optimización del proceso de purificación de la proteína furb de

UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR
DECANATO DE ESTUDIOS PROFESIONALES
COORDINACIÓN DE LICENCIATURA EN BIOLOGÍA
OPTIMIZACIÓN DEL PROCESO DE PURIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA FURB DE
ANABAENA SP.
Por:
Lorena Zuliani Álvarez
Realizado con la asesoría de:
Tutor Académico: Maria I. Gonzatti.
Tutor Industrial: Mary Fillat.
INFORME DE PASANTÍA
Presentado ante la Ilustre Universidad Simón Bolívar
como requisito parcial para optar al título de
Licenciada en Biología
Sartenejas, Marzo de 2010
3
4
RESUMEN
El hierro es fundamental en el metabolismo celular, ya que está involucrado en una
multitud de procesos biológicos esenciales. La homeostasis de Fe en procariotas es regulada
mediante la proteína Fur (ferric uptake regulator), la cual actúa como represor transcripcional de
genes regulados por hierro mediante la unión al ADN dependiente de Fe 2+. En Anabaena sp. se
han descrito tres homólogos de Fur: FurA, FurB, y Fur C. De ellos, FurB ha sido poco estudiado
debido a que no se ha aplicado un método de purificación que tenga un buen rendimiento. Es por
esto, que el objetivo de este trabajo es optimizar el proceso de purificación de FurB, para poder
realizar posteriores estudios estructurales y bioquímicos. Para ello, se ha clonado el gen en el
vector pET-28a(+) que se introdujo dentro de las células de E.coli BL21 (DH3). Éstas se
indujeron con IPTG para sobre-expresar la proteína dentro de la célula. Seguidamente, se realizó
un escalado a 10L de cultivo para producir mayor cantidad de masa celular. Posteriormente se
llevó a cabo la purificación mediante la cromatografía de afinidad IMAC –Zinc. Y por último, se
efectuó un ensayo de retardo en gel (EMSA) para confirmar que la proteína estaba activa. En la
electroforesis SDS/PAGE se observó la banda de 17 kDa que corresponde a la proteína FurB
purificada, cuya concentración fue de 0,312 mg/mL, resultado tres veces mayor al obtenido en los
anteriores protocolos de purificación, lo que demuestra que este sistema tiene un rendimiento
mayor. Además, el proceso de clonaje e inserción de la cola de histidina a la proteína, es lo que
hace efectivo este nuevo método, que se presenta como un protocolo sencillo y rápido, donde el
producto obtenido es funcional y tiene un alto grado de pureza.
Palabras clave: cromatografía de afinidad, proteína Fur, Anabaena sp.
5
AGRADECIMIENTOS
Quisiera agradecer de forma muy especial a mis padres y a mi hermano, por haberme
ensañado que a través del esfuerzo y la perseverancia se alcanzan los objetivos, pero sobretodo
por haber llenado el hogar de cariño y apoyo incondicional durante la realización de este
trabajo y a lo largo de mi carrera. A Manuel, por ser mi compañero de camino, por compartir
conmigo los buenos y malos momentos, y por motivarme a dar lo mejor de mí en todo lo que me
propongo. A mis tutoras, Marisa Gonzatti y Mary Fillat, por impartirme sus conocimientos y
guiarme en esta tarea de la que hoy cosecho sus frutos. A mis compañeros de trabajo del
laboratorio de biología estructural de la Universidad de Zaragoza, gracias por su ayuda y su
amistad, ya que hay un pedacito de cada uno de ustedes que forma parte de este trabajo. A mis
amigos, que siempre han sido una presencia constante durante mi carrera, y que han contribuido
en el profesional que me convierto hoy. A todos lo que de alguna forma hicieron esto posible,
¡Muchas Gracias!
6
ÍNDICE GENERAL
Página
RESUMEN………………………………………………………………………….
iv
AGRADECIMIENTOS…………………………………………………………….
v
LISTA DE SÍMBOLOS…………………………………………………………….
x
LISTA DE ABREVIATURAS……………………………………………………..
xi
INTRODUCCIÓN
Antecedentes ………………………………………………………………………..
13
Importancia del trabajo y Planteamiento del Problema………………………………
16
Objetivos……………………………………………………………………………..
19
CAPÍTULO 1. Descripción de la Empresa………………………………………….
20
CAPÍTULO 2. Marco Teórico
2.1.- El hierro en bacterias…………………………………………………………..
22
2.2.- Regulación de la homeostasis del hierro. Ferric uptake regulator (Fur)………
25
2.3.- Estructura de Fur……………………………………………………………….
27
2.4.- Genes regulados por Fur……………………………………………………….
30
2.5.- Fur en Anabaena sp…………………………………………………………….
31
CAPÍTULO 3. Diseño Experimental. Materiales y Métodos
3.1.- Cepas utilizadas y Medios de cultivo………………………………………….
34
7
3.2.- Clonaje…………………………………………………………………………
34
3.3.- Transformación de E.coli BL21 (DE3) con el plásmido pET-28a(+)………….
36
Página
3.4.- Screening de expresión de FurB y producción de masa celular………………
37
3.5.- Purificación de FurB mediante cromatografía de afinidad IMAC –Zinc……..
39
3.6.- Ensayo de unión al ADN (EMSA: Electrophoresis Mobility Shift Assay)……
41
CAPÍTULO 4. Resultados y Discusión.
4.1.- Clonaje y Screening de expresión……………………………………………..
44
4.2.- Purificación y Concentración………………………………………………….
47
4.3.- Ensayo de unión al ADN (EMSA)…………………………………………....
52
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES…………………………………...
54
BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………………...
55
8
ÍNDICE DE TABLAS
Página
Tabla 1.- Posibles roles de los homólogos de Fur en Cianobacterias…………………
15
Tabla 2.- Propiedades bioquímicas de las proteínas Fur de
Anabaena sp. PCC 7120………………………………………………………………
31
Tabla 3.- Composición de un gel de SDS/PAGE al 17%...............................................
38
Tabla 4.- Composición del gel al 6% del EMSA……………………………………...
42
Tabla 5.- Mezclas utilizadas para realizar el EMSA…………………………………..
42
9
ÍNDICE DE FIGURAS
Página
Figura 1.- Reacción de Fenton………………………………………………………
16
Figura 2.1.1- Estructura del sideróforo “schizokinen” de Anabaena sp…………….
23
Figura 2.1.2.- Estructuras de las proteínas de almacenamiento de Hierro………….
24
Figura 2.2.1.- Secuencia consenso de Fur de 19 pb reinterpretada como
motivos “6-1-6”……………………………………………………………………..
26
Figura 2.3.1.- Representación de la estructura tridimensional del dímero de Fur
de Pseudomonas aeruginosa………………………………………………………..
28
Figura 2.3.2.- Modelo de la unión de un dímero de la proteína Fur
de Pseudomonas aeruginosa al ADN……………………………………………….
29
Figura 3.2.1.- Estructura del plásmido pET-28a y la secuencia de la
región polylinker……………………………………………………………………..
35
Figura 4.1.1.- Colonias resultantes del proceso de transformación de
E.coli BL21 (DE3) con el plásmido pET-28a(+)…………………………………….
44
Figura 4.1.2.- Screening de expresión de FurB……………………………………...
46
Figura 4.1.3.- Screening de expresión de las cuatro inducciones realizadas
en el proceso de producción de masa celular………………………………………......
47
Figura 4.2.1- Electroforesis SDS/PAGE 17% de las fracciones de 5 en 5 obtenidas
mediante la cromatografía IMAC……………………................................................
48
Figura 4.2.2.- Electroforesis SDS/PAGE 17% de las fracciones de 1 en 1
obtenidas mediante la cromatografía IMAC…………………………………………
49
Figura 4.2.3.- Electroforesis SDS/PAGE 17% de los productos concentrados
de primeras cuatro purificaciones mediante la cromatografía IMAC………………..
50
10
Figura 4.3.1.- Ensayo de retardo en gel (EMSA) de FurB contra pfurA y pfurB……..
LISTA DE SÍMBOLOS Y UNIDADES
°C: grados centígrados
ε
276
: Coeficiente de extinción molar.
μg: Microgramos
μL: Microlitros
µm: Micromilímetro.
μM: Micromolar
A: Ampere
Da: Dalton
D.O: Densidad óptica
g.: Gramos
h: horas
kDa: kilo Dalton
L: Litros
M: molar
min: minutos
mL: mililitros
mM: milimolar
nm: nanómetros
rpm: revoluciones por minuto.
s: segundos
V: Voltios
53
11
LISTA DE ABREVIATURAS
A: Adenina
ADN: Acido desoxirribonucleico
ARN: Acido ribonucleico.
BFr: Bacterioferritina
BSA: Bovine serum albumin. Albumina de suero bovino.
C: Citosina
Cys: Cisteína.
DNasa: Desoxirribonucleasa
dNTP: Deoxiribonucleotidos trifosfato
Dps: DNA binding proteins for starved cells. Proteínas de unión al ADN.
DTT: ditiotreitol
DtxR: dipheria toxin repressor. Represor de la toxina de diferia.
