Fiebre del Valle del Rift

CAPITULO 2.1.8.
FIEBRE DEL VALLE DEL RIFT
RESUMEN
La fiebre del Valle del Rift (FVR) es una zoonosis aguda o hiperaguda de rumiantes domésticos de
África. Está causada por un único serotipo de un bunyavirus del género Phlebovirus que es
transmitido por mosquitos. La enfermedad se presenta en condiciones climáticas que favorecen la
reproducción de los mosquitos vectores y se caracteriza por lesiones hepáticas. La enfermedad es
más grave en ovejas, cabras y ganado bovino, en los que origina abortos en animales gestantes y
una alta tasa de mortalidad en los recién nacidos. Los animales adultos no gestantes, aunque son
susceptibles a la infección, son más resistentes a las manifestaciones clínicas de la enfermedad.
Existe una amplia variación en la susceptibilidad al FVR entre animales de distinto genotipo.
Aquellas razas o cepas que son exóticas en África o que proceden de áreas donde la FVR no es
endémica, tienden a ser más susceptibles. Los camellos sufren una infección asintomática por
FVR, pero las tasas de aborto pueden ser tan altas como en el ganado bovino.
Los humanos resultan sensibles a la infección mediante contacto con material infectado o por
picaduras de mosquito. La infección humana por vectores es una característica llamativa en países
con una población relativamente pequeña de animales hospedadores. En tales áreas, la FVR
puede manifestarse primero en humanos. Ha causado enfermedad grave en personal de
laboratorio y debe ser manejado con un alto nivel de bioseguridad (13,15). Se recomienda que el
personal de laboratorio esté vacunado.
Identificación del agente: el virus FVR representa un único serotipo de un bunyavirus del género
Phlebovirus y tiene las propiedades morfológicas y fisicoquímicas típicas de los bunyavirus. El
virus tiene un genoma segmentado con ARN de una sola cadena y polaridad negativa y consta de
tres segmentos: L (grande), M (medio) y S (pequeño), cada uno de los cuales está contenido en
una nucleocápsida separada dentro del virión. El segmento S es un ARN de doble sentido, es
decir, presenta codificación bidireccional (9).
El virus se puede aislar de la sangre, recogida preferentemente con anticoagulante, durante la fase
febril de la enfermedad, o del hígado, bazo y tejidos cerebrales de animales muertos o de los
órganos de fetos abortados. Los aislamientos primarios se hacen normalmente en cultivos
celulares de varios tipos, tales como células de riñón de mono verde africano (células Vero),
células de riñón de hámster neonato, retículo de embrión de pollo (CER: células desarrolladas por
Tsunemasa Motohashi en el Nippon Institute for Biological Science, Tokio, Japón) o en células
primarias de origen ovino o bovino. Alternativamente, para el aislamiento primario del virus se
pueden usar hámsteres, ratones adultos o lactantes, huevos de gallina embrionados o corderos de
dos días de edad.
Se puede efectuar un diagnóstico rápido usando como antígeno el sobrenadante de muestras
homogenizadas en pruebas de neutralización vírica (NV); por tinción inmunofluorescente de frotis
de hígado, bazo, cerebro o cultivos celulares infectados; o por demostración del virus en el suero
tomado durante la fase febril de la enfermedad mediante enzimoinmunoensayo o por
inmunodifusión.
La presencia de lesiones histopatológicas características en el hígado sirve de ayuda al
diagnóstico.
Pruebas serológicas: Los animales infectados desarrollan anticuerpos específicos que pueden
ser demostrados por NV a los 3 días después de la infección o por enzimoinmunoensayo a los 67 días, y por inhibición de la hemaglutinación. Otras pruebas serológicas menos usadas incluyen
inmunofluorescencia, fijación de complemento e inmunodifusión.
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Capítulo 2.1.8. — Fiebre del Valle del Rift
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: Las vacunas con virus vivos y los
antígenos para uso en países donde FVR es endémica o en otros durante brotes epidémicos,
deben prepararse a partir de cepas no patógenas de virus FVR crecidas en cultivos celulares de
ratón o atenuadas por mutación. La cepa de FVR atenuada por mutación no se encuentra todavía
en fase recomendable para su uso.
En países que están libres del virus FVR, las vacunas y las pruebas diagnósticas deben limitarse a
aquellas en las que se emplea virus inactivado. Se pueden obtener cepas adecuadas de virus en el
Laboratorio de Referencia para FVR de OIE (véase Cuadro presentada en la Parte 3 de este
Manual).
A. INTRODUCCIÓN
La Fiebre del Valle del Rift (FVR) es una enfermedad febril zoonósica aguda o hiperaguda, transmitida por
mosquitos, y causada por un virus de la familia Bunyaviridae, género Phlebovirus. Normalmente se presenta en
forma epizoótica en extensas áreas de un país después de fuertes lluvias e inundaciones, y se caracteriza por
altas tasas de abortos y mortalidad neonatal, principalmente en ovejas, cabras y ganado bovino. La
susceptibilidad al FVR varía considerablemente en razas diferentes. Algunos animales autóctonos de África
muestran sólo infecciones asintomáticas, mientras que los foráneos o de otras razas sufren una manifestación
clínica grave con mortalidad y aborto. Los animales susceptibles de mayor edad no gestantes y algunas otras
especies no muestran signos de enfermedad. Los camellos se han relacionado con frecuencia con las epidemias
de FVR en el este de África y Egipto. La enfermedad clínica no aparece en camellos adultos, pero se presentan
abortos y se han observado algunas muertes postnatales tempranas.
