Fragmentos circulantes de propéptidos natriuréticos tipo B N

Clinical Chemistry 59:10
1523–1531 (2013)
Medicina basada en la evidencia y la utilización de prueba
Fragmentos circulantes de propéptidos natriuréticos tipo B
N-terminal en el plasma de pacientes con
insuficiencia cardiaca
Jared Yong Yang Foo,1† Yunxia Wan,1† Benjamin L. Schulz,2† Karam Kostner,3,4 John Atherton,3,5
Justin Cooper-White,1,6 Goce Dimeski,3,7 y Chamindie Punyadeera1,6,8*
ANTECEDENTES: El uso de los análisis del propéptido natriurético tipo B N-terminal (NT-proBNP) no estándar puede contribuir al diagnóstico incorrecto de la
insuficiencia cardiaca (IC). Asimismo, aún debe establecerse un consenso común respecto de las formas
circulantes del NT-proBNP en uso en los análisis actuales. Intentamos caracterizar y cuantificar las diferentes
formas del NT-proBNP en la circulación de los pacientes con IC.
CONCLUSIONES: En el plasma obtenido de los pacientes
con IC, se observó NT-proBNP inmunoreactivo en
forma de múltiples fragmentos truncados en los extremos N y C de la molécula de NT-proBNP completa.
La inmunodetección del NT-proBNP se mejoró considerablemente con el uso de anticuerpos no dirigidos a
esas regiones terminales. Estas conclusiones respaldan
el desarrollo de un análisis de NT-proBNP de última
generación dirigido a epı́topos no terminales y que
evita la región glucosilada central de esta molécula.
MÉTODOS:
© 2013 American Association for Clinical Chemistry
Se obtuvieron muestras de plasma de pacientes con IC (n ⫽ 20) en reposo y se almacenaron a
⫺80 °C. Se enriqueció el NT-proBNP del plasma de
pacientes con IC mediante el uso de inmunoprecipitación seguida de análisis espectrométrico de masas. Se
desarrollaron y validaron inmunoanálisis AlphaLISA®
no competitivos homogéneos a medida para cuantificar 6 fragmentos de NT-proBNP.
RESULTADOS:
La espectrometrı́a de masas identificó la
presencia de varias formas procesadas en los extremos
N y C del NT-proBNP circulante, con proteólisis fisiológica entre Pro2-Leu3, Leu3-Gly4, Pro6-Gly7 y
Pro75-Arg76. Acorde con este resultado, los inmunoanálisis AlphaLISA demostraron que los anticuerpos
dirigidos a los extremos N o C terminales midieron una
baja concentración aparente de NT-proBNP circulante. La aparente concentración de NT-proBNP circulante se aumentó con anticuerpos dirigidos a los
epı́topos no glucosilados y no terminales (P ⬍ 0.05).
1
The Australian Institute for Bioengineering and Nanotechnology (Instituto Australiano de Bioingenierı́a y Nanotecnologı́a); 2 School of Chemistry and Molecular Biosciences (Facultad de Quı́mica y Biociencias Moleculares); y 3 School of
Medicine, the University of Queensland (Facultad de Medicina de la Universidad
de Queensland), Brisbane, Queensland, Australia; 4 Department of Cardiology
(Departamento de Cardiologı́a), Mater Adult Hospital, Brisbane, Queensland,
Australia; 5 Department of Cardiology (Departamento de Cardiologı́a), Royal
Brisbane and Women’s Hospital, Brisbane, Queensland, Australia; 6 School of
Chemical Engineering, the University of Queensland (Facultad de Ingenierı́a
Quı́mica de la Universidad de Queensland), Brisbane, Queensland, Australia;
7
Chemical Pathology (Patologı́a Quı́mica), Princess Alexandra Hospital, Brisbane, Queensland, Australia; 8 Afiliaciones actuales: Saliva Translational Research Group, The University of Queensland Diamantina Institute (Universidad
de Queensland Diamantina Institute), Woolloongabba, Australia.
La insuficiencia cardiaca (IC)9 es un problema sanitario mundial, asociado con resultados clı́nicos deficientes y una carga económica considerable en los
sistemas sanitarios de todo el mundo (1 ). Aproximadamente 23 millones de personas en todo el mundo
conviven con la IC y es probable que esta cifra aumente
en el futuro cercano debido a la población que envejece
y aumenta (2 ). Se ha demostrado que la medición del
péptido natriurético tipo B (BNP) en plasma o el fragmento N-terminal del propéptido natriurético cerebral
(NTproBNP) mejoran la exactitud del diagnóstico en
pacientes con sospecha de IC (3–5 ) Sin embargo, la
utilidad de estos péptidos para la IC está limitada por
amplias variaciones de un paciente a otro, la presencia
de varias formas del péptido NTproBNP en la sangre
(3 ) y grandes diferencias en la imprecisión entre los
métodos de detección utilizados. El último punto ad-
† Jared Yong Yang Foo, Yunxia Wan y Benjamin L. Schulz contribuyeron de igual
manera al trabajo y deberı́an considerarse como primeros autores.
* Dirigir correspondencia para estos autores a: Saliva Translational Research
Group, The University of Queensland Diamantina Institute, Level 6, TRI | 37
Kent St. |, Woolloongabba, QLD 4102, Australia. Fax ⫹61-(0)7-3443-6966;
correo electrónico: [email protected].
Recibido para la publicación el lunes, 26 de noviembre de 2012; acceptado para
la publicación el miércoles, 12 de junio de 2013.
