Análisis Cualitativo de Colorantes Artificiales en Productos

PRÁCTICA No. 1: Cromatografía en Papel1. Análisis Cualitativo de Colorantes Artificiales en Productos Alimenticios Palabras Clave: Cromatografía en Papel, Factor de Retención, Factor de Retención Relativo, Colorantes Artificiales, Fase Estacionaria, Fase Móvil, Patrón Interno. Introducción. La industria alimenticia adoptó por la utilización de colorantes para hacer mas presentables al público muchos de sus productos, sin embargo, a través de los años se determinó que algunos colorantes (muchos de ellos sintéticos) tenían el potencial de perjudicar la salud, por este motivo algunos de estos colorantes fueron completamente prohibidos. Eventualmente se desarrollaron otros colorantes sintéticos para reemplazarlos y algunos de ellos se incluyen normalmente tanto en alimentos como en productos farmacéuticos el día de hoy. La tartrazina es solo un ejemplo de este tipo de sustancias, es referido también como amarillo # 5, y tiene el potencial de causar reacciones alérgicas en algunas personas y por lo tanto su presencia debe de ser indicada en los alimentos en los que es incorporada tales como bebidas carbonatadas y caramelos por citar algunos. Es probable encontrar tatrazina mezclada con rojo o azul para formar otros colores como el anaranjado y el verde. Fundamento. La cromatografía, es la técnica de análisis químico utilizada para separar sustancias puras de mezclas complejas. Esta técnica depende del principio de adsorción selectiva, además es necesario aclarar que todos los procesos cromatográficos poseen: una Fase Estacionaria, que funciona como soporte mecánico y participa activamente en los procesos de separación (ésta define el tipo y principio de la cromatografía). Y una Fase Móvil, que en la mayoría de los casos es líquida, con las propiedades físicas y químicas que permiten el desplazamiento del analito sobre la fase estacionaria. La fase móvil puede ser de naturaleza orgánica (solventes volátiles), o inorgánica (ácidos diluidos o agua), y hasta una combinación de ambas. En la cromatografía de gases la fase móvil es una combinación de gases inertes como el nitrógeno. La Cromatografía en Papel es un método sencillo y rápido, las fibras de celulosa del papel filtro ordinario retienen agua, que es vital para el proceso, ambos conforman la fase estacionaria. La fase móvil consiste en este caso, de una mezcla de solventes que trepan la fase estacionaria por efecto de capilaridad dentro de un recipiente en donde se introduce el papel. Estos solventes tienen necesariamente que poseer la polaridad requerida para afectar el desplazamiento de los analitos, de lo contrario estos no se moverán del punto de aplicación. En la cromatografía en dos dimensiones es preciso llevar a cabo una medida del desplazamiento del analito a lo largo del papel o placa que se utiliza, se denomina Factor de Retención y se define como: Rf = [distancia recorrida por el analito] ÷ [distancia recorrida por el frente del solvente] Debido a que los valores de factor de retención Rf casi no pueden reproducirse con dos cifras significativas debido principalmente a que el valor del Rf es sensible a variables como el grosor de la fase estacionaria, la humedad que contiene la fase móvil, se acude a un valor que 1
Actualizada por Marvin Zacarias y Jorge Reyes.
resulte más representativo conocido como Factor de Retención Relativo Rx. El Rx está definido de la siguiente manera: Rx = [distancia recorrida por el analito] ÷ [distancia recorrida por una sustancia de referencia] Una sustancia de referencia es por lo regular un Patrón Interno el cual se define como una sustancia de identidad conocida y de alta pureza empleada para fines comparativos. Un Rx ideal es igual a 1, con lo cual se confirma la identidad de un analito con respecto a la sustancia referencia. Debe de tenerse en cuenta que el factor de retención Rf puede brindar información acerca de la afinidad de la muestra tanto a la fase móvil como a la fase estacionaria. Finalmente, la cromatografía se puede clasificar en función de las características polares o apolares de la fase estacionaria, de ésta manera, la existe la cromatografía en Fase Normal (cuando la fase estacionaria es polar) y en Fase Reversa (cuando es apolar), la naturaleza de los solventes debe de ser inversa a la de la fase estacionaria para efectuar la separación. Este tipo de cromatografía en dos dimensiones se suele llevar a cabo en una cámara cromatográfica la que preferiblemente debe de estar saturada con los vapores de la fase móvil a emplear antes de colocar en el interior el papel o placa. Las fases móviles tienen una vida corta principalmente si se emplean solventes orgánicos volátiles, estas deben ser reemplazadas diariamente. Objetivos: 1. Determinar la presencia de tartrazina y otros colorantes artificiales en productos alimenticios. 2. Determinar se el colorante sintético amarillo #5 se encuentra presente en otros colores utilizados en alimentos. 