Agammaglobulinemia ligada al sexo. Reconstitución in vitro

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Agammaglobulinemia ligada al sexo. Reconstitución in vitro
M.C. García Rodríguez, R. Pérez de Diego, G. Fontán Casariego
Servicio de Inmunología. Hospital Universitario «La Paz». Madrid (España).
La agammaglobulinemia ligada al cromosoma X (ALX)
se debe a un bloqueo en el desarrollo de los linfocitos B y
se caracteriza porque los pacientes no producen
inmunoglobulinas, tienen una susceptibilidad aumentada
a infecciones por bacterias y enterovirus y su cifra de linfocitos
B está muy disminuida o ausente. El gen responsable de
la misma es el de la protein-tirosin-kinasa de Bruton (BTK)
cuyas mutaciones dan lugar al fenotipo clásico de la
enfermedad o a veces presentaciones atípicas por razones
hoy desconocidas.
Es una enfermedad rara,1 de cada 50.000-100.000 nacidos
vivos, y hay pocas series en la literatura que describan en
un amplio grupo de pacientes su clínica, analítica y estudio
del defecto molecular y proteico. En nuestro grupo hemos
estudiado 69 pacientes de 52 familias no relacionadas y
tratamos de ver si existe en ellos una correlación genotipofenotipo.
Una vez que se sospecha la enfermedad basándonos en
los datos clínicos, analíticos y la historia familiar si la hubiere,
estudiamos en primer lugar la expresión de BTK por Western
blot o por citometría de flujo, y posteriormente hacemos
el diagnóstico molecular del paciente y las posibles portadoras
en la familia.
Hemos encontrado en total 48 mutaciones diferentes, el
45% de las cuales son de novo, y las más frecuentes las missense
(un 40%). Las clasificamos entre más severas o menos severas
y en todos los casos hemos estudiado la capacidad para
producir proteína, encontrando que únicamente siete pacientes
presentaban una expresión proteica normal o disminuida,
lo que ha permitido hacer en ellos estudios de fosforilación.
Mayoritariamente dan lugar a un fenotipo clásico de la
enfermedad, aunque también hemos encontrado presentaciones
poco frecuentes. Dentro de los afectos en una misma familia
existen diferencias en su presentación clínica y analítica e
incluso alguno de ellos permanece asintomático en edad
adulta. Hemos podido observar que algunos de los que
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tienen una mutación de las consideradas menos severas
conservan una cifra normal de alguna de las inmunoglobulinas
y actividad cinasa residual, lo que puede explicar que algunos
de dichos pacientes expresen un fenotipo más benigno de
la enfermedad. Quizá los diversos fenotipos estén relacionados
con el tipo de mutación o su localización, pero es posible
que en las diferencias intrafamiliares y en las formas de
presentación menos graves intervengan otros factores hoy
desconocidos.
Al hacer la correlación genotipo-fenotipo en la serie
encontramos que aquellas mutaciones menos severas tenían
unas cifras de inmunoglobulinas al diagnóstico más elevadas
que las más graves, una edad al diagnóstico mayor y un
menor número de hospitalizaciones antes de comenzar su
tratamiento con gammaglobulina intravenosa.
Sin embargo, algunas de las menos severas se asocian
a fenotipos clásicos y hemos visto también cómo mutaciones
con ausencia de expresión proteica se asocian a fenotipos
menos severos, por lo que creemos que, comparando paciente
a paciente, el papel que puede tener el tipo de mutación en
la evolución de la enfermedad es desconocido y que el
pronóstico de la enfermedad se verá favorecido únicamente
con el diagnóstico temprano de la enfermedad, así como
con la instauración precoz del tratamiento adecuado.
La expresión de BTK estudiada por Western blot y
citometría de flujo muestra que 7 de ellas expresan proteína,
por lo que analizamos la actividad cinasa de estos casos
mediante Western blot con detección del residuo tirosina223 de BTK fosforilado. Se observa que mutaciones fuera
del dominio cinasa (R28C, R288W y K374N) permiten la
autofosforilación de la tirosina 223 implicada en la activación
de la BTK, mientras que mutaciones en dicho dominio (K430E
y F540S) no presentan autofosforilación. Las mutaciones
R544G y R544S, a pesar de estar en el dominio cinasa,
muestran autofosforilación, debido a que dicha arginina
está implicada en mantener inactiva a la BTK.
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VII MEETING OF THE SPANISH GROUP FOR PRIMARY IMMUNODEFICIENCIES
Por otra parte, hemos estudiado si la coexpresión de
proteína normal y mutada puede producir efecto dominante
negativo, para ver qué tipo de mutaciones serían
potencialmente tratables en un futuro mediante terapia
génica. Para ello hemos usado un modelo celular, el linfoma
B de pollo DT40, cuya respuesta a la vía anti-IgM-BCR
por ausencia de BTK es similar a humanos. Para los pacientes
que expresan proteína, se reproducen sus mutaciones
mediante mutagénesis dirigida en los vectores pApuro y
pSGT, que posteriormente son transfectados por
electroporación. Los clones son seleccionados por resistencia
a puromicina en células DT40 salvaje y DT40 deficiente en
BTK. Se realizan Western blot de BTK para detectar la
presencia de proteína, y se miden los niveles de calcio
mediante citometría de flujo con los marcadores Fluo-4 y
Fura Red. Observamos que la transfección del gen mutado
en células DT40 deficiente en BTK no corrige los niveles de
calcio tras estimulación con Anti-IgM, mientras que la
transfección del gen normal si lo hace. La coexpresión de
proteína normal y mutada no produce en ningún caso efecto
dominante negativo que afecte a la señal de calcio en respuesta
a anti-IgM, incluso con niveles de expresión de BTK mutada
muy elevados.
CORRESPONDENCIA:
Dra. M.C. García Rodríguez
Servicio de Inmunología
Hospital La Paz
Paseo de la Castellana 268
28046 Madrid
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