Ámonio - R-Biopharm AG

Ámonio
BOEHRINGER MANNHEIM / R-BIOPHARM
Enzymatic BioAnalysis/Food Analysis
Método UV
Para uso in vitro solamente
Para la determinación de Amonio en alimentos y
otros materiales y para la determinación de
nitrógeno luego de digestión por Kjeldahl (ver Pto.
12.2)
Cat. No. 10 112 732 035
Test-Combinado para 50 determinaciones
Principio (Ref. A1)
En presencia de glutamato deshidrogenasa (GIDH) y nicotinamida
adenina dinucleótido reducido (NADH), el amonio reacciona con 2oxoglutarato a L-glutamato con oxidación del NADH.
+
2-oxoglutarato + NADH + NH4
⎯ GlDH → L-glutamato + NAD
+ H2O
+
La cantidad de NADH oxidado en la reacción anterior es
estequiométrica con la cantidad de amonio y se mide por medio de
su absorbancia a 334, 340 ó 365 nm.
El ensayo combinado contiene:
1. Botella 1 con aprox. 60 ml de solución de:
buffer trietanolamina, pH 8.0; 2-oxoglutarato, 150 mg.
2. Botella 2 con 50 tabletas cada una contiene NADH, aprox. 0.4 mg
3. Botella 3 con aprox. 1.2 ml de solución de glutamato
deshidrogenasa, aprox 1000 U
4. Botella 4 control de amonio para control del ensayo (la medición
del control no es necesaria para el cálculo de los resultados). Usar la
solución control sin diluir. (Vto.: ver etiqueta)
Preparación de las soluciones
1. Usar el contenido de la Botella 1 sin diluir.
2. Disolver una tableta de la Botella 2 con un ml de solución de la
Botella 1 en un tubo de reacción para cada ensayo (blanco y
muestras) dependiendo del número de determinaciones. Usar una
pinza para tomar las tabletas de la Botella 2. Esto resulta en la
mezcla de reacción 2*.
3. Usar el contenido de la Botella 3 sin diluir.
Estabilidad de los reactivos
La Solución 1 es estable a 2-8°C (ver etiqueta).
Llevar la solución 1 a 20-25°C antes de su uso.
Las tabletas 2 son estables a 2-8ºC (ver etiqueta)
La mezcla de reacción 2 es estable por 3 días a 2-8ºC.
Llevar la mezcla de reacción 2 a 20-25ºC antes de su uso.
El contenido de la botella 3 es estable a 2-8°C (ver etiqueta).
Procedimiento
1
Long. de Onda :
2
Cubeta de Vidrio :
Temperatura:
Volumen final:
Leer contra:
de
340 nm, Hg 365 nm ó Hg 334 nm
1.00 cm paso de luz
20-25°C
3.020 ml
blanco de aire (sin cubeta en el paso
Solución de Muestra:
luz) ó contra agua.
3
0.2-8 μg amonio /ensayo (en 0.1002.000 ml volumen muestra)
1 La absorción máxima de NADH es a 340 nm. En espectrofotómetros las mediciones se
toman a la máxima absorción, si se utilizan fotómetros espectrales equipados con lámpara
de vapor de mercurio, las mediciones se toman a 365 nm ó 334 nm.
2 Si se desea se pueden utilizar cubetas descartables en lugar de cubetas de vidrio.
3 Ver las instrucciones para el rendimiento del ensayo.
Almacenar a 2-8° C
Esta traducción en español has sido realizada por R−Biopharm
Latinoamérica con el objeto de ayudar a los usuarios a entender el
procedimiento, pero no se actualizan regularmente por lo que no
pueden remplazar las instrucciones en inglés. Las instrucciones de
uso que son válidas, son aquellas incluidas en cada kit en Alemán y
en Inglés, dado que están escritas e impresas por el fabricante
(Roche). Refiérase siempre a las instrucciones incluidas en cada kit.
