Irene Fernández

La Espectrometria de Masas
en la
Identificación de Proteinas
Dra. Irene Fernández
Servicio de Espectrometria de Masas. UB.
PROTEÒMICA
Gel
1. Spot
2. Rentat
3. Digestió
4. Extracció
Extracció
Proteïna
Barreja de
Pèptids tríptics
Espectrometria de Masses
MALDI
Electrospray
Base de Dades
ELIMINACIÓN
- Colorantes ( sales de plata, Coomassie Blue, . . . )
- Urea (desnaturalitzación prot., detergentes )
- Agentes reductores ( DTT, DTE )
- Glicerol, agentes alquilantes, SDS
Proteasas y posiciones de corte específicas
Proteína
Enzima
Trypsin
Posición de corte
/K-, /R-, \P
Chymotrypsin
Glu C (V8)
Lys C
Asp N
/W-, /Y-, /F-, \P
/E-, /D, \P
/K-, \P
/d-
R
K
R
Trypsin
K
Mezcla de Péptidos trípticos
R
K
Informació masses
MS
NH2
15.200 Da
%
COOH
Punts de digestió
Modificació
m/z
Proteïna
Digestió Enzimàtica ( Trypsina, V8)
Química (CNBr, BNPS)
Seqüència
MS/MS
NH2
1025
MS
COOH
NH2
COOH
215
518
m/z
Pèptids tríptics
874
1025
1448
m/z
BASE DE DADES
Detección en el Masas
Cromatograma de iones
TIC
%
EM
A) Muestra pura
t
Spec#1[BP=399.0,18512]
399
100
%
1.9E+4
279
90
263
718
80
277
% Intensity
70
622
280 328
60
40
30
20
623
415
50
247
717
621
400
278
301
377
560
456
721
625
10
0
200
360
520
680
840
0
1000
Mass(m
/z)
m/z
Espectro
Voyager Spec #1 MC[BP = 379.1, 6899]
%
379.1
100
6899
90
904.5
80
1296.7
70
1570.7
50
294.1
40
30
20
10
1298.7
234.0
228.0
0
225
1572.7
335.1
906.5
520
815
1110
Mass (m/z)
1405
m/z
0
1700
Voyager Spec #1 MC[BP = 379.1, 6899]
1296.7
100
%
12C+14N+16O
4940.9
90
80
1297.7
70
13C+14N+16O
12C+15N+16O
60
% Intensity
% Intensity
60
50
2x13C+14N+16O
13C+15N+16O
40
1298.7
30
20
10
0
1292.0
1294.2
1296.4
1298.6
Mass (m/z)
1300.8
m/z
0
1303.0
Monoisotopic Mass
Monoisotopic Mass
Monoisotopic Mass
Average Mass
ANALISIS DE UNA MEZCLA
TIC
1
2
3
HPLC
EM
4
%
1
2
%
3
%
%
m/z
4
m/z
%
m/z
m/z
FONTS D’IONITZACIÓ
ELECTROSPRAY
MALDI
ELECTROSPRAY
FONT ELECTROSPRAY
LC/MS
HPLC
Introducció directa
Ions : (M+nH)n+, (M-nH)n-
analitzador
Característiques del procés
d'ionització (I)
a) Tècnica d'ionització suau
- T. Ambient
- P. Atmosfèrica
- Molt poca fragmentació
b)Pot produir MULTIPLICITAT DE
CÀRREGA en aquelles molècules amb
posicions susceptibles d'ionitzar -se, com
els grups -NH2 lliures de les proteïnes.
!
No es necessari disposar d'analitzadors
de gran rang de lectura, es a dir amb
quadrupols ( < 4000uma ) es poden
detectar molècules de 100.000uma.