Los síntomas de la enfermedad suelen ser poco específicos, haciendo difícil el reconocimiento de casos
individuales (5-8, 16, 28). Sin embargo, es característica la existencia de numerosos abortos y de
mortalidad entre animales jóvenes, junto a la enfermedad en humanos. La FVR tiene un período de incubación
corto: 12-36 horas en corderos. Puede aparecer una fiebre bifásica de hasta 41°C, y la fiebre permanece alta
hasta poco antes de la muerte. Los animales afectados muestran decaimiento, poca tendencia al desplazamiento
o a la alimentación, y pueden presentar hinchazón en los nódulos linfáticos superficiales y dolor abdominal. Los
corderos raramente sobreviven más de 36 horas tras la aparición de los signos de enfermedad. Los animales
mayores de 2 semanas pueden morir con manifestaciones agudas, hiperagudas o desarrollar una infección
asintomática. Algunos animales pueden regurgitar la ingesta y presentar diarrea hemorrágica o sanguinolenta de
olor nauseabundo junto con descargas nasales mucopurulentas con restos de sangre. A veces se puede
observar ictericia, particularmente en los bóvidos. Además de estos síntomas, el ganado adulto puede presentar
lagrimeo, salivación y falta de producción láctea. En ovejas gestantes, la mortalidad y la frecuencia de aborto
varían del 5% a casi el 100% en diferentes brotes y en diferentes manadas. La tasa de muerte en el ganado
vacuno es normalmente inferior al 10%.
Las lesiones hepáticas de la FVR son muy similares en todas las especies, variando principalmente con la edad
del individuo infectado (6). Las lesiones más notables se presentan en fetos abortados y corderos recién nacidos
y consisten en un aumento de tamaño moderado o grande del hígado que se presenta blando y sin consistencia,
con color que varía de marrón amarillento a marrón rojizo y manchas irregulares de congestión. En el
parénquima, siempre se presentan numerosos focos necróticos de color blanco grisáceo, pero que pueden no
ser fácilmente discernibles. En la oveja adulta, las lesiones son menos graves y aparecen focos necróticos
distribuidos por todo el parénquima de color rojizo o blanco grisáceo. Por lo general, la pared de la vesícula biliar
presenta hemorragias y edema. Las lesiones hepáticas en los corderos se acompañan casi siempre de
numerosas hemorragias pequeñas en la mucosa del rumen. El contenido del intestino delgado y del rumen es de
color chocolate oscuro a consecuencia de la presencia de sangre parcialmente digerida. En todos los animales,
el bazo y los nódulos linfáticos periféricos se inflaman, están edematosos y pueden presentar petequias.
A nivel microscópico, la lesión más evidente de la FVR tanto en animales como en humanos es la necrosis
hepática. En los fetos y neonatos de ganado vacuno y ovino, los focos necróticos consisten en agregados
densos de restos celulares y nucleares, algo de fibrina y unas cuantas células inflamatorias. Existe una
importante necrosis lítica en la mayoría de los hepatocitos y se pierde la arquitectura normal del hígado. En casi
el 50% de los hígados afectados, se encuentran cuerpos de inclusión intranuclear que son eosinofílicos y ovales
o bacilares. También se observa mineralización de los hepatocitos necrosados. En los animales adultos, la
necrosis hepática es menos difusa y en las ovejas la ictericia es mas frecuente que en los corderos (26).
En humanos, las infecciones por FVR son normalmente asintomáticas o asociadas a una manifestación no fatal
similar a la gripe que varía de moderada a grave (15). Una minoría de pacientes puede desarrollar lesiones
oculares, encefalitis o una enfermedad hepática grave con manifestaciones hemorrágicas, que, por lo general, es
fatal. En humanos, el virus FVR ha causado infección grave entre personal de laboratorio. La plantilla debe ser
vacunada y trabajar con un nivel 3 de contención, en condiciones de un nivel 4 de contención, o llevar protección
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respiratoria. Se necesita tener un cuidado especial cuando se trabaja con animales infectados o cuando se
realizan análisis post-mortem (ver Capítulo I.1.6. Seguridad humana en los laboratorios veterinarios de
microbiología).
No se han demostrado diferencias antigénicas significativas entre aislamientos de FVR y cepas cultivadas en
laboratorio de muchos países, pero se han visto diferencias en cuanto a patogenicidad (27).
La infección en humanos a través de mosquitos vectores es una característica propia de países que, como
Egipto, tienen una población relativamente escasa de animales hospedadores y una gran población de
mosquitos.