Pipetear en la cubeta
Blanco
Muestra
mezcla de reacción 2
1,000 ml
1,000 ml
sol. Muestra
0,100 ml
agua bidestilada
2,000 ml
1,900 ml
Mezclar ***, leer las absorbancias de las soluciones (A1) luego de
aprox. 5 min. a 20-25ºC. Iniciar la reacción con:
solución 3
0,020 ml
0,020 ml
Mezclar ***,esperar a que finalice la reacción (aprox. 20 min.) leer las
absorbancias de las soluciones (A2). Si la reacción no se ha
detenido luego de 20 min. continuar leyendo las absorbancias a
intervalos de 2 min. hasta que el aumento de las mismas sea
constante.
* Para simplificar el desarrollo del ensayo es posible pipetear directamente 1.000 ml de la
solución 1 en la cubeta y agregarle 1 tableta de la botella 2. Luego de la disolución de la
tableta con la ayuda de la espátula, continuar como se describe en el procedimiento. La
diferencia de volumen (ca. 1%, aumento del volumen por una tableta en 3.020 ml de
volumen del ensayo) tiene que tomarse en cuenta en el cálculo, multiplicando el resultado
por 1.01.
** Enjuagar el tip de la pipeta en la solución de muestra antes de dispensarla.
*** Por ejemplo con espátula plástica ó por agitación suave luego de cerrar la cubeta con
Parafilm (trademark of the American Can Company, Greenwich, Ct., USA)
Si la absorbancia A2 disminuye constantemente, extrapolar la misma
al tiempo de la adición de la solución 3 (GIDH).
Determinar la diferencia de absorbancias (A1-A2) para ambos, el
blanco y las muestras. Sustraer la diferencia de absorbancias del
blanco de las diferencias de absorbancias de las muestras.
ΔA = (A—A2)muestra – (A1 – A2)blanco
Las diferencias en las medidas de absorbancia deben, como regla,
ser al menos de 0.100 unidades de absorbancia para obtener
suficiente precisión en los resultados (ver “Instrucciones para el
rendimiento del ensayo” y “Sensibilidad y límite de detección”, punto
4).
Cálculos
De acuerdo a la ecuación general del cálculo de las concentraciones:
V x MW
c = ------------------------- x ∆A (g/l)
ε x d x v x 1000
V
v
MW
d
ε
= volumen final (ml)
= volumen de muestra (ml)
= peso molecular de la sustancia a ensayar (g/mol)
= paso de luz (cm)
= coeficiente de extinción del NADH a:
-1
-1
340 nm = 6.3 (l x mmol x cm )
-1
-1
Hg 365 nm = 3.4 (l x mmol x cm )
-1
-1
Hg 334 nm = 6.18 (l x mmol x cm )
Corresponde para amonio
3.020 x 17.03
0.5143
c = ----------------------------------- x ∆A = ------------- x ∆A (g amonio / l
ε x 1.00 x 0.100 x 1000
ε
sol. muestra)
Si la muestra se ha diluido durante la preparación, los resultados
deben multiplicarse por el factor de dilución F.
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Cuando se analizan muestras sólidas ó semisólidas que se pesan
para la preparación de la muestra, los resultados se calculan a partir
de la cantidad pesada:
c amonio (g/l de sol. )
Contenido amonio = ------------------------------------------- x 100 (g / 100g)
peso muestra en g/l sol.
1. Instrucciones para el funcionamiento del kit
La cantidad de amonio presente en el ensayo debe ser entre 0.2 ug
y 8 ug. Para obtener una diferencia de absorbancias suficiente, la
solución de muestra debe diluirse para dar una concentración de
amonio entre 0.01 y 0.08 g/l.