Previously published online at DOI: 10.1373/clinchem.2012.200204
9
Abreviaturas no estándar: IC, insuficiencia cardiaca; BNP, péptido natriurético
tipo B; NT-proBNP, propéptido natriurético tipo B N-terminal; NYHA, New York
Heart Association (Asociación del Corazón de Nueva York); IP, inmunoprecipitación; LC, cromatografı́a de lı́quidos; MS/MS, espectrometrı́a de masas en
tándem; LOD, lı́mite de detección.
1523
quiere particular importancia cuando los pacientes obtienen acceso a diferentes servicios de laboratorio que
utilizan plataformas de diagnóstico diferentes (4, 5 ).
Asimismo, tampoco hay consenso acerca de los fragmentos circulantes del NT-proBNP derivado del
proBNP preliminar segregado por el tejido cardiaco
durante la IC. Esta falta de consenso se complica aún
más por la creciente evidencia que indica que los inmunoanálisis de NT-proBNP pueden detectar proBNP en
la sangre de pacientes con IC, causado por la falta de
procesamiento del proBNP preliminar por la conversión de la proteasa furina y corina presente en la circulación (6 – 8 ).
A fin de evaluar las diferencias en el desempeño
analı́tico y los resultados clı́nicos de los inmunoanálisis
de BNP y NT-proBNP, se llevó a cabo un programa de
pruebas de capacidad, denominado CardioOrmoCheck, por parte de Clerico y cols. para determinar la
imprecisión de la medición (8.7 %) en las concentraciones de NT-proBNP mediante el uso de 3 inmunoanálisis de NT-proBNP que utilizan anticuerpos y normas para el diagnóstico de Roche (9 ). También resulta
evidente a partir del estudio CardioOrmoCheck que la
mayorı́a de los laboratorios italianos utilizaron el NTproBNP en lugar del BNP. Los análisis de NT-proBNP
de Roche utilizan diferentes anticuerpos (policlonales y
monoclonales) dirigidos a diferentes epı́topos de NTproBNP (10 ).
Ala-Kopsala y cols. han demostrado que existen
variantes (truncamientos en los extremos amı́nicos y
carboxı́licos) del NT-proBNP circulante en el plasma
obtenido de pacientes con IC (11 ), lo que origina diferentes moléculas de NT-proBNP inmunoreactivas menores que el fragmento completo de 76 aminoácidos.
Sin embargo, este estudio no se concentró en la cuantificación e identificación de las formas de NT-proBNP
circulante en pacientes con IC. Es probable que la cuantificación y alcanzar una opinión consensuada sobre las
principales formas moleculares del NT-proBNP en la
circulación conduzcan a una mejora en la exactitud del
análisis de NT-proBNP respecto del diagnóstico y el
tratamiento de los pacientes con IC.
Los propósitos de este estudio fueron la identificación y cuantificación de la principal forma de circulación del NT-proBNP en el plasma obtenido de pacientes con IC; dicha información puede usarse para
brindar asesoramiento sobre el desarrollo de análisis de
diagnóstico de última generación.
Materiales y métodos
PARTICIPANTES Y OBTENCIÓN DE MUESTRAS
Esta investigación fue aprobada por el University of
Queensland Medical Ethical Institutional Board (Comité Institucional Ético Médico de la Universidad de
1524 Clinical Chemistry 59:10 (2013)
Queensland) y el Mater Hospital Medical Ethical Review Board (Comité de Revisión Ético del Hospital
Mater). Todos los participantes eran mayores de 18
años y otorgaron consentimiento informado por escrito antes de donar las muestras para nuestro estudio.
Reclutamos pacientes con IC sintomáticos [n ⫽ 20;
clase funcional 3 de New York Heart Association (Asociación del Corazón de Nueva York, NYHA)] con una
fracción de expulsión del ventrı́culo izquierdo ⬍ 40 %
de un departamento de cardiologı́a general. El diagnóstico de IC fue confirmado por el cardiólogo del Mater
Adult Hospital (Hospital Mater de Adultos) conforme
a las directrices para la prevención, la detección y el
tratamiento de la IC crónica en Australia (12 ). Se solicitó a todos los participantes del estudio abstenerse de
realizar ejercicios 24 h antes de la obtención de las
muestras. Los participantes eran de origen europeo,
africano y asiático, y no presentaban sı́ntomas de fiebre
ni de infección respiratoria. Las muestras de sangre se
obtuvieron en tubos de AEDT (Greiner Vacuette®;
Greiner Bioone) para minimizar la degradación in
vitro del NT-proBNP y a continuación se centrifugaron de inmediato a 500 g a 4 °C durante 10 min. Las
muestras se dividieron en partes y se almacenaron a
⫺80 °C.
PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN POR ESPECTROMETRÍA DE
MASAS DEL NT-proBNP ENDÓGENO
Para identificar los principales productos proteolı́ticos
del NT-proBNP en la circulación, se utilizó el plasma
de pacientes con IC (n ⫽ 4) para las reacciones de inmunoprecipitación (IP). En resumen, el anticuerpo
monoclonal NT-proBNP (dirigido a los aminoácidos
13–20) se conectó quı́micamente a Dynabeads® M-270
Epoxy (Invitrogen) mediante quı́mica EDS-NHS
[1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida y Nhidroxisuccinimida] conforme a las instrucciones del
fabricante.