EMSA: Electrophoretic mobility shift assay. Ensayo electroforético de movilidad en gel.
Fe: Hierro
Fur: ferric uptake regulator. Regulador de la incorporación del hierro.
FurB-His: proteína Fur recombinante con la cola de histidina.
G.: Guanina
His: Histidina.
IMAC: Immobilized metal ion affinity chromatography. Cromatografía de afinidad a un metal
inmovilizado.
IPTG: Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
Irr: Iron response regulator. Regulador de la respuesta al hierro.
LB: Medio Luria-Bertani
12
LBK: Medio Luria-Bertani más Kanamicina.
MntR: Manganese transporter regulator. Regulador del transporte de Manganeso.
Mur: Manganese uptake regulator. Regulador de la incorporación de Manganeso.
Nur: Nickel uptake regulator. Regulador de la incorporación de Níquel.
PCR: Polymerase chain reaction. Reacción en cadena de la polimerasa.
PerR: peroxidase regulator
pI: Punto Isoeléctrico.
PMSF: fenilmetilsulfonil fluoruro
Pro: Prolina
PSA: Persulfato de Amonio
ROS: Reactive oxygen species. Especies reactivas de oxígeno.
RT-PCR: Reverse transcription PCR. PCR en Transcripción Reversa.
SDS/PAGE: sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis. Electroforesis en gel de
poliacrilamida con dodecilsulfato sódico
T: Timina
TEMED: Tetrametiletilenodiamina
Zn: Zinc
Zur: Zinc uptake regulator. Regulador de la incorporación de Zinc.
13
INTRODUCCIÓN
Antecedentes
Un descubrimiento clave en el entendimiento de la regulación del transporte de hierro en
bacterias fue cuando Hantke en 1981 observó, en un mutante de E. coli, que la expresión de
todos las funciones inhibidas por hierro (producción de sideróforos y biosíntesis de distintas
proteínas de la membrana externa) se realizaba constitutivamente. Este mutante se comportaba de
forma similar al de Salmonella typhymurium aislado unos años antes (Ernst et al., 1978), y el
cual se había denominado fur (ferric uptake regulator, por sus siglas en inglés). Su
comportamiento claramente sugería que muchos, sino todos, los genes dependientes de hierro
estaban regulados por un represor dependiente del metal.
Estudios posteriores de fur en E.coli permitieron mapear el gen (Bagg y Neilands, 1985),
clonarlo (Hantke, 1984) y secuenciarlo (Schaffer et al., 1985), así como la proteína pudo ser
purificada por primera vez por Wee et al. en 1988.
A partir de entonces, se han descrito homólogos de Fur en muchas bacterias Gram-negativas,
incluidos patógenos humanos como Yersinia (Staggs y Perry, 1991), Pseudomonas (Prince et al.,
1993), Helicobacter pylori (Bereswill et al., 1998) e incluso en patógenos de plantas como
Erwinia chrysanthemi (Franza et al., 1999). Asimismo, se han identificado proteínas Fur en
bacterias Gram – positivas, como Bacillus subtilis (Bsat et al., 1998) y Staphylococcus (Heidrich
et al., 1996). La mayoría de estos homólogos son capaces de complementar el mutante fur en
E.coli, sugiriendo que los mecanismos moleculares que controlan la regulación de la
transcripción por hierro, son compartidos por muchos microorganismos (Escolar et al., 1999).
14
Hoy en día se conoce la estructura tridimensional de la proteína Fur presente en diversos
microorganismos la cual puede encontrarse en las bases de datos, como es el caso de E. coli
(Gonzales de Peredo et al., 1999), P. aeruginosa (Pohl et al., 2003), V. cholerae (Sheikh y
Taylor, 2009), entre otras. Todas ellas son dímeros que contienen un dominio de unión al ADN
en extremo amino-terminal y un dominio de dimerización en el extremo carboxi-terminal, donde
además se sitúa el sitio de unión del metal regulador.
En el caso de las cianobacterias, la proteína Fur fue descrita por primera vez en
Synechococcus PCC 7942 usando un ensayo de represión en vivo en E.coli. Con la finalidad de
inactivar el gen fur, se produjeron mutantes merodiploides que, en condiciones de abastecimiento
de Fe, presentaron un fenotipo deficiente en hierro, evidenciando el rol de esta proteína en la
regulación de la incorporación de hierro en cianobacterias (Ghassemian y Straus, 1996).
Fur también ha sido estudiada en otras cianobacterias como Anabaena sp., Synechocystis y
Microcystis aeruginosa (tabla 1). En el caso de Anabaena, el homólogo de Fur fue descrito por
primera vez por Bes et al. en el 2001, en el Laboratorio de Biología Estructural de la Universidad
de Zaragoza. Estudios posteriores demostraron la existencia de tres ortólogos fur en el genoma de
Anabaena sp. PCC 7120, codificados por los genes all1691, alr2473 y all0957, denominados
furA, furB y furC, respectivamente y cuyos marcos de lectura abiertos contienen el motivo rico en
histidina característico de la familia Fur. Por otra parte, se han realizado estudios del estado de
oligomerización (Hernández et. al, 2002) y análisis de interacción Fur-ADN, para observar las
interacciones de la proteína con sus promotores (Hernández et al., 2004).
De estas tres proteínas, FurA ha sido la más estudiada y también se ha demostrado su relación
con el metabolismo del nitrógeno en cianobacterias (López-Gomollón et al., 2007). De FurB solo
se conoce que su función está relacionada con la defensa ante el estrés oxidativo, ya que se ha
visto que se une inespecíficamente al ADN protegiéndolo del daño que puede ocasionar los
radicales hidroxilos o la DNasa I (López-Gomollón et al., 2009). FurC, en cambio, no se conoce
con exactitud su función, pero se ha especulado que puede modular la actividad de FurA y FurB,
15
así como puede estar involucrada con funciones relacionadas a los mecanismos fotosintéticos,
procesos que están ausentes en microorganismos heterótrofos (López – Gomollón et al., 2009).
Tabla 1.- Posibles roles de los homólogos de Fur en Cianobacterias. Tomado de: Fillat M., en
prensa
Cepa de cianobacteria
Synechoccocus 7942
Homólogos de
Fur
S7942 0987

Anabaena PCC 7120
All 1691 (FurA)



Anabaena PCC 7120
Alr 2473 (FurB)

Anabaena PCC 7120
All 0957 (FurC)

Synechocystis 6803
Slr 1738 (PerR)

Synechocystis 6803
Slr 1937 (Zur)
Microcystis aeruginosa MAE 37080
NIES - 843


Rol regulatorio
propuesto
Homeóstasis del
hierro
Homeóstasis del
hierro
Defensa ante el
estrés oxidativo
Metabolismo del
nitrógeno.
Defensa ante el
estrés oxidativo
Modula
la
actividad de FurA
y FurB mediante la
formación
de
heterodímeros
Defensa ante el
estrés oxidativo
Transporte de Zinc
Modulación de la
síntesis
de
microcistina
Referencia
Ghasemian
y
Straus, 1996
Hernández et al.,
2009
Lopéz- Gomollón
et al., 2007
López – Gomollón
et al., 2009
López – Gomollón
et al., 2009
Hernández et al.,
2004
Singh et al., 2003
Pakrasi et al., 2001
Martín- Luna et
al., 2006
16
Importancia del trabajo y Planteamiento del Problema
El hierro es fundamental en el metabolismo celular, ya que funciona como co-factor para un
gran número de enzimas, además de estar involucrado en una multitud de procesos biológicos
esenciales (Wackett et al., 1989). Además, en cianobacterias una gran parte del “pool” de hierro
es utilizado para construir proteínas que participan en el transporte de electrones en la fotosíntesis
y en la cadena respiratoria, así como en rutas de asimilación y fijación de nitrógeno (Straus,
1994); llegando a ser los requerimientos de este nutriente alrededor de 10 veces más altos que en
un microorganismo heterótrofo (Keren et al., 2004).
Por consiguiente, este metal es un factor limitante en el crecimiento celular, al mismo tiempo
que es uno de los principales determinantes de la productividad primaria en los océanos (Coale et
al., 1996). La falta de hierro también es una señal importante ambiental para desencadenar la
expresión de factores de virulencia (Litwin y Calderwood, 1993). De igual forma, su deficiencia
puede acarrear la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS, por sus siglas en inglés). En
Anabaena sp. PCC 7120 se comprobó que la producción de ROS era similar en deficiencia de
hierro como en condiciones de estrés oxidativo. Este hecho no se produce en bacterias
heterotróficas, por lo que se propuso que era un proceso característico de organismos
fotosintéticos (Latifi et al., 2005).