Tabla de dilución
Cantidad estimada de
amonio por litro
Dilución con
agua
Dilución
Factor F
< 0,08 g
-
1
0,08-0,8 g
1+9
10
0,8-8,0 g
1 + 99
100
Si la medida de la diferencia de absorbancias (∆A) es muy pequeña
(ej. < 0.100), debe prepararse nuevamente la solución de muestra
(pesar mas cantidad de muestra ó diluir menos la muestra) ó el
volumen de muestra que se pipetea en la cubeta puede aumentarse
hasta 2.000 ml. El volumen de agua agregada debe, en ese caso,
disminuirse para obtener el mismo volumen final en el ensayo para la
muestra y el blanco. El nuevo volumen de muestra v debe tomarse
en cuenta en los cálculos.
2. Información técnica
2.1 Usar solamente agua bidestilada fresca para el ensayo.
2.2 Trabajar en una atmósfera libre de amonio (prohibido fumar en el
laboratorio).
3. Especificidad (Ref. 1)
El método es específico para amonio.
En el análisis de sulfato de amonio comercial se obtienen valores
aprox. del 100%.
4. Sensibilidad y límite de detección (Ref. 1.2)
La mínima diferencia de absorbancia para el procedimiento es de
0.005 unidades. Esto corresponde a un volumen máximo de muestra
v = 2.000 ml y medición a 340 de una concentración de amonio de
0.02 mg/l de solución de muestra (si el v = 0.100 ml, esto
corresponde a 0.4 mg/l de solución de muestra).
El límite de detección de 0.08 mg/l deriva de una diferencia de
absorbancia de 0.020 (medida a 340 nm) y de un volumen máximo
de muestra de v = 2.000 ml.
5. Linealidad
La linealidad de la determinación existe desde aprox. 0.2 ug de
amonio / ensayo (0.08 mg amonio/ l de solución de muestra;
volumen de muestra v = 2.000 ml) hasta 8 ug de amonio / ensayo
(0.08 g amonio/ l de solución de muestra; volumen de muestra v =
0.100 ml).
6. Precisión
En una determinación por duplicado de una única solución de
muestra, se puede obtener una diferencia de 0.005 a 0.010 unidades
de absorbancia. Con un volumen de muestra de v = 0.100 ml y
medido a 340 nm, esto corresponde a una concentración aprox. de
amonio de 0.4-0.8 mg/l. (Si la muestra se diluye durante la
preparación de la misma, el resultado se debe multiplicar por el
factor de dilución F. Si la muestra se pesa para su preparación, ej.
usando 1 g muestra/100 ml = 10 g/l, se puede obtener una diferencia
de 0.004-0.01g/100 g).
En la literatura se han publicado los siguientes datos:
CV = 1.6 %
(plasma)
CV = 0.88-1.16 % (soluciones de Cloruro de amonio)
CV = 0.34 %
(solución de cloruro de amonio)
CV = 0.36-0.96 % (muestras de carne)
(Ref. 1.1)
(Ref. 1.2)
(Ref. 3.2)
7. Interferencias y fuentes de error
Durante la precipitación de proteínas con ácido perclórico que se
lleva a cabo en alimentos se pueden obtener, ocasionalmente,
fragmentos proteicos. Estos fragmentos se mantienen en solución y
gradualmente forman amonio en buffer alcalino, generando
reacciones “creep”. La formación de amonio es muy baja y puede
calcularse y diferenciarse del contenido de amonio de la muestra por
extrapolación de la absorbancia A2 al tiempo de adición de la
solución 3 (GIDH).
Los ingredientes comunes de los alimentos no interfieren con la
determinación de amonio. Solamente altas concentraciones de
taninos en los jugos de fruta pueden causar una inhibición de la
reacción de la GIDH. Por ello los jugos de fruta deben tratarse con
PVPP.
Dado que altas concentraciones de metales pesados causan
turbidez, ello también produce dificultad en la determinación de
amonio. En la mayoría de los casos las altas concentraciones de
iones metálicos pueden removerse como hidróxidos por
alcalinización de la solución de muestra (pH > 7.5). El tiosulfato de
sodio agregado ocasionalmente al agua de las piletas de natación,
no interfiere en el ensayo hasta 1 mg/ensayo.