El NT-proBNP de plasma enriquecido se digirió
con tripsina en 50 mmol/l Tris-HCl pH 7.5 con 10
mmol/l ditiotreitol a 37 °C durante 16 h; se quitó la sal
con C18 ZipTips (Millipore) y se analizó mediante
cromatografı́a de lı́quidos (LC)-ionización por electronebulización– espectrometrı́a de masas en tándem
(MS/MS) con un sistema Prominence nanoLC (Shimadzu) en un espectrómetro de masas TripleTof 5600
con una interfaz Nanospray III (AB SCIEX), como se
describió anteriormente (13 ). Se quitó la sal de aproximadamente 2 ␮g de péptido mediante captura Agilent
C18 (tamaño de orificio de 300-Å, tamaño de partı́cula
de 5-␮m, diámetro interior de 0.3-mm ⫻ 5 mm) a un
caudal de 30 ␮l/min durante 3 min, y luego se realizó la
separación en una columna Vydac EVEREST de fase
inversa C18 HPLC (tamaño de orificio de 300-Å,
tamaño de partı́cula de 5-␮m, diámetro interior de
Evaluación de LMPGs NACB con AGREE II
Figura 1. Diagrama esquemático que ilustra los puntos de unión de anticuerpos en los 6 fragmentos del NT-proBNP
glucosilado y la cobertura de péptidos de espectrometrı́a de masas del NT-proBNP enriquecido mediante inmunoprecipitación del plasma.
(A), Los 6 inmunoanálisis usan anticuerpos monoclonales de diagnóstico para detectar NT-proBNP1–20, NT-proBNP13– 45,
NT-proBNP1– 45, NT-proBNP28 –76, NT-proBNP13–76 y NT-proBNP1–76. Los sitios de proteólisis en los extremos N y C detectados
por nuestro análisis de espectrometrı́a de masas se muestran con lı́neas verticales rojas. * Par de anticuerpos que aportó la
mayor concentración de NT-proBNP aparente. (B). Las secuencias correspondientes a los péptidos identificados con una
confianza ⬎ 99 % están en negrita. Los puntos de división no tripsı́nicos se muestran con lı́neas rojas verticales (consulte la
Tabla 2).
150-␮m ⫻ 150 mm) a un caudal de 1 ␮l/min. Los péptidos se separaron con un gradiente del 10 % al 60 % de
amortiguador B (80 % de acetonitrilo con 0.1 % de
ácido fórmico) durante 45 min, con amortiguador A (1
% de acetonitrilo y 0.1 % de ácido fórmico) y amortiguador B. Se realizó el ajuste de las configuraciones
del gas y la tensión según lo dispuesto. Se realizó un
análisis de MS TOF (espectrometrı́a de masas de
tiempo de vuelo) de 350 a 1800 m/z durante 0.5 s
seguido de la adquisición de espectrometrı́a de masas
en tándem dependiente de la información con selección de electroforesis capilar automatizada de los 20
principales péptidos de 40 m/z a 1800 durante 0.05 s
por espectro.
Se identificaron las proteı́nas mediante Protein Pilot (AB SCIEX) y la búsqueda se realizó en la base de
datos LudwigNR (descargada en http://www.wehi.
edu.au/faculty/advanced_research_technologies/proteomics/
wehi_systems_biology_mascot_server conforme a la actualización del 27 de enero de 2012; 16 818 973
secuencias; 5 891 363 821 residuos) con los siguientes
ajustes estándar: tipo de muestra, identificación; alquilación de cisteı́na, ninguna; instrumento, TripleTof
5600; especie, sin restricción; objetivo de identificación, modificaciones biológicas; enzima, tripsina;
tarea de búsqueda, identificación exhaustiva. Se realizó
el análisis de tasa de detección de falsos positivos mediante ProteinPilot en todas las búsquedas. Se incluyeron los péptidos identificados con ⬎ 99 % de confianza y con una tasa de detección falsa local ⬍1% para
su posterior análisis, y se inspeccionaron manualmente
los espectros de fragmentación de espectrometrı́a de
masas en tándem. Los cromatogramas de iones
extraı́dos se obtuvieron mediante PeakView 1.1.
INMUNOANÁLISIS AlphaLISA DE NT-proBNP EN PLASMA
Medimos la inmunoreactividad del NT-proBNP con 6
inmunoanálisis AlphaLISA con diferentes especificidades de epı́topos (Fig. 1A). Todos los anticuerpos
fueron de origen monoclonal y se compraron a Hy Test
(http://www.hytest.fi) excepto por 11D1, de My Biosource (MBS311067; http://www.mybiosource.com). La
especificidad de estos anticuerpos monoclonales se
probó y validó ampliamente por parte de los fabricantes y también se utilizó de forma correcta para investigar la inmunodetección del NT-proBNP glucosilado
Clinical Chemistry 59:10 (2013) 1525
circulante en la sangre humana (14 ). Asimismo, se
probó de forma exhaustiva la especificidad de estos anticuerpos monoclonales mediante Hy Test y My Biosource en análisis no competitivos como anticuerpos
de detección y captura para el uso con muestras en
suero/plasma de pacientes con IC ası́ como para analitos de proBNP y NT-proBNP no glucosilados expresados de forma recombinante.
