COMPARACIÓN DE LA CINÉTICA DE FERMENTACIÓN DE 27

COMPARACIÓN DE LA CINÉTICA DE FERMENTACIÓN DE 27 CEPAS DE
Saccharomyces cerevisiae VÍNICAS EN MOSTOS MUY AZUCARADOS.
Fernández-González* M., Barrajón N., Díaz-Hellín P., Úbeda J.
Instituto Regional de Investigación Científica Aplicada (IRICA), Universidad de Castilla-La
Mancha (UCLM). Avda. Camilo José Cela s/n 13071 Ciudad Real.
[email protected]
Palabras clave:
levaduras, vino, azúcar, fructosa, glucosa
RESUMEN
Este trabajo es un primer paso en la selección de cepas de levadura para utilizar en técnicas
de hibridación que presenten mejores aptitudes tecnológicas en lo que se refiere al consumo
total del azúcar a baja temperatura de mostos muy azucarados.
Se han estudiado un total de 27 cepas de levaduras Saccharomyces procedentes de
ecosistemas vínicos, 25 de la colección de la Universidad de Castilla La Mancha (UCLM) y 2
comerciales. Las microvinificaciones se realizaron a 20ºC utilizando un mosto concentrado
diluido hasta 130g/L de glucosa y 130g/L de fructosa, y se inocularon con 2x10 6 cel/mL. La
cinética de fermentación se siguió por pérdida de peso y una vez terminada, se analizaron la
glucosa, fructosa, etanol y glicerol mediante HPLC.
Todas las levaduras tuvieron una cinética entre las 24-72h comprendida entre 0,28- 0,54
gCO2/L/h, El glicerol osciló entre 8,7-11,6 g/L, el etanol 95,8-131,6 g/L, la glucosa 0,2-6,8
g/L y la fructosa 1,9 y 45,9 g/L. Las levaduras estudiadas diferían en su capacidad para
consumir fructosa, y éste es un indicador del comportamiento en mostos potencialmente
problemáticos. La mitad de ellas fueron capaces de asimilarla igual que la glucosa y por tanto
útiles para evitar paradas de fermentación.
INTRODUCCIÓN
Durante la fermentación alcohólica del vino las levaduras son las encargadas de transformar
la glucosa y la fructosa del mosto en etanol y CO2 principalmente. Los mostos contienen
cantidades generalmente iguales de fructosa y de glucosa (Fleet and Heard, 1993) y la
concentración típica de hexosas oscila entre 160 y 300 g/L, pero en algunas condiciones
enológicas especiales y dependiendo de la variedad de uva, la proporción puede variar.
Como consecuencia del cambio climático, está aumentando la cantidad de fructosa en los
mostos con respecto a la glucosa y está afectando a la calidad global del producto final
(Jones et al. 2005). Aunque Saccharomyces generalmente consume tanto la glucosa y la
fructosa durante la fermentación, prefieren consumir la glucosa y por tanto lo hace de forma
rápida, lo que resulta en una reducción de la relación glucosa/fructosa y el predominio de la
fructosa al final de la fermentación (Berthels et al. 2004). Durante esta fase de la
fermentación, cuando las fuentes de nitrógeno se han consumido y la concentración de
etanol es alta, algunas cepas tienen problemas para fermentar la fructosa residual,
resultando en una ralentización o parada fermentativa (Bauer y Pretorious, 2000). Los vinos
obtenidos de esta forma son más susceptibles a alteraciones microbianas que generan
metabolitos indeseables responsables de off-flavors. Todo ello desemboca en pérdidas
importantes para el sector, ya que aunque el proceso se recupera casi siempre mediante la
reinoculación de levaduras de “final de fermentación”, la aireación o el empleo de
coadyuvantes metabólicos, como las “cortezas de levadura”, el tiempo empleado en
operaciones suplementarias por el equipo técnico supone un gravoso coste adicional para la
bodega y una mala prensa para el iniciador empleado.
En los últimos años, debido a las condiciones extremas de vinificación, tanto para adaptarse
a las exigencias del mercado, buscando vinos más aromáticos y peculiares, como por efecto
del cambio climático, que afecta a la composición de los frutos, vuelven a demandarse cepas
de levaduras que posean un perfil tecnológico y enológico óptimo y heterogéneo.
