efecto del momento de la incorporación de la glucosa al medio de

EFECTO DEL MOMENTO DE LA INCORPORACIÓN DE LA GLUCOSA AL
MEDIO DE CULTIVO SOBRE EL DESARROLLO DE LOS EMBRIONES
BOVINOS CULTIVADOS IN VITRO.
EFFECT OF GLUCOSE SUPPLEMENTATION TIME TO THE CULTURE MEDIUM ON
BOVINE EMBRYO DEVELOPMENT IN VITRO
BARRIO M, PEÑA A I, QUINTELA L A, BECERRA J J, DEIROS J, REY C, RUIBAL S
Y HERRADÓN P G
Obstetricia y Reproducción. Departamento de Patoloxía Animal. Facultad de Veterinaria
de Lugo. Universidad de Santiago de Compostela.27002 Lugo .España.
Tel:982252303. e-mail: [email protected]
PALABRAS CLAVEEmbriones bovinos, glucosa, cultivo in Vitro
ABSTRACT
Con la realización de este trabajo tratamos estudiar como influye el momento
de la suplementación de la glucosa en el desarrollo de los embriones bovinos in vitro. Para
ello realizamos dos experimentos, cultivando a los embriones en medio SOFm
suplementado con aminoácidos, glutamina, insulina, transferrina y selenito sódico,
utilizando dos concentraciones diferentes de glucosa: 1 y 2 mM. En cada uno de los
experimentos los zigotos se dividieron al azar en dos grupos. En el primer experimento la
adicción de la glucosa se realizó al inicio del período de cultivo, y en el segundo
experimento los zigotos se cultivaron en el medio descrito anteriormente en ausencia de
glucosa, y la suplementación con ésta se realizó 48 horas después de iniciar el cultivo. Tras
el análisis estadístico de los resultados hemos podido observar que se desarrolla un mayor
porcentaje de embriones cuando el medio esta suplementado con glucosa desde el inicio del
cultivo, especialmente cuando la concentración de este metabolito es de 1 mM. Sin
embargo, la suplementación retardada de glucosa no parece influir en la viabilidad
embrionaria, ya que los porcentajes de eclosión tras 10 días de cultivo son similares en
ambos grupos.
SUMMARY
The time of glucose supplementation in the medium used during in vitro culture
bovine blastocysts was evaluated. Zygotes were cultured in SOFm containing, glutamine,
amino acids, insulin, transferrin and sodium selenite. After maturation and fecundation in
vitro presumtive zygotes were randomly divided in four groups: a) in the first experiment
two different concentrations of glucose (1 and 2 mM) were added at 0 h p.i. (hours
postinsemination); b) in the second experiment the same concentrations of glucose were
added at 48 h p.i.. Results showed a highest percentage of blastocysts formation when the
culture medium was supplemented with 1mM of glucose added at 0 h p.i. However, adding
glucose 48 h p.i. had no negative effects in embryo development, seeing that, the
proportions of hatched blastocysts on day 10 p.i. were similar in different groups studied.
INTRODUCCIÓN
Hasta hace muy pocos años, los estudios relativos a las necesidades metabólicas de
los embriones de rumiantes eran muy escasos, utilizándose como referencia los trabajos
realizados en otras especies, fundamentalmente en embriones de ratón. En esta especie, la
glucosa produce un efecto inhibidor sobre las primeras divisiones, pero es necesaria para
que los embriones se desarrollen hasta blastocistos (Chatot y col, 1989; 1994). Dado que la
glucosa está presente en el fluido oviductal, el efecto negativo de la glucosa, ha sido
considerado un artefacto provocado por el ambiente a que son sometidos los embriones
durante el cultivo in vitro (Gardner, 1998). En la especie bovina, las elevadas
concentraciones de glucosa (>3 mmol/l) actúan como inhibidoras durante las primeras
etapas de segmentación, mientras que unos niveles superiores a 5 mmol/l estimulan el
desarrollo de los blastocistos cuando son añadidas a partir del día 4 de cultivo (Kim y cols,
1993). Ello parece indicar que, en la mayor parte de las especies de mamíferos, la
capacidad para utilizar la glucosa aumenta a medida que avanza el desarrollo (Thompson,
1996). Los embriones de rumiantes metabolizan en mayor proporción el lactato que la
glucosa durante las primeras fases de división. Sin embargo, a medida que avanza el
desarrollo se incrementa el consumo de glucosa, debido, probablemente, a la mayor
demanda energética. El incremento en la producción de ATP responde a los dos procesos
que ocurren durante el desarrollo embrionario temprano: la compactación y la formación
del blastocele. La formación de esta cavidad va acompañada de un incremento considerable
en la actividad de la bomba Na+/K+ ATP-asa dependiente (Thompson y col., 1996, 2000).