8. Reconocimiento de interferencia durante el procedimiento del
ensayo
8.1 Si la conversión de amonio se ha completado en el tiempo
estipulado en “Procedimiento” se puede concluir, en general, que no
han ocurrido interferencias.
8.2 Al completarse la reacción, la determinación puede reiniciarse
con el agregado de amonio (cloruro de amonio, sulfato de amonio,
cualitativa ó cuantitativamente): si la absorbancia se altera
posteriormente al agregado del material estándar, esto también es
una indicación que no ha ocurrido interferencia.
8.3 Se pueden reconocer errores del operador ó interferencia en la
determinación por la presencia de sustancias contenidas en la
muestra, realizando una doble determinación utilizando dos
volúmenes diferentes de muestra (ej. 0.100 ml y 0.200 ml): las
diferencias en las mediciones de las absorbancias deben ser
proporcionales a los volúmenes de muestra utilizados.
Cuando se analizan muestras sólidas, se recomienda que se pesen
diferentes cantidades (ej. 1g y 2g) en recipientes de 100 ml. Las
diferencias de absorbancias medidas y los pesos de la muestra
utilizados deben ser proporcionales para volúmenes idénticos.
8.4 Se pueden reconocer posibles interferencias causadas por
sustancias contenidas en la muestra utilizando un estándar interno
como control: además de las determinaciones de la muestra, el
blanco y el estándar, se lleva a cabo otra determinación con la
muestra y el control juntos en el mismo ensayo. La recuperación se
puede calcular de la diferencia de absorbancias medidas.
8.5 Posibles pérdidas durante la determinación se puede reconocer
por medio de ensayos de recuperación: la muestra debe prepararse
y analizarse con y sin el agregado de material estándar. Dicha
adición debe recuperarse cuantitativamente dentro del rango del
error del método.
9. Riesgo de los reactivos
Los reactivos utilizados en la determinación de amonio no son
materiales riesgosos de acuerdo a las Regulaciones de Sustancias
Peligrosas, las Leyes Químicas ó la Regulación 67/548/EEC de la
CEE y subsecuentes Guías de alteraciones, suplementos y
adaptaciones. Aún así, deben cumplirse todas las medidas de
seguridad generales que se aplican a todas las sustancias químicas.
Luego de su utilización, los reactivos deben desecharse con el
descarte del laboratorio, pero deben observarse siempre las
regulaciones locales. El material de empaque puede desecharse en
recipientes destinados al reciclado.
10. Información general sobre la preparación de muestra
Al llevar a cabo el ensayo:
Usar muestras líquidas límpidas, incoloras y prácticamente
neutras directamente ó luego de diluirlas de acuerdo a la tabla de
dilución, y usar un volumen hasta 2.000 ml;
Filtrar soluciones turbias;
Desgasear muestras que contengan dióxido de carbono (ej. por
filtración);
Ajustar muestras ácidas a pH 7-8 por el agregado de una solución
de hidróxido de sodio ó de potasio;
Ajustar muestras ácidas y levemente coloreadas a pH 7-8 por el
agregado de una solución de hidróxido de sodio ó de potasio y
posterior incubación durante 15 min.;
Tratar las muestras “altamente coloreadas” que se usan sin diluir
ó en grandes volúmenes con polivinilpolipirrolidona (PVPP) – (ej. 2.55 g/100 ml);
Muela ú homogeneice las muestras sólidas ó semisólidas, extraer
con agua ó disolver en agua y filtrar si es necesario;
Desproteinizar muestras que contengan proteínas con ácido
perclórico ó ácido tricloroacético;
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Extraer muestras que contengan grasa con agua caliente (la
temperatura de extracción debe ser mayor que el punto de fusión de
la grasa involucrada). Enfriar para permitir que la grasa se separe,
colocar el recipiente en baño de hielo por 15 min y filtrar;
Romper emulsiones con ácido tricloroacético;
Nota importante
La clarificación de Carrez no debe utilizarse en la preparación de la
muestra para la determinación de amonio debido a la baja tasa de
recuperación (absorción de amonio).