La FVR se presenta normalmente como epizootias en África, que pueden incluir varios países en una región
aislada y al mismo tiempo. Estas manifestaciones siguen a ciclos periódicos de lluvias excepcionalmente fuertes
que pueden ocurrir muy raramente en zonas semiáridas (ciclos de 25-35 años), o más frecuentemente (ciclos de
5-15 años) en praderas de la sabana. En períodos entre epizootias puede ocurrir un bajo nivel indetectable de
FVR. Se debe sospechar la existencia de FVR cuando a lluvias extraordinariamente fuertes sigue la presentación
de abortos junto a una enfermedad fatal caracterizada por necrosis y hemorragias en el hígado, que afecta sobre
todo a corderos, cabritos y terneros, y que es paralela a la aparición de una enfermedad semejante a la gripe en
trabajadores de granjas y personal que maneja carne cruda.
Cuando existen sospechas de que se manipula carne y muestras de tejido infectadas por el virus FVR se deben
utilizar medidas preventivas para proteger a los trabajadores de la infección.
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
1.
Identificación del agente
El virus FVR se puede aislar del suero y de la sangre recogida con anticoagulante durante la fase febril de la
enfermedad, del hígado, del bazo, y del cerebro de animales que hayan muerto, o de fetos abortados.
Normalmente el aislamiento primario se realiza en hámsteres, ratones jóvenes o adultos, o en cultivos celulares
de varios tipos.
a)
Cultivo
Para el aislamiento de virus debe disponerse de aproximadamente 5 ml de sangre recogida durante el
estado febril de la enfermedad o unos 5 g de hígado, bazo o cerebro recogidos tras la muerte. Las muestras
deben mantenerse a 0-4°C durante el transporte. Si es probable que dicho transporte dure más de 24
horas, la muestra se debe congelar y enviar en hielo seco.
Se suspende aproximadamente 1 g de tejido homogenizado al 1/10 en medio de cultivo celular o solución
salina tamponada, pH 7.5, conteniendo penicilina sódica (1.000 Unidades Internacionales [UI]/ ml), sulfato
de estreptomicina (1 mg/ml), micostatin (100 UI/ ml) o fungizona (2.5 µg/ ml). La suspensión se centrifuga a
1.000 g durante 10 minutos y el sobrenadante líquido se inyecta intracerebralmente en ratones de 1-5 días
o intraperitonealmente en hámsteres o ratones adultos. Los ratones jóvenes morirán o estarán claramente
enfermos al día 2. Los ratones adultos muestran signos de afección 1-3 días más tarde. Aunque los
animales de laboratorio preferidos son los ratones y hámsteres, también se pueden usar corderos y huevos
de gallina embrionados.
Para el cultivo del virus de la FVR pueden utilizarse varias células en monocapa, entre las que se incluyen
células de riñón de mono verde africano (Vero), riñón de hámster neonato (BHK), retículo de embrión de
pollo (CER: células desarrolladas por Tsunemasa Motohashi en el Nippon Institute for Biological Research,
Tokio, Japón; recaracterizada como una línea celular de hámster) (3) y células primarias de riñón o testículo
de ternero y cordero, que se inoculan con 1 ml de sobrenadante de la muestra y se incuban a 37°C durante
1 hora . Se aconseja inocular también algunos cultivos con una dilución 1/100 del inóculo. Con esto se evita
la producción de partículas defectivas que se produce con el uso de inócula con muy alta concentración de
virus. También deben prepararse algunos tubos con cubreobjetos. Los cultivos se lavan con tampón fosfato
salino a temperatura ambiente y se recubren con medio que contiene 2% de suero exento de anticuerpos
contra FVR. Los cultivos se observan microscópicamente durante 5-6 días. El virus FVR produce un efecto
citopático (ECP) caracterizado por provocar una ligera redondez en las células y a continuación la
destrucción de toda la monocapa celular en 12-24 horas. La identificación específica del antígeno del virus
FVR se puede realizar 18-24 horas tras la infección mediante tinción por inmunofluorescencia de las
preparaciones en los cubres.
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El virus también puede ser detectado por inmunofluorescencia en frotis de hígado, bazo y cerebro. A veces
se puede hacer un diagnóstico rápido demostrando la presencia del antígeno vírico en tejidos o sueros de
animales febriles por pruebas de fijación de complemento o de inmunodifusión en gel de agar (IGDA).
También se puede lograr un diagnóstico rápido mediante detección del ARN vírico usando una reacción en
cadena de la polimerasa con trascripción inversa (RT-PCR).
b)
Inmunodifusión en gel de agar
La prueba IGDA es de utilidad en laboratorios sin disponibilidad de servicio de cultivo de tejidos. Se
homogeniza aproximadamente 1 gramo de tejido, preferentemente hígado, y se hace una suspensión al 1020% en tampón borato salino, pH 9,0. El material se centrifuga a 1.000 g y el sobrenadante se usa en la
prueba. Las versiones de micro-IGDAs se realizan en portas estándar para microscopía que se cubren con
3 ml de agarosa al 1% en tampón borato salino. Se preparan diseños de seis pocillos periféricos y un pocillo
central que se llenan con los reactivos del siguiente modo: un suero positivo, preferentemente hiperinmune,
en el pocillo central, control positivo de antígeno en los pocillos 1 y 4, tejidos problema en los pocillos 2 y 5,
y tejidos negativos en los pocillos 3 y 6. Se debe formar una línea continua de precipitado entre el antígeno
control y el suero positivo que debería extenderse hasta incluir una línea entre el tejido problema y el suero
en caso de la prueba que fuera positiva.