Tripèptid Lys-Met-Asp ( KMD)
MW monoisotopic= 459.3 Da
CH-(CH2)3-NH2
H2N-CH-CO-NH-CHR2-CO-NH-CHR3-COOH
A
CH-(CH2)3-NH2
+
H3N-CH-CO-NH-CHR2-CO-NH-CHR3-COOH
A1 (M+H)+= 460.3
+
CH-(CH2)3-NH3
+
H3N-CH-CO-NH-CHR2-CO-NH-CHR3-COOH
A2 (M+2H)2+= 461.3/2 = 230.6
A2
%
230.6
A1
460.3
m/z
ES Myoglobin
20 femtomoles MWaverage=16.951.1
A18
A19
A20
Espectre real ESI
A21
A
m/z
n=
Deconvolució a l’escala
real de masses
m
m1-H
m2- m1
Barreja: human haemoglobin
n= 1
!m= 1
!m
!m
n= 2
!m= 0,5
n= 3
!m= 0,33
n = 1/!m
- Micro Electrospray : µL/min LC/MS amb split
- Nano Electrospray : nL/min. Biomolècules. No LC/MS.
Si MS/MS. Límits de detecció femtomols
- Tampons volàtils
- Molècules solubles en dissolvents polars (H2O,
CH3CN, MeOH).
- Mostres netes ( no : sals, detergents, SDS, ...),
processos previs de purificació.
- Tècnica depenent de la Concentració
- Lectura ions positius i negatius.
- Informació : Pes Molecular ( <40Kda)
• Seqüència : Fragmentació en font
• Tàndem MS/MS
TIC
MALDI
Matrix Assisted Laser Desorption Ionization
1 µL
Cristal.lització
Matriu ( SA, CHCA,
THAP, DHB)
Mostra
Concentracions:
Peptids,proteïnes : 0.1 a 10pmol/µL
Oligonucleòtids :10 a 100pmol/µL
Laser
hν
Ions
(M+H)+
(M-H)-
MALDI
Analitzador
( TOF, quadrupol)
MALDI
- Tècnica senzilla i ràpida. Fàcil preparació mostra.
- Informació :. Pes Molecular. Fins 300KDa.
Poca fragmentació
. Anàlisi barreges sense separació prèvia
( digerits proteics )
. Seqüenciació : PSD, ISD, Enzimàtica
(informació estructural )
. Proteïnes, pèptids, oligonucleòtids,
oligosacàrids, . . . .
- Quantitat de mostra : µL, conc. : <pmol
- No quantitativa
Spec #1=>NR(1.50)[BP = 2131.5, 591]
2165.49
100
ADA
2305.90
90
80
40394.3
70
% Intensity
590.8
60
50
20173.1
40
30
20
10
0
0
14264.4
28528.8
42793.2
0
71322.0
57057.6
Mass (m/z)
TRYPSINA
Spec #1[BP = 1891.3, 1175]
1891.36
100
1175.0
2424.58
90
Pèptids tríptics
80
% Intensity
70
60
50
40
1144.22
30
1130.14
1517.20
20
10
0
584
1036.17
909.59
1287.16
1152.18
1156
1860.34
2168.47
2511.59
2801.34
2272.49
1484.15
1914.17
1728
3033.48
2504.32
2300
Mass (m/z)
2713.54
2872
0
3444
Daniel C. Liebler “ Introduction to Proteomics”. Humana Press, 2002
Daniel C. Liebler “ Introduction to Proteomics”. Humana Press, 2002
(Time of flight)
Detector
INFORMACIÓ ESTRUCTURAL
• Lectura dels ions formats a la font
• Possibilitat de fragmentació (MSn). Informació estructural Pèptids i proteïnes
MS
Anàlisi dels ions de la font. A+ , B + , C+
MS2
Selecció d'un dels ions anteriors: Precursor A+
Excitació del Precursor per a fragmentar -lo. A+
Lectura dels ions resultants
MS3
Selecció d'un dels ions anteriors: A+1
Excitació per a fragmentar -lo: A+1
.....
......
A + 1 , A+ 2 , A + 3
A + 1 , A+ 2 , A + 3
Detector
A+11 , A+12
Información masas
Digestión
NH2
NH2
MS
COOH
COOH
NH2
Proteína
COOH
874
MS/MS
1025
1448
m/z
Péptidos trípticos
m/z = 1025
p*
A-L-R-S-C-D-K-R
BASES DE DATOS
215
518
725
m/z
Secuencia péptidos trípticos
Proteína
SEQÜÈNCIACIÓ EN MS
- Maldi-TOF : PSD, ISD
- Electrospray i Maldi-TOF/TOF: MS/MS
- Comparació MS vs Seq. EDMAN
. MS mesura masses. AA nous o modificats es
poden detectar bé.
