Bioquímica II - 2007

Bioquímica II - 2007
SEMINARIO: METABOLISMO DE LÍPIDOS
Temario
Clase 1
1. Digestión. Absorción y transporte de lípidos.
2. Oxidación de ácidos grasos: activación de ácidos grasos, transporte a través de la
membrana mitocondrial, beta-oxidación, oxidación de insaturados, oxidación de ácidos grasos
de cadena impar, regulación de la oxidación, beta-oxidación peroxisomal.
3. Cuerpos cetónicos.
Clase 2
Biosíntesis de ácidos grasos: estrategia, complejo de la ácido graso sintasa, síntesis de
palmitato a partir de acetil CoA, transporte del acetil-CoA mitocondrial hacia el citosol,
regulación de la síntesis, elongación y desaturación, síntesis de eicosaenoides
Clase 3
1. Síntesis de triglicéridos y fosfolípidos.
2. Síntesis de colesterol, control. Sales biliares. Lipoproteínas.
Bibliografía
- Nelson, DL y Cox, M.M. (2005) Lehninger Principles of Biochemistry, Cuarta Edición.
- Voet, D y Voet, JG (2004). Biochemistry, Tercera Edición.
Problemas
Clase 1
1.- a) Escriba la ecuación de oxidación de palmitoil CoA a acetil CoA incluyendo los cofactores
correspondientes.
b) Sume a la reacción anterior la que ocurre cuando los NADH y FADH2 son reoxidados en la cadena
de transporte mitocondrial.
c) Sume la oxidación de los acetil CoA en el ciclo de Krebs para obtener la ecuación final de palmitoil
CoA a CO2 en la célula. Qué detalle debe tener en cuenta para calcular el rendimiento neto de ATP?
d) Escriba las hemirreacciones y la ecuación total para la combustión "in vitro" de palmitato. Qué
conclusiones puede extraer al comparar las degradaciones totales "in vivo" e "in vitro"? Cuántos e- se
ponen en juego y en cuáles reacciones metabólicas?
e) Si el Go para la combustión "in vitro" del ácido palmítico es  - 9.800 kJ/mol, cuál es el
aprovechamiento energético dentro de la célula?
f) Calcule las kcal/g que se liberan al combustionar ácido palmítico, qué cantidad de agua se libera por
gramo de ácido graso oxidado.
g) Cómo compara la combustión de la glucosa y del palmítico "in vivo" e "in vitro"?
h) Si el 15% de la masa corporal de un adulto de 70 kg son triglicéridos, calcular la disponibilidad de
energía en kJ y kcal en forma de triglicéridos.
i) Si el requerimiento basal es aproximadamente 1.600 kcal / día, cuánto tiempo podría sobrevivir esta
personas exclusivamente a partir de los TG?
j) Cuál será la pérdida de peso por día?(no olvidar incluir el agua).
2 - En los casos de diabetes severa, el acetil CoA producido por la oxidación de ácidos grasos excede
la capacidad del ciclo de Krebs y se forman acetoacetato y  hidroxibutirato. Si el acetil CoA no es
tóxico, por qué la mitocondria de hígado debe convertirlo en cuerpos cetónicos.
3.- Se sabe que los atletas ingieren ácidos grasos de cadena corta, 12 carbonos o menos, antes de
una carrera. Para investigar las razones de esta práctica se suministraron ácidos grasos a dos cultivos
de células hepáticas (50 ml cada uno) conteniendo glucagón. A un cultivo se le agregaron 0,2 moles
de 14C 18:0 (act esp: 5Ci /mol) y al otro cultivo 0,2 moles de 14C 12:0 (act esp: 5Ci /mol). A ambos
cultivos se le adicionaron además 0,5 moles de 3H carnitina 18:0 (act esp: 20Ci /mol). Todos los
agregados se realizaron a tiempo 0.
De ambos cultivos se tomaron alícuotas de 2 ml a distintos tiempos y mediante ultracentrifugación y
aplicación de presiones (extrusión) se separaron dos fracciones de cada alícuota: una fracción contenía
mitocondrias sólo con membrana interna (mitoplastos) y la otra fracción contenía citosol y membrana
externa de mitocondria. A partir de los extractos clorofórmicos (20 ml) de ambos compartimientos
subcelulares se tomaron 5 ml para separar por HPLC las fracciones conteniendo ácidos grasos de
distinto tamaño. Luego se midió la radioactividad de 3H sólo en aquellas fracciones clorofórmicas que
también tenían radioactividad de 14C (el complejo acil carnitina es soluble en cloroformo) y los
resultados se muestran en las correspondientes figuras.
