Guía de usuario de RapidFinder STEC Detection Workflow

USER GUIDE
Detección por PCR en tiempo real de la toxina Shiga que produce E. coli
(STEC) en muestras de carne vacuna
Aislamiento de ADN basado en la columna de centrifugación y detección por PCR en tiempo real de
E. coli O157:H7 y cepas "Big 6" de STEC no O157
Número de catálogo 4426715, 4476886, 4476901
N.º de pub. MAN0011144 Rev. A.0
ADVERTENCIA! Lea las hojas de datos de seguridad (SDS) y
siga las instrucciones de manipulación. Lleve el equipo de
protección individual (EPI) adecuado (gafas, ropa, guantes).
Las hojas de datos de seguridad (SDS) se encuentran
disponibles en www.lifetechnologies.com/support.
En esta guía se proporcionan las instrucciones de uso del PrepSEQ®
Rapid Spin Sample Preparation Kit – Extra Clean with Proteinase K
para preparar ADN compatible con la PCR a partir de muestras de 375
g de carne vacuna y detectar después por PCR con los ensayos de
screening y confirmación de RapidFinder™ STEC.
Nota: Estas instrucciones asumen que se tiene experiencia con los kits;
los usuarios inexpertos deben consultar Apéndice A, “Directrices
importantes sobre el procedimiento”.
Visite www.lifetechnologies.com/foodsafety para ver una lista
exhaustiva de flujos de trabajo para la detección de la E. coli
(Pub. no. MAN0009419).
Flujo de trabajo
Materiales necesarios
A menos que se indique lo contrario, todos los materiales están
disponibles en Life Technologies (www.lifetechnologies.com).MLS:
Fisher Scientific (www.fisherscientific.com) u otro proveedor
principal de productos de laboratorio (Major laboratory supplier).
Nota: Los componentes del kit se pueden enviar por separado en
función de la configuración y las condiciones de almacenamiento.
Tabla 1 PrepSEQ® Rapid Spin Sample Preparation Kit – Extra Clean with
Proteinase K (100 reacciones, Cat. no. 4426715)
Componentes
Columnas de centrifugación
Tubos de microcentrifugado, 1,5 ml
Lysis Buffer, 1 botella
Proteinase K (20 mg/ml), 1 tubo
[1]
Cantidad o
volumen
100
2 × 100
5 ml
1,25 ml
Conservación[1]
Temperatura
ambiente
(23±5 °C)
5±3 °C
Inferior a -18 °C
Consulte la etiqueta del producto para conocer la fecha de caducidad.
Para analizar muestras ambientales y de alimentos solamente.
Tabla 2 RapidFinder™ Ensayo de cribado de STEC (96 reacciones;
Cat. no. 4476886)
Descripción
Cantidad
Microesferas del
ensayo liofilizadas[2],
tiras de 8 tubos (tapas
azules)
12 tiras (96 tubos)
1 gradilla
MicroAmp® Optical 8Cap Strips (tapas
transparentes)
12 tiras (96 tapas)
Control negativo de
detección de
patógenos (tapa roja)
1,5 ml
[1]
[2]
[3]
Conservación[1]
5±3 °C
Proteja de la luz y la
humedad.[3]
5±3 °C
Consulte la etiqueta del producto para conocer la fecha de caducidad del kit.
Las microesferas pueden tener un tono morado-rosáceo.
Guarde las bolsas en un recipiente hermético.
Tabla 3 RapidFinder™ Ensayo de confirmación de STEC (96 reacciones;
Cat. no. 4476901)
Descripción
Conservación[1]
Cantidad
Microesferas del ensayo
liofilizadas[2], tiras de 8 tubos
(tapas rosas)
12 tiras (96 tubos)
1 gradilla
MicroAmp Optical 8-Cap
Strips (tapas transparentes)
12 tiras (96 tapas)
Control negativo de detección
de patógenos
1,5 ml
®
[1]
[2]
[3]
5±3 °C
Proteja de la luz y
la humedad.[3]
5±3 °C
Consulte la etiqueta del producto para conocer la fecha de caducidad del kit.
Las microesferas pueden tener un tono morado-rosáceo.
Guarde las bolsas en un recipiente hermético.
Tabla 4 Otros materiales necesarios
Artículo
Origen
Instrumento y equipo
Applied Biosystems 7500 Fast
Real-Time PCR System
Póngase en contacto con su
representante de ventas local.
