Mínima concentración inhibitoria de ácido sórbico para

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDESTE
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2000
Mínima concentración inhibitoria de ácido sórbico
para Zygosaccharomyces bailii en sistemas modelo acuosos
Castro, Marcela P.1 - Campos, Carmen A.2 - Garro, Oscar A.1 - Gerschenson, Lía N.2
1. Facultad de Agroindustrias - UNNE.
Cte. Fernández 755 - (3700) Sáenz Peña - Chaco - Argentina.
Tel./Fax: +54 (03732) 420137 - E-mail: [email protected]
2. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales - UBA.
ANTECEDENTES
El interés que los consumidores manifiestan por la alimentación ha adquirido diversos matices a lo largo de
las últimas décadas, siendo sus ejes centrales: las características organolépticas, la información sobre la
naturaleza y contenido de los alimentos y con especial énfasis, todos los aspectos relacionados con los riesgos
toxicológicos y con la salud. A este respecto, los aditivos alimentarios han tenido y tienen todavía un interés
muy especial (Multon, 1988). Así, si bien la conservación de los alimentos por adición de conservantes
presenta muchas ventajas es un procedimiento fuertemente rechazado por los consumidores que temen los
efectos tóxicos de los mismos. Esto ha llevado a las industrias elaboradoras de alimentos a la búsqueda de
alternativas que permitan suprimir la adición de conservantes ó, al menos, disminuir su concentración con el
objeto de satisfacer las exigencias de los consumidores.
El pH de estos alimentos varía en un rango de aproximadamente 2,9 a 4,4 debido a la incorporación de ácido
acético en una concentración que oscila entre 0,5% y 1,2%. Aunque estas condiciones son generalmente de
carácter bactericida (Smittle, 1977)., un limitado grupo de microorganismos acidófilos es capaz de crecer bajo
estas condiciones lo que se evidencia por la generación de dióxido de carbono y “off-flavors”. La microflora
causante del deterioro de aderezos y salsas parece bastante restringida y consiste en pocas especies de
Lactobacillus, Saccharomyces y Zygosaccharomyces (Smittle, 1987). Por años se ha sabido que las levaduras
contaminan estos alimentos. En 1949, Williams y Mrak reportaron que Zygosaccharomyces globiformas
deterioraba estos productos. Más tarde, Kurtzman et al. (1971) encontraron que 13 de 17 muestras de
aderezos contenían Zygosaccharomyces bailii. Debido a su tolerancia a condiciones ácidas, su osmofilicidad
(Lodder, 1970) y resistencia a los preservadores (Pitt, 1974), éste microorganismo se reconoce universalmente
como un problema en la industria de los aderezos.
En nuestro país, el Código Alimentario (C.A.A.) permite la utilización de diversas aditivos para la
conservación de estos productos, entre los cuales el ácido sórbico, o su sal potásica, es uno de los más
utilizados. A éste se suman el ácido benzoico, o algunas de sus sales, la sal disódico cálcica del ácido
etilendiamino tetracético (E.D.T.A.), como secuestrante de metales, y el ácido l-ascórbico, como antioxidante
(Arts. 1279 a 1284).
El objetivo del presente trabajo fue determinar las mínimas concentraciones de ácido sórbico que inhiben el
crecimiento de Z. bailii y, estudiar el efecto de la adición de distintos aditivos sobre la acción antimicrobiana
del preservador.
MATERIALES Y METODOS
La composición de los diferentes sistemas estudiados se detalla en la Tabla I; y fue diseñada para modelar la
formulación de aderezos de bajas calorías para ensaladas. Todas las sustancias químicas utilizadas fueron de
calidad analítica con excepción del ácido acético, el cual fue de grado alimenticio.
Las concentraciones de sorbato de potasio ensayadas fueron: 200 ppm, 400 ppm, 600 ppm, 800 ppm y 1000
ppm, teniendo en cuenta que el último valor es el máximo permitido por el C.A.A. para el tipo de alimento
modelado.
El pH de los sistemas se ajustó a 3,50 mediante el agregado de gotas de ácido cítrico, previo al autoclavado,
de modo tal que al cabo de la esterilización el pH de los sistemas fuera de 3,50 ± 0,02. Éste se midió mediante
un electrodo de vidrio acoplado a un pHmetro Fisher (Accumet, Denver, USA).