Se sabe que las concentraciones citosólicas de los metabolitos antes cualquier agregado son: carnitina 2mM,18:0
0,4 mM y 12:0 0,15 mM.
a) Explique cuál sería el beneficio de ingerir ácidos
grasos de cadena corta antes de una carrera.
b)Calcule cuales son los valores absolutos en cpm
correspondientes al 100% de 14C y 3H de la figura
a) y al 100% de 14C en la figura c). Considere que
la eficiencia del contador es 50% para ambos
isótopos. (desprecie las pérdidas de radioactividad
por el fraccionamiento subcelular)
c) Explique porqué el máximo de la figura B es
inferior al máximo de la figura A
d)¿A que atribuye las diferencias de las curvas de
14C y 3H en la figura B a partir de los 20 min?
Clase 2
1 - Escriba la reacciones de a) transferencia del acetil-CoA mitocondrial desde la mitocondria al citosol,
b) formación de palmitato en hígado a partir de acetil CoA mitocondrial, y NADPH, ATP y CO2
citosólicos y c) la acetyl CoA carboxilasa y su regulación
2 - Considere una preparación que contiene todas las enzimas y cofactores necesarios para la síntesis
de ácidos grasos a partir de acetil CoA y malonil CoA.
a) Si se agrega (2 2H) acetil CoA y un exceso de malonil CoA frío, cuántos átomos de 2H se
incorporaran en palmitato?, en qué posiciones?
b) Idem si se agrega acetil CoA frío y 2(2H)malonil CoA.
3 - Escribir las hemirreacciones y la reacción total para la formación de ácido palmitoleico a partir de
ácido palmítico. Describa los componentes del sistema de desaturación microsomal. Porqué las
desaturasas son oxidasas mixtas?
4.- Siguiendo las reglas que cumplen las 9, 6 y 5 desaturasas de los mamíferos, construya las
familias de ácidos grasos esenciales y no esenciales y señale cuáles poseen relevancia biológica.
Clase 3
1.- En una compañía farmacéutica se estaban ensayando los efectos de distintas drogas sobre el
metabolismo de los triglicéridos cuando recientemente se logró el efecto buscado con un análogo de
la DHAP (dihidroxiacetona fosfato).
Los ensayos consistían en incubar cultivos de hepatocitos en un medio rico, con una elevada
concentración de glucosa uniformemente marcada con 14C, con y sin el agregado del análogo de la
DHAP, y luego medir el contenido de tripalmitato de glicerilo a tiempos sumamente cortos respecto del
tiempo de división celular. (no se requiere los AG para síntesis de membrana).
Se entiende que en estas condiciones el medio rico en todo momento provee en exceso la energía y los
nutrientes necesarios para el metabolismo celular y por lo tanto el flujo mayoritario de la glucosa es
hacia la síntesis de triglicéridos.
a) Escriba la ruta metabólica que está siendo investigada indicando las fórmulas, enzimas y los
mecanismos de regulación involucrados. Describa las reacciones catalizadas por el complejo de la
ácido graso sintasa sin detallar el mecanismo.
b) En el cultivo control, a tiempos cortos, antes de que se haya sintetizado la primera molécula de
citrato, cuáles serán en números relativos a la cantidad y marca de la glucosa incubada, el número de
moles y la actividad específica (cpm/mol de compuesto) de (i) glicerol 3P y (ii) acetil CoA.
Exprese también la cantidad total de radioactividad en el cultivo respecto de las condiciones iniciales de
la glucosa incubada. Explique claramente todos los cálculos y razonamientos. Haga las suposiciones
que crea necesarias, se aceptará cualquier suposición que sea bioquímicamente lógica. Para el cálculo
de la actividad específica considere sólo el número de átomos de C de cada compuesto, no tenga en
cuenta la cantidad de O e H por átomo de C.
c) Idem al inciso anterior pero para la molécula de citrato, antes de que se haya sintetizado la primera
molécula de triglicérido. Exprese los resultados respecto de la glucosa incubada.
d) Idem al inciso (b) pero para la molécula de tripalmitato de glicerilo. Exprese los resultados respecto
de la glucosa incubada.
e) Cuál puede ser el efecto del análogo de DHAP sobre el metabolismo de triglicéridos?(Los
razonamientos de los incisos anteriores lo ayudarán a encontrar la respuesta). Explique en detalle el
efecto inicial de la mencionada droga y cada uno de los pasos subsiguientes que se ven afectados.
f) Qué efectos hormonales se pondrían en juego si se quisiera ensayar la droga en humanos? Ud.
esperaría que los mencionados efectos hormonales intensifiquen o disminuyan los resultados obtenidos
con cultivos de hepatocitos?
