilación agrupada de las moléculas de ADN en plasma de todos los
autosomas excepto los cromosomas 13, 18 y 21. Debido a la presencia de una dosis adicional del cromosoma 21 fetal para los fetos afectados, las densidades
normalizadas de metilación del cromosoma 21 fueron
considerablemente menores en los casos de trisomı́a 21
en comparación con los casos euploides (P ⫽ 0.003,
prueba del orden de Mann–Whitney; Fig. 4).
Análisis Prenatal No invasivo Methylomic
Análisis
Utilizamos la secuenciación por bisulfito hologenómica para analizar los metilomas del ADN en el
ADN en plasma. Aplicamos el método para evaluar el
perfil de metilación de un feto y la placenta mediante
muestras de ADN de secuenciación preparadas a
partir de plasma materno. Pudimos realizar análisis
metilómicos fetales y placentarios no invasivos durante
el embarazo y supervisar los cambios en serie durante la
evolución del embarazo. El alcance de los datos de
secuenciación nos permitió estudiar los metilomas del
plasma materno a escala hologenómica a una resolución de nucleótido único.
Con la información del genotipo de la madre, pudimos inferir el perfil de metilación del ADN fetal a
partir de los datos del plasma materno. También desarrollamos un algoritmo para predecir de forma no invasiva el perfil de metilación de la placenta sin tener que
usar las diferencias de genotipo entre el feto y la madre.
Por tanto, la información obtenida de manera convencional mediante el estudio de tejidos placentarios (p.
ej., estado del sellado genómico, estado de metilación
especı́fico de los tejidos y variación gestacional) podrı́a
evaluarse directamente a partir del plasma materno.
Dada la asociación conocida entre el estado de metilación del ADN con alteraciones y las diferentes afecciones relacionadas con el embarazo (1–3 ), el método
que describimos podrı́a usarse para el desarrollo de
biomarcadores y estudios fisiopatológicos. La plataforma también puede aplicarse directamente en la
evaluación prenatal de enfermedades fetales o relacionadas con el embarazo, como demostramos en la detección de la trisomı́a 21.
El alto nivel de similitud entre los metilomas de
células sanguı́neas y el plasma en hombres y mujeres no
embarazadas, ası́ como entre los metilomas de células
sanguı́neas maternas y la muestra de plasma materno
luego del parto, confirmó además que las células hematopoyéticas constituyen las fuentes principales de ADN
en el plasma humano (23 ). No obstante, las proporciones generales de CpG metiladas en las muestras de
plasma materno del primer trimestre y del tercer trimestre se redujeron en comparación con los datos de
las células sanguı́neas maternas o la muestra de plasma
materno luego del parto. Sospechamos que los niveles
reducidos de metilación durante el embarazo respondieron a la naturaleza hipometilada de las moléculas de ADN fetal presentes en el plasma materno. De
hecho, el análisis independiente de las lecturas de
secuenciación especı́ficas del feto y compartidas nos
permitió demostrar que las moléculas del ADN fetal
circulante presentaban una hipometilación mucho
mayor que las moléculas de ADN del entorno. Una
comparación de las densidades de metilación de los
locus correspondientes en las lecturas del plasma materno especı́ficas del feto y los datos del tejido placentario del primero y el tercer trimestres demostraron
altos niveles de correlación. Estos datos proporcionan
evidencia genómica de que la placenta es la fuente principal de moléculas de ADN fetal en el plasma materno y
constituyen un principal paso hacia adelante, en comparación con evidencia anterior basada en locus seleccionados (31 ). La inhibición del perfil de metilación en
la muestra de plasma materno luego del parto para asemejarse más a la de las células sanguı́neas maternas
sugiere que la moléculas del ADN fetal se eliminaron de
la circulación materna (34 ). El cálculo de las concentraciones de ADN fetal basadas en marcadores del SNP
del feto demostraron efectivamente que la concentración se redujo del 33.9% antes del parto hasta solo el
4.5% en la muestra luego del parto.
Curiosamente, nuestros datos demostraron una
relación entre el estado de metilación y el tamaño de las
moléculas de ADN en plasma. Las moléculas de ADN
en plasma son conocidas por presentarse en la circulación en forma de moléculas reducidas y la mayorı́a de
las moléculas son de aproximadamente 160 bp
(23, 32 ). Los perfiles de tamaño caracterı́stico de las
moléculas de ADN en plasma sugieren que muchas de
estas moléculas están asociadas con monocucleosomas, que posiblemente se derivan de la degradación
enzimática durante la apoptosis. En este estudio, demostramos que las moléculas hipometiladas eran menos
extensas que las hipermetiladas. La misma tendencia se
observó en las moléculas de ADN fetal y materno.