3. Aplicar el factor de retención relativo en la identificación de los colorantes. Materiales. • Papel filtro para cromatografía Whatman No.1 o No.3 (Qualitative) de dimensiones 7x8 cm. • Lana natural desgrasada. • Cámara Cromatográfica de vidrio. • Estufa. • Capilares. • Beaker de 10, 50, 100 y 250 ml. • Varias de vidrio. • Erlenmeyer de 125 ml. • Embudos. • Probetas de 100 y 10 mL • Viales de vidrio. • Papel de aluminio. • Masking tape. • Tape mágico. • Material usual de laboratorio. Reactivos. • Agua desmineralizada • Acido acético glacial GR. J.T. Baker • Acetato de sodio GR Merck • Alcohol Anhidro GR J.T. Baker • Hidróxido de amonio GR Mallinckrodt Ar. • n‐Butanol GR Merck • Citrato de sodio GR Merck • Estándares de colorantes artificiales  Rojo #3 (Eritrosina)  Amarillo #6 (Crepúsculo)  Amarillo #5 (Tartrazina)  Rojo #40 (Allura)  Rojo #2 Procedimiento: • Preparación del Estándar de Colorante Artificial (Cualitativo): Pesar 0.05 g de estándar y disolverlo con 8 ml de agua desmineralizada, agregar esta solución dentro de un vial, perfectamente identificado. • Preparación de Fase Móvil. 1. Fase Móvil A: se combinan 50 mL de n‐Butanol, 25 mL de Etanol, 10 mL de hidróxido de amonio y 15 mL Agua desmineralizada. 2. Fase Móvil B: 2 g Acetato de sodio, 20 mL de Hidróxido de amonio y 80 mL de Agua desmineralizada. 3. Ejecute inmediatamente la Preparación de Cámara de Desarrollo que se describe más adelante. • Preparación de Fase Estacionaria. 1. Sobre un trozo de papel Watman No. 3 de 14 x 9 cm se traza con un lápiz una recta paralela a uno de los bordes y a una distancia de éste de 1 cm. 2. Sobre esta línea se ponen los puntos necesarios los cuales tienen que tener la misma distancia entre si. • Preparación de la Muestra (Procedimiento de Extracción): 1. En un beaker de 50 mL pesar aproximadamente 5 gramos de muestra (utilizar botonetas o clorets). 2. Alimentos con alto contenido de azúcar y/o grasa, deben de ser procesados para aislar el colorante, por lo que se procede a agregar etanol al 70% hasta cubrir bien la muestra y deben de permanecer en reposo durante 4 horas mediante agitación. 3. Seguidamente filtrar la muestra. 4. Concentrar el extracto, colocar el beaker en una estufa y evaporar el etanol hasta aproximadamente 1 mL. •
Procedimiento de Sembrado en Cromatografía en papel: 1. Llevar a cabo la técnica correspondiente al sembrado en la página de la sección de técnicas complementarias al inicio de este manual. 2. Pida a su instructor la muestra desconocida MDC01 y siémbrela en el papel. • Preparación de Cámara de Desarrollo. 1. Coloque 10 ml de Fase Móvil dentro de la cámara (beacker 100 mL) y tápelo por medio de una pieza de papel aluminio que no permita la salida de los vapores. 2. Deje reposar la cámara durante 15 minutos antes de proceder al Desarrollo Cromatográfico que se describe más adelante. • Desarrollo Cromatográfico: 1. Colocar el papel cuidadosamente dentro de la cámara de desarrollo a manera tal que se sumerja uniformemente dentro del solvente y no un extremo primero. 2. Dejar que la fase móvil trepe por el papel hasta que alcance a un cálculo estimado de 1 cm del borde del papel. 3. Cuando lo anterior suceda saque el papel y marque el frente del solvente con un lápiz. Luego seque el papel y efectúe las marcas pertinentes para el cálculo de los factores correspondientes. Resultados: 1. Calcular el factor de retención de cada compuesto. 2. Calcular el factor de retención relativo para aquellas muestras a las que se le compare con un patrón de referencia. Análisis de Resultados: Explicar la presencia o ausencia del colorante tatrazina en base a los resultados generados, además establezca los principios físicos (capilaridad) y químicos (desplazamiento de los analitos) para este experimento. Cuestionario: 1. ¿Para la separación de pigmentos (sustancias que dan color a las plantas) como carotenoides y xantofilas que también son colorantes utilizados en alimentos, puede aplicarse la técnica de cromatografía en papel? 2. ¿Cómo podría hacerse un análisis cuantitativo de la tartrazina y de los demás colorantes separados por esta técnica? 3. ¿Qué otros colorantes están presentes en los alimentos? 4. Según diferencias en la estructura molecular de los colorantes son más afines o menos a la fase móvil ¿que colorantes presentan la característica de tener un menor factor de retardo sobre el papel utilizado como fase estacionaria? Bibliografía: 1. Kandel M. Chromatography of M&M candies. Journal of Chemical Education, 1992 (69): 988‐989 2. Tyson, J. Analysis , What Analytical Chemist Do. The Royal Society of Chemisty, Cambridge, 1988. vii + 186 p. (pp 146) 3. Skoog, D. A.; Holler, F. J. & Nieman, T. A. Principios de Análisis Instrumental. 5ta Edición McGraw‐Hill/Interamericana de España, S. A. España, 2001, xxv + 1028 4. Pavia, D.L., Lampman, G.M., Kriz, G.S. and Engel, R.G. "Introduction to Organic Laboratory Techniques ‐ a Microscale Approach", 2nd Ed., Saunders Publishers (1995). Pasto, D., Johnson, C. and Miller, M. "Experiments and Techniques in Organic Chemistry, 1st Ed., Prentice Hall (1992). Internet: Para más información puede visitar: 1. Chromatography: In Search of Yellow Dye #5 Autor: Ann VanBlaricum. Última Actualización: 1997. [http://www.doggedresearch.com/chromo/] 2. Cellulose chromatography Papers. Autor: Watman. Última Actualización: 2007. [http://www.whatman.com/CelluloseChromatographyPapers.aspx]