2.- Se sabe que los ácidos grasos insaturados de la dieta disminuyen el nivel de colesterol plasmático, aunque los
mecanismos moleculares de las familias de ácidos grasos todavía no se han aclarado. En este trabajo se estudia
1
el efecto del agregado de distintos ácidos grasos “in vitro” sobre la actividad de receptores de LDL y la actividad de
la lecitin-colesterol acyltransferasa (ACAT) en células en cultivo.
Las lipoproteinas LDL se purificaron por ultracentrifugación y se marcaron con 125I; 99% de la radioactividad
se puede precipitar tratando con TCA al 10% . Fibroblastos y macrófagos se incubaron con 125I-LDL durante 2,5 hs,
se lavaron, y luego se analizó la radioactividad total. La unión inespecífica se midió agregando exceso (30 a 50
veces) de LDL no radiactiva y la radioactividad remanente en estas condiciones se consideró como unión
inespecífica de la LDL a estructuras de la superficie celular distintas al receptor de LDL.. La unión específica se
obtuvo restando la unión inespecífica de la radiactividad total medida inicialmente.
Las células así tratadas se incubaron luego durante 5 y 24 hs en suero deficiente en lipoproteínas para medir a)
la unión a la superficie celular, b) la captación (internalización ) y c) la degradación celular de 125I-LDL . Al final de
la incubación las células se lavaron y se colectó el medio de cultivo para luego precipitarlo con TCA y medir su
radioactividad..
La degradación de LDL se calculó como la diferencia entre la radioactividad soluble en TCA y la
degradación espontánea medida en incubaciones paralelas en ausencia de células. La unión de LDL a la
superficie celular se midió como la radiactividad desplazada de las células luego de otra incubación adicional
durante 1 hora en un búfer conteniendo dextran-sulfato. La cantidad de LDL internalizada se midió como la
marca que permanecía asociada a la célula luego de la incubación con
dextran sulfato.
a) Explique en forma concisa el metabolismo de las LDL. Que procesos y
que regulaciones metabólicas se desencadenan en la célula hepática
luego de la unión de las LDL a su receptor? Que importancia tiene que 2
de esos procesos compartan el mismo elemento regulador?
b) La Fig 1 muestra el efecto de suplementar fibroblastos (barras sólidas)
y macrófagos, (barras rayadas) con y sin ácido oleico previo al agregado
de 25g/ml 125I-LDL y de los tratamientos antes descriptos. Los
resultados se expresan como porcentajes respecto del control incubado
sin ácido oleico.
1).Interprete este experimento en forma cuantitativa.
2) Sabiendo que la actividad específica de las lipoproteínas es 250
cpm/ng de proteína LDL, proponga un protocolo para este experimento
indicando los volúmenes y diluciones que emplearía en los distintos
pasos hasta la medición en el ccontador de centelleo; indique claramente
las suposiciones que realiza.
c) La Fig. 2 muestra la unión específica de las LDL a su receptor
en fibroblastos (A) y macrófagos (B) con () y sin () el agregado de ácido oleico. Los insertos
muestran el análisis de Scatchard. Basado en las conclusiones de la Fig 1, porqué fue necesario
realizar este experimento y que conclusiones extrae del mismo?
d) Otros resultados:
a) la cantidad de mRNA del receptor con y sin el agregado de ácido oleico y no mostró diferencias;
b) el agregado de cicloheximida, inhibidor de síntesis proteica, durante el experimento eliminó el
aumento de la unión de las LDL a la superficie celular producida por el ácido oleico y c) incubaciones en
presencia de actinomicina D, inhibidor de la transcripción, no mostraron cambios. Que puede concluir
acerca del efecto de los ácidos grasos insaturados sobre los receptores de LDL?
e) La Fig. 3 muestra los efectos del agregado de distintos ácidos grasos sobre la degradación de LDL y
la distribución intracelular de los “pooles” de colesterol esterificado (CE) y colesterol libre (FC).
Interprete este experimento.
f) Finalmente la Fig. 4 muestra el efecto de un inhibidor de la ACAT sobre la degradación de LDL en
ausencia de ácidos grasos (), con ácido oleico (), con ácido eicosapentenoico, 20.5 (), y con ácido
araquidónico, 20:4 (). Recuerde que el agregado de ácidos grasos se realiza previamente a la adición
de 125I-LDL. Resultados similares a los mostrados se obtuvieron en cultivos de células hepáticas.