c)
Reacción en cadena de la polimerasa
Se puede conseguir también un diagnóstico rápido por detección del ARN vírico (23) usando una prueba
RT-PCR. La PCR se usó, entre otras técnicas, para la detección de antígeno en dos recientes brotes de
FVR en África –uno en Kenia en 1998 y un brote limitado en Sudáfrica en 1999. La RT-PCR seguida por
secuenciación de la región que codifica la proteína NS(S) se ha empleado en análisis filogenéticos para
caracterizar dos ramas distintas del virus FVR –una egipcia y otra sub-sahariana- convirtiendo a esta
técnica en un poderoso instrumento de epidemiología molecular (22).
d)
Histopatología
El examen histopatológico del hígado de los animales afectados revelará una citopatología característica, y
la inmunotinción permitirá la identificación específica del antígeno viral del FVR en las células infectadas.
Esta es una herramienta diagnóstica importante porque el hígado y otros tejidos se pueden mantener en
formol salino en condiciones de campo con propósitos de diagnóstico, lo que facilita el manejo y transporte
en áreas alejadas del laboratorio.
2.
Pruebas serológicas
Las pruebas de neutralización del virus (NV) incluyendo la microneutralización, la neutralización por reducción de
placas (PRN) y la neutralización en ratón se han usado para detectar anticuerpos contra el virus FVR en el suero
de una variedad de especies. Las pruebas de neutralización son muy específicas y reflejarán las respuestas más
tempranas, pero estas pruebas sólo pueden llevarse a cabo con virus vivos y su uso no es recomendable fuera
de las áreas endémicas o en laboratorios sin los adecuados servicios de bioseguridad y personal vacunado.
Otras pruebas disponibles son enzimoinmunoensayo (ELISA), inhibición de la hemaglutinación (HI), IGDA,
inmunofluorescencia, radioinmunoensayo y fijación de complemento. Sin embargo, en estas pruebas pueden
ocurrir reacciones cruzadas entre el virus FVR y otros phlevovirus. Una ventaja de estas pruebas es el hecho de
que pueden realizarse con antígeno inactivado y, por consiguiente, pueden ser utilizadas en países exentos de
FVR.
La técnica ELISA es un método seguro y sensible que puede usarse con varias especies para detectar
anticuerpos contra el virus FVR. Una prueba ELISA con captura de IgM permite diagnosticar una infección
reciente en una muestra aislada de suero.
La prueba de HI puede emplearse con gran seguridad en áreas no endémicas. No obstante, los sueros de
individuos que han tenido infecciones previas con phlebovirus distintos de FVR pueden reaccionar con el
antígeno de FVR a títulos tan altos como 40 y, más raramente, a títulos de 320 (27). En casos sospechosos, el
Laboratorio de Referencia de la OIE para FVR (ver Cuadro mostrado en la Parte 3 de este Manual) puede ayudar
a realizar pruebas de neutralización para determinar la especificidad. El título de anticuerpos por HI tras la
vacunación con virus FVR vacunal puede ser tan alto como 640 o, raramente, 1.280, mientras que los títulos que
se alcanzan tras infecciones naturales por el virus FVR son, por lo general, significativamente más altos.
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a)
Neutralización vírica
La prueba NV se puede usar para determinar la presencia de anticuerpos en animales infectados por vía
natural y en animales vacunados con la vacuna VRF. La prueba es muy específica y se puede usar para
probar sueros de cualquier especie. Normalmente se usa para medir la eficacia de la vacuna. Algunos
factores, además de los anticuerpos neutralizantes, pueden jugar un papel en la resistencia frente al FVR.
Como antígeno se usa una cepa neurotrópica para cerebro de ratón muy atenuada del virus FVR
denominada cepa Smithburn (25), también conocida como virus vivo modificado y adaptado a cultivos
celulares. El antígeno se guarda a 4°C en forma liofilizada. Este stock se titula para determinar la dilución
que producirá 100 DICT50 (dosis infectiva del 50% en cultivo de tejidos) en 25 µl bajo las condiciones de la
prueba.
•
Procedimiento de la prueba
i)
Inactivar el suero problema durante 30 minutos en un baño a 56°C.
ii)
Añadir 25 µl del medio de cultivo celular con 5% de suero negativo para FVR y antibióticos en cada
uno de los 96 pocillos de una placa de cultivo celular.
iii)
Añadir 25 µl del suero problema al primer pocillo de cada fila y hacer diluciones dobles. Titular cada
suero por duplicado de 1/10 a 1/80 a efectos de prueba o por cuadruplicado y a más altas diluciones
para determinar el título de punto final. Incluir controles positivos y negativos de sueros conocidos.
iv)
Añadir 25 µl de antígeno vírico FVR (diluido con medio del cultivo celular y calculado para suministrar
100 DICT50 por pocillo) a cada pocillo que contenga el suero problema diluido y a los pocillos de las
filas que contengan controles de suero positivo y negativo. Además, hacer diluciones dobles de
antígeno en al menos dos filas de las que contienen solo medio del cultivo celular.
v)
Incubar 30 minutos a 37°C.
vi)
Añadir 50 µl por pocillo de células Vero, CER o cualquier otra suspensión celular apropiada, a una
concentración de 3 x 105 células/ml o a una dilución que se conozca que origina una monocapa
confluente en 12 horas.
vii)
Incubar las placas durante 3-5 días en una atmósfera de 3-5% de CO2.
viii) Las monocapas se examinan diariamente usando un microscopio invertido para evidenciar ECP. No
debería producirse ECP en las filas que contienen el suero control positivo y debería presentarse un
ECP claro en las filas que contengan el suero control negativo indicando la presencia de virus.