Las uvas tintas, para alcanzar la madurez fenólica adecuada, se sobremaduran en el campo
con lo que el contenido de azúcar y el grado alcohólico aumentan: hay un exceso de azúcar
residual o, si finaliza correctamente la fermentación, de alcohol (González et al. 2007) y lo
mismo ocurre con los mostos blancos de las últimas partidas cosechadas ya que poseen un
elevado grado brix. La elaboración en “blanco” no incluye etapas de aireación y trasiego
como ocurre con los “tintos” por lo que las células de levadura no se recuperan del estrés de
rehidratación-osmótico-térmico y, si además las condiciones climáticas son adversas, con un
descenso más o menos brusco de las temperaturas a principio del otoño, junto a un elevado
grado alcohólico, se obtienen vinos con más de 2 g/L de azúcar.
El objetivo de este estudio es seleccionar cepas de levaduras que presenten mejores
aptitudes tecnológicas en lo que se refiere al consumo total del azúcar a baja temperatura de
mostos muy azucarados con el fin de utilizarlas posteriormente en programas de hibridación.
MATERIAL Y MÉTODOS
Cepas de levaduras. Se han utilizado un total de 25 cepas de levaduras S. cerevisiae de la
colección de la UCLM procedentes de ecosistemas vínicos y que en estudios previos habían
demostrado que eran capaces de agotar los azúcares de fermentación así como dos cepas
comerciales BCS103 y UCLMS-325 (Fermentis); la primera indicada para mostos con
potencial alcohólico elevado, muy clarificados, así como para reiniciar fermentaciones de
mostos que hayan sufrido paradas y la segunda recomendada para potenciar la estructura de
los vinos blancos, debido a que produce elevadas concentraciones de glicerol y otorga
carácter a los vinos varietales neutros y poco aromáticos. En la tabla 1 se recogen las cepas
de levadura utilizadas en el estudio.
Microvinificaciones. Las cepas de la colección que se mantenían congeladas a -70ºC, se
recuperaron en caldo YPD y se sembraron en picos de flauta con el mismo medio sólido. Se
añadió una ansada de cultivo en un medio de propagación (mosto concentrado diluido hasta
10% de azúcar) y se incubó 24h a 28ºC con buena agitación. Tras la incubación se realizó
recuento en cámara de thoma de los precultivos y se inocularon matraces de 100mL con
75mL de mosto concentrado diluído (130g/L de glucosa, 130g/L de fructosa, pH3.3) provisto
de válvulas müller con una población de 2x106 cl/mL.
Las fermentaciones se llevaron a cabo por duplicado a 20ºC sin agitación y se siguió la
cinética de fermentación por pérdida de peso debido a la producción de CO2, dando por
finalizado el proceso cuando el 50% de los fermentados mantenían un peso constante.
Análisis de los fermentados. A los fermentados se analizaron la glucosa, fructosa, etanol
y glicerol mediante HPLC, utilizando un equipo JASCO-PU1580 dotado de una columna
BioRad HPX-87H 300 x 7,8mm y un detector de índice de refracción. Se utilizó H2SO4 (0,254
g/L) como fase móvil y la temperatura del horno fue de 25ºC (Díaz-Hellín, P et al. 2012)
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En las Figura 1 se recoge el gráfico con la cinética de fermentación de las levaduras
estudiadas expresado en gCO2 liberado/L frente al tiempo en días.
En la Tabla 1 se recogen los resultados obtenidos. Todas las levaduras tuvieron una cinética
entre las 24-72h comprendida entre 0,28 gCO2/L/h para las más lentas (UCLMS-59 y
UCLMS-71) y 0,54 gCO2/L/h para la más rápidas (UCLMS-241). En líneas generales se pudo
relacionar la velocidad de fermentación en la fase de crecimiento exponencial, es decir entre
el segundo y cuarto día, con el contenido de azúcares residuales al final de fermentación.
