necrosis hematopoyética epizoótica

CAPÍTULO 2.1.1.
NECROSIS HEMATOPOYÉTICA EPIZOÓTICA
1. DEFINICIÓN DE LA ENFERMEDAD
A los efectos de este capítulo, se considera que la necrosis hematopoyética epizoótica es una infección
sistémica clínica o subclínica de peces con aletas producida por el virus de la necrosis hematopoyética
epizoótica (EHNV).
2. INFORMACIÓN SOBRE EL DISEÑO DE PROGRAMAS DE VIGILANCIA
a)
Factores del agente
• Agente etiológico y cepas del agente
El EHNV es un miembro del género Ranavirus de la familia Iridoviridae cuya especie tipo es el
virus 3 de la rana (Frog virus 3, FV3) (7). Otras especies son el virus de Bohle (BIV), el virus
del bagre (ECV), el virus del siluro europeo (ESV) y el ranavirus de Santee-Cooper. Debe
tenerse cuidado al hablar del ECV y del ESV como dos virus independientes, pues la literatura
científica indica que son aislamientos de un mismo virus (17). En este género existen muchas
otras especies probables. Se han aislado ranavirus de ranas sanas o enfermas, de salamandras y
de reptiles en América, Europa y Australia (8, 10, 12, 18, 29, 38, 39). Los ranavirus tienen
viriones icosaédricos grandes (150.180 nm), un genoma con ADN bicatenario de 150-170 kb,
y se replican tanto en el núcleo como en el citoplasma, con ensamblaje citoplásmico (7). Estos
virus poseen antígenos comunes que pueden detectarse mediante enzimoinmunoensayos
(ELISA) e inmunofluorescencia, pero no se han producido anticuerpos neutralizantes eficaces
que puedan ayudar a la identificación.
Desde el reconocimiento en 1986 de que esta enfermedad se debía en Australia al EHNV, se
han descrito síndromes similares por iridovirus necrotizantes en peces de piscifactorías. Entre
éstos se incluyen el bagre (Ictalurus melas) en Francia (ECV) (26), el siluro (Silurus glanis) en
Alemania (ESV) (2, 3), el rodaballo (Scophthalmus maximus) en Dinamarca (5) y otros peces en
Finlandia (4, 31).
El EHNV y el ECV son virus distintos, que se pueden diferenciar mediante análisis genómico
(1, 17, 23-25). Esto permite la separación epidemiológica de casos de la enfermedad en peces
con aletas de Australia (EHNV) y de Europa (ECV) y la diferenciación de éstos de los
ranavirus que afectan a ranas (FV3 y BIV).
• Supervivencia fuera del hospedador (es decir, en el medio natural): el EHNV es muy resistente
a la sequedad y en agua puede sobrevivir durante meses. Puede persistir en tejidos congelados
de peces durante más de dos 2 años (19) y en peces muertos congelados por al menos un año
(33). Por estas razones se supone que el EHNV puede perdurar durante meses o años en el
agua y los sedimentos de una piscifactoría, así como en las plantas y el material asociado al
equipo.
• Estabilidad del agente: el EHNV es sensible al etanol al 70%, a concentraciones de
200 mg/litro de hipoclorito sódico o a un calentamiento de 60ºC durante 15 minutos (19).
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Capítulo 2.1.1. — Necrosis hematopoyética epizoótica
b)
Factores del hospedador
• Especies hospedadoras susceptibles: solo se conocen infecciones naturales por EHNV en dos
especies de teleósteos, la perca (Perca fluviatilis) y la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) (20-22),
pero otras especies de peces con aletas son susceptibles de infecciones experimentales por el
EHNV. Individuos de las siguientes especies murieron tras su inoculación en masa: perca
Macquarie (Macquaria australasica), perca plateada (Bidyanus bidyanus), gambusia (Gambusia affinis)
y Galaxias olidus. Basándose en estos resultados, se puede considerar al EHNV como un
patógeno indiscriminado.
• Fases susceptibles del hospedador: todas las edades en la trucha arco iris y en la perca.
• Especies o subpoblaciones predilectas (probabilidad de detección): normalmente los síntomas
clínicos son más evidentes en peces pequeños menores de un año y en las formas juveniles de
la trucha arco iris y de la perca.
• Órganos diana y tejidos infectados: hígado, riñón, bazo y otros tejidos parenquimatosos. No
conoce si el EHNV puede detectarse en el tejido de las gónadas, en el fluido ovárico o en el
fluido espermático, ni si estos tejidos son adecuados para la vigilancia de los reproductores.
• Infecciones persistentes con portadores asintomáticos
Trucha arco iris: En la trucha arco iris, la elevada mortalidad de los casos y la baja prevalencia de
la infección por el EHNV implica que la tasa de incorporación de portadores es
probablemente muy baja (< 2%) (34). En un alevín de trucha arco iris clínicamente sano se
detectó una infección persistente con un número muy pequeño de viriones infecciosos a los
63 días de una inoculación intraperitoneal (35), pero la significación de esta observación no
está clara debido a la ruta artificial de inoculación. El EHNV se ha encontrado en peces
cultivados, pero como presentaban lesiones histológicas debidas a EHNV, su presencia se
considera como una infección activa más bien que como debida a un estado de portador (36).
Se han examinado muy pocas muestras de reproductores como para estar seguros de que los
reproductores no están infectados (34). Durante, o después de un brote, se detectaron
anticuerpos contra el EHNV en el suero de una pequeña proporción de peces cultivados de
1+ a 2+, pero no en crías pequeñas 0+; sin embargo, resulta dudoso saber si éstos fueron
supervivientes del brote (34, 36) o si estaban infectados por otro ranavirus menos virulento.
Perca: Esta especie es muy susceptible al EHNV y parece improbable que constituya un
reservorio como hospedador adecuado (35). Sin embargo, hay algunas evidencias
contradictorias. El EHNV o un ranavirus relacionado se aisló en 2 de 40 percas adultas y
aparentemente sanas durante una epizootia en peces juveniles en Victoria (20), pero como el
período de incubación se extiende hasta 28 días (35), estos peces podrían haber estado en fase
preclínica. En Victoria se han obtenido varios aislamientos de ranavirus en la perca en épocas
en las que no había ninguna epizootia evidente, y algunos ejemplares aparentemente sanos
mostraron anticuerpos séricos contra el EHNV o un virus relacionado (datos no publicados).
Bacalao Murray: Esta especie puede ser un portador adecuado ya que, tras una inoculación en
masa, tuvo lugar una infección sin enfermedad (19).
• Vectores: como el EHNV es un virus resistente, se puede transferir por redes, botes y otros
equipos, o por peces usados como cebo en la pesca recreativa. Las aves son vectores
mecánicos potenciales para el HENV, transportándolo en el intestino, en las plumas, en las
patas y en el pico. Las gaviotas plateadas (Larus novaehollandiae) y el gran cormorán
(Phalacrocorax carbo) se alimentan de formas juveniles infectadas de percas de aleta roja, y el
contenido gastrointestinal de estas aves fue positivo para el EHNV por técnicas ELISA y por
la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (33). Es probable que el virus resulte inactivado a
la temperatura corporal típica de las aves (40-44ºC), pero es posible una dispersión del EHNV
por regurgitación del material ingerido a las pocas horas de alimentarse (33).
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Capítulo 2.1.1. — Necrosis hematopoyética epizoótica
c)
Patrón de la enfermedad
• Ocurrencia y mecanismos de transmisión
Trucha arco iris: Con muy bajas frecuencias de mortalidad, la enfermedad es generalmente difícil
de identificar. Las epidemias naturales parecen estar relacionadas con una cría descuidada,
particularmente con alta densidad de población, un flujo inapropiado de agua y contaminación
de los tanques con alimentos. Los parámetros de calidad del agua son sub-óptimos y son
comunes otras enfermedades intercurrentes, como enfermedades de la piel causadas por
protozoos, hongos e infecciones sistémicas bacterianas. El daño epidérmico puede suponer
una vía de entrada para el EHNV. Se han detectado epidemias en piscifactorías cuyas
temperaturas del agua oscilan entre 11 y 20ºC (34, 36). El período de incubación tras
inoculación intraperitoneal fue de 3-10 días a 19-21ºC, y de 14-32 días a 8-10ºC (35).
El EHNV se ha extendido entre las piscifactorías de trucha arco iris con los pequeños peces
de siembra y probablemente por el agua de transporte (21, 34, 36). Se supone que las remesas
de peces contienen una baja proporción de individuos con infecciones clínicas o subclínicas
progresivas, más bien que peces portadores. La baja prevalencia de la infección en la trucha
arco iris significa que la infección activa puede pasar fácilmente desapercibida en una
población y extenderse debido al comercio pesquero. No existen datos sobre la posible
transmisión vertical del EHNV al interior de los huevos o sobre su superficie, ni se han
evaluado protocolos de desinfección de huevos. Aún no se ha aislado el EHNV de tejidos
ováricos o de reproductores, por lo que el fluido espermático o el ovárico pueden no ser las
muestras adecuadas para demostrar la ausencia del EHNV.