Dado que se conoce que la metilación del ADN tiene
influencia en el concentrado nucleosómico (35 ), nuestros datos sugieren que las moléculas de ADN hipometiladas presentaron una concentración menos densa de
histonas y; por lo tanto, fueron más susceptibles a la
degradación enzimática. Por otra parte, los datos presentados en la Fig. 3 también demuestran que a pesar
de que el ADN fetal presentaba una hipometilación
mucho mayor que la de las lecturas maternas, los perfiles de tamaño del ADN fetal y materno se superponen. Esta observación sugiere que el estado de hipometilación del ADN fetal no es el único factor responsable
de su relativa brevedad en comparación con el ADN
materno.
En resumen, hemos reunido adecuadamente los
metilomas del ADN mediante análisis de secuenciación
por bisulfito masiva en paralelo del ADN en plasma. El
presente método ofrece una forma no invasiva de investigar o supervisar clı́nicamente importantes afecciones relacionadas con el embarazo que se basa en un
análisis metilómico genómico. Consideramos que el
método presenta una interesante función que desempeñará un papel futuro en las pruebas, la supervisión y
la investigación prenatales. También anticipamos una
Clinical Chemistry 59:11 (2013) 1593
aplicación de este método en otras áreas de la medicina
donde el análisis del ADN en plasma resulta de interés.
Por ejemplo, los metilomas de los tipos de cáncer
podrı́an determinarse a partir del ADN en plasma de
los pacientes con cáncer (36 ), o bien los metilomas de
órganos trasplantados podrı́an determinarse a partir
del ADN en plasma de los receptores de trasplantes de
órganos (23, 37 ).
Contribuciones de los autores: Todos los autores confirmaron que
han contribuido al contenido intelectual de este documento y han cumplido con los siguientes 3 requerimientos: (a) contribuciones significativas
a la concepción y el diseño, la adquisición de datos o el análisis e interpretación de estos; (b) redacción o revisión del artı́culo en relación con su
contenido intelectual; y (c) aprobación final del artı́culo publicado.
Declaración de los autores o posibles conflictos de interés: Tras la
presentación del manuscrito, todos los autores completaron el formulario de declaración del autor. Declaraciones o posibles conflictos de
interés:
Empleo o liderazgo: Y.M.D. Lo, Clinical Chemistry, AACC.
Papel del consultor o asesor: R.W.K. Chiu, Sequenom; Y.M.D. Lo,
Sequenom.
Propiedad de acciones: R.W.K. Chiu, Sequenom; Y.M.D. Lo,
Sequenom.
Honorarios: No se declara.
Financiamiento de la investigación: R.W.K. Chiu, University
Grants Committee of the Government of the Hong Kong Special
Administrative Region (Comité de Becas Universitarias del Gobierno de la Región Administrativa Especial de Hong Kong), China,
conforme a Areas of Excellence Scheme (Esquema de Áreas de Excelencia) (AoE/M-04/06) y Sequenom; Y.M.D. Lo, University Grants
Committee of the Government of the Hong Kong Special Administrative Region (Comité de Becas Universitarias del Gobierno de la
Región Administrativa Especial de Hong Kong), China, conforme a
Areas of Excellence Scheme (Esquema de Áreas de Excelencia) (AoE/
M-04/06), S.K. Yee Foundation y Li Ka Shing Foundation.
Testimonio de expertos: No se declara.
Patentes: F.M.F. Lun, patente de los Estados Unidos US 7,901,884;
R.W.K., Chiu, diversas patentes y patentes en trámite; P. Jiang, diversas patentes y patentes en trámite; K.C.A. Chan, diversas patentes y
patentes en trámite; Y.M.D. Lo, diversas patentes y aplicaciones de
patentes en el área de las pruebas prenatales no invasivas.
Otras remuneraciones: R.W.K. Chiu, Illumina; Y.M.D. Lo, Illumina
y Life Technologies.
Papel del patrocinador: Las organizaciones patrocinadoras no jugaron papel alguno en el diseño del estudio, la selección de los pacientes
inscriptos, la revisión e interpretación de los datos ni la preparación
o aprobación del manuscrito.
Agradecimientos: Agradecemos a L. Chan, Y. Jin, C. Lee y K. Chow
por la asistencia técnica.
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