Todas las cepas que dejaron un mayor contenido de azúcares en el medio tuvieron
velocidades inferiores a 0,40 gCO2/L/h, a excepción de la UCLMS-263 con un valor de 0,50
gCO2/L/h. Las que tuvieron un contenido de azúcares totales por debajo de 5 g/L,
presentaron una cinética superior a 0,40g/L/h. Sin embargo, las cepas UCLMS-59 y UCLMS71 que presentaron las cinéticas más bajas de 0,28g/L/h mostraron valores de azúcares
residuales muy variables entre ellas siendo de 6,4 g/L y 51 g/L respectivamente. La cinética
más alta correspondió a la UCLMS-241 con 0,54 gCO2/L/h, y un valor de azúcares de 5,3,
que no fue el valor más bajo para este parámetro como cabría pensar y que perteneció a la
levadura comercial BCS103 (3,45 g/L) y una cinética de 0,41 gCO2/L/h, 0,13 puntos más
baja que la velocidad máxima.
Tabla 1. Resultados de las fermentaciones a 20ºC a partir de mosto natural concentrado y
posteriormente diluido de 27 cepas de Saccharomyces. Las concentraciones están expresadas en g/L.
Cepa de levadura
CF1
Glucosa
Fructosa
GF2
RGF3
Glicerol
Etanol
UCLMS-2
UCLMS-3
UCLMS-4
UCLMS-31
UCLMS-33
UCLMS-38
UCLMS-59
UCLMS-71
UCLMS-75
UCLMS-147
UCLMS-202
UCLMS-218
UCLMS-220
0,33
0,34
0,33
0,45
0,49
0,35
0,28
0,28
0,42
0,30
0,45
0,37
0,36
6,77
0,95
0,44
0,89
1,52
6,82
0,67
2,62
0,56
0,92
0,43
0,98
0,16
45,91
10,96
25,28
5,65
3,33
44,20
5,76
32,86
4,36
7,59
4,79
19,59
9,58
52,68
11,90
25,71
6,54
4,85
51,02
6,43
35,48
4,91
8,51
5,21
20,57
9,74
0,15
0,09
0,02
0,16
0,45
0,15
0,12
0,08
0,13
0,12
0,09
0,05
0,02
9,74
8,75
9,43
10,31
10,84
8,67
9,31
8,75
10,45
11,56
10,47
9,07
9,06
95,77
113,79
110,99
126,73
125,21
112,63
131,36
113,03
125,63
114,72
124,66
118,88
126,86
UCLMS-227
UCLMS-228
UCLMS-234
UCLMS-239
UCLMS-241
UCLMS-263
UCLMS-267
UCLMS-273
0,29
0,43
0,37
0,44
0,54
0,50
0,43
0,37
1,19
1,00
1,34
0,58
1,28
0,74
1,47
0,98
18,34
3,32
7,38
4,39
4,05
9,64
2,29
6,78
19,53
4,31
8,71
4,96
5,33
10,38
3,76
7,76
0,06
0,30
0,18
0,13
0,32
0,08
0,64
0,14
9,87
10,43
10,26
9,61
11,05
10,07
10,33
10,44
105,71
124,77
124,23
129,76
131,57
122,13
131,15
119,97
UCLMS-277
UCLMS-280
UCLMS-287
BC S103*
UCLMS-325*
0,50
0,37
0,47
0,41
0,33
1,65
1,25
1,57
1,53
1,74
2,24
15,45
4,77
1,92
25,30
3,88
16,69
6,34
3,45
27,03
0,74
0,08
0,33
0,80
0,07
10,49
10,13
10,45
10,89
9,31
128,41
110,43
127,17
127,45
109,95
1
CF. Cinética de fermentación entre las 24-72h expresada en gCO2/L/h
GF. suma de Glucosa y fructosa en g/L.
3
RGF. Relación glucosa-fructosa
*levaduras comerciales Fermentis.
2
Figura 1. Cinética de fermentación de las levaduras estudiadas
Todas las levaduras dejaron menos de 5 g/L de glucosa en el medio a excepción de las
UCLMS-2, UCLMS-38, en cambio el valor de fructosa fue mucho más variable entre 45,9 y
1,9. Casi todas las levaduras consumen la glucosa en la misma cantidad, sin embargo los
niveles de fructosa son cepa dependiente y éste es un indicador del comportamiento en
mostos potencialmente problemáticos. El 38,5% fueron capaces de asimilarla igual que la
glucosa y por tanto útiles para evitar paradas de fermentación, aunque la mayoría de ellas
de ellas dejaron cantidades superiores a 5 g/L. Solo 7 levaduras fueron capaces de dejar
vinos con menos de 5 g/L de azúcares reductores y por lo tanto serían útiles para fermentar
mostos muy azucarados a bajas temperaturas (Figura 2).