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Alícuotas de 40 ml de cada uno de los sistemas se colocaron en frascos color caramelo de 250 ml de
capacidad, se esterilizaron por 121°C durante 15 min y se dejaron enfriar a temperatura ambiente. Luego, se
procedió a su inoculación y posterior almacenamiento en una cámara de temperatura constante y convección
forzada a 33 ± 1°C.
Tabla I. Composición de los sistemas modelo.
Sistema
I
II
III
IV
V
Medio Nutritivo
(%p/p)
97,40
97,32
97,28
95,28
93,28
EDTA
(%p/p)
0,075
0,075
0,075
0,075
Ascórbico
(%p/p)
0,05
0,05
0,05
NaCl
(%p/p)
2,00
2,00
Sacarosa
(%p/p)
2,00
Todos los sistemas contenían 2,50 % p/p de una solución de ácido acético (5% p/v).
La cepa utilizada para este estudio, Zygosaccharomyces bailii NRRL 7256, se incubó a 25°C por 24 h en
caldo Sabouraud (Biokar Diagnostics, Beauvais, Francia), al cabo de las cuales 40 µl de la suspensión se
inocularon a los sistemas modelo estériles, bajo flujo laminar, para lograr un recuento en los sistemas de 1.106
UFC/ml.
Cada sistema modelo se almacenó por triplicado para cada una de las concentraciones de sorbato de potasio.
Se utilizaron como blanco de lectura los sistemas que contenían 1000 ppm de preservador; éstos fueron
igualmente inoculados, para descartar cambios debidos a reacciones enzimáticas que pudieran ocurrir durante
el almacenamiento. Se monitoreó el crecimiento microbiano normal mediante sistemas “testigo” que no
contenían preservador. Todos los sistemas se incubaron durante 288 h y se midió la absorbancia de los
mismos a 540 nm a intervalos de 72 h. Las lecturas se realizaron en espectrofotómetro Beckman (Beckman
Instruments, mod. DU-640B, Fullerton CA, USA). La mínima concentración inhibitoria (MCI) se determinó
como la concentración de preservador más baja a la cual no hubo crecimiento microbiano al cabo del tiempo
total de incubación (Hsiao y Siebert, 1999).
DISCUSION DE RESULTADOS
En las figuras 1 a 5 se representa la variación de la absorbancia en función del tiempo para cada uno de los
sistemas modelo acuosos, con el agregado de sorbato de potasio en distintas concentraciones según lo
indicado anteriormente. Allí se observa que, en ausencia del preservador (sistemas testigo), la levadura se
desarrolló bien alcanzando su crecimiento el estado estacionario al cabo de aproximadamente 100 h. Estos
resultados muestran que ni los factores de estrés usados (depresión del pH a 3,5 por agregado de ácido acético
y cítrico, depresión de la actividad acuosa a 0,987 por adición de NaCl), ni el agregado de distintos aditivos
(EDTA, ácido ascórbico, sacarosa) en forma individual o combinada, resultaron inhibitorios para el
crecimiento de la levadura inoculada y destacaron que el agregado del sorbato resultó clave para mantener la
estabilidad microbiológica de los sistemas en estudio.
Cabe mencionar que, las curvas de crecimiento que mostraron lecturas inferiores a 0.1 de absorbancia se
consideraron como de crecimiento nulo, ya que en todos los casos se observó que el pardeamiento de las
muestras podría estar interfiriendo en las lecturas de densidad óptica, principalmente en las mediciones para
tiempos más largos.
En las figuras 1 a 5, se observa que en los sistemas que contenían 200 ppm de sorbato de potasio se registró
crecimiento microbiano a lo largo del almacenamiento, mientras que en aquellos con 400 ppm, o más, no se
evidenció desarrollo en todo el período estudiado. En base a estos resultados, se concluyó que la MCI de
ácido sórbico para Z. bailii en los modelos estudiados fue de 400 ppm.
En la figura 6 se representan los resultados obtenidos para todos los sistemas conteniendo 200 ppm de KS.
Puede observarse que, independientemente de la composición del sistema, todas las curvas fueron semejantes.
Esto indicaría que los distintos aditivos añadidos no influirían sobre la acción antimicrobiana del preservador.