11. Ejemplos de aplicación
Determinación de amonio en jugos de fruta
Agregar 0.5-1.0 g (!) de polivinilpolipirrolidona húmeda (PVPP) a 10
ml de jugo de fruta (jugos claros, turbios ó coloreados) – cuando
aumenta el volumen de muestra, neutralizar, si es necesario, y llevar
a 20 ml con agua en un recipiente. Agitar por 1 min. con agitador
magnético. Filtrar la solución de muestra inmediatamente y usar para
el ensayo.
Determinación de amonio en agua (piletas de natación) (Ref. 3.1,
3.4)
Filtrar la muestra de agua si es necesario, y usar la muestra clara
para el ensayo. Diluir la muestra de acuerdo a la tabla de dilución ó
usar hasta un volumen de muestra de v = 2.000 ml para el ensayo.
Determinación de amonio en leche
Mezclar 1 ml de leche con 4 ml de ácido tricloroacético (0.3 M).
Luego de aprox. 5 min. centrifugar para separar el precipitado.
Decantar el sobrenadante y neutralizar con KOH (10 M) (el factor de
dilución puede despreciarse debido a la alta concentración del KOH),
filtrar y usar 1.000-2.000 ml de solución de muestra para el ensayo.
Determinación de amonio en productos panificados
Pesar aprox. 10 g de muestra en homogeneizador, agregar aprox. 20
ml de ácido perclórico (1 M) y homogeneizar por 2 min. Proceder
según “carne y productos cárnicos”. Usar como máximo 1.000 ml
para el ensayo.
Determinación de amonio en carne, productos cárnicos (Ref.
3.2, 3.3) y queso
Pesar aprox. 5 g de muestra homogeneizada (de una muestra de
100 g, que ha sido molida y homogeneizada en un homogeneizador)
en un recipiente, agregar 20 ml de ácido perclórico (1 M) y
homogeneizar por 2 min. Transferir el contenido cuantitativamente
con 40 ml de agua. Ajustar el pH a 7.0 (< 7.5) primero con hidróxido
de potasio (5 M) y luego exactamente con hidróxido de potasio (2 M).
Transferir el contenido cuantitativamente en un recipiente de 100 ml,
llevar a volumen con agua, teniendo en cuenta que la fase lipídica se
encuentre sobre el nivel y la fase acuosa en encuentre en el nivel.
Para la separación de la grasa y para la precipitación del perclorato
de potasio, refrigerar por 20 min. Luego filtrar. Descartar los primeros
mililitros. Usar la solución clara, posiblemente algo turbia para el
ensayo, diluyendo si es necesario de acuerdo a la tabla de dilución.
Calcular la cantidad de amonio de acuerdo a la fórmula
anteriormente detallada, pero debe multiplicarse por el factor de
desplazamiento del volumen K = 0.98.
Determinación de amonio en pastillas de orozuz y de sales de
amonio
Pesar 1 g de muestra molida y homogeneizada en un recipiente de
100 ml, agregar aprox. 60 ml de agua a 60 – 70ºC y agitar con
agitador magnético por 10 min. hasta que el material esté
completamente disuelto. Ajustar a 20-25ºC, llevar a volumen con
agua, mezclar y filtrar. Descartar los primeros mililitros, usar el
filtrado claro (generalmente) para el ensayo, luego de diluirlo de
acuerdo a la tabla de dilución si es necesario.