Los 6 inmunoanálisis de NT-proBNP presentan
una denominación conforme al primer aminoácido al
que se une al anticuerpo de captura en la molécula del
NT-proBNP y el último aminoácido al que se une el
anticuerpo de detección en la molécula del NTproBNP de los aminoácidos 1 a 76: NT-proBNP1–20
(5B61–12 y 13G1213–20); NT-proBNP13– 45 (18H513–20 y
11D128 – 45); NT-proBNP1– 45 (5B61–12 y 11D128 – 45);
NT-proBNP28 –76 (11D128 – 45 y 28F867–76); NTproBNP13–76 (18H513–20 y 28F867–76); NT-proBNP1–76
(5B61–12 y 28F867–76). Cada análisis AlphaLISA de NTproBNP se preparó mediante el uso de un par de anticuerpos monoclonales, con un anticuerpo biotinilado
y unido a las microesferas del donante con recubrimiento de estreptavidina (5B6, 11D1, o 18H5) y el segundo anticuerpo conjugado con las microesferas del
receptor (11D1, 13G12 o 28F8) (15 ) (16 –19 ). El
analito del NT-proBNP se compró a PerkinElmer. Las
normas del NT-proBNP se prepararon mediante el uso
de mezclas de plasmas obtenidas de voluntarios sanos
(n ⫽ 10) y la combinación con amortiguador del inmunoanálisis High Block en una proporción de 50
%:50 %. Esto nos permitió superar los efectos de la
matriz que comúnmente se encuentran al desarrollar
los inmunoanálisis en plasma.
BIOTINILACIÓN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES DE
NT-proBNP PARA INMUNOANÁLISIS
Se agregó N-hidroxisuccinimida-ChromaLink-biotina
(2 g/l) (9007–105K, Solulink) al anti-NT-proBNP respectivo a una proporción molar de 30:1 y se incubó
durante 2 h a temperatura ambiente. Se utilizaron columnas Zeba Spin Desalting Columns (89882; Thermo
Scientific Pierce) para eliminar la biotina sin ligar y
purificar el anticuerpo NT-proBNP biotinilado
después de la incubación. El anticuerpo NT-proBNP
biotinilado se almacenó a 4 °C.
ACOPLAMIENTO DE ANTICUERPOS NT-proBNP A LAS
MICROESFERAS DEL RECEPTOR AlphaLISA
Se agregó disolución amortiguadora de fosfato (250 ␮l)
a las 50 ␮l de microesferas del receptor AlphaLISA
(6772003; PerkinElmer) y se centrifugó a 16 000g durante 15 min, y se desechó el supernadante. Se agregó al
sedimento de microesferas del receptor 0.1 mg de anticuerpo NT-proBNP, 1.25 ␮l del 10 % de Tween-20,
25 ␮g de NaBH3CN y PBS (0.13 mol/l, pH 7.4, Gibco®;
1526 Clinical Chemistry 59:10 (2013)
Life Technologies) para lograr un volumen final de reacción de 200 ␮l, que se incubó durante 24 h a 37 °C.
Luego se agregó 10 ␮l de carboximetoxilamina a la reacción con 1 h de incubación a 37 °C. El anticuerpo
monoclonal NT-proBNP conjugado se purificó por
centrifugación a 16 000 g durante 15 min; se desechó el
supernadante y el sedimento de microesferas se resuspendió en 1 ml de 0.1 mol/l de Tris- HCl (pH 8). El paso
de purificación se repitió 3 veces y luego se realizó la
sonicación (20 pulsos por segundo). Las microesferas
conjugadas se almacenaron a 4 °C.
INMUNOANÁLISIS AlphaLISA DE NT-proBNP CON DESARROLLO
INTERNO
En resumen, el inmunoanálisis AlphaLISA utiliza un
par de anticuerpos NT-proBNP. Un anticuerpo se biotiniliza y se une a las microesferas del donante con recubrimiento de estreptavidina mientras que un segundo anticuerpo se conjuga a las microesferas del
receptor. Las microesferas entran en contacto directo
en presencia del NT-proBNP. La estimulación de las
microesferas del donante promueve la liberación de
moléculas simples de oxı́geno que desencadenan la
transferencia de una cascada de energı́a a las microesferas del receptor, lo que origina un aumento marcado
de emisión de luz a 615 nm (18 ).
Las muestras se analizaron por triplicado en 384
pocillos ProxiPlatesTM (PerkinElmer®). La única excepción al protocolo del fabricante fue reducir el volumen de reacción total de 50 ␮l a 10 ␮l. En resumen, el
análisis consistió en una muestra/analito (1 ␮l), anticuerpo biotinilado (25 mmol/l) y mezcla de microesferas del receptor (25 ng/l), y microesferas del donante
de estreptavidina (80 ng/l). Para todos los inmunoanálisis, la concentración final de microesferas del receptor fue de 10 ␮g/ml y la concentración final del anticuerpo biotinilado fue de 1 nmol/l. El tiempo total de
incubación fue de 1.5 h a temperatura ambiente en la
oscuridad y la lectura de placas se realizó con el lector
EnSpire™.
CARACTERÍSTICAS DE DESEMPEÑO DE LOS ANÁLISIS DE
NT-proBNP AlphaLISA
A fin de evaluar la idoneidad del análisis AlphaLISA
para medir el NT-proBNP en plasma, agregamos 2
concentraciones conocidas del analito del NT-proBNP
en mezclas de plasmas de sujetos sanos. Tanto las
muestras enriquecidas como las no enriquecidas se
midieron en el mismo inmunoanálisis AlphaLISA. Los
porcentajes de recuperación de las 2 muestras de
plasma enriquecidas se calcularon con referencia a las
correspondientes mezclas de plasmas no enriquecidas
en un único análisis AlphaLISA, mediante el uso de la
siguiente ecuación (20 ):
Evaluación de LMPGs NACB con AGREE II
Porcentaje de recuperación 共%兲
Table 1. Caracterı́sticas de los pacientes con IC.
⫽ 兵共关NT-proBNP]plasma agregado
⫺ 关NT-proBNP]plasma sin agregar兲/
Parámetro
Edad, años, media (SD)
关NT-proBNP]agregado} ⫻ 100.