. N-terminal no lliure no és problema
. MS es pot fer directament sobre barreges senzilles
. Adquisició rápida i no gasta reactius
. Tamany de pèptids fins a 25 residus aprox.
. L’informació a vegades no es complerta i alguns
pèptids presenten dificultats
. Quantitat : pmol de substància
MALDI-TOF INFORMACIO ESTRUCTURAL (ISD)
( In Source Decay )
-La ΔM entre els diferents fragments ens informa de la seqüència
Tant en proteínes com en DNA
SECUENCIACIÓN DE PÉPTIDOS
Fragmentos iónicos
x3
R1 O
y3
z3
x2 y2 z2 x1 y1 z1
C-Terminal
R2 O
R3 O
R4
NH2- C- -C- -N- -C- -C- -N- -C- -C- -N--C
H
H H
H H
H H
N-Terminal
a1 b
1
CO2H
c1 a2 b2 c2 a3 b3 c3
H2N------aa1------aa2------aa3------COOH
- Immonium Ions ( Fragmentaciones características
de cada aminoácido H2N+=CHRn)
Roepstorff, P.; Fohlmann, J. Biomed.Mass Spectrom, 11, 601 (1984)
Ejemplo espectro MS/MS
Ión precursor doblemente cargado: 627.3
Mr = 1253.6 Da
Secuencia: qCYFHQFLK
NANOLC011_011009135104
#781 RT: 51.94
F: + c d Full ms2 [email protected] [ 160.00-1265.00]
-Espectros complicados.
-Programas secuenciación DE NOVO.
-Introducción en las bases de datos.
AV: 1 NL: 5.24E5
672.1
100
95
90
85
80
75
70
65
Relative Abundance
60
55
434.8
50
535.1
45
40
719.0
1107.1
819.2
994.1
35
848.1
30
1108.1
25
407.0
20
271.7
518.1
435.8
15
10
5
259.9
176.4
242.4
282.9
343.8
994.9
536.0
849.2
654.2
1080.1
983.2
482.6
618.5
389.0
736.2
803.3
315.7
943.4
966.3
1125.9
1011.9
1179.3
0
200
300
400
1109.1
581.9
500
600
700
m/z
800
900
1000
1100
1213.6
1200
Secuenciación - PSD
MALDI-TOF con REFLECTOR
Linear
Detector
Fuente
Reflector Detector
Tof-Lineal
Selección m/z=
Reflector
Laser
Láser
%
Espectro
m/z
PSD del Péptido de MW=1404.6
Peso de los fragmentos
Introducción
base de datos
Protein Databases NCBI
Swiss Prot
OWL
Secuencia AKLMRLQ
Gene Databases
dbEST
Fragmentación MS/MS
Ionización
Selección
- Analizadores en Tandem
- Ion Trap
Fragmentación
Lectura Fragmentos
%
Espectro fragmentos
m/z
Fragmentación MS/MS
Fuente
Ionización
Analizador
Selección
C.C.
Fragmentación
Analizador
Lectura Fragmentos
Triple Quadrupolo
QQQ
Quadrupolo-TOF
QTOF
Sector Magnético Quadrupolo BQ
TOF-TOF
ESI/Q-TOF
Fuente
Quadrupolo
TOF
muestra
Ionización
(M+H)+n separación m/z
CID
MS/MS
separación m/z
MS/MS d’un pèptid tríptic
de la Myoglobina
GLSDGEWQQVLNVWGK
MW=1815.3
A2
%
908.5
A
1816.3
A3
MS/MS
m/z
y5
%
y6
y3
y4
N
V
L
y7
y9
y10
V
W
QQ
m/z
GLSDGE-W-QQ-V-L-N-V-WGK
A
G
C
A
A
Q
A
C
G
INFORMACIÓ ESTRUCTURAL
•
•
Lectura dels ions formats a la font
Possibilitat de fragmentació (MSn). Informació estructural Pèptids i proteïnes
MS
Anàlisi dels ions de la font. A+ , B+ , C+
MS2
Selecció d'un dels ions anteriors: Precursor A+
Excitació del Precursor per a fragmentar-lo. A+
Lectura dels ions resultants
MS3
Selecció d'un dels ions anteriors: A+1
Excitació per a fragmentar-lo: A+1
.....