La glucosa interviene, también, en la síntesis de ribosa y NADPH a través de la vía de las
pentosas-fosfato (Thompson, 2000). Con la realización de este trabajo pretendemos estudiar
si el momento de la suplementación de glucosa al medio de cultivo interfiere en el posterior
desarrollo embrionario.
MATERIAL Y MÉTODOS
Los ovocitos se obtuvieron a partir de ovarios de hembras bovinas sacrificadas en un
matadero local, en ningún caso se tuvieron en cuenta la raza, la edad o el estado fisiológico
de los animales. Los ovarios se introducen en solución salina estéril (ClNa al 0,9%)
suplementada con antibiótico-antimicotico, a una temperatura entre 30-35ºC hasta la
extracción de los complejos cúmulo-ovocito. Mediante la utilización de una jeringuilla de
10 mL y una aguja de 18 G se procedió a la aspiración de dichos complejos cúmuloovocitos a partir de los folículos visibles cuyo diámetro oscilaba entre 3-7 mm. El
contenido folicular obtenido se depositó en un tubo cónico de 50 mL (Falcon TM, Becton
Dickinson, NJ, USA), durante al menos 15 minutos con el fin de que los ovocitos se
decanten en el fondo del mismo. Solo los ovocitos rodeados de 3 o más capas de células del
cúmulo han sido seleccionados para su posterior maduración. Después de tres lavados en
medio fresco Tyrode tamponado con Hepes, TL-Hepes, (Parrish y cols, 1988), los ovocitos
han sido colocados en las gotas de maduración, transcurriendo desde la recogida de los
ovarios en matadero hasta este momento entre 4 y 6 horas.
El medio básico utilizado para la maduración fue TCM-199 (TCM-199, solución
salina de Earle con L-glutamina y 25 mM de bicarbonato sódico, ICN, (Biomedicals Inc.,
Costa Mesa. California, USA), tamponado con 25 mM de Hepes y suplementado con 10%
de Suero Fetal Bovino (FBS, Flow Lab., Costa Mesa, CA, USA), 0.2 mM de ácido
piruvico, 50 µg/mL de gentamicina, 0.5 µg/mL de FSH, 10 µg/mL de hCG y 1 µg/mL de
17-β estradiol. Se prepararon microgotas de 50 µL bajo aceite de parafina y en cada una de
ellas se introdujeron 10 complejos cúmulo-ovocito. El cultivo se realizó a 38,5ºC en una
atmósfera que contenía 5% de CO2 y máxima humedad relativa durante un período de 24
horas.
Transcurrido este período se evaluó el grado de expansión de las células del cúmulo
mediante estereomicroscopio.
Para realizar la inseminación se utilizó semen congelado de un único toro de Raza
Rubia Gallega. Dicho semen fue descongelado en un baño de agua a 37ºC durante 1
minuto. Posteriormente se procedió a la selección de una población de espermatozoides
móviles, mediante su deposición en un gradiente discontinuo de Percoll (45/90%) en un
tubo cónico de 10 mL (FalconTM, Becton Dickinson NJ, USA). Tras su centrifugación a
700 x g durante 30 minutos, se eliminó el sobrenadante y el pellet espermático se
resuspendió en 30 µL de medio TL-Sperm (Parrish y cols, 1986). La concentración final
fue determinada mediante recuento celular en un hemocitometro.