Pacientes con
IC (n ⴝ 20)
73 (10.9)
Sexo, M:F, n
Las muestras de plasma por triplicado se realizaron en
un único análisis AlphaLISA y en 3 análisis AlphaLISA
independientes (20 ). Evaluamos el lı́mite de detección
(LOD) de los análisis mediante el uso de 12 blancos (sin
NT-proBNP) por triplicado en 1 serie. Se realizó la lectura del LOD a partir de una curva de respuesta según la
dosis sigmoidal basada en la señal (21 ):
11:09
Índice de masa corporal, kg/m2,
media (SD)
Clasificación de NYHA
29.9 (6.19)
Todos los pacientes
eran de clase 3
Presión arterial sistólica, mmHg,
media (SD)
124 (3.81)
Presión arterial diastólica, mmHg,
media (SD)
75 (4.83)
Recuento de señales del LOD
⫽ 共promedio de recuento de señales de blancos兲
⫹ 关3 ⫻ 共SD de señal de blancos)].
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Todos los análisis estadı́sticos se realizaron con el software GraphPad Prism 5 versión 5.03 (GraphPad Software). Se generó una curva estándar mediante el gráfico de las cifras “brutas” de AlphaLISA en
comparación con los criterios del NT-proBNP con una
ecuación logı́stica de 4 parámetros (curva de respuesta
según la dosis sigmoidal con pendiente variable) y ponderación de datos 1/y2 (minimiza las distancias relativas al cuadrado). Antes de los análisis estadı́sticos, se
realizó la prueba de normalidad general de D’Agostino
y Pearson en las concentraciones de NT-proBNP en
plasma (variables continuas) de los 6 fragmentos en los
que se probó la distribución normal. Para comparar los
valores sin distribución normal, se llevó a cabo la
prueba de pares equiparados de Wilcoxon sobre la base
de los datos de 2 grupos equiparados. Las diferencias
entre los 2 grupos se consideraron estadı́sticamente significativas a P ⬍ 0.05. Se calcularon los coeficientes de
correlación de Spearman para investigar la relación entre 2 grupos de variables continuas sin distribuciones
normales.
Resultados
caron varios péptidos semi tripsı́nicos, en los cuales un
extremo del péptido no fue resultado de la división en
un sitio de reconocimiento tripsı́nico bajo acuerdo
general.
La abundancia relativa de estos péptidos obtenidos con tripsina total y parcial del NT-proBNP de cada
individuo se determinó mediante la cuantificación
relativa de la intensidad de los cromatogramas de iones
extraı́dos de cada forma del péptido. Los grupos de los
extremos N y C de los péptidos se normalizaron de
forma individual, y ası́ se obtuvo una medición semi
cuantitativa de la abundancia de fragmentos de división de los extremos N y C del NT-proBNP en la
circulación de los pacientes con IC. Esto demostró que
las proporciones relativas de las formas de procesamiento diferenciado del NT-proBNP fueron similares
de forma sustancial entre los pacientes y que el NTproBNP circulante se encuentra sujeto a un alto grado
de procesamiento proteolı́tico de los extremos N y C
(Fig. 2).
Table 2. Péptidos NT-proBNP obtenidos con
tripsina total y parcial identificados después de la
inmunoprecipitación del plasma.
Posicióna
1–21
Reclutamos pacientes con IC en la etapa 3 de la clasificación de NYHA y las caracterı́sticas de los pacientes se
incluyen en la Tabla 1.
Los péptidos de NT-proBNP se confirmaron en las
fracciones de elución luego de la inmunoprecipitación
de las muestras de pacientes con IC mediante el uso de
anticuerpos especı́ficos para NT-proBNP (Tabla 2).
Estos péptidos cubrieron las porciones de los extremos
N y C de la proteı́na madura de NT-proBNP prevista
(acceso UniProtKB P16860). Sin embargo, se identifi-
Péptidob
m/z
z
⌬masa
HPLGSPGSASDLETSGLQEQR.N 722.68 3 ⫺0.003
3–21
P.LGSPGSASDLETSGLQEQR.N
966.46 2 ⫺0.004
4–21
L.GSPGSASDLETSGLQEQR.N
909.92 2 ⫺0.005
7–21
P.GSASDLETSGLQEQR.N
789.36 2 ⫺0.004
67–76
K.MVLYTLRAPR
407.23 3
0.001
67–75
K.MVLYTLRAP.R
532.3
2
0.002
67–73
K.MVLYTLR.A
448.25 2
0.001
a
Posición del aminoácido en la proteı́na madura de NT-proBNP.
Las divisiones no tripsı́nicas se muestran en negrita; las divisiones erróneas
se muestran subrayadas.
b
Clinical Chemistry 59:10 (2013) 1527
issue10). El desempeño del análisis de NT-proBNP AlphaLISA se resume en la Tabla 3.
En las muestras de plasma con IC, se utilizaron
anticuerpos dirigidos al NT-proBNP completo ası́
como 5 pares de anticuerpos dirigidos a diferentes partes de la molécula para medir las concentraciones de
NT-proBNP. La concentración de NT-proBNP1–20 estuvo comprendida entre 2182 y 19 808 ng/l, con una
mediana de 8885 ng/l (RIC, 4166 –14 204 ng/l). Las
concentraciones de NT-proBNP1– 45 estuvieron comprendidas entre 91.6 y 2645 ng/l, con una mediana de
448.3 ng/l (RIC, 195.2– 860.3 ng/l). La concentración
de NT-proBNP13– 45 estuvo comprendida entre 165.1 y
14 164 ng/l, con una mediana de 2151 ng/l (RIC, 840.5–
3969 ng/l). La concentración de NT-proBNP13–76 estuvo comprendida entre 969.2 y 91 458 ng/l, con una
mediana de 14 705 ng/l (RIC, 5045–28 999 ng/l). La
concentración de NT-proBNP28 –76 estuvo comprendida entre 140.8 y 2995 ng/l, con una mediana de 600.5
ng/l (RIC, 369.2–1339 ng/l). La concentración de NTproBNP1–76 estuvo comprendida entre 399.7 y 16 091
ng/l, con una mediana de 4201 ng/l (RIC, 1370 – 8244
ng/l). El par de anticuerpos que reconoció el fragmento
de NT-proBNP13–76 aportó la mayor concentración en
comparación con los pares de anticuerpos que reconocieron las otras partes de la molécula (P ⬍ 0.05) (Fig.