......
A+1 , A+2 , A+3
A+1 , A+2 , A+3
A+11 , A+12
Modificaciones Postraduccionales
. Las proteínas estan presentes en los sistemas vivos
en múltiples formas modificadas, lo que añade complejidad
a la resolución de los proteomas.
Modificaciones más importantes:
--Fosforilaciones
--Glicosilaciones
--Oxidaciones
--Acetilaciones. . .
Thermo electron corporation
MODIFICACIONES POSTRADUCCIONALES
1) FOSFORILACIONES : Serina (S), Threonina (T) y Tyrosina (Y)
Cambios Biológicos
. Activación/desactivación enzimática
. Alteración interacciones y asociaciones proteicas
. Cambio estructura proteínas, degradación. . .
Cambios observables en el masas
. Adición Grupo Fosfato : PO4H3
. ΔM de la Proteína/Péptido
. MS/MS
M-S-D-K
+ 80 uma por cada fosforilación
PO4H3 m/z=1
Pérdida PO3
m/z=1
Pérdida
M- p S-D-K
ΔΜ = − 98
ΔM = - 79
Fosforilación de S , T y Y
Modificaciones Postraduccionales : Fosforilación
Spec #1 MC=>NR(4.00)[BP = 11258.5, 617]
G-N-D-T-T-L-D-S-S-M-E
11260.97
100
617.4
90
80
% Intensity
70
60
50
40
30
11221.81
20
10
0
11000
11200
11400
11600
11800
Mass (m/z)
**
0
12000
****
G-N-D-T-T-L-D-S-S-M-E
*
Spec #1=>NR(5.00)[BP = 11346.4, 372]
11347.98
100
11427.25
90
* *
*
371.7
11.266
11506.70
80
11.347
% Intensity
70
60
11.427
11554.65
11266.47
50
11387.06
11606.43
40
11.506
11712.60
30
11831.89
20
10
0
11000
11200
11400
11600
Mass (m/z)
11800
0
12000
80
80
80
Thermo electron corporation
MODIFICACIONES POSTRADUCCIONALES
2) GLICOSILACIONES : Adición de un Carbohidrato o un Polisacárido
dando lugar a una glicoproteína. Moléculas complejas debido a la
heterogeneidad de los azúcares.
. >60% Proteínas en mamíferos
. Marcadores interacciones célula/célula, célula/molécula :
Fertilización, respuesta immune, replicación viral,
infecciones parasitarias, crecimiento de la célula,
inflamaciones, degradaciones . . .
Cambios observables en el masas
. Adición azúcares en posiciones
N-Linked NH2 Asn
O-Linked Ser, Thr
. Incremento del peso de la proteína en función de la modificación.
N- y O-linked Protein Glicosylation
Thermo electron corporation
MODIFICACIONES POSTRADUCCIONALES
2) GLICOSILACIONES : Análisis
. Identificación de la Proteína Glicosilada, tipo de Glicosilación y
posición en la cadena peptídica, caracterización de la Glicosilación :
Secuencia de las cadenas
. Incremento del peso de la proteína en función de la modificación.
Estrategia
GlcNac
Proteolisis
Detección y
aislamiento de la Proteína
GlcNac
LC-MS/MS
MALDITOF/TOF
. Identificación Proteína
( DataBase)
. Identificación grupo GlcNac
. Posición en la cadena peptídica
. Secuenciación azúcares
Secuenciación cadena glicosídica
. Enzimática ( glicosidasas )
. MS/MS
GlcNac
%
m/z
MODIFICACIONES POSTRADUCCIONALES
3) Acetilaciones: Adición de un grupo Acilo
( -COCH3) en el grupo
amino terminal o los grupos amino libres (Lisina K )
ΔM = 42
Oxidaciones: Metioninas ΔM = 16
Aductos acrilamida: Cisteínas ΔM = 71
Carbamidometilación : Adición grupo -CH2CONH2 en el
grupo -SH de las cisteínas ΔM = 57
Comprovación Interacción Específica entre Proteínas
Da
Dominio Da
Fusionado con GST
GST-Da
Mw= 36 KDa
?