Determinar los resultados por el método de Spearman-Kärber.
b)
Enzimoinmunoensayo
Se ha desarrollado y utilizado ampliamente un método indirecto ELISA que emplea un antígeno inactivado
producido en cultivo celular y conjugado con proteína G-peroxidasa (21). El antígeno FVR para ELISA se
prepara a partir de cultivos Madin-Darby y el control negativo de antígeno se prepara a partir de monocapas
no inoculadas. Los sedimentos celulares se extraen con un método que emplea sacarosa-acetona (4) y se
inactivan con beta-propriolactona (24).
•
Procedimiento de la prueba
A menos que se señale lo contrario, los volúmenes usados son 50 µl/ pocillo, todas las diluciones se
hacen con tampón con 3% (peso/volumen) de leche deshidratada, y todos los lavados se repiten tres
veces.
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i)
Cubrir la mitad de la placa con 50 µl/pocillo de antígeno positivo y la otra mitad con antígeno negativo
a una dilución predeterminada. Incubar toda la noche a 4°C. Lavar la placa.
ii)
Añadir 100 µl/pocillo de tampón bloqueante, incubar 1 hora a 37°C. Lavar la placa.
iii)
Añadir el suero problema y los sueros control a una dilución predeterminada por duplicado al antígeno
positivo y al negativo. Incubar 1 hora a 37°C. Lavar la placa.
iv)
Añadir el conjugado de Proteína G/peroxidasa de rábano a dilución adecuada. Incubar 1 hora a 37°C.
Lavar la placa.
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v)
Añadir el substrato tetrametilbenzidina como se presenta comercialmente y dejar la placa 20 minutos a
temperatura ambiente (22°C) en la oscuridad (tiempo de desarrollo).
vi)
Añadir solución que detiene la reacción (ácido sulfúrico 2 M) y leer la placa a una densidad óptica de
450/650 nm.
vii)
La disposición de la placa es como se indica:
1
2
3
4
5
6
7
8
9
A
(1)
(1)
(5)
B
(2)
(2)
(6)
C
(3)
(3)
(19)
D
(4)
(4)
(20)
E
(1)
(1)
(5)
F
(2)
(2)
°(6)
10
11
12
(5)
(cc)
(cc)
(6)
(c++)
(c++)
(19)
(c+)
(c+)
(20)
(c– –)
(c– –)
(5)
(cc)
(cc)
(6)
(c++)
(c++)
G
(3)
(3)
(19)
(19)
(c+)
(c+)
H
(4)
(4)
(20)
(20)
(c– –)
(c– –)
A, B, C y D = Ag positivo; E, F, G, y H= Ag negativo
c)
Inhibición de la Hemaglutinación
La prueba IH adaptada en versión de microtécnica se basa en Clarke & Casals (4). Se emplea antígeno de
hígado de hámster extraído en sacarosa/acetona en una placa de ensayo de 96 pocillos con fondo en U y
se diluye de modo que se usan en la prueba 4 unidades hemaglutinantes. Los inhibidores inespecíficos de
la hemaglutinina se extraen de los sueros antes de la prueba mediante extracción con caolín y luego por
adsorción en eritrocitos de ganso prensados (RBC). Las diluciones dobles seriadas de los sueros se hacen
en tampón borato salino, pH 9,0, y se ensayan frente a volúmenes iguales de antígeno. Las placas se dejan
a 4°C durante la noche antes de añadir 50 µl de RBC al 0,5% a cada uno de los pocillos. Las placas se
leen tras 30 minutos a temperatura ambiente y los puntos finales se indican como el inverso de la dilución
más alta de suero que produce una inhibición total de la hemaglutinación.
En cada prueba se incorporan sueros control positivo y negativo. Una prueba se considera válida solamente
si los sueros control dan los resultados esperados. Los sueros con títulos inferiores a 1/40 se consideran
negativos.
La técnica de HI es una prueba adecuada de ensayo para inspecciones aunque no es muy específica.
Entre los phlebovirus ocurren reacciones cruzadas notables, pero los títulos homólogos exceden a los
heterólogos. Experimentalmente, se ha demostrado que hay phlebovirus africanos distintos del FVR que no
son patógenos para los rumiantes, y no es probable que los anticuerpos que ellos puedan inducir originen
confusión en el diagnóstico de FVR (27).
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO
Se ha usado una vacuna viva preparada con la cepa atenuada Smithburn del virus FVR para controlar FVR en
ganado bovino y ovino no gestante en áreas endémicas y durante brotes epidémicos, mientras que se usan virus
vacunales inactivados a partir de cepas naturales en el caso de animales gestantes y en países libres de FVR (1,
2). Las vacunas con virus inactivados deben prepararse a partir de cepas muy inmunogénicas del virus FVR
producidas en cultivo celular. El virus debe inactivarse con formaldehído y mezclarse con un adyuvante para
potenciar la inmunogenicidad. Las vacunas inactivadas deben ensayarse muy cuidadosamente en cuanto a
seguridad para garantizar que no existe ningún virus vivo residual.