Pero no sólo una escasez de hierro puede causar daños negativos, un exceso de Fe resulta
potencialmente tóxico. Este metal es capaz de catalizar la formación de radicales hidroxilos OH
mediante la reacción de Fenton (figura 1). El radical hidroxilo es extremadamente reactivo y
puede perjudicar a la gran mayoría de biomoléculas (Imlay, 2003)
H2O2 + Fe2+
OH- + FeO2+ + H+
Figura 1.- Reacción de Fenton
Fe3+ + OH- + OH
17
El hierro que cataliza la reacción de Fenton se conoce como “hierro libre”, ya que no está
formando parte de proteínas de reserva o de enzimas. Este hierro procede de enzimas que
espontáneamente pierden su metal, como ocurre con la aconitasa de E. coli. Los iones
superóxidos y los radicales hidroxilos, contribuyen al estrés oxidativo aumentando los niveles de
hierro libre en la célula, ya que una de sus dianas preferidas son los grupos sulfoférricos, y como
consecuencia de su acción, rompen el centro y liberan el átomo de hierro (Imlay, 2003).
La incorporación de Fe tiene que ser cuidadosamente regulada para mantener la
concentración intracelular del metal dentro de los límites deseables. Este proceso de control es
llevado a cabo por reguladores transcripcionales, cuyo principal representante es la familia de
proteínas Fur.
Como el hierro influencia tantos procesos en la célula, es tentador considerar a Fur como un
regulador global que ajusta todo el metabolismo a causa de las fluctuaciones en la disponibilidad
de hierro en el entorno, en lugar de ser sólo un factor de transcripción muy específico para unos
pocos promotores de sideróforos (Escolar et al., 1999).
Al hacer una inspección de los genes regulados por Fur se ha descubierto que esta proteína
además participa en otras funciones que no están relacionadas directamente con el metabolismo
del hierro. Esto incluye diferentes procesos celulares como defensa ante el estrés oxidativo
(Tardat y Touati, 1993), quimiostasis (Karjalanien et al., 1991), rutas metabólicas (Hantke, 1987;
Stojiljkovic et al., 1994), bioluminiscencia (Makemson y Hastings, 1982), producción de toxinas
y otros factores de virulencia (Litwin y Calderwood, 1993), entre otros.
Por esta razón, esta familia de proteínas ha despertado interés en los investigadores, que
buscan descubrir las funciones y los mecanismos en los que está involucrada en la célula. En el
caso de Anabaena, se han descrito tres homólogos de Fur: FurA, FurB y Fur C, de los cuales se
han estudiado mayormente características funcionales de FurA, pero en relación a FurB sólo se
ha descubierto que puede intervenir en la protección contra el estrés oxidativo (López-Gomollón,
2009). Se puede decir que una de las razones por las cuales FurB ha sido menos estudiada es
18
porque no se ha aplicado un método de purificación que tenga un buen rendimiento. Cabe
destacar que estas proteínas tienden a agregarse fácilmente, es decir, a formar dímeros o
heterodímeros debido a la presencia de puentes disulfuros intermoleculares e interacciones
hidrofóbicas (Hernández et al., 2002), dificultando la solubilidad de los productos obtenidos
mediante la purificación
Según anteriores publicaciones, la proteína FurB puede ser purificada mediante dos pasos:
cromatografía heparin-Sepharose 6 Fast Flow, seguido por la columna MonoS FPLC (GE
Healthcare). Pero en este caso, no se conseguía una cantidad suficiente y homogénea de proteína
que permitiera hacer otro tipo de estudios, como cristalizarla para conocer su estructura
tridimensional, y así tener una idea de la función estructural de la familia Fur en cianobacterias.
Conociendo las características de FurB, es posible diseñar un método más práctico y más
eficiente, para obtener como resultado una buena cantidad de proteína, que sea soluble y pura,
que nos permita realizar ensayos para descifrar su función como parte de la familia Fur y poder
caracterizarla bioquímicamente.
Por eso es importante realizar un nuevo proceso de purificación y en el laboratorio de
Biología Estructural de la Universidad de Zaragoza, se ha propuesto utilizar la Cromatografía de
Afinidad IMAC (Immobilized metal ion affinity chromatography) para solventar este problema.
19
Objetivo General
Optimizar el proceso de purificación de FurB de Anabaena sp., para obtener proteína a gran
escala y, posteriormente, poder realizar estudios estructurales y bioquímicos.
Objetivos Específicos

Realizar un Screening para verificar la sobre-expresión de FurB en la cepa E.coli BL21
(DE3)

Sistematizar el protocolo de purificación de FurB, utilizando el método IMAC –Zinc
(Immobilized Metal ion Affinity Chromatography).

Estudiar la actividad de la proteína mediante ensayos de unión al ADN (EMSA:
Electrophoretic mobility shift assay).
20
CAPÍTULO 1
DESCRIPCIÓN DE LA EMPRESA
En la Facultad de Ciencias de la Universidad de Zaragoza en España, se encuentra el
Departamento de Bioquímica y Biología Celular, que nace en 1976 gracias al profesor Grande
Covián, un fisiólogo venido de la Universidad de Minnesota. Allí se ubican los laboratorios de
investigación de diferentes grupos y se lleva a cabo la mayor parte de la tarea docente: se
imparten las licenciaturas de Bioquímica, Química, Máster en Biología Molecular y Celular, así
como un Doctorado en Mención de Calidad. El equipo del departamento lo integran una veintena
de profesores permanentes, al igual que una decena de contratados, que imparten las asignaturas
en varias carreras ofertadas por la universidad, y realizan trabajos de investigación de
reconocimiento nacional e internacional.
Dentro de los grupos de investigación que allí se encuentran están: grupo de biogénesis y
patología mitocondrial, grupo de apoptosis, inmunidad y cáncer, grupo de biología de la
reproducción, grupo de investigación en neurociencias, grupo de genética de los trastornos del
metabolismo lipídico y el grupo de biología estructural. En este último, las profesoras e
investigadoras María Fillat, y María L. Peleato tienen como principal objetivo el estudio de la
regulación y el mecanismo de acción de la proteína Fur en Cianobacterias.
A partir del descubrimiento de la secuencia del gen fur en Anabaena sp. en el año 2001, este
grupo de investigación se ha volcado en la caracterización de estas proteínas, así como en
conocer las funciones que desempeña cada miembro de la familia Fur. Para ello están realizando
estudios estructurales, funcionales y fisiológicos tales como: estudios del patrón de
oligomerización, análisis de interacción con el ADN, estudios de la regulación de la expresión de
21
los genes de la familia Fur mediante fusiones a genes informadores, RT-PCR y análisis de
Northern y Western blots, entre otros.
También se han caracterizado algunos de los genes relacionados con la síntesis de
cianotoxinas y con los mecanismos de defensa frente al estrés oxidativo. Se ha clonado y
sobreexpresado la proteína Fur de Microcystis aeruginosa y se han llevado a cabo diversos
estudios en relación a la regulación del operón mcy, implicado en la síntesis de la cianotxina
microcistina.
22
CAPÍTULO 2
MARCO TEÓRICO
2.1.- El hierro en bacterias
El hierro es un elemento esencial para los microorganismos. Tanto el Fe 2+ como el Fe3+ son
iones relativamente pequeños que forman fácilmente complejos hexacoordinados con ligandos
que contienen Carbono, Nitrógeno o Azufre. En las proteínas encontramos átomos de hierro
formando parte de grupos hemos y centro sulfoférricos, o también jugando un papel estructural y
catalizador (Litwin y Calderwood, 1993).
Sin embargo, en condiciones de vida actuales, es decir, en presencia de O 2 y a pH neutro, el
Fe2+ es rápidamente oxidado a Fe3+, el cual forma óxidos e hidróxidos insolubles reduciendo
drásticamente la cantidad de hierro disponible (Straus, 1994). A pH 7 la concentración de Fe 3+ en
disolución es de 103 iones por mililitro, valor que se sitúa muy por debajo de los 10 5 iones de
hierro requeridos para la supervivencia de una sola bacteria (Braun et al., 1991).
Es por ello que, como primer paso, los microorganismos han desarrollado diferentes
estrategias para la solubilización del hierro y posterior asimilación del mismo, como:
acidificación del medio extracelular para aumentar la solubilidad de hierro; reducción del ión
férrico a ferroso, mucho más soluble; o la utilización de moléculas quelantes del ión férrico.
De todos los sistemas, la utilización de compuestos quelantes es el más utilizado por
procariotas. Los quelantes producidos por microorganismos, denominados sideróforos, son
23
moléculas de bajo peso molecular (menor de 100 Da), que mantienen el Fe 3+ soluble durante
horas o días debido a su lenta cinética de disociación (Rose y Waite, 2003). Aunque su estructura
es muy variada, todos forman complejos hexacoordinados octaédricos con el Fe 3+. Una vez que el
sideróforo ha unido un átomo de hierro, es introducido dentro de la célula por sistemas de
transporte específicos. Tanto la producción de sideróforos como la de sus receptores está
regulada por la disponibilidad de hierro (Guerinot, 1994).