Perca: La enfermedad se reconoce por la espectacular mortalidad epizoótica en peces de
cualquier edad, afectando a una gran proporción de la población. Típicamente, se infectan las
formas infantiles y juveniles, pero en áreas infectadas por primera vez también afecta a los
adultos. Cuando la enfermedad se reconoce por vez primera en un área existe un notable
descenso de población (20, 22, 23). Las epizootias naturales de EHNV que afectan a la perca
juvenil y adulta ocurren principalmente en el verano (20, 22, 34). Se supone que en las formas
juveniles la enfermedad está relacionada con la aparición anual de gran número de peces
jóvenes no inmunes y su subsiguiente exposición al virus mientras se desarrollan en aguas
poco profundas; raramente estos brotes incluyen a los peces adultos. Es posible que la
temperatura ambiental sea el factor que dispara los brotes cuando las formas juveniles de los
peces se alimentan de la fauna planctónica en aguas superficiales calientes, mientras los adultos
se alimentan de invertebrados bentónicos y presas de mayor tamaño en aguas profundas y más
frías (35). El período de incubación en condiciones experimentales varió de 10 a 28 días a 12–
18ºC, en comparación con los 10-11 días a 19–21ºC, y las percas adultas fueron resistentes a la
infección a temperaturas por debajo de 12ºC (35).
La existencia del EHNV en percas de sistemas fluviales muy alejados o en aguas confinadas
separadas, y su progresión aguas arriba, indica que el EHNV se extiende por otros medios
además de por el agua. Las migraciones de la perca en Australia son inciertas (ver también los
vectores). La recurrencia anual en las percas de piscifactorías se ha debido a la reinfección de
lotes sucesivos de peces a base de percas silvestres presentes en una misma área de aporte.
• Prevalencia
Trucha arco iris: El EHNV se ha descrito con más frecuencia en formas juveniles de longitud
menor de 125 mm, con una mortalidad diaria por debajo del 0.2% y una mortalidad total de
hasta el 4%. Sin embargo la trucha arco iris puede ser susceptible en todas las edades, aunque
todavía no se ha visto la infección en reproductores (34, 36). Durante los brotes, el EHNV se
ha detectado por aislamiento de virus en 60-80% de los peces moribundos o muertos, pero
solamente en 0-4% de los peces clínicamente sanos en contacto con ellos. Con un nivel de
confianza del 99%, los límites para la prevalencia de infecciones subclínicas son de 0-8%
basados en muestras de 150 peces. Tras un brote, el virus no pudo encontrarse en absoluto en
los peces supervivientes. Parece, por lo tanto, que el EHNV es muy poco infeccioso pero que
tiene un alto índice de mortalidad. Se han detectado anticuerpos contra el EHNV en peces
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Capítulo 2.1.1. — Necrosis hematopoyética epizoótica
cultivados a baja prevalencia (0,7%, límites de confianza al 95%, 0,02-3,7%). El EHNV puede
estar presente en una piscifactoría sin causar sospechas porque la tasa de mortalidad puede no
superar la tasa normal de muerte de fondo.
Perca: La enfermedad se reconoce por la mortalidad epizoótica en peces de cualquier edad y
afectando a una gran proporción de la población, con notable descenso de la misma (20, 22,
33).Típicamente, en áreas endémicas resultan afectadas las formas de alevines y juveniles de los
peces, pero en áreas infectadas por vez primera también se infectan los adultos.
• Distribución geográfica
Trucha arco iris: La infección con el EHNV solo se conoce en piscifactorías localizadas en
embalses de los ríos Murrumbidgee y Shoalhaven en Nueva Gales del Sur, Australia. Algunas
instalaciones dentro de esta región han permanecido indemnes a la enfermedad (36).
Perca: El EHNV es endémico en el sudeste de Australia, pero tiene una distribución
discontinua. La enfermedad ocurre en muchos depósitos grandes y pequeños de agua
embalsada en Victoria, y desde 1986 se ha extendido progresivamente aguas arriba por el
embalse del río Murrumbidgee a través de Nueva Gales del Sur y el territorio de la capital
australiana. Se ha observado una dispersión similar en el río Murray en el sur de Australia (33).
• Mortalidad y morbilidad
Hay diferencias llamativas entre la susceptibilidad de la perca y la de la trucha arco iris al
EHNV que se reflejan en la prevalencia de la mortalidad y de la morbilidad. La perca es muy
susceptible al EHNV. La inoculación experimental en masa con tan solo 0,08 TCID50/ml
(dosis infectiva del 50% en cultivo de tejidos) fue letal, y dosis demasiado bajas para ser
detectadas por aislamiento del virus en células BF-2 fueron mortales por inoculación
intraperitoneal (35). En contraste, y respecto al patrón natural de la enfermedad, la trucha arco
iris fue resistente a la exposición en masa con 102.2 TCID50/ml (35) mientras que por
inoculación en masa durante 1 hora con 103 TCID50/ml solo 1 de cada 7 ejemplares resultó
infectado (21). Estos hallazgos, con observaciones de campo, sugieren una baja infectividad
con una elevada tasa de mortalidad para la trucha arco iris y una alta infectividad con una
elevada tasa de mortalidad para la perca.
• Impacto económico/ productivo de la enfermedad
Trucha arco iris: Debido a la escasa tasa de mortalidad existe un bajo impacto económico
directo.
Perca: Hay una mortalidad epizoótica espectacular que afecta a una proporción muy importante
de la población y que conlleva la pérdida de la piscifactoría durante años (20, 22, 33).
d)
Control y prevención
• Vacunación: ninguna disponible
• Quimioterapia: ninguna disponible
• Inmunoestimulación: no probada
• Producción de resistentes: no probada
• Repoblación con especies resistentes: no probada
• Agentes bloqueadores: no probados
• Prácticas generales de manejo: el control de la enfermedad en la trucha arco iris depende de la
reducción del impacto de la infección manteniendo bajas tasas de animales y una adecuada
calidad del agua. El mecanismo de protección puede actuar a través del mantenimiento de una
piel sana.
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Capítulo 2.1.1. — Necrosis hematopoyética epizoótica
3. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO
a)
Métodos de diagnóstico de campo
• Síntomas clínicos: no hay síntomas clínicos específicos. Se encuentran peces muertos. Los
peces moribundos pueden manifestar pérdida de equilibrio, erupciones en los opérculos y
pueden ser de color oscuro. Puede haber evidencia clínica de prácticas de cría de mala calidad,
como superpoblación y calidad sub-óptima de agua, lo que se manifiesta en lesiones de la piel,
aletas y branquias (27).
b)
Métodos clínicos
• Lesiones macroscópicas: puede que no existan lesiones claras o que existan lesiones
inespecíficas en la piel, aletas y branquias. Una pequeña proporción de peces puede mostrar
inflamación del riñón, hígado o bazo. Puede haber lesiones focales blancas o amarillentas en el
hígado, que corresponden a áreas con necrosis (27).
• Lesiones microscópicas: en cortes de material fijado con formalina, teñidos rutinariamente con
hematoxilina y eosina, con frecuencia se observa en el hígado, el riñón y el bazo
hematopoyéticos una necrosis aguda focal, multifocal o localmente extendida, de coagulación
o necrosis por licuefacción. Se puede ver, particularmente en las zonas cercanas que rodean las
áreas necróticas del hígado y del riñón, un pequeño número de cuerpos de inclusión basóficos
intracitoplásmicos. También se pueden ver lesiones necróticas en el corazón, páncreas, tracto
gastrointestinal, branquias y seudobranquias (27).
• Citopatología por microscopía electrónica: los tejidos afectados (como riñón, hígado y bazo)
contienen células que exhiben necrosis. Las células contienen destacadas inclusiones
citoplásmicas que son áreas del citoplasma donde los virus se ensamblan. Dentro del
citoplasma aparecen agregados (en disposición paracristalina) de grandes virus icosaédricos sin
envuelta (175 nm + 6 nm); también están presentes virus aislados. Los virus completos
(conteniendo nucleoides densos a los electrones) salen por gemación de las células infectadas a
través de la membrana citoplásmica. Con frecuencia, el núcleo de las células infectadas se
localiza en disposición periférica y su forma está distorsionada.
c)
Métodos de detección e identificación del agente
• Métodos de detección directa
i)
Métodos microscópicos
• Microscopía óptica
Cortes fijados: para evidenciar la necrosis del tejido y los cuerpos de inclusión
basófilos intracitoplásmicos se pueden usar métodos de rutina como la fijación del
tejido en formalina neutra tamponada al 10%, inclusión en parafina, preparación de
cortes de 10 μm y tinción con hematoxilina y eosina. Estos cuerpos de inclusión son
indicativos pero no confirmativos de la presencia del EHNV. Los cortes finos fijados
con formalina y embebidos en parafina también se pueden teñir para identificar el
antígeno de EHNV asociado con las lesiones necróticas usando un método de
inmunoperoxidasa (ver más adelante).
• Microscopía electrónica
Cortes ultrafinos: para demostrar la necrosis tisular, la presencia de virus y los cuerpos
de inclusión víricos, se pueden utilizar métodos ordinarios en la preparación de
cultivos de tejidos y cultivos celulares (11). Los tejidos y células fijadas con una
fijación alternativa y otro sistema de inclusión pueden emplearse para la detección de
antígeno (15).