La fecundación in vitro se realizo según el método descrito por Parrish y cols,
(1986). Concluido el período de maduración los grupos de 10 ovocitos fueron lavados tres
veces en medio TL-Hepes y posteriormente transferidos a gotas de 50 µL de medio TLSperm suplementado con 6 mg/mL de albumina sérica bovina (BSA), 2 µg/mL de heparina,
20 µM de D-penicillamina, 10 µM de hipotaurina y 1 µM de epinefrina. La concentración
final de espermatozoides en cada gota de fecundación fue de 2 x 106 espermatozoides/mL.
Los gametos fueron incubados en las condiciones descritas para la maduración durante un
período de 18 horas.
Al final del período de fertilización los presuntivos zigotos fueron lavados 3 veces
en medio TL-Hepes y transferidos a gotas de 50 µL de medio de cultivo, recubiertas de
aceite de parafina.
En este trabajo se realizaron dos experimentos; el medio de cultivo utilizado en
ambos casos fue SOFm suplementado con 1mM de glutamina, 1% de aminoácidos
esenciales y 1% de aminoácios no esenciales y la mezcla de ITS (insulina: 5 µg/mL;
transferrina 5 µg/mL; y selenito sódico 5 ng/mL a) en el primero de ellos los presuntivos
zigotos se dividieron en dos grupos añadiéndoles desde el inicio del cultivo glucosa en dos
concentraciones diferentes 1 y 2 mM, respectivamente; b) en el segundo experimento se
utilizaron las mismas concentraciones de glucosa, pero suplementadas al medio a las 48
horas de empezar el cultivo.
Cada experimento se repitió en 4 ocasiones.
Para determinar la eficacia del sistema de cultivo se ha determinado la proporción de
embriones que se dividen 48 h p.i., el porcentaje de embriones que alcanzan el estado de
blastocisto en días 7 y 8 de cultivo y el número de los mismos que eclosionan hasta el día
10 de cultivo.
Los resultados de la suplementación con las distintas concentraciones de colesterol al
medio en cuanto a proporción de zigotos que se dividen, porcentaje de blastocistos, y tasas
de eclosión se han analizado utilizando el Modelo Lineal General (GLM). Se ha utilizado el
test de Dunnet para comparar datos individuales cuando se observaba algún efecto
significativo (p<0,05).
RESULTADOS
Tabla 1: Resultados tanto de segmentación como de producción de blastocistos, tras la
suplementación del medio con glucosa (1y 2 mM de glucosa: Gluc) (P<0.05) en diferentes
momentos de administración (Experimento 1 y 2, datos no comparados entre sí)
EXPERIMENTO 1
EXPERIMENTO 2
1 mM Gluc
2 mM Gluc
1 mM Gluc
2 mM Gluc
% Div 48hpi 84,65±7,87
76,85±8,13
82,26±6,82
82,37±2,95
%blast 7d
21,09±6,55
14,47±4,97
7,97±1,72
6,89±3,93
%blast 8d
8,21±0,801
4,16±6,04
6,81±5,57
9,60±2,66
%blast tot
29,31±6,72
18,91±8,40
14,79±5,15
16,49±5,04
%eclos
27,01±20,59 39,58±42,69
40,40±5,71
49,20±7,97
Al evaluar de forma conjunta los valores obtenidos en los experimentos 1 y 2,
podemos determinar el efecto de la suplementación tardía de glucosa. Para ello hemos
comparado el porcentaje de blastocistos obtenido, en función de que la glucosa esté
presente desde el inicio del cultivo (experimento 1) o sea incorporada 48 h más tarde
(experimento 2). Nuestros resultados, reflejados en el gráfico 1, indicaban que el porcentaje
de blastocisto era superior cuando el medio contenía 1 mM de glucosa desde el inicio del
cultivo. Estas diferencias se establecían durante el día 7, ya que los valores observados en el
día 8 fueron muy similares para los cuatro grupos considerados.