3A). Las correlaciones entre NT-proBNP13–76 y los 5
fragmentos se muestran en la Fig. 3, B–F.
Figura 2. Proporción relativa de péptidos obtenidos
con tripsina total y parcial por los extremos N y C del
NT-proBNP purificados por IP de pacientes individuales.
(A) Péptidos del extremo N: negro, H1-R21; blanco, L3-R21;
gris, G4-R21; a rayas, G7-R21. (B) Péptidos del extremo C:
negro, M67-R76; blanco, M67-P75.
Realizamos una comparación (n ⫽ 28) entre el análisis diagnóstico de Roche y nuestro NT-proBNP13–76 con
desarrollo interno (correlación de Spearman de r ⫽
0.69 y P ⬍ 0.05) (consulte la Fig. 1 de los Datos complementarios que acompañan la versión en lı́nea de este
artı́culo en http://www.clinchem.org/content/vol59/
Análisis
Empleamos una combinación de análisis de
espectrometrı́a de masas e inmunoanálisis AlphaLISA
para caracterizar las formas de circulación del NT-
Table 3. Caracterı́sticas de desempeño de nuestros inmunoanálisis de NT-proBNP.
Inmunoanálisis AlphaLISA
NT-proBNP1–20
Recuperación, % 300 ng/l
% 3000 ng/l/
Variabilidad intranalı́tica, %
Variación interanalı́tica,
% (ES)
LOD, ng/l
101.9
6.55 (0.88)
8.78 (0.56)
90.7
9.14 (0.76)
6.69 (0.70)
52.4
7.58 (1.09)
7.13 (0.65)
26.4
7.34 (0.62)
9.59 (1.03)
168
7.30 (0.69)
6.32 (0.88)
147
5.39 (0.75)
4.46 (0.59)
82.6
NT-proBNP13–45
81
80
NT-proBNP1–45
77.8
76
NT-proBNP28–76
96.7
78.8
NT-proBNP13–76
88.1
121
NT-proBNP1–76
71.5
70.2
1528 Clinical Chemistry 59:10 (2013)
45.3
Evaluación de LMPGs NACB con AGREE II
Figura 3. Comparación y correlación de las concentraciones de NT-proBNP13–76 en plasma (la mayor concentración
aparente) en comparación con NT-proBNP1–20, NT-proBNP13– 45, NT-proBNP1– 45, NT-proBNP28 –76 y NT-proBNP1–76 en
plasma de pacientes con IC (n ⴝ 20).
(A) Los porcentiles 25, 50 (mediana) y 75 se indican en los gráficos de caja y bigotes. * Notablemente diferente de la
concentración de NT-proBNP13–76 al nivel P ⬍ 0.05. Se calculó la correlación de Spearman entre las concentraciones de
NT-proBNP13–76 y (B) NT-proBNP1–20 en plasma, Spearman r ⫽ 0.890, P ⬍ 0.0001; (C) NT-proBNP13– 45, Spearman r ⫽ 0.859,
P ⬍ 0.0001; (D) NT-proBNP1– 45, Spearman r ⫽ 0.788, P ⬍ 0.0001; (E) NT-proBNP28 –76, Spearman r ⫽ 0.908, P ⬍ 0.0001;
y (F) NT-proBNP1–76, Spearman r ⫽ 0.946, P ⬍ 0.0001.
proBNP en el plasma de pacientes con IC. Los 6 inmunoanálisis AlphaLISA desarrollados en forma interna
demostraron buena sensibilidad analı́tica para la cuantificación de los fragmentos del NT-proBNP. Controlamos los efectos de la matriz mediante la mezcla de
plasmas de sujetos sanos (n ⫽ 10) y la adición de concentraciones conocidas del analito de NT-proBNP, y
obtuvimos recuperaciones de entre el 70.2 % y 121 %.
Estas recuperaciones constituyen una buena señal de
que los inmunoanálisis de NT-proBNP son adecuados
para el uso con muestras de plasma. Estos análisis luego
se usaron para cuantificar y comparar diferentes fragmentos de NT-proBNP en el plasma de pacientes con
IC, y para identificar el par de anticuerpos que aportaron la mayor concentración aparente de NT-proBNP
en la circulación.