Figura 2. Concentración en g/L de glucosa (G), fructosa (F) y suma de glucosa + fructosa (G+F) en los
fermentados elaborados con las distintas levaduras.
Respecto al glicerol aquellas levaduras que dejaron mayor cantidad de azúcares residuales
produjeron menos glicerol y etanol lógicamente, pero cuando la cantidad de azúcares
consumida fue similar la levadura UCLMS-147 fue la que mayor cantidad de glicerol produjo
11,6 g/L y menor contenido en etanol 114,7 g/L y por tanto podría ser la candidata ideal
para cumplir con las nuevas demandas del mercado que en los últimos años tienden hacia
vinos con un mayor contenido en glicerol y menor cantidad de etanol. El glicerol es el mayor
y más importante compuesto no volátil producido por las levaduras en el vino y contribuye
significativamente en la calidad de los vinos proporcionando cuerpo y un ligero dulzor. Está
considerado como el tercer producto mayoritario de la fermentación después del etanol y el
CO2. La formación de glicerol es el resultado del balance redox y de la respuesta al estrés y
las diferencias de concentración observada entre las distintas cepas de levadura puede ser
debido a diferentes respuestas al shock osmótico (Orlic et al. 2010).
CONCLUSIONES
En este trabajo se han encontrado algunas levaduras aptas desde el punto de vista
tecnológico para ser utilizadas en programas de hibridación, como la UCLMS-267 y -277
capaces de agotar azúcares en mostos problemáticos a baja temperatura, y la UCLMS-147
con un poder fermentativo más moderado en términos de rendimientos de etanol y mayor
rendimiento en otros productos secundarios como el glicerol y por tanto útil para obtener
vinos con menor contenido de alcohol, ya que una producción excesiva de alcohol además de
constituir una limitación en la calidad sensorial del vino, lo es también para su viabilidad
comercial.
AGRADECIMIENTOS
Mónica Fernández quiere agradecer a la Fundación del Parque Científico y tecnológico de
Albacete (FPCTA) por la concesión de un contrato INCRECYT.
BIBLIOGRAFÍA
Bauer, F.F., Pretorius, I.S., (2000).Yeast stress response and fermentation efficiency: how to
survive the making of wine—a review. S.Afr. J. Enol. Vitic. 21, 27–51.
Berthels, N.J., Cordero Otero, R.R., Bauer, F.F., Thevelein, J.M., Pretorious, I.S., (2004).
Discrepancy in glucose and fructose utilization during fermentation by Saccharomyces
cerevisiae wine yeast strains. FEMS Yeast Research 4, 683-689.
Diaz-Hellin, P, Ubeda, J, Briones, A.I. (2012). Improving alcoholic fermentation by activation
of Saccharomyces species during the rehydration stage. LWT - Food Science and
Technology, ISSN 0023-6438, 10.1016/j.lwt.2012.06.011.
Fleet, G.H., Heard, G.M. (1993). Yeasts – growth during fermentation. In: Wine Microbiology
and Biotechnology (Fleet, G.H., Ed). Harwood Academic Publishers GmbH, Chur. 27-54.
Gonzalez, R., Barcenilla J.M. Tabera, L. (2007). Cepas vínicas de Saccharomyces cerevisiae
con bajo rendimiento en alcohol. ACE enología.
Jones, G.V., White, M.A., Cooper, O.R., Storchmann, K., (2005). Climate Change and Global
Wine Quality. Climatic Change, 73, 319-343
Orlić S., Arroyo-López F.N., Huic-Babić K., Lucilla I., Querol A., Barrio E. (2010). A
comparative study of the wine fermentation performance of Saccharomyces paradoxus
under different nitrogen concentrations and glucose/fructose ratios. J Appl Microbiol, 108,
73-80.