Gráfico 1: Efecto del momento de la incorporación glucosa al medio de cultivo (al inicio
del cultivo: suplementación no diferida: ND a las 48 h p.i.: suplementación diferida: D).y
de su concentración (1 y 2mM) en el porcentaje de blastocistos, La presencia de diferentes
letras sobre las distintas columnas del gráfico expresan la existencia de diferencias
estadísticamente significativas.
35
d
% de Blastocistos
30
25
1mM D
a
20
15
10
e
ab
b
ed
ed
2mM D
2mM ND
b
5
0
Bls 7d
1mM ND
Bls 8d
Bls tot
DISCUSIÓN
Al revisar la bibliografía disponible, podemos comprobar la existencia de opiniones
contradictorias en relación al efecto de la glucosa sobre el desarrollo embrionario temprano.
Ello es, en gran medida, una consecuencia de extrapolar a las especies domésticas los
resultados obtenidos empleando embriones de ratón. El metabolismo de la glucosa parece
ser diferente en los embriones bovinos durante su desarrollo temprano, como ya fue
apuntado por Pinyopummintr y Bavister (1991). Se ha demostrado que el fluido oviductal
bovino contiene glucosa a una concentración que oscila entre 0.05 y 0.2 mM (Carlson y
cols., 1970). Por otra parte, cuando los embriones se mantienen en el oviducto ligado de
una oveja, situación que favorece su desarrollo, están sometidos a una concentración de
glucosa de 1,5 mM (Leese, 1988).
Otro aspecto que debemos tener presente al interpretar los datos recogidos en la
bibliografía, es que en muchos de los trabajos en los que se describen los efectos negativos
de la presencia de glucosa en los medios de cultivo, la concentración utilizada es
notablemente superior a la empleada en nuestro caso (5,6 mM en el medio B2 de Menezo y
6,7 mM en en TCM199). Esta concentración fue preconizada por Bettarbed y Wright
(1985) para los medios de cultivo utilizados para el desarrollo in vitro de los embriones de
rumiantes.
Posteriormente, Furnus y cols. (1997) demostraron que la presencia de glucosa a una
concentración 5 mM durante las primeras 24 horas de cultivo, reducía significativamente el
porcentaje de blastocistos obtenidos. De hecho, una parte de los efectos favorables del
cocultivo con células somáticas, han sido atribuidos a que éstas reducían considerablemente
la concentración de glucosa presente en el medio (50% en 48 horas).
La capacidad de utilizar la glucosa se va incrementando, progresivamente, a medida
que los zigotos evolucionan hasta blastocistos expandidos. El incremento en la utilización
de glucosa no es lineal, sino que se produce por etapas, el primer aumento importante se
observa al producirse la activación del genoma embrionario (Kim y cols, 1993; Khurana y
Niemann, 2000). Este hecho ha sido atribuido a que la activación del genoma embrionario
provoca el incremento de la síntesis de los enzimas, que intervienen en el metabolismo de
la glucosa, o a que provoca cambios en la regulación de los mismos (Rieger y col, 1992).
Así, durante el desarrollo pre-compactación, el ATP se obtiene a partir de la oxidación del
piruvato o de algunos aminoácidos. Durante esta etapa, la glucólisis debe estar deprimida
para que el desarrollo se produzca de forma correcta, de tal manera, que un fallo en la
depresión de la actividad glucolítica determina el bloqueo en el desarrollo, que en el caso
concreto de la especie bovina se produce en la etapa de 8 a 16 células (Gardner y col, 1998;
Thompson y col, 2000). La actividad glucolítica está condicionada por la presencia de
ciertos compuestos en el medio de cultivo. Así, el fósforo inorgánico tiene la capacidad de
estimular la glucólisis anaerobia, inducir un descenso de la fosforilación oxidativa y, como
consecuencia de ella, un descenso del contenido del ATP intracelular (Schini y Bavister,
1988). La concentración intracelular de magnesio interviene, también, en la regulación de la
actividad glucolítica, al actuar como un cofactor necesario para algunas de las enzimas que
intervienen en el proceso (Lane y Gardner, 1997). Por ello, la capacidad del EDTA para
suprimir la glucólisis y regular el metabolismo oxidativo, ha sido atribuida a su acción
quelante del Mg. Otra etapa, decisiva en la utilización de la glucosa por los embriones
bovinos, es la formación y expansión del blastocele. Ello es consecuencia de las elevadas
necesidades energéticas de las ATPasas Na+, K+ dependientes. En el caso de los embriones
bovinos, el metabolismo de la glucosa se duplica entre las etapas de mórula y blastocisto
expandido (Tiffin y cols, 1991). Este hecho ha sido tenido muy en cuenta en el momento de
establecer la formulación del SOF 98, medio de cultivo secuencial diseñado por Thompson
y col (2000), mediante la incorporación de nitrato sódico y 2,4 dinitrofenol, sustancias que
estimulan la glucólisis, al inhibir parcialmente el metabolismo oxidativo.