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Capítulo 2.1.1. — Necrosis hematopoyética epizoótica
Microscopía electrónica de contraste negativo: para detectar virus se pueden usar los
sobrenadantes de tejidos homogeneizados (10% [p/v]). Los ranavirus tienen un
aspecto distintivo. Varían en diámetro (150-180 nm), tienen una envuelta limitante
derivada de la célula (membrana plasmática) que rodea una cápsida con simetría
distorsionada. Por debajo de la cápsida hay una membrana sintetizada de novo
rodeando un nucleoide que contiene el ADN bicatenario y proteínas minoritarias.
Estas preparaciones también pueden usarse para confirmar la antigenicidad de los
ranavirus (11).
ii)
Aislamiento e identificación del agente
• Preparación de tejidos de peces para aislamiento de virus y para ELISA
Se ha validado un método simple de preparación de tejidos de peces para cultivo
celular y para ELISA (37).
i)
Se bañan los peces grandes en etanol al 70% durante 30 segundos; se bañan los
peces pequeños en etanol al 70% durante 5 segundos, luego se lavan en agua
destilada. Se realiza la disección aséptica de los peces en una cabina de
bioseguridad de Clase II.
Peces grandes: se extrae 0,1 g de hígado, riñón, bazo (+ otros órganos en
situaciones específicas) y se coloca en tubos estériles (ET). Se pueden obtener
tubos eppendorf azules # 3032-877 de Edwards Instrument Co., que son tubos
estériles adecuados para utilizarlos con morteros de moler tejidos (ver más
adelante). En algunas situaciones el hígado, el riñón y el bazo se pueden juntar en
un único ET.
Peces medianos (30-60 mm de longitud): se pasan todas las vísceras al tubo.
Peces pequeños (< 30 mm de longitud): se eliminan la cabeza y la cola, y se
coloca el resto del pez en el tubo.
ii)
Se congelan los tubos con los tejidos a –80ºC hasta que se necesiten.
iii) Se añade a cada tubo 0,5 ml de medio de homogeneización (Medio Mínimo
Esencial de Eagle, con sales de Earle más glutamina [Laboratorios Flow] [MEM]
suplementado con 200 UI/ml de penicilina, 200 μg/ml de estreptomicina y
4 μg/ml de anfotericina B). Se homogeneiza el tejido en los tubos con un émbolo
adecuado estéril hasta formar una fina mezcla (los émbolos para homogeneizar
precipitados Kontes pueden lavarse, autoclavarse y volverse a utilizar, Edwards
Instrument Co., Cat # K749520-000).
iv) Se añade otro 0,5 ml de medio de homogeneización a cada tubo y se mezcla con
el émbolo.
v)
Se añaden tres bolas de vidrio estériles a cada tubo (3 mm de diámetro, Selby #
219958), y se cierra la tapa del ET.
vi) Se coloca la suspensión en un agitador vórtex potente durante 20–30 segundos y
se deja a 4ºC durante 2 horas.
vii) Se vuelve a colocar como antes la suspensión en un agitador vórtex y se
centrifuga durante 10 minutos a 2.500 g en una microcentrífuga de sobremesa.
viii) Se transfiere el sobrenadante, ahora denominado homogeneizado tisular
clarificado, a un nuevo ET. Los homogeneizados se pueden congelar a –80ºC
hasta que se requieran para aislamiento del virus y pruebas ELISA.
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Capítulo 2.1.1. — Necrosis hematopoyética epizoótica
• Cultivo celular / medios artificiales
El cultivo celular es la mejor prueba (prueba de referencia) pero es cara y de larga
duración. El EHNV crece bien en muchas líneas celulares de peces, como la BF-2
(línea celular de alevín de mojarra oreja azul; ATCC CCL 91), FHM (de carpita
cabezona; ATCC CCL 42), EPC (epithelioma papulosum cyprini [13]), y CHSE-214 (línea
celular de embrión del salmón real; ATCC CRL 1681), a temperaturas que varían de
15 a 22ºC (9) pero la BF-2 es la preferida por los laboratorios de referencia utilizando
una temperatura de incubación de 22ºC tanto antes como después de la inoculación
con el virus. El procedimiento para las células BF-2 se detalla más adelante. Se
presenta también más adelante un procedimiento para células CHSE-214 teñidas con
inmunoperoxidasa.
La identidad de los virus en cultivo celular se determina por inmunotinción, ELISA,
inmunomicroscopía electrónica, PCR u otros métodos.
Muestras: homogeneizados de tejidos.
Procedimiento técnico del cultivo celular: las células se cultivan en tubos con 2 ml de
medio de crecimiento (MEM + 10% de suero fetal bovino (FCS) con 100 UI/ml de
penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina y 2 μg/ml de anfotericina B). Las células se
incuban a 22ºC hasta que estén casi confluentes, lo que puede tardar hasta 4 días
dependiendo de la dosis de siembra. El día de la inoculación se cambia el medio a un
medio de mantenimiento (MEM con 2% FCS y 100 UI/ml de penicilina, 100 μg/ml
de estreptomicina y 2 μg/ml de anfotericina B). Utilizando medio de
homogeneización, se hace una dilución 1/10 de los homogeneizados, juntos o por
separado. Cada tubo de cultivo se inocula con 200 μl de muestra. Un tubo se inocula
con homogeneizado sin diluir y dos tubos con el homogeneizado a 1/10. No se
requiere paso de adsorción. Como los tubos de cultivo contienen 2 ml de medio, el
inóculo de 1/10 representa una dilución 1/100 de un homogeneizado tisular de
0,1 g/ml. Como alternativa, se pueden inocular dos o tres tubos directamente con
20 μl de homogeneizado sin diluir. Téngase en cuenta que el uso de grandes
volúmenes de inóculo sin diluir (200 μl) a menudo se acompaña de elevada toxicidad
celular o contaminación, y que por tanto el método simple puede ser preferible. Los
tubos se incuban en una estufa a 22ºC durante 6 días y se leen al día 3 y al día 6. Los
tubos se comprueban al menos una vez para detectar muestras con bajos niveles de
virus. Al día 6, los tubos primarios (P1) se congelan a –20ºC durante toda la noche, se
descongelan mezclando suavemente el contenido, y a continuación se inoculan 100 μl
del sobrenadante del cultivo en un tubo nuevo (P2). El resto de los sobrenadantes P1
se transfiere a tubos estériles de 5 ml y se mantienen a 4ºC para pruebas ELISA (a fin
de confirmar que la causa del efecto citopático [ECP] de debe al EHNV). P2 se incuba
de modo similar y se realiza un tercer paso si es necesario.
Interpretación de los resultados:
• El ECP está bien desarrollado y consiste en lisis focal rodeada por células
granulosas redondeadas. Este cambio se extiende rápidamente hasta afectar a toda
la monocapa, que se separa del soporte y se desintegra.
• Métodos de detección del antígeno basados en anticuerpos
Debe advertirse que los anticuerpos utilizados en todos los métodos relacionados
(inmunoperoxidasa, ELISA de captura de antígeno e inmunomicroscopía electrónica)
presentan reacción cruzada con todos los ranavirus conocidos (17).
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Capítulo 2.1.1. — Necrosis hematopoyética epizoótica
Detección de EHNV de cultivos infectados usando inmunoperoxidasa
Principio de la prueba: El EHNV se replica dentro de las células cultivadas. La adición
de un detergente suave permeabiliza las células permitiendo que un anticuerpo de
conejo purificado se una por afinidad a las proteínas víricas intracelulares. El EHNV
se detecta por un anticuerpo anti-conejo marcado biotinado y un conjugado a base de
estreptavidina-peroxidasa. La adición de un substrato resulta en una coloración rojiza
de las áreas marcadas con los anticuerpos.
Muestra: homogeneizados de tejido.
Características operativas: cuando se realiza este protocolo del modo descrito, la
tinción es destacada y específica. Sin embargo la prueba no ha sido validada con
respecto a su sensibilidad o reproducibilidad.
Preparación de las células: el procedimiento que se describe a continuación es para
células CHSE-214. También se pueden utilizar otras líneas celulares recomendadas.
i)
Para CHSE-214, el día antes de su uso se siembran placas de 24 pocillos con
250.000 células por pocillo (o 4 millones de células en 40 ml de medio de
crecimiento por placa) en 1,5 ml de medio de crecimiento (MEM de Earle con
aminoácidos no esenciales [EMEM], 10% de FCS, 10 mM de HEPES, 2 mM de
glutamina, 100 UI de penicilina y 100 μg de estreptomicina) y se incuba durante
toda la noche a 22ºC en 5% de CO2 (Nota: los cultivos deben estar casi
confluentes y contener antes de uso células sanas en división)
ii)
Se elimina el medio, se inocula cada pocillo con 150 μl de una suspensión del
tejido homogeneizado (hígado, riñón o bazo), se incuba durante 1 hora a 22ºC y
luego se añade 1,5 ml de medio fresco de mantenimiento (como el medio de
crecimiento excepto que contiene 2% de FCS), y se devuelve a la estufa (22ºC).
iii) Se observan los cultivos para ECP. Si al cabo de 10 días no hay ECP, se pasan los
cultivos a células CHSE frescas recogiendo las células y el medio y añadiendo
150 μl a las células de la nueva placa; adviértase que las células no se congelan y
descongelan. No hay necesidad de eliminar el medio existente, solamente se
devuelve la placa a la estufa (22ºC). De nuevo se observa diariamente el ECP.
iv) Cuando se observa primeramente el ECP se fijan las células (50 μl de una
solución de formalina al 20%). Después de incubar por 1 hora a temperatura
ambiente, se elimina la mezcla de medio y solución de formalina y los pocillos se
lavan dos veces con PBSA (solución salina tamponada con fosfato) para eliminar
la formalina. Si las placas se van a guardar a 4ºC se añade más PBSA.