Que puede concluir con estos resultados acerca del mecanismo por el cual los ácidos grasos
insaturados estimulan la actividad de los receptores de LDL?
Figura 2
Figura 4
3- El proceso mayoritario para la provisión endógena de ácidos grasos no esterificados (NEFA) al
sistema vascular durante los períodos de ayuno es la inducción de lipólisis de triacilglicéridos (TAG), y
la lipasa hormona-sensible (HSL) es la enzima fundamentalmente responsable de la hidrólisis de TAG.
Ratones genéticamente modificados mediante la técnica de “gene knock out” (ko) carecen de HSL y
exhiben una actividad lipolítica de triacilglicéridos reducida. En este problema se muestran los
resultados obtenidos para distintos parámetros metabólicos en animales “ko”, modificados como
consecuencia de la disrupción del gen de la HSL, y en animales “wt”, control.
a) Con respecto a la HSL: indique qué hormona/s la activa/n y en qué tejido se encuentra, cómo se
efectúa el transporte de lípidos desde y/o hacia ese tejido cuando la enzima HSL está activada y
cuando la misma está inhibida.
b) Indique que procesos esperaría Ud que se vean afectados en el tejido adiposo de los ratones sin
actividad HSL
c) La tabla 1 muestra la masa corporal y la masa de tejido adiposo blanco (WAT) en animales ko y wt
alimentados con dieta normal
Masa corporal (g)
Masa de WAT total (g)
Wt
HSL-ko
t-test
29.23 ± 1.94 30.76 ± 2.18 ns
8.26 ± 1.21
8.25 ± 0.39
ns
Tabla 1 : HSL-ko: ratones
deficientes en HSL, ns: no
significativo, wt: ratones control
En la Figura 1 se analizaron los niveles de NEFA en WAT en los ratones ko con respecto a los wt.
En la Figura 2 se muestra la incorporación de NEFA en TAG y fosfolípidos (PL)
Qué conclusiones saca de los resultados mostrados en la tabla 1 y en las Figuras 1 y 2?
nmolNEFA/ug DNA
wt
ko
Fig. 1. Niveles de NEFA
en WAT en ratones wt y ko
alimentados con dieta
normal. en presencia de
un agonista de la
epinefrina
Fig. 2 Incorporación de NEFA en TG y PL en tejido adiposo de animales
alimentados y en ayuno. El tejido adiposo de animales ko y wt se incubó en
presencia de 3H- ácido oleico. Se extrajeron y separaron los lípidos
empleando TLC. Los lípidos se visualizaron con vapores de yodo, las
manchas radioactivas correspondientes a TG y PL se rasparon y
cuantificaron mediante centelleo líquido. *diferencia significativa para p
0.05, ** diferencia significativa para p 0.01.
d) La Figura 3 muestra la incorporación de [14C] D-glucosa en WAT en animales ko y wt
i) Indique la vía a de síntesis de TAG a partir de glucosa. Incluya fórmulas y nombres de las
enzimas pero no explique ningún mecanismo de reacción. Tome tripalmitina como ejemplo.
Considere que tiene cantidad suficiente de NADPH
Fig. 3. Incorporación [14C] D-glucosa en
WAT Después de 2 horas de la inyección
de la sustancia radioactiva, los animales se
sacrificaron y se removieron trozos de
tejido adiposo. Los lípidos se extrajeron y
la incorporación en lípidos totales se
determinó mediante centelleo líquido. **
p 0.01.
ii) Los animales wt se inyectaron con 400ul de glucosa 2mM marcada con [14C], 3uCi / ul, en los
carbonos 1 y 2. Si el triglicérido mayoritario es la tripalmitina, indique
.
a. La actividad específica de la tripalmitina en uCi/umol de tripalmitina
b. Que conslusiones extrae del experimento mostrado en la Figura 3.
e) La Tabla 2 muestra algunas actividades enzimáticas en los ratones wt y ko.
Interprete estos resultados y proponga una conclusión final que pueda extraerse del análisis
conjunto de los resultados mostrados a lo largo de todo el problema.
Tabla 2.. G6PDH: glucosa 6P deshidrogenasa, FAS: ácido graso sintasa, ACC: acetil CoA carboxilasa. Los
ensayos se realizaron con las enzimas citosólicas del WAT de animales alimentados