Sin embargo, y en aparente contradicción con todo lo anteriormente expuesto, nuestros
resultados indicaban que, independientemente de su concentración (1 ó 2 mM), la
incorporación de glucosa a las 48 horas postínseminación, no permitía obtener unos
resultados tan favorables como los logrados cuando la glucosa estaba presente en el medio
desde el inicio del cultivo. Estos resultados divergen claramente de los obtenidos por Kim y
cols (1993), quienes señalaban que la glucosa no resulta necesaria para los embriones
bovinos hasta los días 3-4 del desarrollo, momento a partir del cual estimulan el desarrollo
embrionario. Tampoco coinciden con los resultados obtenidos por Ellington y col (1989),
quienes observaron, que la presencia de glucosa en el medio de cultivo durante las primeras
36-48 horas provoca, en los embriones bovinos, una disminución del porcentaje de
blastulación. No obstante, es necesario tener presente que la concentración de glucosa
utilizada por estos autores (3,3 mM) era superior a la empleada por nosotros. Por el
contrario, en un estudio realizado por Khurana y Niemann (2000), se pudo comprobar que
la omisión de glucosa en el medio durante las primeras 72 horas de cultivo, determinaba
que ninguno de los zigotos progresara hasta mórula o blastocisto. Algunos estudios
recientes, han puesto de manifiesto que la presencia del pronúcleo masculino dentro del
citoplasma del ovocito va acompañada de un incremento de la utilización de glucosa
(Pantaleon y col, 2001), que generalmente se produce a través de la vía de las pentosas
fosfato (Urner y Sakkas, 1999). La glucosa metabolizada a través del ciclo de las pentosas
genera NADPH, utilizado en las reacciones de reducción, y ribosa 5 fosfato, precursor en la
síntesis de nucleótidos para la replicación del ADN y el ARN (Urner y Sakkas, 1999). En
un estudio, en el que cuantificaba el metabolismo de la glucosa tras la fecundación in vitro,
se observó que tanto la glucólisis como el ciclo de las pentosas estaban notablemente
incrementadas en los ovocitos fecundados, y que la intensidad del metabolismo de la
glucosa se correlacionaba con el tiempo que tardaba en iniciarse la fase S del ciclo celular
(Comizzoli y col, 2003). El incremento de la glucólisis, observado por estos autores, es
bastante discreto (alrededor de 1,5 pmol/ovocito por hora), en comparación con la intensa
glucólisis observada en los blastocistos bovinos (10 pmol/embrión por hora) (Rieger y cols,
1992). A pesar de que existen algunos estudios en los que se indica que la glucosa no es
necesaria para los embriones bovinos durante los primeros ciclos celulares (Parrish y col,
1989), Thompson y col (1996) observaron que estos embriones utilizan muy pocos sustratos
endógenos, cuando el medio de cultivo contiene los sustratos exógenos apropiados. Por lo
tanto, la ausencia de glucosa en el medio de cultivo, obligaría a los zigotos a utilizar otras
sustancia presentes en el citoplasma del ovocito, como puede ser el caso del glucógeno
(Hsieh y col 1979).
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