Protocolo
i)
Se diluye el anticuerpo primario anti-EHNV y el suero normal con una solución
de 1% de leche desnatada en PBSA (SM) a las concentraciones indicadas en el
prospecto del agente relevante y hasta el volumen requerido para la prueba.
ii)
Se retira el PBSA de los pocillos (con cultivos celulares fijados) y se lavan los
pocillos dos veces con 0,05% (v/v) de Tween 20 en PBS (PBST). Se añaden
50 μl de soluciones del anticuerpo primario a cada pocillo de una placa de
96 pocillos o 200 μl en una placa de 24 pocillos. Se incuba durante 15-30 minutos
en un agitador de placas a 100–200 rpm a temperatura ambiente (22–24ºC), o sin
agitación a 37ºC durante 1 hora.
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
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Capítulo 2.1.1. — Necrosis hematopoyética epizoótica
iii) Se diluye el suero anti-conejo biotinado (anticuerpo secundario) al 0,1% con
solución SM como se indica en el prospecto del revelador hasta el volumen
requerido para la prueba.
iv) Se elimina la solución de anticuerpo primario y se lavan los pocillos tres veces
con PBST. Se añade el anticuerpo secundario a todos los pocillos. Se incuba a
temperatura ambiente en un agitador de placas a 100-200 rpm durante 15–
30 minutos, o sin agitación durante 1 hora.
v)
Se diluye el conjugado estreptavidina-peroxidasa en solución SM al 0,1% como se
indica en el prospecto del revelador hasta el volumen requerido para la prueba.
vi) Se eliminan los anticuerpos secundarios de los pocillos y se lavan los mismos tres
veces con PBST. Se añade el conjugado a cada pocillo. Se incuba a temperatura
ambiente en un agitador de placas a 100-200 rpm durante 15-30 minutos, o sin
agitación durante 1 hora.
vii) Preparación de la solución madre del substrato 3-amino-9-etilcarbazol (AEC): se
disuelve una tableta de AEC (20 mg) en 2,5 ml de dimetil formamida. La
solución se diluye después 1/10 en 45 ml de tampón acetato 0,05 M (4,1 ml de
acetato sódico anhidro en 1 litro de agua desionizada; el pH se ajusta a 5,0 con
ácido acético glacial).
viii) Se elimina el conjugado de los pocillos. Se lava (tres veces) con PBST.
ix) Se diluye el stock de AEC en 47,5 ml de tampón acetato. Inmediatamente antes
de su uso, se añaden 25 μl de peróxido de hidrógeno al 30% a la solución de
AEC, y luego se añade a cada pocillo. Se incuba a temperatura ambiente durante
20 minutos.
x)
Se elimina la solución de substrato y se lavan los pocillos dos veces con agua
desionizada para detener la reacción.
xi) Se da coloración de contraste durante 1 minuto con hematoxilina de Mayer (50 o
200 μl/pocillo) y se lava con agua desionizada.
xii) Se añaden 50 μl de agua de grifo de Scott, se lava con agua desionizada y se seca
al aire.
Interpretación de los resultados:
• Reacción positiva: una tinción granular, focal y rojiza de las células indica la presencia
de virus identificado por el anticuerpo de diagnóstico.
• Reacción negativa: no aparece tinción rojiza y todas las células deben estar teñidas de
azul pálido debido a la coloración de contraste.
• Tinción de fondo: puede ocurrir una tinción de color rosa pálido no granular, no focal
y más generalizada por todo el cultivo. Esta tinción de fondo puede ser debida a
muchas razones, por ejemplo a una reacción inespecífica del anticuerpo con
componentes no víricos, a un lavado ineficaz o a la caducidad de otros reactivos.
Detección del EHNV mediante ELISA de captura de antígeno
La prueba ELISA de captura de antígeno ha sido validada para detectar EHNV en
cultivos celulares y directamente en los homogeneizados tisulares de peces. La
sensibilidad analítica es 103–104 TCID50/ml. La especificidad está próxima al 100% y
la sensibilidad para la detección directa en tejidos de peces es del 60% respecto a la
preuba de referencia de aislamiento de los virus en células BF-2 (16, 37) (datos no
publicados). La prueba ELISA se usa tanto para diagnosis como para certificación. Las
96
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
Capítulo 2.1.1. — Necrosis hematopoyética epizoótica
pruebas de neutralización no pueden emplearse para identificar el EHNV porque tras
la inmunización de mamíferos o peces no se producen anticuerpos neutralizantes. Los
anticuerpos monoclonales de ratón producidos contra el EHNV se dirigen contra
epítopos de la proteína mayor de la cápsida (MCP) y son no neutralizantes (datos no
publicados). Se han desarrollado anticuerpos de conejo anti-EHNV para uso en
ELISA de captura de antígeno, tinción con inmunoperoxidasa e inmunomicroscopía
electrónica (14, 16, 27). Los reactivos y los protocolos están disponibles en el
laboratorio de referencia.
Muestras: muestras de homogeneizados tisulares preparados según un protocolo
validado (ver más adelante); cultivos celulares.
Principio de la prueba: las partículas de EHNV se capturan de la muestra mediante un
anticuerpo de conejo purificado por afinidad que está unido a la placa. El EHNV se
detecta con un segundo anticuerpo y un conjugado marcado con peroxidasa
empleando el cromógeno ABTS (ácido 2,2´-azino-di (3-etil-benzatiazolina)-6
sulfónico). El enzima se inactiva a los 20 minutos y los resultados de la densidad
óptica (DO) se comparan con los estándares.
Características operativas: el protocolo se basa en procedimientos publicados (16, 30,
32, 37). Cuando se realiza como se describe en este protocolo, las características
operativas de la prueba son las que se indican en el cuadro 1. Si se sigue el
procedimiento de normalización recomendado, la precisión del ensayo tiene un CV
(coeficiente de variación) <10% medido como variación en la DO de los controles
entre placas a lo largo del tiempo,
Cuadro 1. Características operativas del ELISA para EHNV en comparación
con la prueba de referencia del cultivo celular en células BF-2
Muestra
Línea de corte
Positivo-Negativo**
Sensibilidad
Especificidad
Tejidos de pez*
DO 0,5
60%
>99%
Sobrenadantes de cultivos de tejidos
con efecto citopático (células BF2)
DO 0,3
>99%
>99%
* solamente perca y trucha arco iris. Con la perca dorada ocurre una DO de fondo más elevada. No hay datos para
otras especies.
** estos cortes se determinan por el laboratorio de referencia de la OIE para el EHNV y variarán según el lote del
antígeno de control. Los valores indicados arriba corresponden al lote 86/8774-4-5-01.
Componentes de la prueba y preparación de reactivos
i)
Se necesitan placas de microtitulación con fondo plano (Linbro Cat. # 76:381:04,
ICN Flow; o Dynatech Inmunolon 1 Cat # 011-010-3350; o equivalente).
ii)
La inmunoglobulina anti-EHNV de conejo purificada por afinidad y el antisuero
anti-EHNV de oveja se suministran como reactivos en forma liofilizada.
Reconstituir con 1 ml de agua purificada y dejar el vial a temperatura ambiente
durante 2 minutos. Mezclar el contenido con suavidad. Estos reactivos son
estables durante al menos 4 años cuando se mantiene a una temperatura de
–20ºC. Para uso rutinario en las pruebas ELISA se recomienda que los stocks de
trabajo de ambos anticuerpos se preparen como una dilución 1/10 en TSGM
(fórmula al final de esta sección). Son estables a –20ºC por al menos 5 años y no
se solidifican a esta temperatura.
iii) El conjugado se suministra como un polvo liofilizado (reactivo comercial, KPL
#14-23-06; 0,5 mg). Este reactivo ha mostrado una notable coherencia en cuanto
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
97
Capítulo 2.1.1. — Necrosis hematopoyética epizoótica
a actividad entre lotes diferentes a lo largo de un período de 15 años. El producto
debe reconstituirse con una solución estéril de glicerol al 50% en agua, repartido
en alícuotas de 150 µl y guardado como solución no diluida a -20ºC. Se prepara
una solución de trabajo añadiendo 900 µl de TSGM a 100 µl de la solución no
diluida. La solución de trabajo también se guarda a -20ºC y es estable por al
menos 1 año. Los lotes nuevos de este conjugado deben titularse frente a un lote
antiguo utilizando protocolos estándar.
iv) El antígeno control del EHNV, inactivado por el calor, se suministra como un
polvo liofilizado. Se reconstituye en 1 ml de agua estéril y se guarda en pequeñas
alícuotas a -20ºC. En el mismo día en que se realizan las pruebas se preparan
diluciones empleando PBSTG (PBS + Tween + gelatina). Las diluciones del
antígeno control del EHNV (A, B, D y F) cubren el rango de las señales de
respuesta del ensayo y permiten realizar un procedimiento de normalización.
Equipo
Se recomienda un lavador automático de placas, aunque las placas se pueden lavar a
mano. El ensayo depende de las condiciones de lavado de las placas. Si la DO de los
controles resulta inesperadamente baja, y el conjugado y los otros reactivos no han
caducado, debería ajustarse el lavador de placas de modo que la presión de lavado
durante el llenado y aspiración de los pocillos sea mínima.