M) ó con hidróxido de sodio diluido (1 M) en el caso de fertilizantes
acídicos. Calentar a 60-70ºC con agitador magnético termostatizado
por aprox. 10 min. Dejar enfriar, transferir cuantitativamente a un
recipiente de 100 ml y llevar a volumen con agua. Mezclar la
solución y filtrar si es necesario.
Usar 0.100 ml de la solución clara diluida, si es necesario, para el
ensayo.
12.2 Determinación de nitrógeno luego de digestión por Kjeldahl
La determinación de nitrógeno total se puede obtener por medio de
la determinación de amonio en una muestra mineralizada de acuerdo
al método de Kjeldahl. Normalmente, las muestras se incineran
(ácido sulfúrico). El amonio, originado del nitrógeno, se determina de
acuerdo a el siguiente procedimiento: Pesar 2 g de muestra molida y
homogeneizada en un recipiente de Kjeldahl de 100 ml, agregar 20
ml de ácido sulfúrico (gravedad específica = 1.84 g/ml) y
aproximadamente 30 mg de muestra catalítica (ej. de acuerdo a
Wieninger) ó un tableta de Kjeldahl, calentar por aprox. 2-3 h hasta
que la muestra se haya desintegrado (solución amarilla ó verde
amarilla). Dejar que la muestra enfríe y con cuidado (usar anteojos
protectores) transferir el material cuantitativamente en un recipiente
con 600 ml de agua fría (con baño de hielo), agitando todo el tiempo
(agitador magnético). Neutralizar con aprox. 60 ml de KOH (10 M)
(pH 6-8). Transferir la solución neutralizada cuantitativamente a un
recipiente de 1 l, llevar a volumen con agua y mezclar.. SI es
necesario, filtrar la mezcla (en general es necesario después de la
desintegración con las pastillas de Kjeldahl), descartar los primeros
mililitros. Usar la solución diluida, si es necesario, para el ensayo.
Cálculo
Contenido de nitrógeno de la muestra (en %) =
∆A × V × MW × 100
= --------------------------------------------------------ε × d × v × 1000 × cantidad pesada [g]
∆A × 3.020 × 14.01 × 100
= -----------------------------------------------------------------ε × 1000 × 0.100 × 1000 × cantidad pesada [g]
12.3 Determinación de amonio en muestras de fermentación y
medio de cultivo de células
Colocar la muestra (luego de centrifugar, si es necesario) en un baño
de agua a 80ºC por 15 min. para detener las reacciones enzimáticas.
Centrifugar y usar el sobrenadante (diluido de acuerdo a la tabla de
dilución si es necesario) para el ensayo. Alternativamente se puede
desproteinizar con ácido perclórico. Ver los ejemplos mencionados
anteriormente. Homogeneizar el medio gelatinoso de agar con agua
y tratar como se describe.
Referencias
1.1 da Fonseca-Wollheim, F., Bergmeyer, H. U. & Gutmann, I. (1974) in Methoden der
enzymatischen Analyse (Bergmeyer, H. U. Hrsg.) 3. Aufl., Bd. 2, S. 1850-1853, Verlag
Chemie, Weinheim and (1974) in Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H. U. ed.)