RapidFinder™ Express Software
Versión 1.2.1
Disponible en
www.lifetechnologies.com/us/en/
home/technical-resources/
software-downloads/rapidfinderexpress-software.html[1]
®
MicroAmp® 96-well Base
Cat. no. N8010531
MicroAmp® Cap Installing Tool
Cat. no. 4330015
Soporte de placa 7500 Fast
Precision para tubos de 0,1 ml
Cat. no. 4403809
Para aislar el ADN:
Microcentrífuga de mesada
MLS
Para PCR:
Microcentrífuga de mesada con
adaptadores para tiras de 8 tubos
MLS
Artículo
Bloques térmicos, 97 °C y 56 °C
Origen
MLS
Mezclador Vortex de laboratorio
MLS
Gradilla para tubos de 1,5 ml
MLS
Pipetas:
• Desplazamiento positivo
• Desplazador de aire
• Multicanal
MLS
Consumibles
Bolsas de enriquecimiento con
malla, 10” × 15”, 92 onzas (WhirlPak® Filter Bag for Homogenizer
Blenders o equivalente)
Nasco B01488WA o equivalente
Guantes desechables
MLS
Tips de micropipeta, resistentes a
los aerosoles (con filtro)
MLS
Para usar como tubos de equilibrio
vacíos según sea necesario:
MicroAmp® Fast 8-Tube Strip,
0,1 ml
MicroAmp® Optical 8-Cap Strips
Cat. no. 4358293
Cat. no. 4323032
Reactivos
Nuclease-Free Water
Cat. no. AM9938
Caldo de triptona de soja, medio
seco
Oxoid CM0129
[1]
Actualización gratuita de RapidFinder™ Express Software v1.1
o
Centrífuga de placas
Incubadoras de aire forzado, 42 °C
MLS
Preparación de las muestras de alimentos
1
Homogeneización y
enriquecimiento de las
muestras de alimentos
a. Por cada 375 g de muestra de carne vacuna, precaliente 1 l de caldo de triptona de soja (TSB, Tryptone
Soya Broth) preparado a 48±1 °C.
b. Combine 300-500 ml de TSB precalentado con una muestra de carne vacuna de 375 g en una bolsa de
enriquecimiento filtrada y apriete la bolsa 10 veces como mínimo para homogeneizar la muestra.
c. Añada el resto de TSB precalentado a la bolsa, mezcle brevemente y, a continuación, incube a 42±1 °C
durante 16-20 horas.
Aislamiento del ADN mediante el PrepSEQ® Rapid Spin Sample Preparation Kit – Extra Clean with
Proteinase K
2
Preparación del
Proteinase K-Lysis
Buffer y
precalentamiento de los
bloques térmicos
Antes de cada uso del kit:
•
Prepare el Proteinase K-Lysis Buffer: combine los siguientes componentes para el número de muestras
necesario; almacénelos en hielo hasta su uso.
Componente
Volumen por muestra
Volumen para n muestras[1]
5 µl
5,5 µl × n
50 µl
55 µl × n
Proteinase K, 20 mg/ml
Lysis Buffer
[1]
•
2
Incluye un 10 % de excedente.
Precaliente los bloques térmicos a 97 °C y 56 °C.
Guía de usuario de RapidFinder™ STEC Detection Workflow (aislamiento de ADN mediante la columna de centrifugación)
3
Filtrado de la muestra
enriquecida mediante la
columna de
centrifugación
a. Inserte una columna de centrifugación en un tubo rotulado, retire 750 μl de la muestra enriquecida
procedentes de la parte filtrada de la bolsa de enriquecimiento, cargue la muestra en la columna de
centrifugación y tape la columna.
b. Microcentrifugue el conjunto de la columna de centrifugación a 12 000-16 000 × g durante 3 minutos
aproximadamente.
c. Saque el conjunto de la microcentrífuga y, a continuación, deseche la columna de centrifugación usada.
d. Aspire suavemente el sobrenadante sin alterar el sedimento y, a continuación, deseche el sobrenadante.