Se recomienda un lector automático de placas, aunque las placas se pueden leer a
simple vista.
Se deben usar pipetas de precisión calibradas (por ejemplo, Gilson) para preparar
diluciones de todos los reactivos y para colocar los reactivos en los pocillos de la placa
de microtitulación.
Protocolo
i)
Se recubre una placa con 96 pocillos para ELISA (100µl/pocillo) con el antiEHNV de conejo purificado por afinidad diluido 1/12.800 en tampón borato
para recubrimiento. Se incuba durante toda la noche a 4ºC.
ii)
Se lava la placa cinco veces con tampón de lavado (agua purificada por milli-Q
(MQ) más 0,05% de Tween 20). También puede emplearse agua destilada o
desionizada en éste y los restantes pasos.
iii) Se prepara una solución bloqueadora; se calienta la solución en un microondas o
baño maría para disolver la gelatina y se deja enfriar luego a temperatura
ambiente.
iv) Se bloquea el resto de sitios de unión usando solución bloqueadora
(100µl/pocillo) (1% [p/v] de gelatina en PBSTG para dilución [PBS, 0,05% [v/v]
de Tween 20, 0,1% [p/v] de gelatina]). Se incuba a temperatura ambiente durante
30 minutos.
v)
Se lava la placa cinco veces como antes.
vi) Se trabaja en una cabina de bioseguridad de Clase II. Se diluye el antígeno control
(ver más adelante) en PBSTG y se añade a la esquina derecha inferior de la placa.
Se añaden 100 μl/pocillo de muestras de homogeneizado tisular o de
sobrenadante de cultivo y antígenos control. Todas las muestras y controles se
añaden a pocillos duplicados. Se incuba a 90 minutos a temperatura ambiente.
98
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
Capítulo 2.1.1. — Necrosis hematopoyética epizoótica
Los antígenos control son diluciones de un sobrenadante de cultivo celular de EHNV
86/8774 tratado por calor. Se espera que los controles den la DO que se indica a
continuación, aunque habrá alguna variación de laboratorio a laboratorio y, por tanto,
debería admitirse una variación de + 10%.
Control
Dilución en PBS*
A
B
D
F
1/5
1/40
1/200
1/3.000
DO (405 nm)*
>2
1,90
0,68
0,16
* Estas diluciones y valores de OD están determinadas por el laboratorio de referencia de la
OIE para el EHNV y variarán según el lote de antígeno control. Los valores anteriores se
refieren al lote 86/8774-4-5-01. El corte positivo-negativo para muestras de
homogeneizados tisulares clarificados de perca y de trucha arco iris en esta prueba ELISA
se aproxima al valor de OD del control D en cada placa.
i)
Se lava la placa a mano para evitar contaminación del lavador de placas. Trabajar
en una cabina de bioseguridad de Clase II. Aspirar los pocillos usando una pipeta
multicanal. Lavar la placa dos veces.
ii)
Se lava la placa cinco veces en el lavador de placas como se ha indicado antes.
iii) Se añade el segundo anticuerpo anti-EHNV de oveja, diluido 1/32.000 en
PBSTG (100 μl/ pocillo). Incubar 90 minutos a temperatura ambiente.
iv) Se lava la placa cinco veces en el lavador de placas.
v)
Se añade el conjugado diluido 1/1500 en PBSTG (100 μl/ pocillo). Incubar
90 minutos a temperatura ambiente.
vi) Se lava la placa cinco veces en el lavador de placas.
vii) Se añade el substrato ABTS (22 ml ABTS + 10 μl H2O2) (100 μl/ pocillo) y se
coloca la placa en un agitador de placas. Se controla temporalmente este paso
desde el momento en que se añade al primer pocillo de la placa 1 el substrato. Se
incuba durante 20 minutos.
viii) Se añade inmediatamente solución para detener la reacción (50 μl/pocillo), agitar
la placa brevemente y leer la OD a 405 nm. Se calcula la DO media de los
pocillos duplicados. Se calcula el coeficiente de variación de los duplicados: las
muestras con CV >15% deberían volverse a anlizar si la DO media cae muy
cerca de la línea de corte positivo-negativo.
Normalización de los datos y control de calidad del límite de decisión
Si se desea normalizar los datos de placa a placa a lo largo del tiempo, o realizar un
control de calidad sobre el límite de la decisión, se puede seguir el siguiente
procedimiento. Se usan los antígenos control en pruebas ELISA durante al menos
cinco ocasiones en una período de 3 semanas (en total 20 placas de ELISA
independientes). Calcular la DO media para cada antígeno control. Luego, para cada
placa que se utilice después, calcular un factor de corrección de placa (PCF) del modo
siguiente:
PCF = (DO media del control A/ DO real + DO media del control B/ DO real +
DO media del control D/ DO real + DO media del control F/ DO real) /4.
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
99
Capítulo 2.1.1. — Necrosis hematopoyética epizoótica
Multiplicar la DO media real de cada muestra por el PCF para esa placa y considerar
estos valores en el informe.
Se permite que el PCF varíe entre 0,8 y 1,2, que corresponde a un coeficiente de
variación del 10%. Los valores fuera de este margen sugieren que la placa necesita
analizarse de nuevo. La variación de PCF con el tiempo suministra un medio directo
para monitorizar la estabilidad de los reactivos, las variaciones del procedimiento y los
errores del operario. Este método de control de calidad ha sido validado para el
ELISA de captura de antígeno.
Tampones y otros reactivos
Tampón borato de recubrimiento
Ácido bórico
Tetraborato disódico (Na2B4O7.10 H2O)
NaCl
Agua tratada con MQ, hasta
Autoclavar
6,18 g
9,54 g
4,38 g
1 litro
10 × Solución salina tamponada con fosfato (10 × PBS)
NaCl
80,00 g
KCl
2,00 g
Na2HPO4
11,50 g
2,00 g
KH2PO4
Agua tratada con MQ, hasta
900 ml
Ajustar a pH 7,2 con HCl o NaOH; llevar hasta 1 litro
Autoclavar
Para solución de trabajo se diluye 1/10 y se vuelve a comprobar el pH.
Para guardar en frascos las sales en polvo, se hace dos veces la cantidad arriba
indicada; se guarda; para rehacer, se añade 1,8 litros de agua MQ, se ajusta el pH y se
lleva hasta 2 litros.
ABTS1
Tampón citrato fosfato
Ácido cítrico
21,00 g
Na2HPO4
14,00 g
Agua MQ hasta 800 ml; ajustar el pH a 4.2; llevar a 1 litro
ABTS
0,55g
Tampón citrato fosfato, llevar hasta
1 litro
Se distribuye en alícuotas de 22 ml y se congela.
Inmediatamente antes de usar, se añaden 10 μl de H2O2 por cada alícuota de 22 ml.
Solución de parada de la reacción (NaN3 al 0.01% en ácido cítrico 0,1 M)
Ácido cítrico
10,5 g
Agua MQ, llevar hasta
500 ml
Se añaden 50 mg de azida sódica o 1 ml de una solución al 5%.
Conjugado KPL # 14-23-062
1
2
ABTS Cat. No. A 1888, Sigma Aldrich Pty Ltd, Sydney, Australia; Tel.: (+61-2) 9841 0500; E-mail: www.sigmaaldrich.com
Suministrador del reactivo: Bio-Mediq DPC Australia, P.O. Box 106, Doncaster, Victoria 3108, Australia. Tel.: (+61-3) 9840
2767; Fax: (+61-3) 9840 2767. Se puede visitar: www.kpl.com para enlaces con distribuidores de todo el mundo.
100
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
Capítulo 2.1.1. — Necrosis hematopoyética epizoótica
Crioprotector TSGM
10 × Tris/ solución salina, pH 7.4
Glicerol
Agua purificada estéril hasta
Autoclavar
Se añade Mertiolato al 10%
Se guarda en botella color topacio a 4ºC
10 × Tris/ solución salina (250 mM de Tris, 1,5 M de NaCl)
Tris
NaCl
Agua purificada estéril
Se ajusta el pH a
50 ml
250 ml
500 ml
1 ml
15,14 g
43,83 g
500 ml
7,4
Inmunomicrosocopía electrónica
• Marcaje con oro de cortes de tejidos o cultivos celulares
Principio de la prueba: Los homogeneizados de tejidos o cultivos celulares pueden
emplearse para examen por microscopía electrónica. La microscopía electrónica
convencional (examen de cortes ultrafinos) genera datos sobre la estructura y la
morfogénesis del virus. La microscopía electrónica de contraste negativo producirá
imágenes que pueden utilizarse para examinar la estructura particular del virus. El uso
de anticuerpos conjugados con oro en estas preparaciones permite examinar tanto la
ultraestructura como la antigenicidad (15). Estos datos globales permiten la
clasificación del género Ranavirus.
Células y tejidos
i)
Se fijan los tejidos o las células como se describe en la ref. 15. Brevemente, para
fijar las células se usa glutaraldehído tamponado al 2,5% (v/v) (tampón
cacodilato, o fosfato) durante 40 minutos. Después de la fijación primaria las
células se lavan en el mismo tampón (3 × 20 minutos), se vuelven a fijar en
tetróxido de osmio tamponado al 1% (p/v) durante 1 hora, se lavan (3 ×
5 minutos) en agua doblemente destilada por ósmosis inversa, se deshidratan por
pasos en escala ascendente de alcoholes (70-100%) y se incluyen en una resina
epoxídica (como Spurrs o epon). Para el marcaje con oro de los cortes ultrafinos,
se debe prestar cuidado con la fijación y la inclusión. Por ejemplo, las células
deben fijarse en glutaraldehído al 0,25% (v/v) con 2–4% de paraformaldehído.