Aunque se ha determinado la producción de sideróforos para muchas cianobacterias, sólo se
han caracterizado estructuralmente el sideróforo “schizokinen”, un citrato – hidroxamato
producido por Anabaena sp. (Lammers y Sanders-Loehr, 1982) (figura 2.1.1) y “anachelin”, un
catecolato aislado de Anabaena cylindrica (Beiderbeck et al., 2000). Existen algunas estirpes de
cianobacterias que no producen sideróforos, por lo que su mecanismo de adquisición de hierro se
basa en la utilización de los quelantes excretados al medio de otros organismos. Además, las
estirpes productoras de sideróforos también suelen ser capaces de transportar a su interior el
hierro acomplejado por quelantes producidos por otros microorganismos. De hecho, se ha
sugerido que la capacidad que tienen las cianobacterias de asimilar hierro mediante este
mecanismo es lo que les permite prevalecer sobre las algas eucariotas durante las proliferaciones
celulares (Murphy et al., 1976).
Figura 2.1.1- Estructura del sideróforo “schizokinen” de Anabaena sp. Tomado de: http://www.genaxxon.
com/images/catalogue/schizoki_fe_gr.jpg
Como los sideróforos suelen ser moléculas polares, no son capaces de atravesar la membrana,
por lo que son excretadas proteínas de transporte propias. Por ejemplo, el sistema de transporte
24
para “schizokinen” en Anabaena sp. es específico y en contra gradiente, por lo que está asociado
al consumo de ATP (Lammers y Sanders-Loehr, 1982).
Debido a la capacidad del hierro libre de catalizar la producción de radicales libres, tras su
transporte al interior celular, debe ser almacenado de forma que siga siendo utilizable pero no
tóxico. En bacterias, las proteínas encargadas de esta tarea son las bacterioferritinas (BFr) y Dps
(DNA binding proteins for starved cells) (figura 2.1.2). Las bacterioferritinas están compuestas
por 24 unidades que forman un anillo en cuyo interior pueden albergar hasta 2000 átomos de
hierro, además también pueden unir de forma no covalente grupos hemo (Andrews et al., 2006)
Las Dps están formadas por 12 unidades que pueden alojar unos 500 átomos de hierro en su
interior. Además, ésta proteína protege al ADN del daño oxidativo mediante una unión no
específica.
Figura 2.1.2.- Estructuras de las proteínas de almacenamiento de Hierro. A la izquierda la estructura
de bacterioferritina B de Pseudomonas aeruginosa (resolución: 2,10 Å) (Weeratunga et al., 2010), y a la
derecha la de Dps de Vibrio cholera (resolución: 1,67 Å) (Nocek et al., en prensa). Tomado de Protein
Data Bank (PTB).
25
2.2.- Regulación de la homeostasis del hierro. Ferric uptake regulator (Fur)
La homesostasis del hierro es mantenida en casi todos los procariotas mediante dos familias
diferentes de proteínas represoras, ambas actuando a nivel transcripcional. Las dos familias
principales de reguladores se denominan Fur, presente en la mayor parte de los microorganismos,
y DtxR (dipheria toxin repressor), que actúa como regulador en bacterias Gram-positvias con
alto contenido en G + C (Andrews et al., 2006).
El DtxR regula la adquisión del hierro, la expresión de la toxina de la diteria (tox) o la
expresión de la hemooxigenasa hmuO (Schmitt, 1997). Es muy frecuente la existencia de varios
metaloreguladores de cada familia en un mismo microorganismo. Así, por ejemplo Bacillus
subtilis o Staphylococcus aureus contienen al menos cuatro reguladores de la homeostasis de
metales, tres de los cuales son proteínas homólogas a Fur (Fur, PerR, Zur), y la cuarta es un
miembro de la familia DtxR (MntR).
Aunque Fur y DtxR poseen muy poca similitud en su estructura primaria, se ha visto que su
funcionamiento es similar, ya que ambas son represores dependientes de hierro que se unen al
ADN en forma de dímero (Andrews et al., 2006).
La proteína Fur es un polipéptido de unos 13-20 kDa que actúa como represor
transcripcional de genes regulados por hierro mediante una actividad de unión al DNA
dependiente de Fe2+ (Bagg y Neilands, 1987) Cuando el hierro no es un elemento limitante, Fur
en forma de dímero, utilizando un átomo de Fe 2+ como co-represor, se une a una secuencia
palindrómica de DNA denominada “iron box” o caja Fur, impidiendo la transcripción del gen.
Por el contrario, en escasez de hierro, Fur libera el átomo co-represor y deja de ejerce su acción
represora, de forma que quedan accesibles las zonas promotoras de los genes para que la ARN
polimerasa lleve a cabo la transcripción (Escolar et al., 1999). De hecho, se ha demostrado que la
unión del catión divalente al sitio regulador produce un cambio conformacional en el dominio Nterminal de la proteína, en el cual reside la capacidad de unión al ADN (Coy y Neilands, 1991).
26
Este modelo explicaba la acción represora de Fur, de forma que se expresaban sus genes
dianas en deficiencia de hierro. Sin embargo, existen algunos genes cuya transcripción está
reprimida en déficit ferroso, como la superóxido dismutasa o la bacterioferritina en E.coli
(Dubrac y Touati, 2000). Este hecho se pudo explicar gracias al descubrimiento en E.coli del
ARN antisentido RythB. Es un pequeño ARN de 90 nucleótidos cuya transcripción esta
reprimida por Fur. De esta forma, la represión de algunos genes observada en deficiencia de
hierro se debe a un efecto indirecto de Fur al activar la transcripción del ARN antisentido que
impide la traducción de dichos genes (Masse y Gottesman, 2002).
La secuencia consenso de unión de Fur es una secuencia palindrómica rica en A y T. Este
resultado se obtuvo mediante ensayos de protección de ADN frente a la digestión de DNasas con
Fur de E.coli, identificando una secuencia palindrómica de 19 pb que resultaba protegida (de
Lorenzo et al., 1987). Aunque era claro que Fur se unía a esta secuencia, habían resultados que
concordaban que Fur se uniera solo a esta secuencia propuesta. Por lo tanto, este modelo de caja
Fur fue reinterpretado posteriormente como una serie de, al menos, 3 repeticiones de un motivo
de 6 pb, sin importar la orientación (figura 2.2.1). El hexámero NATA/TAT parece ser la unidad
de interacción con Fur en el sitio de unión. Esto pudiera proveerle a la proteína la capacidad de
comportase como un represor específico así como un regulador más general (Escolar et al.,
1999).
Consenso
Figura 2.2.1.- Secuencia consenso de Fur de 19 pb reinterpretada como motivos “6-1-6”. Tomado de
Escolar et al., 1999.
27
Sin embargo, puede que este modelo de caja Fur no sea el que se encuentre en todos los
procariotas, ya que existen casos, como el de B. japonicum donde la secuencia reconocida por
Fur no muestra similitudes con el consenso establecido (Friedman y O’Brian, 2003)
2.3.- Estructura de Fur
El análisis de las secuencias primarias de Fur revela la existencia de regiones altamente
conservadas, como un dominio rico en Histidinas H3-5X2CX2X, característicos de esta familia, o
el motivo GXCX2-5C, presente en el extremo C-terminal. Además de estos dominios, algunos
residuos están muy conservados, como la tirosina 57 (según secuencia de Fur de E.coli), presente
en todos los homólogos, la glicina 67 o la glicina 131 conservada en prácticamente todas las
proteínas Fur (Vasil y Oschsner, 1999).
Esta proteína puede encontrarse en diversos estados de oligomerización (dímero, trímeros,
tetrámeros, etc.), como se ha observado mediante ensayos in vitro en Anabaena sp. (Hernández et
al., 2002). Este fenómeno no es extraño, ya que la oligomerización es una característica bastante
común entre proteínas de unión a ADN. Además, la proteína puede oligomerizar unida al ADN
como se observó en el acoplamiento de Fur de E.coli sobre el promotor de la aerobactina
mediante microscopia electrónica (Frechon y Le Cam, 1994).
Se ha determinado la estructura tridimensional de Fur y como ejemplo se tiene la de
Pseudomonas aeruginosa (Pohl et al., 2003) La estructura propuesta es un dímero, donde cada
monómero posee dos sitios de unión a metal, uno de unión a Zn 2+, con fines estructurales, en el
que el metal se encuentra en un entorno tetraédrico, y otro sitio regulador de unión a Fe 2+, donde
el metal está coordinado en un entorno octaédrico (figura 2.3.1)
28
Figura 2.3.1.- Representación de la estructura tridimensional del dímero de Fur de Pseudomonas
aeruginosa (Resolución 1,8 Å) (A) Vista perpendicular al eje binario cristalográfico (B) Vista sobre el eje
binario. El dominio N-terminal se representa en azul, mientras que el dominio C-terminal se representa en
verde. Los átomos de Zn2+ presentes en la estructura se representan como esferas rojas. H: hélice. S: hebra.
Tomado de Pohl et al., 2003
En la estructura se observan dos dominios diferenciados: uno amino-terminal implicado en la
unión al ADN, y otro carboxi-terminal de dimerización, donde además se sitúa el sitio de unión
del metal regulador. A pesar de que las secuencias de Fur y DtxR no muestran homología
significativa, ambos dominios de unión al ADN comparten el mismo plegamiento (D’Aquino et
al., 2005).