Las directrices para la producción de vacunas veterinarias se presentan en el Capítulo I.1.7. Principios de
producción de vacunas veterinarias. Las normas dadas aquí y en el Capítulo I.1.7 intentan ser de naturaleza
genérica y pueden ser suplementadas con requisitos nacionales o regionales.
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En humanos, se ha usado durante 25 años una vacuna experimental inactivada con considerable éxito en cuanto
a protección de personas con riesgo de FVR. En la actualidad esta vacuna se está produciendo en células
diploides. Sin embargo, la limitada disponibilidad de esta vacuna impide su uso en la población general.
Dos nuevas candidatas a vacunas producidas a partir de aislamientos humanos de FVR están siendo sometidas
a diversos ensayos con vistas a reemplazar las vacunas existentes.
La primera, MV P12, es una cepa mutada de virus cultivado en presencia de 5-fluorouracilo con mutagénesis
seriada que produce en una atenuación para el ratón. Se ha probado en ovejas la inmunogenicidad y la
patogenicidad y el virus no provoca abortos en ovejas gestantes (17). MV P12 confirió protección en corderos
jóvenes (10,14) y en ganado bovino (18, 19). En pruebas posteriores más extensas realizadas en ovejas la
vacuna produjo abortos y teratología fetal grave cuando se usó después de 28 días de gestación (12).
La segunda candidata, Clon 13, una variante de virus que origina pequeñas placas de lisis y que no reacciona
con dos anticuerpos monoclonales específicos, resultó ser avirulenta para ratones y hámsteres y muy
inmunogénica. Su inmunogenicidad y patogenicidad se ha probado en corderos, ovejas, y cabras jóvenes y
adultas (20). En ensayos adicionales se comportó como no abortiva en ovejas gestantes y confirió más de un
80% de protección frente a un virus prueba de desafío (11). El virus Clon 13 presenta la pérdida de una porción
del segmento de ARN pequeño que codifica proteínas no estructurales, lo que podría conducir a una vacuna
estable.
En la siguiente descripción de producción de vacunas, se suministra información sobre la producción de vacuna
viva junto a información sobre producción de vacuna inactivada. Debe resaltarse que las vacunas vivas y las
inactivadas nunca deben producirse simultáneamente en los mismos servicios, debido al riesgo de contaminar la
vacuna viva atenuada con una cepa virulenta de virus antes de ser inactivada. El personal que maneja virus FVR
vivo debe estar vacunado y trabajar con nivel de contención 3 para minimizar el riesgo de autoinfección.
1.
Control del inóculo
a)
Características del inóculo vírico
Vacuna viva: El stock de antígeno deriva de la cepa original neurotrópica de Smithburn. Esta cepa no es
letal en ratones adultos inyectados intraperitonealmente y es segura cuando se usa en todas las razas de
ganado vacuno, ovejas y cabras. Sin embargo, puede causar anormalidades fetales o aborto en animales
gestantes.
Vacuna inactivada: Se puede usar como virus de inóculo una cepa de virus FVR altamente inmunogénica
adaptada a crecer en cultivos celulares. Se diferencia de la cepa atenuada en que es letal para los ratones
adultos cuando se inyecta intraperitonealmente.
b)
Método de cultivo
Tanto las cepas de virus atenuado como la inactivada se producen en cultivos celulares de células BHK,
Vero o CER. Los virus se guardan en forma liofilizada en viales que contienen 1 ml de una suspensión de
cultivo celular. El título vírico (tras inoculación intracerebral en ratones jóvenes) debe ser de al menos 106.5
LD50 en el ratón (50% de la dosis letal) por ml.
c)
Validación como vacuna
Los virus inoculados deben carecer de agentes indeseables, ser seguros para el uso y capaces de
estimular una inmunidad eficaz en las especies y razas a las que va dirigida.
•
Pruebas
El inóculo de virus liofilizado se regenera en medio de cultivo celular estéril sin antibióticos y se comprueba
la ausencia de bacterias y hongos. El contenido de un vial así reconstituído se inocula en dos tubos de
medio con tioglicolato y en dos tubos de medio con hidrolizado de soja y caseína. Los cultivos con
tioglicolato se incuban a 37°C durante 7 días y los cultivos con hidrolizado de soja y caseína a 20°C durante
14 días. Los cultivos deberían permanecer negativos.