No se emplea fijación secundaria y las células se incluyen en una resina acrílica
del tipo LR White (LRW).
ii)
Tras la fijación y la inclusión, se preparan cortes ultrafinos y se transfieren a
rejillas de níquel con un film de soporte.
iii) Se cortan los cortes de los bloques de inclusión de LRW adecuados.
iv) Adherir los cortes a las rejillas de níquel, que han sido tratadas con ácido acético
al 20%, luego con etanol al 90%, y después lavadas en agua obtenida por ósmosis
inversa.
v)
Se bloquea con 2% (p/v) de leche desnatada en polvo en PBSA (10 minutos).
vi) Se bloquean los aldehídos libres con 0,1 M de glicina en PBSA (20 minutos).
vii) Se lavan con PBSA (3 × 1 minuto). Este es un paso opcional que se usa solo si
hay un exceso de aldehído libre (un alto ruido de fondo puede ser indicativo de
ello).
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
101
Capítulo 2.1.1. — Necrosis hematopoyética epizoótica
viii) Si no se usa proteína A con oro, bloquear entonces con el suero normal de la
especie – este suero debe ser homólogo al que se compleja con el oro. La
dilución recomendada es aproximadamente 1/40 (10 minutos).
ix) Se incuba con el anticuerpo primario. Si se desconocen los detalles de la
incubación, se realizarán las reacciones iniciales con diluciones de 1/100 a
1/2700 (mediante diluciones triples seriadas). Se diluyen los anticuerpos en 1%
(v/v) de gelatina de pescado de agua fría en PBSA (60 minutos, temperatura
ambiente).
x)
Se lava con 1% (v/v) de gelatina de pescado de agua fría en PBSA (6 ×
3 minutos).
xi) Se incuba con el anticuerpo secundario marcado con oro o con proteína A-oro o
proteína G-oro. La dilución recomendada es 1/40 en PBSA que contiene 1%
(p/v) de BSA, 0,1% (v/v) de Tween 20 y 0,1% (v/v) de Triton X, 60 minutos,
temperatura ambiente.
xii) Se lava con PBSA (6 × 3 minutos a temperatura ambiente)
xiii) Fijación secundaria con 2,5% (v/v) de glutaraldehído en PBSA (5 minutos a
temperatura ambiente).
xiv) Se lava en agua obtenida por ósmosis inversa (3 × 3 minutos a temperatura
ambiente).
xv) Se seca con papel de filtro (el tipo no es importante).
xvi) Se tiñe con acetato de uranilo y acetato de plomo.
Interpretación de los resultados
• Los virus dentro del citoplasma de células infectadas serán marcados
específicamente con el oro. Los virus se localizarán aisladamente, dentro de
cuerpos de ensamblaje (cuerpos de inclusión) y en disposiciones paracristalinas.
• Marcaje con oro de partículas víricas (virus adsorbidos a las rejillas)
i)
Con un émbolo, se prepara un homogeneizado al 10% (p/v) de hígado, riñón o
bazo y clarificar (5 minutos, 2.500 g).
ii)
Se adsorbe el sobrenadante (del homogeneizado o de cultivos celulares) al
soporte de la rejilla.
iii) Se utilizan rejillas de oro de malla 200 recubiertas de carbono.
iv) Se fija la muestra con 0,1% (v/v) de glutaraldehído y 1% (v/v) de NP40 en PBS
(2 minutos).
v)
Se lava con PBS (3 × 3 minutos).
vi) Se bloquea con 5% (v/v) de gelatina de pescado de agua fría (Sigma) en PBS
(10 minutos) y luego con tampón de incubación (PBS/0,1% de gelatina de
pescado de agua fría).
vii) Se incuba con el anticuerpo durante 1 hora a temperatura ambiente (anti-EHNV
de conejo purificado por afinidad, Lote No. M708; suministrado por el
laboratorio de referencia de la OIE; dilución aconsejada 1/500).
viii) Se lavan las rejillas con tampón de incubación (6 × 3 minutos).
102
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
Capítulo 2.1.1. — Necrosis hematopoyética epizoótica
ix) Se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente con proteína A conjugada con
oro de 10 nm (para la dilución consultar la recomendación de los
suministradores).
x)
Se lava (6 × 3 minutos).
xi) Se fija con 2,5% de glutaraldehído (5 minutos).
xii) Se lava con agua destilada (3 × 3 minutos) y se tiñe 1 minuto con 2% de ácido
fosfotúngstico (pH 6,8).
Interpretación de los resultados:
• La inclusión de NP40 permite que los anticuerpos y la proteína A-oro penetren
por la membrana externa y reaccionen con la cápsida situada debajo. El marcaje
debería ser específico para el virus. Como control negativo debería incluirse un
suero de conejo purificado inespecífico para EHNV.
Tinción con inmunoperoxidasa
Muestras: cortes finos de tejidos fijados con formalina e incluidos en parafina.
Procedimiento técnico
El siguiente protocolo pretende la demostración cualitativa de los antígenos del
EHNV en cortes finos de tejidos fijados con formalina e incluidos en parafina (27). Se
supone que el antígeno puede haber establecido uniones cruzadas y por tanto se
incluye un paso de digestión por proteasa que puede omitirse si se examinan muestras
que no han sido fijadas. Para la tinción se utiliza un kit comercial (DAKO® LSAB
K0679) con estreptavidina marcada con peroxidasa y una mezcla de inmunoglobulinas
biotinadas anti-conejo/anti-ratón/anti-cabra como anticuerpos secundarios. También
se utilizan otros reactivos comercializados. Por su conveniencia, son suministrados
igualmente por DAKO3. El anticuerpo primario anti-EHNV de conejo purificado por
afinidad (Lote No. M708) se suministra liofilizado por el laboratorio de referencia de
la OIE.
i)
Se realizan cortes de 5 μm y se montan en portaobjetos de vidrio SuperFrost®
Plus G/Edge (Menzel-Glaser, HD Scientific Cat. No. HD 041300 72P3). Marcar
alrededor de la muestra con un rotulador de vidrio para limitar la extensión de los
reactivos.
ii)
Se elimina la parafina de los cortes. Se precalientan los portas en una estufa a
60ºC durante 30 minutos. Se colocan los portas en un baño con xileno e incubar
5 minutos. Se repite una vez. Hay que tener en cuenta que el recambio de xileno
no tiene efectos perjudiciales.
Se elimina el exceso de líquido y se colocan los portas en etanol absoluto durante
3 minutos. Repetir una vez.
Se elimina el exceso de líquido y se colocan los portas en etanol al 95% durante
3 minutos. Repetir una vez.
Se elimina el exceso de líquido y se colocan los portas en agua destilada o
desionizada durante 30 segundos.
3
Dako Cytomation California Inc., 6392 via Real, Carpinteria, CA 93013, USA. Tel.: (+1-805) 566 6655. Fax: (+1-805) 566
6688; Dako Cytomation Pty Ltd, Unit 4, 13 Lord Street, Botany, NSW 2019 Australia, Fax: (+61-2) 9316 4773; se puede
visitar www.dakocytomation.com para enlaces en otros países.
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
103
Capítulo 2.1.1. — Necrosis hematopoyética epizoótica
iii) Se expone los antígenos mediante un tratamiento con proteasa. Se cubren los
portas con Proteinasa K (5-7 μg/ml) y se incuban durante 20 minutos (solución
dispuesta para uso, DakoCytomation Cat. No. S3020). SE lavan los portas por
inmersión tres veces en agua. Se colocan en un baño con PBST por 5 minutos
(PBS pH 7,2, 0,05% [v/v] de Tween 20). Se elimina el exceso de la solución de
lavado y se seca cuidadosamente alrededor del corte.
iv) Se realiza la reacción de inmunotinción empleando el kit Universal DAKO
SLAB®+ Peroxidasa (Dako Cytomation Cat. No. K0679). Se añaden los
siguientes reactivos sobre el porta, asegurándose de que el corte del tejido está
cubierto por completo. Debe evitarse que se seque.
v)
3% de peróxido de hidrógeno: se cubre el corte y se incuba durante 5 minutos. Se
lava suavemente con PBST y se coloca en un nuevo baño de lavado.
vi) Anticuerpo primario (anti-EHNV de conejo purificado por afinidad 1/1.500
Lote No. M708), y en un segundo porta un reactivo de control negativo (suero
normal de conejo no inmune a una dilución 1/1500). Se cubre el corte y se
incuba durante 15 minutos. Se lavan los portas.
vii) Puente: se cubre el corte y se incuba durante 15 minutos. Se lavan los portas.
viii) Estreptavidina peroxidasa: se cubre el corte y se incuba durante 15 minutos. Se
lavan los portas.
ix) Solución de substrato cromógeno: se cubre el corte y se incuba durante
5 minutos. Se lavan los portas suavemente con agua destilada.
x)
Se efectúa la tinción de contraste colocando los portas en un baño de
hematoxilina de Mayer DAKO® durante 1 minuto (modificación de Lillie, Cat.