29
A partir de esta estructura tridimensional se realizó un modelado de la unión de la proteína al
ADN. La mejor concordancia entre los datos estructurales y los conseguidos mediante ensayos in
vitro de protección frente a la acción de DNasas, se obtenían cuando dos dímeros de Fur
interaccionaban en el surco mayor en caras opuestas de la doble hélice, provocando un cambio
conformacional del ADN (figura 2.3.2) (Pohl et al., 2003)
Figura 2.3.2.- Modelo de la unión de un dímero de la proteína Fur de Pseudomonas aeruginosa al ADN.
Tomado de Pohl et al., 2003
30
2.4.- Genes regulados por Fur
El principal grupo de genes regulados por Fur es el relacionado con el metabolismo del
hierro, como los implicados en la síntesis de sideróforos o de sus receptores. Esto constituye una
medida de ahorro además de protección frente a la entrada de péptidos tóxicos. De una forma
indirecta a través del ARN antisentido RythB, en E.coli induce la expresión de bacterioferritinas
(Masse y Gottesman, 2002). También se ha demostrado la regulación mediante Fur de proteínas
implicadas en la defensa frente al estrés oxidativo, como IsiA, la superóxido dismutasa (Masse y
Gottesman, 2002) o la catalasa-peroxidasa (Pym et al., 2001).
El aparato fotosíntetico sufre una serie de adaptaciones a la deficiencia de hierro, por lo que
no resulta raro que Fur esté involucrado en esta transformación. Este proceso se engloba dentro
de las medidas de economía del hierro en condiciones de deficiencia. Por ejemplo, el
transportador de electrones flavodoxina codificado por el gen isiB es inducido drásticamente en
condiciones de deficiencia de hierro, para sustituir a la ferredoxina en la cadena fotosintética
(Singh et al., 2003).
Una proteína Fur de Microcystis aeruginosa se ha visto que participa en la producción de
toxina microcistina (Martin-Luna et al., 2006), así como otros homológos de Fur pueden estar
involucrados en el desencadenamiento de factores de virulencia en distintas bacterias (Litwin y
Calderwood, 1993).
Una de las consecuencias de la deficiencia de hierro es la disminución en la síntesis de
proteínas y el aumento del tiempo requerido para la división celular, por lo que no resulta de
extrañar que parte de la maquinaria de transcripción, como los genes de las proteínas
ribosomales, estén reprimidos en deficiencia de hierro (Singh et al., 2003).
Además de Fur, se han identificado otras proteínas homólogas implicadas en diversas
funciones celulares, lo que ha permitido establecer hasta este momento varias subclases de la
31
familia Fur: aquellas que responden a la disponibilidad de metales, como hierro (Fur), Zinc (Zur),
Manganeso (Mur) o Níquel (Nur) o también las que responden a otros estímulos, como la
disponbilidad de hemo (Irr) o el estrés oxidativo (PerR) (Lee y Helmann, 2006). Todas estas
proteínas son represoras transcripcionales que se unen al DNA en forma de dímero.
2.5.- Fur en Anabaena sp.
En Anabaena sp. se han descrito tres secuencias homologas a Fur denominadas FurA, FurB y
FurC (Hernández et al., 2004) Sus características bioquímicas fueron estudiadas y se presenta en
resumen en la tabla 2.
Tabla 2.- Propiedades bioquímicas de las proteínas Fur de Anabaena sp. PCC 7120. Tomado de
Fillat, en prensa.
Peso
molecular
(Dalton)
ε
276
Aminoácidos
pI
#
Cys
motivos
m-1 cm-1
CXXC
#
His
Motivos ricos
de histidina
Unión
grupo
Hemo
FurA
17144
13760
149
6,8
5
2
12
H5X2CX2C
+
FurB
15116
5720
132
8,67
5
2
7
H2X2CX2C
+
FurC
17328
13490
149
5,34
3
0
6
HXHX2CX2T
-
La proteína FurA que posee la mayor homología con las Fur de enterobacterias, es el
miembro de esta familia mejor conocido en cianobacterias. Además es la más abundante en
células de Anabaena que crecen en condiciones estándares (Hernández, 2004).
La presencia de dos sitios de unión a metal, con roles reguladores y estructurales
respectivamente, es común en la familia Fur. Por lo general, es un Zinc estructural que está
coordinado por 4 cisteínas, como en el caso FurB de Mycobacterium tuberculosis (Lucarelli et
32
al.,2007). Estas cisteínas son parte de dos motivos CXXC, que están conservados en FurA de
Anabaena, pero no están involucrados en la coordinación de un ión Zinc auxiliar.
FurA está involucrada en la regulación de los genes de la toma de hierro y
almacenamiento del mismo, además de participar en la modulación de varias rutas relacionadas
con el metabolismo del nitrógeno y la homeostasis reductora (Fillat, en prensa).
La proteína de estudio en este trabajo es FurB. Ésta presenta un peso molecular
ligeramente menor que sus homólogos y tiene un punto isoeléctrico mucho mayor. Posee un
dominio de histidinas característico de la familia Fur y el dominio de cisteína en su extremo
carboxi-terminal (tabla 2). Además tiene un dominio regulador de hemo formado por la secuencia
de aminoácidos CP (Cys-Pro) y la presencia de este grupo impide la unión con el ADN (LópezGomollón et al., 2009).
Los niveles de FurB en la célula se ven afectados durante el estrés oxidativo, lo cual
aumenta la transcripción de furB unas 30 veces. La habilidad de FurB de proteger el ADN del
clivaje producido por radicales hidroxilos o DNasaI, y el incremento de supervivencia de células
de E.coli que sobre-expresa la proteína, sugiere que posiblemente ésta proteja a la célula del
ROS, evadiendo el daño al ADN mediante la unión inespecífica, actuando de forma similar a una
proteína Dps (López-Gomollón et al., 2009). FurB podría jugar un papel dual dependiendo del
nivel de expresión. En la ausencia de estrés oxidativo, la transcripción de furB es menor y el
regulador se unirá a sitios específicos del ADN. Sin embargo, bajo condiciones oxidantes el nivel
de FurB será lo suficientemente alto como para unirse de forma inespecífica al ADN y prevenir el
daño oxidativo (Fillat, en prensa).
Por último, FurC es el miembro de esta familia que posee el contenido más bajo de
histidina y a diferencia de FurA y FurB no es capaz de unir el grupo hemo (tabla 2). Se ha visto
que FurC no puede unirse por sí sola al ADN, sin embargo la presencia de FurA o FurB, activa la
habilidad de unirse a secuencias de ADN (Hernández et al., 2004). La presencia de esta proteína
entonces parece modular la actividad de los otros homólogos, aumentando la capacidad de FurA
33
de unirse al ADN y disminuyendo la actividad de unión de FurB. Sin embargo, se necesita más
investigación en esta área para conocer si esta modulación se lleva a cabo in vivo y cuáles son los
mecanismos que están involucrados. La función que tiene FurC en cianobacterias es todavía
desconocida.
34
CAPÍTULO 3
DISEÑO EXPERIMENTAL. MATERIALES Y MÉTODOS.
3.1.- Cepas utilizadas y Medios de cultivo
Las cepas utilizadas fueron E.coli DH5α de Invitrogen que contenía el plásmido pET28a(+)
de Novagen; y E.coli BL21 (E3) que fue usada para la sobre-expresión de la proteína FurB. El
medio de cultivo fue el Luria-Bertani (LB) en caldo y sólido, el cual estaba compuesto por: 10
g/L de triptona, 5 g/L de extracto de levadura, 5 g/L de NaCl, y un 1,5% de agar para el medio
sólido. También se utilizó el medio LB complementando con el antibiótico Kanamicina (LBK) a
una concentración final de 50 μg/mL.
3.2.- Clonaje
El clonaje fue realizado previamente en el laboratorio, utilizando para la amplificación de
furB
mediante
PCR
los
siguientes
cebadores:
Primer
foward:
GGAATTCCATATGAGAGCCATACGC, con un sitio de restricción para NdeI; y el Primer
Reverse: CAGTAGTTTAAGCTTTTGACTA, con un sitio de restricción para HindIII. La mezcla
de la reacción incluye 0,5 μM de cada primer, 200 μM de cada dNTP, 1,5 mM MgCl2 y 2,5
unidades de Taq DNA Polymerase (GIBCO-BRL) en un volumen final de 50 μL de PCR buffer
(20 mM Tris-HCl, pH 8.4; 50 mM KCl). Antes de la amplificación, los tubos fueron incubados a
95°C por 3 min para asegurar la completa desnaturalización de las bandas de ADN. La
amplificación se realizó por 30 ciclos de 93°C (0,5 min) para la desnaturalización, 51°C (1 min)
para hibridación y 72°C (1 min) para la elongación. Un paso final en la extensión se realizó a
35
72°C por 10 min. Luego el producto de la PCR fue clonado en el vector pET-28a(+) de Novogen
(figura 3.2.1).
Figura 3.2.1.- Estructura del plásmido pET-28a y la secuencia de la región polylinker
36
3.3.- Transformación de E.coli BL21 (DE3) con el plásmido pET-28a(+)
Aislamiento del plásmido
Las células de E.coli DH5α recombinante con el vector pET-28a se cultivaron en 10 mL de
medio LBK (5 μg/ml) toda la noche a 37°C, 180 rpm. Luego se procedió a purificar el plásmido
con el kit Genelute Plasmind Miniprep de Sigma. El ADN obtenido fue almacenado a -20°C.