4
Lisado de la muestra
a. Añada 55 μl de Proteinase K-Lysis Buffer al sedimento y pipetee arriba y abajo o agite hasta que el
sedimento quede bien disperso.
b. Transfiera la mezcla a un tubo limpio de 1,5 ml evitando la grasa residual.
c. Tape el tubo e incube a 56±1 °C durante 30 minutos como mínimo.
d. Incube a 97±2 °C durante 12±2 minutos y, a continuación, deje que la muestra se enfríe a temperatura
ambiente (23±5 °C) durante unos 2 minutos.
e. Microcentrifugue el tubo a 12 000-16.000 × g durante 1 minuto aproximadamente.
f. Añada 250 μl de Nuclease-Free Water y mezcle bien.
g. Microcentrifugue el tubo a 12 000-16 000 × g durante 1-2 minutos.
PUNTO DE PARADA
(Opcional) Almacene el ADN de una de las siguientes maneras:
A 5±3 °C durante 24 horas como máximo.
Por debajo de –18 °C durante 1 año como máximo.
·
·
Realización de la PCR con el RapidFinder™ Ensayo de cribado de STEC
5
Creación o edición del
archivo de ejecución en
RapidFinder™ Express
Software
En la página principal del RapidFinder™ Express Software,Versión 1.2.1, seleccione Create/Edit a Run File
(Crear/Editar un archivo de ejecución) e introduzca o edite la información sobre el archivo de ejecución.
6
Preparación de las
microesferas del ensayo
Siga la disposición de la placa que determine el RapidFinder™ Express Software.
a. Transfiera el número adecuado de tubos individuales o tiras de 8 tubos de la bolsa de almacenamiento a
una base de 96 pocillos a temperatura ambiente (23±5 °C).
b. Si lo exige la disposición de la placa, ponga las MicroAmp® Fast 8-Tube Strips vacías (o las tiras
parciales) para equilibrar la bandeja cuando se coloquen los tubos de ensayo en el instrumento más
tarde.
7
Preparación de las
reacciones de la PCR
Siga las directrices indicadas en “Manipulación de las muestras” en la página 5 relativas a las muestras
almacenadas.
a. Siga la disposición de la placa que determine el RapidFinder™ Express Software, añada 30 μl de muestra
o control a cada microesfera del ensayo a temperatura ambiente (23±5 °C).
b. Selle los tubos con las tapas ópticas en tiras transparentes que se incluyen en el kit.
c. Asegúrese de que las reacciones queden bien mezcladas: agítelas durante 5-10 segundos a máxima
velocidad.
d. Asegúrese de que los reactivos queden en el fondo de los tubos: centrifugue los tubos a 1000-2000 × g
durante 30 segundos aproximadamente.
e. Repita el paso c y el paso d.
8
Carga y ejecución de las
reacciones
En el RapidFinder™ Express Software, seleccione Start Instrument Run
(Iniciar ejecución de instrumento)
en la página principal, elija el archivo de ejecución adecuado y siga los mensajes del software.
9
Visualización de los
resultados del ensayo
de screening
En RapidFinder™ Express Software, seleccione View Results (Ver resultados) en la página principal,
seleccione el archivo de ejecución adecuado y siga los mensajes para ver los resultados.
Seleccione la casilla de verificación del módulo STEC Screen (Cribado de STEC).
Guía de usuario de RapidFinder™ STEC Detection Workflow (aislamiento de ADN mediante la columna de centrifugación)
3
Realización de la PCR con el RapidFinder™ Ensayo de confirmación de STEC
10
Preparación y ejecución
del ensayo de
confirmación de STEC
Siga los mensajes del software para crear el archivo de ejecución, seleccionando la casilla de verificación del
módulo STEC Confirm (Confirmación de STEC) y, a continuación, prepare y ejecute las reacciones descritas
en “Realización de la PCR con el RapidFinder Ensayo de cribado de STEC” en la página 3.
11
Visualización, impresión
y exportación de los
resultados del ensayo
de confirmación de
STEC
Imprima o exporte los resultados desde la pestaña Reports (Informes) de la página View Results (Ver
resultados).
Para obtener más información acerca del análisis de los datos, consulte:
• La guía de usuario de su instrumento.
• La ayuda en línea de RapidFinder™ Express Software.
Métodos de confirmación independientes
USDA FSIS MLG 5.08 e ISO 16654:2001 son protocolos aprobados para
la confirmación de E. coli O157:H7 y E. coli O157 respectivamente.
Se pueden usar los ensayos TaqMan® para distinguir entre los
serogrupos de las muestras cuyo resultado se determine positivo
según el RapidFinder™ Ensayo de confirmación de STEC.