Además, se mezclan 5 ml del inóculo de virus reconstituído con un mismo volumen de antisuero específico
contra FVR producido en conejos. Después de incubar las mezclas suero/virus a 37°C durante 30 minutos,
las suspensiones víricas se ensayan en cultivos celulares antes y después de una neutralización, así como
en ratones adultos y jóvenes, huevos embrionados y cobayas. El virus neutralizado es:
208
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.1.8. — Fiebre del Valle del Rift
i)
Sembrado en seis cultivos en tubos rotativos con células primarias de riñón de cordero y seis cultivos
en tubos rotativos con células BHK. Los cultivos celulares se incuban a 37°C y se observan
diariamente durante 7 días para observar ECP, tras los cuales se someten a la prueba de
hemadsoción con RBCs de cobaya a 4°C y a 37°C. No debería presentarse ECP ni hemadsorción. Si
el cultivo degenera o presenta sospechas de ECP, el material de estos cultivos debería mezclarse de
nuevo con antisuero y reinocularse en cultivos celulares frescos, que se observan durante otro período
adicional de 14 días. La presencia de ECP específico o de hemadsorción descalifica la muestra como
inóculo vírico.
ii)
Inoculado intraperitonealmente (0,2 ml) en grupos de al menos seis ratones adultos y seis ratones de
2-5 días de edad. Los ratones deberían permanecer sanos durante 14 días. Si muriera algún ratón, se
emulsiona un tejido adecuado, se mezcla con antisuero y se reinocula en otros grupos de ratones,
observándolos de nuevo durante otro período de 14 días. Si existe alguna evidencia de mortalidad
específica, se descalifica la muestra como inóculo vírico.
iii)
Inoculado en al menos diez huevos de gallina embrionados de 8 días mediante el método del punzón
(combinación de la ruta de la membrana coriolantoidea y del saco alantoideo). Los huevos se incuban
a 37°C durante 8 días y se observan diariamente con transiluminación. Los embriones que mueren a
las 24 horas se eliminan. Si después de 24 horas permanecen vivos menos del 70% de los embriones,
la prueba debería, no obstante, repetirse. La causa de muerte embrionaria durante el consiguiente
período de observación debería determinarse estableciendo pruebas adecuadas de esterilidad y de
HI, y por examen de frotis del saco vitelino. Si estas pruebas resultan negativas, debería hacerse,
como antes, una reinoculación de suspensiones obtenidas de los embriones mezcladas con antisuero.
Al día 4 de incubación, se abren al menos 4 huevos y se recoge el líquido del alantoides. Los huevos
restantes se abren el día 8 de incubación. Se examinan las membranas de ambos grupos en cuanto a
lesiones y en cuanto a anormalidades del embrión. El líquido del alantoides se somete a una prueba
HI con RCBs de cobaya y pollo a 4°C y a 37°C. La evidencia de mortalidad embrionaria específica, de
actividad hemaglutinante en el líquido alantoideo, cualquier lesión en las membranas o anormalidades
embrionarias descalifican la muestra como inóculo vírico.
iv)
Inyectado intraperitonealmente con 1,0 ml de inóculo vírico en dos cobayas. Los cobayas deben
permanecer sanos en un período de observación de 14 días.
No superar cualquiera de estas pruebas descalifica al antígeno para uso como inóculo vírico.
2.
Método de producción
Un vial de inóculo vírico liofilizado se reconstituye y se diluye entre 1/100 y 1/1.000 con medio Eagle en el caso
de las vacunas atenuadas y 1/1.000 en el caso de vacunas inactivadas. Para preparar una suspensión de
trabajo, se siembra el virus diluído en un cultivo confluente de células BHK en botellas rotativas y se incuba a
37°C. Cuando el 70% de las células aparecen afectadas (ECP), se recoge el medio y las células y este material
se diluye entre 1/100 y 1/1.000, tras lo cual se siembran de nuevo 10 ml en botellas rotativas con células BHK
confluentes y se incuba otra vez. Tan pronto como se observa un 70% de ECP, se recoge el medio y las células
y se almacenan.
Tanto las suspensiones virales de las vacunas atenuadas como de las inactivadas se titulan intracerebralmente
en ratones neonatos y deberían presentar un título de la menos 106.5 LD50/ml en ratón. Alternativamente, se
puede realizar una titulación de lesiones en células CER.
La vacuna atenuada se liofiliza inmediatamente después de completar las pruebas de titulación y de esterilidad.
Debería usarse un estabilizador, como por ejempo 5% de peptona en tampón fosfato 0,3 M. El volumen de la
vacuna inactivada se ajusta de modo que la vacuna final contenga al menos 106.5 LD50/ml. La suspensión viral
ajustada se inactiva luego a 37°C durante 24 horas con formaldehído a una concentración final de 0,2%. Tras la
inactivación, se añade a la suspensión el mismo volumen de gel de hidróxido de aluminio. La vacuna debe tener
un pH final de 7-7,5.
3.
Control el proceso
Previamente a la inoculación de los cultivos celulares, el inóculo vírico se somete a pruebas de esterilidad en
medios con tioglicolato y con hidrolizado de soja y caseína (ver Sección C.1.c y Capítulo I.1.5. Pruebas para
esterilidad y ausencia de contaminación en materiales biológicos).
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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Capítulo 2.1.8. — Fiebre del Valle del Rift
Se selecciona una muestra representativa de cada lote de vacuna y cada contenido se reconstituye con 5 ml de
agua destilada estéril analizándose para comprobar ausencia de bacterias y hongos.
En las vacunas inactivadas, debe comprobarse la inactivación mediante dos pases en el mismo tipo de cultivo
celular que se usó en la producción de la vacuna.
4.