Obtención de células competentes
A partir de de una colonia en agar LB de E.coli BL21 (DE3) de 18-24 h, se inoculó un vial de
10 mL de caldo LB que se incubó a 37°C, 200 rpm durante toda la noche.
Luego 1% de este cultivo se inoculó en 200 mL de caldo LB, el cual se incubó a 37°C, 200
rpm hasta alcanzar una D.O600: 0,35-0,45 (fase midlog).
Posteriormente se colocó el cultivo en hielo durante 20 min. Se centrifugó a 4000 rpm, 4°C
durante 5 min. Se desechó el sobrenadante y se resuspendió lentamente en 1-2 mL de Buffer 1
(1,47 g CaCl2; 1,42 g MgCl2; 0,32 g CH3COONa en 100 ml de H2O), hasta completar 40 mL
mezclando suavemente.
Luego se volvió a centrifugar a 4000 rpm, 4°C durante 15 min. Se desechó el sobrenadante y
se resuspendió en 4 mL de Buffer 2 estéril frío (1,47 g CaCl 2 + 15 mL glicerol en 100 mL de
H2O). Por último, las células se almacenaron en alícuotas de 200 μL a -70°C.
37
Transformación
Se añadieron 2 μL de DNA a 200 μL de células competentes recién descongeladas. Se
mezclaron suavemente y se incubaron en hielo durante 30 min.
Luego se transfirieron a baño María a 42°C durante 90 s, para ser colocadas posteriormente
en baño de hielo durante 1-2 min.
Se adicionaron 800 μL de medio LB caldo y se incubaron durante 45 min a 37°C, 180 rpm.
Por último, la mezcla de ADN y células competentes fue sembrada uniformemente en placas de
agar LBK y se incubó durante 18 horas a 37°C.
3.4.- Screening de expresión de FurB y producción de masa celular
Screening de expresión
Para comprobar la sobre-expresión de FurB en E.coli BL21 (DE3), se realizó un screening de
expresión. Para ello, se inocularon 4 colonias de BL21 (DE3) /pET28a-FurB y de BL21 (DE3),
como control, en 10 mL de caldo LBK y LB, respectivamente, a 37°C, 180 rpm, durante toda la
noche.
Seguidamente, 200 µL de estos cultivos se incubaron en 10 mL del caldo LBK y LB, a 37°C,
200 rpm, hasta D.O.600nm= 0.5. Cuando la densidad óptica fue alcanzada, los cultivos (células
recombinantes y control) fueron inducidos con Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) a 1
mM de concentración final, e incubados a 37°C, 200 rpm durante 5 horas. Por último, 1 mL de
cada muestra fue centrifugado durante 2 min y el pellet se almacenó a -20°C.
38
De este pellet se tomó 1 µL del extracto puro de las células recombinantes que se diluyó sólo
en 10 µL de H2O destilada; mientras que el resto fue resuspendido en 100 µL de agua destilada,
al igual que el pellet de las células control. 10 µL de estas muestras fueron mezclados con 3µL
de buffer muestra 6X (60 mM Tris; 6 mM EDTA; 15% SDS; 35% β-mercaptoetanol; 42%
glicerol; 0.12% azul de bromofenol). Estas mezclas fueron incubadas a 95°C durante 5 minutos.
Se cargaron 10 µL de cada mezcla en un gel de SDS/PAGE al 17% (tabla 3). La
electroforesis se llevó a cabo durante 45 min a 35 A, utilizando un buffer de corrida 5X (15 g/L
Tris; 75 g/L glicina; 5 g/L SDS) diluido hasta 1X. Luego el gel fue coloreado con Azul de
Coomassie (250 mL/L metanol; 100 mL/L ácido acético; 20 mL/L glicerol; 0.25% azul de
Coomassie) por 30 minutos y fueron decolorados durante toda la noche con la solución
decolorante (250 mL/L metanol; 100 mL/L de ácido acético; 20 mL/L glicerol).
Tabla 3.- Composición de un gel de SDS/PAGE al 17%
Componente
Gel Separador
(mL)
Gel Concentrador
(mL)
H2O
0,36
1,4
Acrilamida:Bis-acrilamida
30%
3,4
0,33
Tris-HCl 1.5 M, pH 8.8
2,24
_
Tris-HCl 0.5 M, pH 6;8
_
0,25
SDS 20%
0,030
0,010
Persulfato de Amonio (PSA)
(0.1 mg/mL)
0.020
0.010
TEMED
0.010
0.010
39
Producción de masa cellular
Se inocularon 200 mL de caldo LBK partiendo de una colonia recombinante crecida en agar
LBK. Se incubó a 37°C, 200 rpm durante toda la noche.
Seguidamente, se tomaron 10 mL para inocular cada litro de LBK (al final fueron 10 L en
total) que se incubaron a 37°C, 200 rpm hasta D.O.600nm = 0.4. Luego se bajó la temperatura y las
células se incubaron a 30°C hasta alcanzar D.O.600nm = 0.5. La producción de proteína fue
inducida con IPTG 1 mM, y se incubó a 30°C durante toda la noche a 200 rpm.
Los cultivos obtenidos fueron centrifugados a 8000 rpm, 4°C durante 10 min. El pellet fue
lavado con solución salina al 0,8%, y nuevamente centrifugado; para posteriormente ser
conservado en alícuotas de 10 g a -20°C. El proceso de sobreexpresión de la proteína FurB fue
verificado mediante la realización de una electroforesis en PAGE/SDS al 17%.
3.5.- Purificación de FurB mediante cromatografía de afinidad IMAC –Zinc (Immobilized
metal ion affinity chromatography)
Preparación de la columna
Para 10 mL de matriz Matrix Chelating Sepharose TM Fast Flow (Amersham), 10 volúmenes
de agua destilada fueron agregados para lavar la matriz a un flujo de 4 mL/min. Luego, 3
volúmenes de ZnSO4 0.25 M fueron aplicados y lavados con 5 volúmenes de agua destilada.
Finalmente, 5 volúmenes de buffer de lisis (100 mM NaH2PO4; 300 mM NaCl, pH 8) fueron
pasados a través de la columna.
40
Purificación y recuperación de la columna
El pellet almacenado fue descongelado y resuspendido en 5 volúmenes de buffer de lisis más
2 mM de PMSF. Esta solución fue sonicada en razón de 10 ciclos por 30 x 30 s.
Después, la solución fue centrifugada 2 veces durante 20 minutos a 15000 rpm y filtrada por
0.45 µm. El sobrenadante fue aplicado en la columna a un flujo de 2 mL/min y se colectó el
volumen muerto. Luego se lavó la columna con el buffer de lavado (buffer de lisis; 35 mM
glicina) hasta observar que DO280nm <0.1.
Posteriormente se aplicaron 3 volúmenes de buffer de elución (buffer de lisis; gradiente de
imidazol hasta 1 M) y se colectaron fracciones de 1 mL.
Para regenerar la columna, se agregaron 5 volúmenes de agua destilada, seguidos de otros 5
de Strip Buffer (50 mM EDTA; 500mM NaCl, pH 7) a un flujo de 3 mL/min. Luego, se pasaron
5 volúmenes de agua destilada y 5 de etanol al 20% para preservar la columna a 4°C.
Las diversas fracciones obtenidas fueron analizadas por SDS/PAGE el 17%, donde se
mezclaron 10 μL de muestra con 4 μL de buffer de muestra, para al final cargar 10 μL en el gel.
Concentración de fracciones y diálisis
Una vez analizadas las fracciones que contenían la proteína purificada, éstas fueron
concentradas en volumen final de 1,5 mL utilizando los tubos Amicon Ultra (Millipore) que
poseen un filtro de 10 kDa. Las fracciones fueron colocadas en este tubo y centrifugadas a 4500
rpm, 4°C durante 30 min, para separar FurB del resto de contaminantes de la muestra.
41
Para elimnar el Imidazol de la muestra, se realizó una diálisis donde se utilizó un buffer que
contenía: 100mM NaH2PO4, 300mM NaCl a pH 6. Se dializaron 200 μL de muestra que se
incubaron durante toda la noche en 1 L de buffer diálisis.
Concentración final de proteínas en la muestra
Para medir la concentración final de proteína obtenida, se tomó una de las muestras
resultantes del proceso de purificación y concentración, y se midió mediante el método del ácido
bicinconínico utilizando el BCA protein Kit Assay de Thermo Scientific.
Las muestras se
midieron en el espectrofotómetro Carry 100 Bio de Varian.
3.6.- Ensayo de unión al ADN (EMSA: Electrophoresis Mobility Shift Assay)
Para determinar la actividad de la proteína se realizó un ensayo de retardo en gel (EMSA).
Para ello se realizó un gel al 6% (tabla 4) que se pre-corrió a 60 V, 4°C, durante 30 min. En este
caso, se probó la proteína FurB purificada contra los promotores PfurA y PfurB, en presencia de
MnCl2 y DTT. Como control negativo se utilizó PnifJ. Las diferentes mezclas que fueron cargadas
en gel se presentan en la tabla 5.