Colocación de la columna de centrifugación/el tubo en la
microcentrífuga
Oriente la bisagra de la tapa del tubo hacia el interior del rotor y sitúe
la tapa en dirección opuesta a la rotación.
Tabla 5 Ensayos TaqMan® STEC
Ensayo
Cat. no.
Diseño ISO[1]
Ensayo TaqMan® STEC 045 y 0121
4485082
Ensayo TaqMan® STEC 026, 0103 y 0145
4485083
Ensayo TaqMan STEC 0111 y 0104
4485084
®
Diseño MLG[2]
TaqMan® STEC O103 y O145
4485063
TaqMan STEC O26 y O111
4485064
TaqMan STEC O45 y O121
4485065
®
®
[1]
[2]
Siga las directrices ISO/TS 13136:2012.
Siga las directrices USDA FSIS MLG 5B (no O157).
Apéndice A Directrices importantes sobre el
procedimiento
Posición incorrecta de
las tapas de los tubos
Para muestras con alto contenido en grasa: retire la capa
de grasa antes del lisado
En el caso de las muestras que contengan una capa superior de grasa
definida después de la centrifugación mediante la columna de
centrifugación, retire la capa de grasa y el sobrenadante de la manera
siguiente:
Tipo de capa de
grasa
•
Use una técnica aséptica adecuada al manipular las muestras para
impedir una contaminación cruzada.
Use una incubadora de aire forzado y asegúrese de que haya
suficiente espacio entre las bolsas de enriquecimiento para que
pueda fluir el aire.
Retirada de la capa de grasa y el sobrenadante
Líquido
Use una pipeta para retirar la grasa de la superficie
superior aspirando con un movimiento circular.
Siga recogiendo el sobrenadante de la superficie
superior hasta retirarlo por completo (deseche el
sobrenadante).
Capa de grasa
sólida
Use una pipeta para desprender suavemente la capa
de grasa y drenar el sobrenadante y la capa de grasa
con un movimiento rápido (deseche el sobrenadante).
Retire el resto de sobrenadante con una pipeta.
Directrices para el enriquecimiento de muestras
•
Posición correcta de
las tapas de los tubos
Directrices para aislar el ADN
Agua limpia para PCR
Use Nuclease-Free Water (Cat. no. AM9938) para todos los
procedimientos descritos en este protocolo que requieran el uso de
agua.
4
Directrices para RapidFinder™ STEC PCR
Software
•
Asegúrese de utilizar RapidFinder™ Express Software,
Versión 1.2.1, que incluye los módulos STEC Screening y STEC
Confirmation. El número de versión se muestra en la página
principal del software.
Guía de usuario de RapidFinder™ STEC Detection Workflow (aislamiento de ADN mediante la columna de centrifugación)
•
El software determina la disposición de la ejecución (disposición
de la placa) durante la creación del archivo de ejecución; por tanto,
se debe preparar antes de distribuir muestras de ADN a las
microesferas del ensayo.
•
MicroAmp® Tube Strips llevan etiquetados los números 1 al 8 en el
lateral de los tubos para orientar las tiras de tubos durante la
manipulación.
Si necesita obtener más información, consulte el Applied Biosystems®
RapidFinder™ Express Software v1.2.1 Quick Reference (Pub. no. 4480999)
o la ayuda en línea del software.
Manipulación de las muestras
•
•
•
Si se han almacenado las muestras de ADN o se ha dispersado el
sedimento, descongele las muestras (si es necesario), agítelas y
centrifúguelas a 12,000-16,000 × g durante 1-2 minutos. Con este
paso se impedirá una contaminación cruzada y se excluirán las
partículas de la PCR.
Use una nueva punta de pipeta para cada muestra.
Si mezcla microesferas de ensayo con muestras de ADN
pipeteándolas arriba y abajo, mantenga la punta de la pipeta en el
fondo del tubo para minimizar la formación de aerosoles y la
contaminación cruzada.
Para muestras con alto contenido en grasa después del lisado:
recogida de muestra de ADN para la PCR
Después del lisado, las muestras de alimentos con alto contenido en
grasa o aceite pueden formar una capa superior que contenga grasa y
residuos encima de la fase acuosa que contiene el ADN. Recoja la
muestra de ADN para la PCR de la fase intermedia transparente,
evitando la capa superior y el sedimento inferior.
Figura 2 MicroAmp® Etiquetado de las tiras de tubos
En esta foto, se han resaltado los números grabados en relieve para
mejorar su visibilidad.