Nuestros resultados de la espectrometrı́a de masas
identificaron varios péptidos semi tripsı́nicos, en los
cuales un extremo del péptido no fue resultado de la
división en un sitio de reconocimiento tripsı́nico bajo
acuerdo general. Estos péptidos semi tripsı́nicos respondieron con mayor probabilidad a la división fisiológica en los extremos N o C del NT-proBNP circulante
antes de la inmunoprecipitación (22 ). No está clara la
identidad de las proteasas responsables de estas actividades de división en el NT-proBNP ası́ como tampoco
Clinical Chemistry 59:10 (2013) 1529
está claro si las actividades de división ocurren antes o
después de la división del proBNP en NT-proBNP y
BNP. Nuestros análisis de espectrometrı́a de masas no
detectaron péptidos de BNP, lo que sugiere que los
péptidos identificados se originaron a partir de NTproBNP y no de proBNP. Sin embargo, es posible que
parte del proBNP esté presente en las muestras luego de
la inmunoprecipitación. No se detectaron péptidos
semi tripsı́nicos que pudieran ser resultado de la división interna, lo que sugirió que estos sitios de división
no tripsı́nicos no se debieron a artefactos de procesamiento sino que representaron formas diferentes del
NT-proBNP con varios alcances del procesamiento
proteolı́tico en los extremos N o C (Fig. 1B). Asimismo,
los datos de la espectrometrı́a de masas indicaron que
una fracción considerable del NT-proBNP circulante
estuvo sometida al truncamiento en ambos extremos N
y C (Tabla 2, Figs. 1 y 2). Esto sugirió que los pares de
anticuerpos para la medición de la concentración del
NT-proBNP circulante idealmente no deberı́an dirigirse a los extremos N o C terminales del péptido.
Evaluamos si este era el caso al comparar las concentraciones aparentes de NT-proBNP mediante el uso de
pares de anticuerpos dirigidos a diferentes segmentos
de NT-proBNP. El par de anticuerpos dirigido al NTproBNP13–76 aportó una mayor concentración que el
NT-proBNP1–76 y el par de anticuerpos dirigido al NTproBNP13– 45 aportó una mayor concentración que el
NT-proBNP1– 45 (Fig. 3). Estos resultados coinciden
con el truncamiento en el extremo N del NT-proBNP
(Tabla 2, Fig. 1), lo que limita la unión del anticuerpo
monoclonal 5B6(1–12) a esta sección de la molécula, y
conduce a una menor concentración aparente de NTproBNP. De forma similar, el par de anticuerpos que
reconoció el NT-proBNP1–20 aportó una mayor concentración que el NT-proBNP1–76 (Fig. 3), coincidente
con el truncamiento del extremo C (Tabla 2, Fig. 1), lo
que limitó la unión del anticuerpo monoclonal
28F8(67–76). Estas conclusiones confirman los datos de
nuestra espectrometrı́a de masas que indican que la
mayor parte del NT-proBNP circulante está truncado
en sus extremos N y C, y también coinciden con las
previas descripciones de las diversas formas del NTproBNP circulante (4, 11 ).
También se ha informado la interferencia de la
glucosilación de la región central del NT-proBNP con
la inmunodetección (14, 23 ). La concentración aparente del NT-proBNP que utilizó el par de anticuerpos
dirigido al NT-proBNP1–20 fue mayor que cuando se
utilizaron los pares de anticuerpos dirigidos al NTproBNP1– 45, NT-proBNP13– 45 o NT-proBNP28 –76
(Fig. 3). Esto coincide con la glucosilación de la región
central del NT-proBNP que causa una unión débil de
los anticuerpos a esta región, lo que corrobora las conclusiones previas (7, 14, 23 ). En forma conjunta, estos
1530 Clinical Chemistry 59:10 (2013)
datos sugieren que un inmunoanálisis ideal de NTproBNP no deberı́a dirigirse a las regiones de los
extremos N y C terminales de la molécula del
NT-proBNP y además deberı́a evitarse la región
glucosilada.
Anteriormente, realizamos la validación de nuestro NT-proBNP1–76 AlphaLISA mediante el uso de 37
muestras de plasma a las que también se realizaron
mediciones de las concentraciones de NT-proBNP mediante el análisis de Roche Diagnostics. Se observó una
correlación significativa entre nuestro análisis y el de
Roche (r 2 ⫽ 0.78 y P ⬍ 0.001) (consulte la Fig. 1
complementaria en lı́nea) (15 ). El actual análisis de
NT-proBNP de segunda generación de Roche Diagnostics se basa en 2 anticuerpos monoclonales que
reconocen epı́topos dentro de los aminoácidos 27–31 y
42– 46 del NT-proBNP (Ficha técnica de Roche Diagnostics; consulte http://www.aacc.org/publications/cln/
2008/July/Pages/newproducts7_0708.aspx). En contraste, en este estudio comprobamos que, de los pares
de anticuerpos que evaluamos, el par dirigido al NTproNBP13–76 aportó la mayor concentración aparente
en las muestras de plasma obtenidas de pacientes con
IC. Sin embargo, nuestros resultados sugirieron que un
inmunoanálisis de NT-proBNP ideal no deberı́a usar
un anticuerpo dirigido a los aminoácidos 67–76, debido al truncamiento del extremo C del NT-proBNP
(Figs. 1 y 2) que reduce su concentración aparente (Fig.
3). Serı́a preferible un anticuerpo alternativo dirigido a
una sección del NT-proBNP entre su región central
O-glucosilada y sus extremos C truncados, pero que
evite ambas regiones. Sin embargo, no hay un anticuerpo como tal disponible actualmente. Asimismo,
los anticuerpos dirigidos al NT-proBNP13–76 aportaron una variabilidad relativamente alta entre individuos. Por lo tanto, serı́a interesante determinar en un
amplio estudio clı́nico si es preferible la detección del
fragmento de NT-proNBP13–76 en las muestras de
plasma a los fragmentos actuales detectados por los
análisis de diagnóstico comerciales. Una limitación de
nuestro estudio fue que usamos una pequeña cohorte
de pacientes con IC clasificada como de clase 3 funcional por NYHA.