42
Tabla 4.- Composición del gel al 6% del EMSA
Componente
Volumen
(mL)
Acrilamida/bis-acrilamida
30 %
2,06
Buffer de electroforesis 5X
(142 g/L de glicina; 30,38
g/L de Tris, pH 8,5)
1,86
Glicerol 50 %
1,4
H2O
4,86
PSA 10 %
0,008
TEMED
0,002
Tabla 5.- Mezclas utilizadas para realizar el EMSA
Pocillo
Test
MnCl2
DTT
PnifJ
Promotor
Fur A/ Fur B
mg/mL
10 mM
10 mM
(μL)
(μL)
500 nm (μL)
(μL)
(μL)
(μL)
H2 O
Binding
BSA
(μL)
Buffer
10X (μL)
1
1
PfurA
11
2
1
2
2
1
1
-
2
PfurB
11,2
2
1
2
2
1
0,8
-
3
PfurA
9,4
2
1
2
2
1
1
1,6 FurA
4
PfurB
10,4
2
1
2
2
1
0,8
0,8 FurB
5
PfurA
10,2
2
1
2
2
1
1
0,8 FurB
Binding Buffer 10X: 10 mM Tris pH 7,5; 40 mM KCl; 5 % glycerol; 0.1 mg/mL BSA
Las mezclas, que contenían un volumen final de 20 μL, fueron incubadas a temperatura
ambiente durante 20 min. Luego se les agregó 3 μL de buffer muestra (50 mM Tris-HCl pH 8;
0,25 % azul de bromofenol; 0,25 % xilencianol; 30 % glicerol) y se corrieron a 80 V a 4°C,
utilizando el buffer de electroforesis a una concentración 1X. Finalmente, para visualizar las
bandas, el gel se colocó en una solución compuesta por 50 mL del buffer de electroforesis más 10
43
μL de SYBR safe de Invitrogen, durante 30 min, con agitación y en la oscuridad. El resultado fue
analizado mediante el Gel Doc 2000 Image Analyser de Bio-Rad.
44
CAPÍTULO 4
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1.- Clonaje y Screening de expresión
En el proceso de clonaje se introdujo la secuencia de FurB en el plásmido pET-28a para
sobre-expresar esta proteína, entre los sitios de restricción NdeI y HindIII. Esto añade a la
estructura de la proteína una cola de histidina en el extremo amino-terminal (dominio de unión al
ADN), pero ésta puede ser eliminada luego mediante el tratamiento con trombina. La
transformación de E.coli BL21 (DE3) con el plásmido pET-28a se ejecutó con éxito como se
observa en la figura 4.1.1. Este procedimiento se realizó todas las veces que se inició la
producción de masa celular e inducción con IPTG.
Figura 4.1.1.- Colonias resultantes del proceso de transformación de E.coli BL21 (DE3) con el plásmido
pET-28a(+).
45
El sistema de expresión utilizado fue el del promotor T7. Éste fue descrito por primera vez
por Studier y Moffat en 1986, que diseñaron un sistema de expresión altamente selectivo para la
ARN polimerasa del bacteriófago T7. El plásmido pET está formado por el gen lacI que codifica
el represor de la proteína lac, el promotor T7 que es específico para la ARN polimerasa del T7,
un operon lac que puede bloquear la transcripción, un sitio polylinker, un origen de replicación
f1, un gen de resistencia a un antibiótico (en este caso kanamicina), y un origen de replicación
Ori.
Para iniciar el proceso de replicación, el gen de interés es clonado en la región polylinker,
tanto el promotor T7 como el operon lac están colocado en sentido 5’en relación al gen clonado.
Cuando la ARN polimerasa del T7 está presente y el operon lac no está reprimido, la
transcripción del gen procede rápidamente.
Las células procariotas no producen naturalmente esta ARN polimerasa, y ésta debe ser
añadida artificialmente. Es por eso que se utiliza la cepa de E.coli BL21 (DE3) que se ha
modificado genéticamente para incorporar el gen de la ARN polimerasa T7, el promotor lac y el
operon lac en su genoma. La inducción del promotor lac viene dado por IPTG, una molécula
análoga a la lactosa. La misma, desplaza al represor del operon lac. Como hay operones lac en
ambos genes que codifican para la polimerasa T7 y el gen de interés, el IPTG activa a ambos,
llevándose a cabo la transcripción y posterior traducción de la proteína deseada (Novagen, 2006).
El sistema pET – E.coli BL21 (DE3) es bastante poderoso, ya que al alcanzar un nivel de
inducción completo, a las pocas horas, el producto deseado puede llegar a ser más del 50% de las
proteínas totales en la célula (Unger, 1997).
Por esta razón se escogió este sistema de expresión para la proteína FurB, y las
condiciones que se utilizaron fueron determinadas anteriormente como las más eficientes. Para
verificar entonces la correcta sobre-expresión de la proteína en las células de E.coli BL21, se
realizó un screening de expresión previo a la producción de masa celular (figura 4.1.2). Como se
observa, existe una producción significativa de FurB en las células recombinante que no se
46
observó en el control, lo cual se constata en el engrosamiento de la banda de alrededor de 17 kDa
que corresponde al peso de FurB-His recombinante.
FurB
Figura 4.1.2.- Screening de expresión de FurB. P.M: Marcador de peso molecular. Carril 1: Células
recombinantes, muestra concentrada. Carril 2: Células recombinantes, muestra diluida. Carril 3: Células
Control.
Luego de verificar este resultado, se realizó un escalado del cultivo a 10 L. para así obtener
una gran cantidad de masa celular de donde se pudiera purificar FurB. En total se realizó el
proceso de producción celular 4 veces, y en cada una se recolectaron aproximadamente 40 g de
células, para un total de ~160 g, las cuales se mantuvieron a -20°C. Para comprobar si el proceso
de sobre-expresión se llevó a cabo, se realizó otro screening tomando una muestra de cada
producción de masa celular (figura 4.1.3). Allí, se demuestra que el sistema de expresión fue
efectivo y que en todas las muestras se encuentra en mayor cantidad la proteína FurB para ser
purificada posteriormente.
47
FurB
Figura 4.1.3.- Screening de expresión de las cuatro inducciones realizadas en el proceso de producción de
masa celular. P.M.: Marcador de peso molcular. Carril 1: Control negativo. Carril 2-5: las cuatro
muestras de proteína recombinante sobre-expresando FurB. Carril 6: Control positivo de FurB.
4.2.- Purificación y Concentración
El proceso de purificación se llevó a cabo a partir de las células con la proteína recombinante
FurB-His. Éstas pasaron por un proceso de lisis celular, en el cual se agregó el buffer de lisis y
PMSF para proteger a la proteína de la acción de las proteasas. La sonicación y posterior
purificación con el buffer de lisis, permite obtener un “pool” clarificado de proteínas con un alto
contenido de FurB y además este buffer permite que la proteína se mantenga en estado soluble.
Cabe destacar que a diferencia de FurA que posee 5 histidinas en su dominio His, FurB sólo
posee 2 histidinas, y por esa razón era más difícil retenerla en el proceso de purificación por
afinidad que se realizaba anteriormente, dando como resultado una baja concentración final de
proteína, en relación a la cantidad que se obtenía de FurA. Es por esto, que la clave en la
efectividad del nuevo sistema de purificación es la adición de la cola de histidina en el extremo
amino terminal en el proceso de clonaje. La cromatografía IMAC, se basa en la afinidad del
aminoácido histidina por iones metálicos en transición como el Cu2+, Zn2+, Ni2+ y el Fe3+
48
(Amersham, 1997). Esta matriz permite mantener inmóviles los iones Zn2+, utilizados en este
caso, en la columna, con lo cual se podrá retener las proteínas que presenten un grupo de
histidinas expuestas. En E.coli otras proteínas también contienen histidina, pero las que se unen
con menos afinidad se retiran con el buffer de lavado, ya que la glicina separa de la matriz
aquellas que están unidas de forma inespecífica.
Otra ventaja del proceso de purificación es el gradiente de imidazol. Este permite aislar
relativamente la proteína deseada, ya que en un principio eluirán otras proteínas que se han unido
con menor afinidad a la columna, obteniendo un producto más puro y libre de contaminantes. Es
por esto, que se realiza el análisis de las fracciones mediante una electroforesis SDS/PAGE para
determinar con exactitud en qué fracción ha eluido la proteína. Primero se realizó una
electroforesis donde se cargaron las fracciones de 5 en 5 (figura 4.2.1), de forma de determinar la
aparición de FurB. Luego se realiza otra electroforesis de estas fracciones de 1 en 1 (figura 4.2.2),
para poder seleccionar las eluciones que contengan mayor cantidad de proteína y una presencia
menor de contaminantes para concentrarlas posteriormente.
FurB
Figura 4.2.1- Electroforesis SDS/PAGE 17% de las fracciones de 5 en 5 obtenidas mediante la
cromatografía IMAC. PM: Marcador de peso molecular. El resto de los carriles corresponde al número de
la fracción que se cargó en el gel. La fracción 25 es donde eluye en mayor cantidad FurB.