Si es necesario para la referencia visual de lo anterior, marque la
pestaña por un extremo de la tira de las tapas. No marque el
centro de ninguna de las tapas (esto puede interferir con la
detección de la PCR en tiempo real).
Use la MicroAmp® 96-Well Base y la MicroAmp® Cap Installing
Tool para sellar los tubos de ensayo con las tiras de tapas ópticas.
Esto impedirá que los tubos se caigan, se doblen o queden mal
alineados.
•
Confirme que las tiras están rectas y que cada tubo esté alineado
con el tubo adyacente.
Use un adaptador de placas para agitar las tiras de tubos o sujete
las tiras de la MicroAmp® 96-Well Base mientras las agita.
•
Buenas prácticas de laboratorio para PCR y RT-PCR
Evite la capa superior que contiene grasa/aceite
Recoja la muestra para PCR por debajo
de la capa de grasa/aceite
Evite el material con partículas de la columna
Figura 1 Muestras con alto contenido en grasa: recoja la muestra de
la fase intermedia después del lisado.
MicroAmp® tiras de tubos
•
•
Siga estas instrucciones para garantizar una conservación
adecuada de las tiras de tubos:
– Recorte la bolsa de almacenamiento por la marca situada
encima de la tira resellable.
– Vuelva a sellar siempre la bolsa de almacenamiento con el
desecante y vuelva a conservarla a 5±3 °C.
Las tiras de 8 tubos se pueden cortar con tijeras.
Si fuera necesario, recorte el material conector que quede para
permitir que encajen mejor con los tubos adyacentes en el 7500
Fast Precision Plate Holder for MicroAmp® Tube Strips.
Cuando se preparan muestras para la amplificación de PCR o RT-PCR:
• Use guantes limpios y una bata de laboratorio limpia (no usados
previamente durante la manipulación de productos amplificados o
usados durante la preparación de la muestra).
• Cámbiese de guantes siempre que sospeche que están
contaminados.
• Mantenga áreas separadas, equipo y suministros exclusivos para
la:
– Preparación de la muestra y la preparación de la reacción.
– Amplificación y análisis de los productos.
• No lleve los productos amplificados al área de preparación de la
reacción.
• Abra y cierre todos los tubos de muestras con cuidado. Evite
salpicar o rociar las muestras.
• Mantenga las reacciones y los componentes tapados tanto tiempo
como sea posible.
• Utilice una pipeta de desplazamiento de aire positivo o puntas de
pipeta con filtro resistentes a los aerosoles.
• Limpie las mesas de trabajo del laboratorio y el equipo
periódicamente con una solución con lejía al 10 % o DNAZap™
Solutions (Cat. no. AM9890).
Si necesita obtener más información, consulte ISO 22174 (2005).
Documentación y soporte
Historial de revisiones
Revisión
A.0
Fecha
Octubre de 2014
Guía de usuario de RapidFinder™ STEC Detection Workflow (aislamiento de ADN mediante la columna de centrifugación)
Descripción
Documento nuevo.
5
Documentación relacionada
Publicación
N.º de pub.
Applied Biosystems® RapidFinder™ Express Software
v1.2.1 Quick Reference
4480999
Applied Biosystems RapidFinder Express Software
v1.2.1 and SDS software v1.4.2.1 User Bulletin
4480998
®
™
TaqMan® Assays for Food and Environmental Testing User MAN0009391
Guide
Asistencia al cliente y soporte técnico
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servicios y asistencia, incluyendo lo siguiente:
• Números de teléfono de contacto de todo el mundo
• Soporte del producto, incluyendo:
– Preguntas más frecuentes (FAQ) sobre productos
– Software, parches y actualizaciones
• Pedidos y soporte web
• Documentación del producto, incluyendo lo siguiente:
– Guías de usuario, manuales y protocolos
– Certificados de análisis
– Fichas técnicas de seguridad (Safety Data Sheets, SDS; también
conocidas como MSDS)
Nota: Para conocer las SDS de los reactivos y productos
químicos de otros fabricantes, póngase en contacto con el
fabricante.
Asistencia sobre seguridad alimentaria
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Número de teléfono dentro de Norteamérica: 1-800-500-6855
Número de teléfono fuera de Norteamérica: Visite
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Translated from the English Publication Number MAN0010869 Rev. A.0.
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20 Abril 2015