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10
Abs. 540 nm
Abs. 540nm
10
1
0.1
0.01
1
0.1
0.01
0
100
200
300
0
Tiempo (h)
300
Fig. 2. Sistema II. Ú, testigo; ¯, 200 ppm;
£, 400ppp; ™, 600 ppm; Î, 800 ppm.
10
Abs. 540 nm
10
Abs. 540 nm
200
Tiempo (h)
Fig. 1. Sistema I. Ú, testigo; ¯, 200 ppm;
£, 400ppp; ™, 600 ppm; Î, 800 ppm.
1
0.1
0.01
1
0.1
0.01
0
100
200
300
0
Tiempo (h)
100
200
300
Tiempo (h)
Fig. 3. Sistema III. Ú, testigo; ¯, 200 ppm;
£, 400ppp; ™, 600 ppm; Î, 800 ppm.
Fig. 4. Sistema IV. Ú, testigo; ¯, 200 ppm;
£, 400ppp; ™, 600 ppm; Î, 800 ppm.
10
10
Abs. 540 nm
Abs. 540 nm
100
1
0.1
0.01
1
0.1
0.01
0
100
200
300
Tiempo (h)
Fig. 5. Sistema V. Ú, testigo; ¯, 200 ppm;
£, 400ppp; ™, 600 ppm; Î, 800 ppm.
0
100
200
300
Tiempo (h)
Fig. 6. Comparación de los distintos sistemas con la
misma concentración de SK (200 ppm).
Sistemas: ™, 21; £, 22; ¯, 23; Î, 24; Ú, 25.
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CONCLUSIONES
El estudio presentado en este trabajo demuestra que en los sistemas analizados, el agregado de KS resulta
clave para inhibir el crecimiento de Z. bailii y que la mínima concentración del preservador que resulta
inhibitoria es de 200 ppm. Estos resultados constituyen un paso preliminar que contribuiría a la formulación
de aderezos con menor contenido de preservadores. No obstante, si bien la determinación de la MCI permite
aproximarse a las concentraciones de preservador necesarias para impedir el deterioro microbiano del tipo de
alimentos modelados para que dicha aproximación fuera lo más certera posible deberían validarse los
resultados obtenidos para los sistemas modelo en alimentos.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen el apoyo económico de la Universidad de Buenos Aires, del Consejo Nacional de
Investigaciones Científicas y Técnicas de la República Argentina, de la Agencia Nacional de Promoción
Científica y Tecnológica de la República Argentina y del Banco Interamericano de Desarrollo.
BIBLIOGRAFIA
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Kurtzman, C.P., Rogers, P.R. and Hesseltine C.W. (1971). Microbiological spoilage of mayonnaise and
salad dressings. Appl. Microbiol. 21: 870-874.
2. Lodder, J.C.E.D. (1970). The Yeasts. A taxonomic study. North Holland Publishing Co., Amsterdam,
Holland.
3. Multon, J.L. (1988). Aditivos y auxiliares de fabricación en las industrias agroalimentarias. Ed. S.A.,
Zaragoza, España.
4. Pitt, J.J. (1974). Resistance of some food spoilage yeasts to preservatives. Food Technol. Austr. 26: 238.
5. Smittle, R.B. (1977). Microbiology of mayonnaise and salad dressing: A review. J. Food Protection,
40:415-421.
6. Smittle, R.B. and Cirigliano M.C. (1994). Salad Dressings, Chapter 53, in Vanderzant C. And
Splittstoesser D.F. (ed.) Compendium of methods for the microbiological examination of foods. 3rd.
Edition. New York, USA.
7. Smittle, R.B. and Flowers, R.M. (1987). Acid tolerant microorganisms involved in the spoilage of salad
dressings, J. Food Protection, 45: 977-983.
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Aires, Argentina.
9. Hsiao C.-P. y Siebert K.J. (1999). Modeling the inhibitory effects of organic acids on bacteria. Int. J.
Food Microbiol. 47: 189-201.
10. Castro M., Garro O., Gerschenson L. y Campos C. (2000). Influence of system composition on sorbic
acid stability in model aqueous systems and emulsions. Proceedings of the 8th. International Congress on
Engineering and Food. Puebla, Méjico.