49
FurB
Figura 4.2.2.- Electroforesis SDS/PAGE 17% de las fracciones de 1 en 1 obtenidas mediante la
cromatografía IMAC. PM: Marcador de peso molecular. El resto de los carriles corresponde al número de
la fracción que se cargó en el gel. Estas fracciones comprenden el rango en el que eluye FurB.
Como puede observarse en la figura 4, en la fracción 25 es donde se hace más notoria la
elución de FurB. A partir de ello, se tomó un rango de 10 fracciones alrededor de ésta, y se
analizaron para establecer cuales se tomarían para el posterior proceso de concentración. Los
resultados fueron similares en los diferentes procesos de purificación, la proteína FurB eluyó
entre las fracciones 20 y 30.
Al momento de realizar la concentración del “pool” de fracciones, se seleccionaron las que
tenían menos contaminantes y se centrifugaron en el tubo Amicon Ultra para concentrarlas en un
volumen final de 1,5 mL. Además con este procedimiento, se eliminan las proteínas con un peso
inferior a 10 kDa que pudieran estar en la muestra. Se procesaron 12 de las 16 alícuotas
almacenadas de masa celular de 10g., de las cuales sólo 8 purificaciones fueron efectivas, esto se
debe a que el método es muy susceptible a pequeños cambios en el pH o en la concentración de
los buffers.
Para verificar el resultado después de la concentración de fracciones, se realizó una
electroforesis SDS/PAGE al 17%, donde se analizaron los productos de las primeras 4
50
purificaciones (figura 4.2.3). Se puede notar que se obtiene un pool final de fracciones alto grado
de pureza y con un contenido alto de la proteína FurB. También se puede constatar la aparición
de una banda alrededor de los 34 kDa en los carriles 1, 2 y 3. Esto probablemente sea el dímero
de la proteína Fur, ya que también se realizó una electroforesis donde se cargo la muestra sin
ningún tratamiento con SDS y se observó que la forma dimérica era mayoritaria con respecto al
monómero en el producto de la purificación (resultados no mostrados).
FurB
Figura 4.2.3.- Electroforesis SDS/PAGE 17% de los productos concentrados de primeras cuatro
purificaciones mediante la cromatografía IMAC. PM: Marcador de peso molecular. El carril 1,2,3 y 4
corresponde al producto final, después de la concentración del pool de fracciones, de las primeras cuatro
purificaciones respectivamente.
Anteriormente se utilizaba para purificar FurB un lecho de heparina-sefarosa, ya que este
método es muy utilizado para proteínas que se unen al ADN. Sin embargo la unión de FurB a esta
matriz era muy pobre y se piensa que se debe a su alto punto isoeléctrico. Además posteriormente
se utilizaba un segundo paso, que era una cromatografía de intercambio iónico para aislar a la
proteína de otros contaminantes obtenidos en el primer paso. El nuevo protocolo propuesto
representa una forma más sencilla de obtener la proteína FurB purificada, ya que se realiza en un
51
solo paso y es rápido. Además se efectúa a temperatura ambiente, tiene un buen rendimiento y el
producto tiene un alto grado de pureza.
Luego de obtener la proteína purificada y concentrada, se realizó una diálisis para eliminar el
imidazol de la muestra, ya que éste puede interferir en ensayos que se quieran efectuar
posteriormente, como es el caso del EMSA, donde esta sustancia puede interferir en la actividad
proteica y en la unión con el ADN. De la misma forma, para determinar la concentración final de
proteína en la muestra, se utilizó el producto de la diálisis.
FurB pudo ser dializada a la misma concentración del buffer de lisis pero a pH 6. También se
hizo una prueba con un buffer de menor concentración de sales (20 mM NaH2PO4, 50 mM NaCl,
pH 6) pero en este caso precipitó la proteína. Se ha visto que las fuerzas iónicas afectan la
oligomerización de Fur, por esta razón la proteína podría agregar a ciertas concentraciones
(Hernández et al., 2002).
Para estimar la concentración final de FurB en la muestra, se utilizó el método del ácido
bicinconínico. Éste se basa en dos reacciones: la primera consiste en la quelación del cobre con la
proteína en un medio alcalino, conocida como la reacción de Biuret, formando un complejo azul
claro. En el segundo paso, el ácido bicinconínico reacciona con el catión reducido Cu 1+
generando una reacción púrpura coloreada intensamente resultado de la quelación de dos
moléculas de BCA con una del ión cuproso. Este método es muy sensible y exhibe una
absorbancia lineal a 562 nm con un incremento en la concentración de proteína (Thermo
Scientific, 2008).
Mediante el kit de Thermo Scientific se pudo determinar que la concentración final de FurB
fue de 17,3 μM. Y a partir de allí se determinó que se obtuvieron 3,74 mg de proteína en 12 mL,
es decir, 0,312 mg/mL. Esta concentración es 3 veces mayor a la que se obtenía anteriormente, lo
cual corrobora que este método tiene un rendimiento mayor y es más eficiente
.
52
4.3.- Ensayo de unión al ADN (EMSA)
Para medir la funcionalidad de la proteína después del proceso de purificación, se realizó un
estudio de unión al ADN (EMSA). El ensayo de retardo en gel busca analizar las interacciones
ADN/ARN y se basa en que los complejos de ADN-proteína migran de forma más lenta en un gel
de poliacrilamida no desnaturalizante que fragmentos de ADN o ARN libres (Promega, 2007).
En este caso, se utilizó DTT y Mn
2+
en el EMSA debido a que anteriores estudios
experimentales sugieren que la afinidad de la proteína por el DNA se ve favorecida en un
ambiente reductor, similar al interior celular, y con la presencia de iones metálicos divalentes, los
cuales actúan como co-represores (Hernández et al., 2004). El Mn2+ se comporta en realidad
como el sustituto del Fe2+, el cual es el co-represor in vivo, pero debido a que el hierro es muy
insoluble en pH fisiológico, se emplea con éxito el manganeso en los estudios in vitro como el
EMSA. De igual forma, se ha visto que es necesario que las cisteínas de la proteína estén
reducidas para incrementar la capacidad de unión con el ADN, y por ende se utiliza el DTT como
agente reductor.
Como control negativo en el ensayo se utilizó el promotor del gen alr1911, uno de los dos
genes de Anabaena sp PCC 7120 anotados como nifJ, y también se agregó BSA para emular el
ambiente celular en el experimento. Dada todas las condiciones, se midió la capacidad de FurB
de unirse al PfurA y a su propio promotor (figura 4.3.1). Se puede observar que la proteína no ha
perdido su actividad biológica y que se ha obtenido un producto de la purificación funcional. Esto
es importante ya que se demuestra que este método de purificación dará un resultado proteico que
podrá utilizarse para múltiples ensayos bioquímicos, de manera de indagar sobre el
funcionamiento de FurB e inclusive realizar estudios estructurales de la proteína.
También puede notarse, en el carril 4 y 5, que FurB se une más a P furA que a su mismo
promotor. No se sabe con exactitud a que se debe esto, pero no todos los genes tienen actividad
autoregulatoria, y en este caso podría ser que FurB ejerciera una regulación mayor en furA que en
su propio gen. De igual forma, en el proceso de clonaje se ha añadido una cola de histidinas
53
acompañada de otra secuencia de aminoácidos en el extremo amino terminal, el cual es el
dominio de unión al ADN. Aunque se puede notar que esta modificación de FurB no afecta la
actividad de la proteína ya que los EMSA son positivos, podría también intervenir en la
preferencia de unión a un promotor con respecto a otro.
nifJ
Figura 4.3.1.- Ensayo de retardo en gel (EMSA) de FurB contra pfurA y pfurB. Carril 1: promotor de
furA. Carril 2: Promotor furB. Carril 3: control positivo, promotor de furA con FurA. Carril 4: Promotor
de furB con FurB. Carril 5: Promotor de furA con FurB. nifJ representa el control negativo. Se utilizó una
concentración de 500 nM de FurA y FurB y 23ng de ADN.
54
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
Se puede concluir que el proceso de clonaje e inserción de la cola de histidina a la
proteína FurB, es lo que permite desarrollar este nuevo protocolo de purificación que se realiza
en un solo paso. Además la cromatografía IMAC se presenta como un método sencillo, rápido y
la proteína obtenida tiene un alto grado de pureza. Como resultado se obtuvo 0,312 mg/mL de
FurB, tres veces más al obtenido en los anteriores protocolos de purificación, corroborando que
este sistema tiene un mayor rendimiento. De igual forma, el producto de la purificación es
funcional, pudiendo utilizarse para realizar ensayos bioquímicos y estructurales que permitan
elucidar la función de esta proteína dentro de la célula.
Se recomienda que para cristalizar la proteína FurB, se realice una segunda cromatografía
de exclusión molecular, ya que de esta forma se podría separar monómeros de dímeros presentes
en el producto de purificación, y así obtener una muestra homogénea para el proceso de
cristalización y posterior estudio de la estructura tridimensional de la proteína.
55
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