No. S3309). Se lava suavemente con agua destilada. Se sumerge 10 veces en un
baño de agua. Se coloca en agua destilada o desionizada durante 2 minutos.
xi) Se monta y añade a las muestras un cubreobjetos con un medio de montaje
acuoso (DAKO® Faramount Aqueous Mounting Medium Cat. No. S3025).
Interpretación de los resultados
• El antígeno de EHNV aparece teñido de marrón en las zonas que rodean las áreas
degenerativas y necróticas de las áreas parenquimatosas. En la misma sección del
corte no debería haber tinción en el control negativo tratado con suero normal de
conejo.
Disponibilidad de la prueba y reactivos: los anticuerpos, reactivos y protocolos del
ensayo están disponibles en el laboratorio de referencia de la OIE.
• Técnicas moleculares
Principios de la prueba: la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) implica que hay
una reacción enzimática de amplificación en la reacción. El término “reacción en
cadena” se refiere a varios ciclos de copia de un trozo específico de ADN o ácido
nucleico diana (nucleótidos), en este caso un trozo del genoma del agente infeccioso.
La región que va a amplificarse se define por dos (o más) secuencias de nucleótidos,
llamados sitios de los cebadores, que flanquean la secuencia diana. Los cebadores, que
son oligonucleótidos cortos complementarios a los sitios de los cebadores, se unen a
la cadena de ADN que va a ser copiada. Usando una polimerasa, que no se
desnaturalice durante los ciclos térmicos, es posible copiar la secuencia diana uniendo
nucleótidos libres a los cebadores. Repitiendo los ciclos térmicos 20-40 veces, la
cantidad de ADN diana copiado es suficiente para proceder a otras operaciones como
su detección, clonación o secuenciación.
104
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
Capítulo 2.1.1. — Necrosis hematopoyética epizoótica
Es posible la identificación de los ranavirus a nivel de género y de especie utilizando
dos métodos basados en PCR dirigidos al gen que codifica la proteína mayor de la
cápsida (MCP). En el primer método se emplean dos ensayos de PCR con cebadores
para MCP y un análisis de restricción para detectar y diferenciar rápidamente el
EHNV de otros ranavirus de origen europeo (ECV), norteamericano (FV3) o
australiano (BIV) (25). Esto se puede realizar en menos de 24 horas con un coste
relativamente bajo. En el segundo método, se usa un único ensayo de PCR para MCP
a fin de generar un producto de 580 pb (pares de bases), que se secuencia después
para identificar el tipo de ranavirus.
Muestras: virus de cultivos celulares o análisis directo en homogeneizados de tejidos.
Procedimiento técnico
i)
PCR y análisis por endonucleasas de restricción (REA)
El producto amplificado en la reacción de PCR, MCP-1, se digiere con PflM I
permitiendo diferenciar entre los iridovirus australianos (EHNV y BIV) y los no
australianos (FV3 americano, y ECV europeo). El producto amplificado por PCR
en otro ensayo, MCP-2, se digiere con Hinc II, Acc I y Fnu4H I (individualmente)
posibilitando la diferenciación de EHNV y BIV (australianos) entre sí y del FV3
(americano) y el ECV (europeo).
Preparación de reactivos
Los reactivos controles de PCR, ADN purificado de EHNV, y ADN purificado
de BIV, se suministran en forma liofilizada por el laboratorio de referencia. Se
reconstituyen con 0,5 ml de tampón TE (10 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA, pH
8,0) dejando el vial a temperatura ambiente durante 2 minutos. Se mezcla el
contenido muy suavemente. Para uso normal como control de PCR se
recomienda que las soluciones de trabajo se preparen a una dilución 1/10 en
tampón TE (pH 8,0). Se deben guardar a -20ºC alícuotas de 125 µl. Cada alícuota
es suficiente para 50 reacciones (se añaden a la mezcla 5 µl) y tiene una vida útil
de al menos 6 meses desde la fecha de la dilución.
Los cebadores M151 y M152 (MCP-1.321 pb), M153 y M154 (MCP-2, 625 pb) se
suministran a la concentración de trabajo y deben mantenerse a -20ºC. Los
cebadores también pueden obtenerse de suministradores comerciales. Las
secuencias de los cebadores se indican en el cuadro 2.
Cuadro 2. Secuencias de los cebadores MCP-1 y MCP-2
Ensayo de la
PCR
MCP-1
MCP-2
Cebador
Secuencia
M151
M152
M153
M154
AAC-CCG-GCT-TTC-GGG-CAG-CA
CGG-GGC-GGG-GTT-GAT-GAG-AT
ATG-ACC-GTC-GCC-CTC-ATC-AC
CCA-TCG-AGC-CGT-TCA-TGA-TG
Tamaño del
producto
Localización
génica
321 pb
266-586
625 pb
842-1466
Mezcla para PCR
En un volumen final de 50 µl (incluyendo los 5 µl del ADN de muestra), las
reacciones de amplificación contienen 2,5 µl de cada uno de los cebadores de
trabajo, 200 µM de cada nucleótido dATP, dTTP, dGTP y dCTP, tampón 10 ×
PCR (66,6 mM de Tris/HCl, 16,6 mM de (NH4)2SO4, 2,5 mM de MgCl2,
1,65 mg/ml de seroalbúmina bovina, 10 mM de beta-mercaptoetanol) y 2 U de
polimerasa Taq. Se incluyen dos controles negativos, uno con solo mezcla de
PCR y otro conteniendo 5µl de tampón TE. En el cuadro 3 se presentan
instrucciones para la preparación del tampón 10 × PCR.
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
105
Capítulo 2.1.1. — Necrosis hematopoyética epizoótica
Cuadro 3. Preparación del tampón 10 × PCR
Ingredientes
4,050 g
1,100 g
Concentración final en 50 μl de
mezcla PCR
66,6 mM
16,6 mM
0,825 g
1,65 mg/ml
1,25 ml
50 ml
2,5 mM
Cantidad
Tris
Sulfato amónico
BSA (Fracción V de seroalbúmina
bovina libre de ácidos grasos)
Cloruro magnésico
Tampón TE (estéril)
Las reacciones para MCP-1 y MCP-2 tienen el siguiente perfil: 1 ciclo de
desnaturalización a 94ºC durante 3 minutos, seguido de 35 ciclos de
desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, hibridación a 50ºC durante
30 segundos y extensión a 72ºC durante 1 minuto; una extensión final a 72ºC
durante 5 minutos, y enfriamiento a 4ºC.
Los resultados de la PCR se comprueban por electroforesis en geles de agarosa al
2% teñidos con bromuro de etidio. El ADN control del EHNV para PCR
(solución de trabajo 1/10) debería dar un resultado similar en intensidad a la
banda de 10-3 en ambos cass.
Análisis con endonucleasas de restricción
El amplicón obtenido por PCR se somete a REA con los enzimas que se
describen en el cuadro siguiente. Todas las endonucleasas deben usarse siguiendo
las instrucciones del suministrador. Las reacciones REA se preparan añadiendo14 μl del producto de la PCR, 2 U de la endonucleasa de restricción apropiada,
1,6 μl de tampón (suministrado con cada endonucleasa de restricción), 1,6 μl de
seroalbúmina bovina a concentración de 100 μg/ml (para el caso de PflM I o
Hinc II) y se lleva a un volumen final de 16μl con agua purificada estéril. Las
reacciones para el análisis de restricción se incuban durante 2-4 horas a las
temperaturas recomendadas y se comprueban por electroforesis en geles de
agarosa al 3%. Los tamaños de las bandas esperadas tras la digestión por las
nucleasas de restricción se indican en el cuadro 4.
Cuadro 4. Análisis de los amplicones de MCP de ranavirus por endonucleasas de restricción
Ensayo de PCR
Enzima de restricción
MCP-1 (321 pb)
PflM I
Hinc II
Acc I
MCP-2 (625 pb)
Fnu4H I
106
Tamaños (pb)
esperados de las bandas
tras la reacción
321
131, 190
100, 138, 387
100, 525
100, 240, 285
238, 387
625
164, 461
33, 38, 44, 239, 271
3, 33, 38, 44, 108, 399
3, 38, 44, 108, 432
3, 9, 38, 44, 108, 151, 272
3, 44, 71, 108, 399
Aplicable a
EHNV, BIV
FV3, WV
EHNV
BIV, FV3
WV
EHNV
BIV, ESV, ECV, WV
FV3, GV
EHNV
BIV
FV3, GV
ESV, ECV
WV
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
Capítulo 2.1.1. — Necrosis hematopoyética epizoótica
Se distribuyen en volúmenes de 500 μl y se guardan a –20ºC. Para soluciones de
trabajo, se añade 3,5 μl de beta-mercaptoetanol por cada 500 μl de tampón 10 ×.
Cualquier tampón sobrante después de preparar la mezcla para PCR debe
desecharse.
La sensibilidad de la PCR para aplicaciones diagnósticas directas con tejidos de
peces está siendo evaluada.
En el laboratorio de referencia de la OIE están disponibles protocolos detallados
para facilitar la realización de la prueba, hojas de ejercicios y ADN control
purificado del EHNV.
ii)
PCR y secuenciación
En este ensayo, para la amplificación de la secuencia diana de MCP (580 pares de
bases [pb]) en el ADN del EHNV por PCR se emplean dos cebadores, un
cebador inverso (5´-AAA-GAC-CCG-TTT-TGC-AGC-AGC-AAA-C-3´) y un
cebador
delantero
(5´-CGC-AGT-CAA-GGC-CTT-GAT-GT-3´).