Un trabajo reciente de Semenov y cols. indicó que
los pacientes con IC tienden a presentar un mecanismo
ineficiente de conversión del proBNP (molécula precursora) mediante la conversión de la furina en NTproBNP y BNP tras la secreción de cardiomiocitos en la
circulación (7 ). Sin embargo, nuestro análisis de
espectrometrı́a de masas no identificó fragmentos del
proBNP en la circulación de los pacientes con IC (n ⫽
4), quizás debido al anticuerpo que elegimos para la
inmunoprecipitación. Katrukha y cols. demostraron
previamente que los anticuerpos especı́ficos para el lugar no podı́an acceder a la región altamente glucosilada
Evaluación de LMPGs NACB con AGREE II
del NT-proBNP28 – 45 en plasma de pacientes con IC a
la que estaban dirigidos, y esto también se corroboró
posteriormente mediante la eliminación enzimática de
las moléculas oligosacáridas O-glucosiladas de estas regiones que ocasionaron un importante aumento (P ⬍
0.05) en las concentraciones de NT-proBNP posteriores a la desglucosilación (24 ). Por lo tanto, los resultados de nuestro estudio se compararon con las conclusiones anteriores, en las cuales los anticuerpos NTproBNP28 – 45 monoclonales no pudieron unirse a las
regiones O-glucosiladas del NT-proBNP humano. Las
correlaciones relativamente estrechas de las concentraciones de NT-proBNP13–76 (región no glucosilada) en
plasma con NT-proBNP13– 45 y NT-proBNP28 –76 sugirieron que las concentraciones de O-glucosilación
(no glucosiladas en comparación con las glucosiladas)
en el NT-proBNP endógeno son comparativamente
constantes en un grupo seleccionado de pacientes con
IC crónica (Fig. 3, C y E). Esto está respaldado por el
trabajo de Nishikimi y cols., que recientemente informaron que los cocientes de formas glucosiladas y no
glucosiladas de NT-proBNP en plasma son constantes
en todos los pacientes con IC (clase 1– 4 de NYHA)
(25 ).
Se ha informado la presencia de moléculas de oligosacáridos unidas por oxı́geno en los residuos Ser y
Thr en la región del NT-proBNP28 – 45 humano en la
documentación para mantener la estabilidad del NTproBNP en la circulación (26 ). Por lo tanto, es probable que los anticuerpos monoclonales dirigidos a los
sitios no glucosilados entre NT-proBNP28 – 45 [es decir,
NT-proBNP30 –35 (Glu-Leu-Gln-Val-Glu-Gln motif)]
excluyan los efectos de la O-glucosilación en la
medición del NT-proBNP en plasma. Esto, junto con
los anticuerpos monoclonales dirigidos al NTproBNP13–20, puede proporcionar una medición más
estandarizada del NT-proBNP en plasma para los futuros inmunoanálisis no competitivos. Nuestros datos
indican que si bien el NT-proBNP inmunoreactivo estuvo presente en el plasma humano en forma de
múltiples fragmentos de la molécula del NT-proBNP
completa, los epı́topos especı́ficos del péptido parecen
ser más abundantes, lo que proporciona objetivos ideales para el desarrollo de análisis de diagnóstico de
última generación para uso clı́nico.
En resumen, hemos proporcionado evidencia que
indica que un inmunoanálisis ideal para detectar el
NT-proBNP en plasma no deberı́a dirigir las regiones
de los extremos N y C terminales del NT-proBNP, debido a los truncamientos proteolı́ticos endógenos en
estos sitios, y además no deberı́a dirigirse a la sección
central O-glucosilada de la proteı́na. Estos resultados
serán importantes para el desarrollo de los inmunoanálisis de NT-proBNP de última generación para fines
de diagnóstico. Nuestras conclusiones allanarán el
camino para el desarrollo de un inmunoanálisis de NTproBNP de tercera generación comercial más estandarizado a fin de detectar la presencia de IC.
Contribuciones de los autores: Todos los autores confirmaron que
han contribuido al contenido intelectual de este documento y han cumplido con los siguientes 3 requerimientos: (a) contribuciones significativas a la concepción y el diseño, la adquisición de datos o el análisis e
interpretación de estos; (b) redacción o revisión del artı́culo en relación
con su contenido intelectual; y (c) aprobación final del artı́culo
publicado.
Declaración de los autores o posibles conflictos de interés: Tras la
presentación del manuscrito, todos los autores completaron el formulario de declaración del autor. Declaraciones o posibles conflictos de
interés:
Empleo o liderazgo: No se declara.
Papel del consultor o asesor: No se declara.
Propiedad de acciones: No se declara.
Honorarios: No se declara.
Financiamiento de la investigación: B.L. Schulz, Beca de National
Health and Medical Research Council Project Grant 631615 y National Health and Medical Research Council Career Development
Fellowship APP1031542; C. Punyadeera, Programa de becas de
Queensland Government Smart Futures Fellowship Programme
(QGSFF), Fondos para la investigación de University of Queensland
New Staff Research Funds (UQNSRSF 601252), Programa de premios a la excelencia de University of Queensland Foundation Research Excellence Award Scheme y donaciones de anticuerpos NTproBNP monoclonales de Perkin Elmer (EE. UU.).
Testimonio de expertos: No se declara.
Patentes: No se declara.
Papel del patrocinador: Las organizaciones patrocinadoras no jugaron papel alguno en el diseño del estudio, la selección de los pacientes
inscriptos, la revisión e interpretación de los datos ni la preparación
o aprobación del manuscrito.
Agradecimientos: Los autores agradecen la ayuda de Fairuz Jamaluddin con las pipetas Zip-Tip en cuatro muestras de plasma
de los pacientes con IC para el análisis de espectrometrı́a de
masas.
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