2nd ed., vol. 4, pp. 1802-1806, Verlag Chemie, Weinheim/Academic Press, Inc., New York
and London
1.2 Bergmeyer, H. U. & Beutler, H.-O. (1985) in Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer,
H. U., ed.) 3rd ed., vol. VIII, pp. 454-461, Verlag Chemie, Weinheim, Deerfield Beach/
Florida, Basel
2.1 Untersuchung von Papieren, Kartons und Pappen für die Lebensmittelverpackungen
(gem. Empfehlungen XXXVI der Kunststoffkommission des Bundesgesundheitsamtes)
Kapitel 8 (Methoden) Pkt. 3.4.2 (Ammoniak)
2.2 Brautechnische Analysenmethoden, Band III, S. 597-599 (1982), Methodensammlung
der MitteleuropÑischen Brautechnischen Analysenkommission (MEBAK), herausgegeben
von F. Drawert im Selbstverlag der MEBAK, Freising
3.1 Höpner, Th. (1977) Enzymatische Methoden in der Wasseranalytik - Mîglichkeiten und
renzen, Vom Wasser 49, 173-182
3.2 Gerhardt, U. & Quang, T. D. (1979) Methoden zur Ammoniakbestimmung in Fleisch und
Fleischerzeugnissen, Fleischwirtschaft 59, 946-948
3.3 Barchietto, G., Cantoni, C., Frigerio, R. & Provera, D. (1984) Esame comparativo dei
prodotti di autolisi nella carne di maiale (Azoto non proteico, Urea, Ammoniaca),
Conservazione degli Alimenti 3, 12-17
3.4 Bartels, U. (1991) Die enzymatische Bestimmung von Ammonium im
Niederschlagswasser, CLB Chemie in Labor und Biotechnik 42, 377-382
3.5 Cheuk, W. L. & Finne, G. (1984) Enzymatic determination of urea and ammonia in
refrigerated seafood products, J.Agric.Food Chem. 32, 14-18
12. Otras aplicaciones
El método también puede ser utilizado para analizar fertilizantes,
fármacos, cosméticos, papel (Ref. 2.1) y en investigación para
análisis de muestras biológicas. Para detalles de muestreo,
tratamiento y estabilidad de los reactivos ver Ref. 1.1-1.2.
Ejemplos
12.1 Determinación de amonio en fertilizantes
Moler aprox. 10 g de muestra y mezclar. Pesar aprox. 100 mg de
material homogeneizado en un recipiente de 100 ml y agregar aprox.
50 a 60 ml de agua. Ajustar el pH 7-8 con ácido clorhídrico diluido (1
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.
Solución control del ensayo de Amonio (Botella 4)
Concentración *: ver etiqueta en frasco
El control del ensayo de amonio es una solución acuosa estabilizada
de amonio. Sirve como control del ensayo enzimático para la
determinación de amonio en alimentos y otros materiales.
Aplicaciones
1 Adición de la solución control de amonio a la mezcla de reacción:
En vez de la solución de muestra utilizar la solución control en el
ensayo.
2. Reinicio de la reacción cuantitativamente:
Una vez finalizada la reacción con la solución de muestra y tomada
la medida de A2, agregar 0.050 ml de solución control a la mezcla del
ensayo. Leer la absorbancia A3 luego de finalizada la reacción
(aprox. 20 min.). Calcular la concentración de la diferencia (A2-A3) de
acuerdo a la ecuación general del cálculo de la concentración.
Aunque hay una dilución de la mezcla del ensayo por el agregado de
la solución control, los resultados casi no difieren del dato estipulado
en la etiqueta.
3. Estándar interno:
La solución control del ensayo puede utilizarse como estándar
interno para controlar el correcto funcionamiento del ensayo (errores
groseros) y para ver si la solución de muestra está libre de
sustancias interferentes.
Pipetear en la
Muestra +
Blanco
Muestra Estándar
cubeta
estándar
sol. Reacción 2 1,000 ml
1,000 ml
1,000 ml
1,000 ml
sol. Muestra
-
sol. Control
-
0,100 ml
-
0,050 ml
-
0,100 ml
0,050 ml
agua bidestilada 2,000 ml 1,900 ml 1,900 ml
1,900 ml
Mezclar y leer las absorbancias de las soluciones (A1) luego de
aprox. 5 min. Continuar como se describe en "Procedimiento".
Seguir las instrucciones dadas bajo "Instrucciones para el
funcionamiento del ensayo" y las notas al pié.
La recuperación del estándar se calcula de acuerdo a la siguiente
fórmula:
2 x ∆A muestra + estándar - ∆A muestra
recuperación = ----------------------------------------------- x 100 (%)
∆A estándar
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4/4