Este
procedimiento de PCR puede emplearse para la detección específica de ranavirus
de la perca, la trucha arco iris, el siluro, pez gato, el gupi (Poecilia reticulata) el
lábrido limpiador (Labroides dimidatus) y un amplio rango de ranavirus de anfibios
(17). Se añade el ácido nucleico (1 μl) al tampón de la polimerasa Taq que
contiene 0,1 μM de cada cebador, 2,5 U de polimerasa Taq (Promega) y 2,5 mM
de MgCl2. La mezcla se incuba en un termociclador automático programado para
35 ciclos a 95ºC durante 60 segundos, a 55ºC durante 60 segundos, y a 72ºC
durante 60 segundos, manteniéndose finalmente a 72ºC por 15 minutos. El ADN
amplificado (580 pb) se analiza por electroforesis en gel de agarosa, se corta y se
secuencia empleando un equipo de secuenciación Cyclone (Bretasec, Australia).
Cada especie vírica se identifica por su secuencia única de ADN que está
disponible en GenBank. Se pueden enviar muestras al laboratorio de referencia
de la OIE para identificaciones específicas.
• Purificación del agente
Se ha descrito la purificación del EHNV (16, 30). Se dispone de un protocolo en el
laboratorio de referencia.
• Métodos serológicos
No se han detectado anticuerpos neutralizantes en peces o en mamíferos expuestos al
EHNV. Para la trucha arco iris y la perca se ha descrito un ELISA indirecto que
detecta los anticuerpos inducidos tras la exposición al EHNV (34, 35). La sensibilidad
y especificidad de estos ensayos no se conoce en comparación con las de una prueba
de referencia, y la interpretación de los resultados es actualmente difícil. En el
laboratorio de referencia hay disponibles protocolos e inmunoglobulinas específicas
como reactivos necesarios para realizar estas pruebas.
4. CLASIFICACIÓN DE LAS PRUEBAS SEGÚN SU FINALIDAD
Los métodos actualmente disponibles para vigilancia, detección y diagnosis del EHNV se presentan en
el cuadro 5. Las designaciones que aparecen en el cuadro indican: A= el método es recomendado por
razones de disponibilidad, utilidad, especificidad y sensibilidad diagnóstica; B= el método es un
método estándar con buena sensibilidad y especificidad diagnóstica; C= el método tiene aplicación en
algunas situaciones, pero su coste, exactitud y otros factores limitan notablemente su aplicación; D= el
método no se recomienda actualmente para este propósito; y NA= no aplicable. Estas designaciones
son algo subjetivas ya que la adecuación incluye aspectos de seguridad, sensibilidad, especificidad y
utilidad. Aunque no todas las pruebas asignadas a la categoría A o B han pasado por una
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
107
Capítulo 2.1.1. — Necrosis hematopoyética epizoótica
estandarización y validación formales (véase el capítulo 1.1.2), su naturaleza rutinaria y el hecho de que
se han usado ampliamente sin resultados dudosos las hace aceptables.
Cuadro 5. Métodos de vigilancia, detección y diagnosis del EHNV
Método
Huevos/
esperma
Síntomas generales
Histopatología
Tinción con inmunoperoxidasa
MET
Inmuno-EM
Cultivo celular
ELISA de captura de antígeno
ELISA de captura de anticuerpo
PCR-REA
PCR - análisis de secuencias
Vigilancia
Crías/
Juveniles
alevines
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
D
D
C
D
D
A
A
D
D
D
D
D
C
D
D
A
A
D
D
D
Adultos
D
D
C
D
D
A
A
C
D
D
Presuntiva
Confirmativa
D
B
C
C
C
A
A
C
C
C
D
D
C
B
B
B
B
D
A
A
MO = microscopía óptica; ME = microscopía electrónica; MET = microscopía electrónica de transmisión;
PCR = reacción en cadena de la polimerasa.
5. CRITERIOS DE DIAGNÓSTICO CONFIRMATIVO
a)
Definición de un caso sospechoso
Pez con aletas, aparentemente sano, moribundo o muerto cuyos tejidos parenquimatosos
contienen evidencia histológica de necrosis por licuefacción o coagulación de tipo focal,
multifocal o con extensión local, con o sin cuerpos de inclusión basófilos intracitoplasmáticos.
b)
Definición de un caso confirmado
Pez con aletas, aparentemente sano, moribundo o muerto cuyos tejidos parenquimatosos
contienen evidencia histológica de necrosis por licuefacción o coagulación de tipo focal,
multifocal o con extensión local, con o sin cuerpos de inclusión basófilos intracitoplasmáticos y/o
en los que se ha demostrado la presencia de EHNV por los siguientes medios:
1. Efecto citopático característico en cultivo celular, y cultivo celular positivo para EHNV
en la prueba de inmunoperoxidasa o en ELISA de capture de antígeno
o bien
2. Tejidos positivos en ELISA de captura de antígeno, tinción con inmunoperoxidasa,
inmunomicrosocopía electrónica o PCR
y además de 1 o 2,
3. Se demuestra por PCR-REA o por PCR-secuenciación que la secuencia corresponde a la
del EHNV.
6. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO Y DETECCIÓN PARA DECLARAR LA AUSENCIA DE INFECCIÓN
Se necesita usar un muestreo estadísticamente válido y que los órganos o muestras recogidos sean los
correctos; no existe evidencia de infección en el tracto reproductivo ni se conoce la participación de los
reproductores en el ciclo de infección, de modo que el fluido ovárico y el espermático son muestras
inadecuadas.
108
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
Capítulo 2.1.1. — Necrosis hematopoyética epizoótica
Deben emplearse pruebas estandarizadas de sensibilidad y especificidad conocida. Esto limita las
pruebas de certificación a la del cultivo celular, que es la prueba de referencia, y al ELISA de captura de
antígeno.
En truchas arco iris aparentemente sanas, la posibilidad de detectar una infección por EHNV es
extremadamente baja, incluso cuando la enfermedad es activa en la misma población, debido a que la
prevalencia de la infección es baja y hay una alta tasa de mortalidad. A efectos prácticos, el EHNV solo
se puede detectar en peces que están clínicamente afectados o que han muerto por la infección. A
partir de una muestra aleatoria de truchas arco iris vivas sería posible clasificar erróneamente una
piscifactoría como libre de EHNV incluso durante un brote de la enfermedad porque la prevalencia de
la infección es generalmente muy baja. Por tanto se recomienda el examen de las mortalidades
“casuales”.
Durante un brote de baja intensidad en la trucha arco iris, la prevalencia del EHNV entre las
mortalidades puede ser del 60-80% y la contribución del EHNV a la mortalidad de “fondo” es
suficiente para permitir la detección del virus en ausencia de enfermedad manifiesta en la población.
Para la detección del EHNV y a efectos de la certificación, la población de interés es “la población de
mortalidad” y se pueden seleccionar muestras para detectar al menos un individuo infectado por el
EHNV a un determinado nivel de confianza teniendo en cuenta el nivel de prevalencia de la infección
y la sensibilidad de la prueba (6, 28). Durante un brote de EHNV el virus se detectó en al menos el 2%
de los peces muertos (36). Por este motivo se asume una prevalencia del 2% para el muestreo del
EHNV a efectos de certificación. La prueba ELISA de captura de antígeno, utilizada para analizar los
homogeneizados titulares respecto al EHNV, tiene una sensibilidad de por lo menos el 60% de la
sensibilidad de la prueba del cultivo celular (37). El tamaño de muestra necesario en una población
muy grande con mortalidades “cotidianas” para poder tener un 95% de confianza en detectar al menos
un individuo infectado mediante una prueba con un 60% de sensibilidad es aproximadamente de 250.
En la práctica, las mortalidades “cotidianas” deben recogerse diariamente y guardarse en grupos de
20 en bolsas de plástico a -20ºC hasta que se hayan recogido los 250 ejemplares de muestra. Cuando
sea posible, se deben seleccionar los tipos jóvenes para simplificar las disecciones y el tratamiento de
los tejidos. Los homogeneizados clarificados individuales que sean positivos por ELISA de captura de
antígeno se someten luego a la prueba del cultivo celular para confirmar la presencia del EHNV. Esta
es una estrategia económica ya que reduce mucho el número de cultivos celulares necesarios.
Alternativamente se pueden usar cultivos celulares y agrupar las muestras de distintos peces para
reducir costes.
La serología también podría tener utilidad en las inspecciones para identificar poblaciones de truchas
infectadas. Suponiendo un 1% de prevalencia de seropositividad en peces cultivados en una
piscifactoría con infección endémica, se necesitaría una muestra de 300 peces para tener un 95% de
seguridad en detectar al menos un individuo afectado (6). Es precisa más investigación para confirmar
la validez de esta propuesta.
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in Venezuela. Dis. Aquat. Org., 33, 1–9.
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NB: Existe un laboratorio de referencia de la OIE para la necrosis hematopoyética epizoótica (véase
cuadro al final de este Manual de animales acuáticos o consúltese la página web de la OIE para una lista
actualizada: www.oie.int).
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Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006