Myo D
Dominio Myo D
Fusionado con
polyhistidinas
Myo D
Mw= 15 KDa
Secuencia His6 MYO-D
MW aprox 15300Da
MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKD
PSSSSAMAPKKKRKVPGVPSSNCIDWIX
KRKTTNADRRKAATMRERRRLSKVNEAFETLKRC
TSSNPNQRLPKVEILRNAIRYIEGLQALLR
DQGSPGTELNCGR
1) Interacción proteica
+
GST-Da
Extracto Proteico
2) Columna afinidad GST
1D-SDS-PAGE
Eluido
Lavado
3) Liberación proteína
Proteínas no
interaccionantes
GST-Da
Prot. Interaccionante
MW
1D-SDS-PAGE
ELUÍDO CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD
Voyager Spec #1=>NR(0.80)=>NR(1.00)[BP = 15457.7, 629]
100
628.9
15407
GST-Da
36504
90
80
GST-Da degradation
GST-Da (2+)
% Intensity
18288
27179
GST-Da
70
MyoD?
60
50
MyoD ?
40
9999.0
17999.4
25999.8
34000.2
Mass (m/z)
Espectro MALDI-TOF
42000.6
50001.0
Digerido tríptico de la proteína interaccionante con Da
Espectro de MALDI-TOF
Voyager Spec #1[BP = 1175.7, 16833]
1175.74
100
1.7E+4
90
80
-Recorte
-Dig. Trypsina
-Extracción péptidos
-Análisis MS
% Intensity
70
60
50
40
2073.00
30
2058.01
1177.75
1206.72
20
1050.59
10
842.55
1333.66
2075.00
1404.70
2060.01
1406.71
1080.45 1208.72
2327.12
2014.02
1300.68
2665.34
1478.67 1613.861717.96
1180.66
1052.60
861.10957.47
1308.77 1422.75
770.34
1838.851935.01 2055.95
2146.982251.20 2384.18 2515.28 2649.34 2776.53 2894.57
1513.43
0
0
749.0
1199.2
1649.4
2099.6
2549.8
3000.0
Mass (m/z)
Identificación Proteína Interaccionante con Da
Myo D
Peptide Mass
Fingerprinting
+ p Full ms2 [email protected] [ 160.00-1250.00]
100
Relative Abundance
90
Bases de Datos
588.34
899.4
MS/MS ión 588.3 (+2)
YIEGLQALLR
588.75
80
70
589.24
60
50
40
249.1
770.5
600.4
30
288.2
20
406.0
888.2
576.1
472.3
401.2 450.3
10
0
MS/MS Spectra
MS-TAG
ZoomScan
Ión 588.3 (+2)
277.0
548.2
175.2
200
300
400
500
704.1
1001.2
775.2
713.4
647.1
881.4
600
700
800
900
m/z
1000
1100
1200
Resultado: Proteína Myo D
Index Number: 127240
Acc. #: P10085 Species: MOUSE Name: Myoblast determination protein 1
pI of Protein: 5.3
Protein MW: 34219
Amino Acid Composition: A36 C9 D25 E19 F8 G22 H8 I7 K9 L27 M4 N9 P36 Q9 R25 S32 T13 V10 W1 Y9
1
11
21
31
41
51
MELLSPPLRD
IDLTGPDGSL CSFETADDFY DDPCFDSPDL RFFEDLDPRL
VHVGALLKPE
81
91
101
111
121
131
VRAPSGHHQA
GRCLLWACKA CKRKTTNADR RKAATMRERR RLSKVNEAFE
TLKRCTSSNP
161
171
181
191
201
211
QALLRDQDAA
PPGAAAFYAP GPLPPGRGSE HYSGDSDASS PRSNCSDGMM
DYSGPPSGPR
241
251
261
271
281
291
KSAAVSSLDC
LSSIVERIST
DSPAAPALLL ADAPPESPPG PPEGASLSDT
EQGTQTPSPD
61
EHAHFSTAVH
141
NQRLPKVEIL
221
RQNGYDTAYY
301
AAPQCPAGSN
Péptidos trípticos identificados - VNEAFETLKR
YIEGLQALL
71
PGPGAREDEH
151
RNAIRYIEGL
231
SEAVRESRPG
311
PNAIYQVL