Control de lotes
a)
Esterilidad
Antes de la liofilización o de la inactivación, cada envase de vacuna almacenada, y después muestras
representativas de cada lote, se prueban respecto a esterilidad en medio con tioglicolato e hidrolizado de
soja y caseína (ver también Capítulo I.1.5. de este Manual).
b)
Inocuidad
Vacuna viva: Se seleccionan al azar recipientes finales de la vacuna atenuada liofilizada y cada uno se
reconstituye en agua destilada como si se tratara de una vacunación. Se inyectan subcutáneamente cuatro
ovejas susceptibles con una dosis de vacuna. Las ovejas se observan diariamente durante 14 días y se
anota su temperatura rectal. Las ovejas deben permanecer sanas.
La vacuna también se inyecta intraperitonealmente en seis ratones adultos (0,25 ml en cada uno), dos
hámsteres y dos cobayas (1 ml en cada uno). Los animales se observan diariamente durante un período de
14 días durante el cual deben permanecer sanos. Una mortalidad atribuíble a la vacuna descalifica el lote.
Vacuna inactivada: En el caso de la vacuna inactivada contra FVR, se inyectan subcutáneamente cuatro
ovejas susceptibles con 2,0 ml de vacuna, se observan diariamente durante 3 semanas y se anota la
temperatura rectal. Las ovejas deben permanecer sanas.
Además, la seguridad se determina también por inyección intracerebral de seis ratones adultos y dos
familias de ratones neonatos, y mediante inyección intraperitoneal de dos cobayas y dos hámsteres. Los
ratones, hámsteres y cobayas se observan durante 14 días. Deben permanecer sanos. Una mortalidad
atribuíble a la vacuna descalifica el lote.
c)
Potencia
Vacuna viva: Se recostituye la vacuna atenuada liofilizada de dos recipientes finales y se titula
intracerebralmente en ratones neonatos. La vacuna final debe contener al menos 104.4 LD50/dosis en ratón.
Alternativamente, se pueden hacer las titulaciones en cultivos celulares.
Dos recipientes finales se mantienen una semana a 37°C, se recosntituyen y se titulan como antes. Cada
uno debe contener al menos 103.4 LD50/dosis en ratón. Alternativamente, se pueden hacer las titulaciones
en cultivos celulares.
Las ovejas inoculadas (ver sección C.4.b.) se sangran a las 2 y 3 semanas de la vacunación y su respuesta
en anticuerpos se determina por PRN. Un título de anticuerpo neutralizante frente al virus de 100 o más es
considerado satisfactorio.
Vacuna inactivada: Las ovejas, inyectadas subcutáneamente para determinar la seguridad (Sección C.4.b.),
se sangran a las tres semanas y su respuesta en anticuerpos se determina por la prueba NV. Un título de
anticuerpo neutralizante frente al virus de 100 o más es considerado satisfactorio.
d)
Duración de la inmunidad
Tanto las vacunas vivas atenuadas como las inactivadas han tenido un amplio uso en condiciones de
campo. Se considera que la vacuna viva induce una inmunidad que dura toda la vida contra la enfermedad
clínica, aunque existe cierta controversia sobre la inmunogenicidad de la vacuna Smithburn. Sin embargo,
el ganado vacuno se puede inmunizar con la vacuna de virus vivo usando esta cepa. La experiencia sobre
la eficacia de campo de las vacunas inactivadas es limitada porque se han empleado en áreas donde FVR
no es endémica, y donde en consecuencia no existe desafío natural frente a la vacuna. Sin embargo,
durante el brote de 1976-1978 en Sudáfrica, observaciones realizadas por veterinarios estatales apoyan la
eficacia de la vacuna. En epizootias más recientes en otras partes, la vacuna inactivada no tuvo éxito en la
protección de los animales contra el aborto, tras dos vacunaciones. Cuando se usa la vacuna inactivada, se
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Capítulo 2.1.8. — Fiebre del Valle del Rift
debe dar una dosis de recuerdo a los 3-6 meses de la vacunación inicial y después la vacunación se
debería repetir anualmente (1, 2).
e)
Estabilidad
Cuando se mantienen a 4°C, las vacunas atenuadas liofilizadas son estables durante al menos 4 años,
mientras que la vacuna inactivada puede mantenerse muchos años. No se recomienda el almacenamiento
a temperaturas superiores.
f)
Conservantes
No se usan conservantes.
g)
Precauciones (riesgos)
Aunque los humanos se pueden infectar durante el manejo de material infectado, no se conoce ningún caso
de enfermedad en el hombre con virus de la vacuna atenuada, pero a menudo ocurre seroconversión. Sin
embargo, las cepas usadas para preparar vacuna inactivada pueden causar enfermedad. Por tanto, todo
personal con probabilidad de exposición al virus de la vacuna debería ser vacunado con la vacuna
inactivada con formalina para el hombre.
5.
Pruebas en el producto final
a)
Esterilidad
Se recogen muestras representativas del producto final y se ensayan como se indica en la Sección C.4.a.
b)
Contenido en humedad
La humedad presente en muestras liofilizadas de la vacuna atenuada no debería superar el 3%.
•
Agradecimiento
Partes de este capítulo se tomaron del capítulo sobre FVR en las ediciones previas de este Manual o están
basadas en él.
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NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Fiebre del valle del Rift (ver Cuadro en la parte 3 de
este Manual de animales terrestres o consultar la página web de la OIE para una lista actualizada:
www.oie.int)
212
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004