Phadebact® CSF Test 20

53-1048-03, Apr-06
Phadebact®
CSF Test 20
Modo de empleo
MKL Diagnostics AB
Kung Hans Väg 3
SE-192 68 Sollentuna
Sweden
Anticuerpos ligados a estafilococos
Coaglutinación
Microorganismo con
antígenos correspondientes
MODO DE EMPLEO
Cada unidad de Phadebact® CSF Test contiene reactivos suficiente para 20 determinaciones.
USO PROPUESTO
Phadebact® CSF Test está destinado a la detección directa de antígenos capsulares de los siguientes
microorganismos: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae tipo b, Neisseria meningitidis grupos A, B,
C, Y, W135 y Streptococcus agalactiae (Strep B) en líquido cefalorraquídeo. También es posible la identificación de
alguno de estos antígenos en muestras serológicas y de orina. Favor de referir a la sección de suero y orina para
información detallada.
RESUMEN Y EXPLICACION DEL ANALISIS
La meningitis bacteriana aguda es una infección de las meninges, causada por una diversidad de microorganismos
gram-positivos y gram-negativos, predominantemente Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae y
Streptococcus pneumoniae (1). La meningitis bacteriana puede también aparecer a consecuencia de infecciones en
otras partes del cuerpo (2), siendo posible la infección bacteriana múltiple simultánea (3). El estreptococo grupo B
se ha perfilado como el agente etiológico principal de la meningitis durante los dos primeros meses de vida (4). Los
métodos tradicionales de diagnóstico son microscopía de frotis y cultivo. Técnicas serológicas de diagnóstico, tales
como contrainmuno-electroforesis (CIE) e inmunofluorescencia, requieren personal experto y equipos especiales.
Phadebact® CSF Test basado en la técnica de coaglutinación (5) permite la identificación rápida y directa de
Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae tipo b, Neisseria meningitidis and Streptococcus agalactiae en
líquido cefalorraquídeo, usando un método simple en porta.
PRINCIPIOS DEL PROCEDIMIENTO
La técnica de coaglutinación: anticuerpos desarrollados en conejo y específicos contra Streptococcus pneumoniae,
Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae tipo b y Streptococcus agalactiae, han sido acoplados a la proteína A
en la superficie de estafilococos no viables (6, 7). Cuando una muestra cefalorraquídea, infectada con uno de estos
microorganismos, se mezcla con los reactivos, los antígenos específicos en la superficie celular reaccionan con los
anticuerpos específicos del reactivo, formando una red de coaglutinación, visible a ojo desnudo.
REACTIVOS
Cada equipo de Phadebact® CSF Test contiene reactivos en cantidad suficiente para efectuar 20 determinaciones.
Los reactivos son de color azul (azul de metileno) para facilitar la interpretación de los resultados.
Composición de los reactivos
• CSF Pneumococcal Reagent
• CSF H. influenzae type b Reagent
• CSF Strep B Reagent
• CSF Meningococcal Reagent.
Los anticuerpos han sido desarrollados en conejo.
LISTO PARA USAR
1 vial
1 vial
1 vial
1 vial
Otros componentes
•
Goteros
•
Portas desechables
•
Modo de empleo
Precauciones
Solo para diagnóstico in vitro.
Atención! Los reactivos contienen azida sódica como conservante. La azida sódica puede reaccionar con el plomo
y el cobre de las cañerías, formando azidas metálicas altamente explosivas. Al desechar los residuos use abundante
agua para evitar la formación de estas azidas. Favor de referir al procedimiento de descontaminación recomendado
por CDC.
Preparación de los reactivos
Los reactivos están LISTOS PARA USAR.
Caducidad y almacenamiento
La fecha de caducidad se indica en la etiqueta exterior y en las etiquetas de los viales. Se recomienda almacenar el
kit entre 2-8°C. Los reactivos no deben congelarse.
OBTENCION Y MANIPULACION DE LAS MUESTRAS
Favor de referir a un manual estándar de microbiología concerniente a la colección, preparación y transporte de
muestras cefalorraquídeas.
Suero
Coleccionar la muestra sanguínea asépticamente por venopunción en un tubo limpio sin anticoagulante. Dejar
coagular por lo menos 10 min a temperatura ambiente (12-25°C). Centrifugar 10-15 min a 1 000x g o hasta que el
supernadante este libre de eritrocitos. Transferir el suero a un envase limpio de vidrio. Los mejores resultados se
obtienen con suero fresco.
Orina (muestras limpias)
Favor de referir a un manual estándar de microbiología concerniente a la colección y preparación de muestras de
orina (8).
PROCEDIMIENTO
Materiales suministrados
Ver REACTIVOS.
Materiales requeridos pero no suministrados
•
Pipetas Pasteur
•
Asas de inoculación desechables
•
Incubadora 80°C
•
Reloj con lectura fácil de minutos
Parámetros del análisis
Temperatura de la reacción
Duración de la reacción
Volumen de los reactivos
temperatura ambiente
1 minuto
una gota
Preparación de las muestras
Calentar la muestra de líquido cefalorraquídeo en una incubadora o baño María a 80°C durante 5 min. Dejar enfriar
y usar en el test. La posible contaminación con eritrocitos se debe al daño accidental de vasos capilares durante la
punción lumbar. En este caso se recomienda centrifugar la muestra.
Suero
Calentar la muestra en un calentador o baño María a 80°C, 3- 5 min. Dejar enfriar. Centrifugar a 1 000x g, 10 min
para precipitar el coágulo. Si es necesario, diluya el suero 1:4 con una solución de EDTA 0.1M, pH 7.4, antes de
calentar, para evitar el exceso de coagulación. Analizar el supernadante.
Orina
Centrifugar y eliminar el sedimento. Para aumentar la sensibilidad, concentrar el supernadante 25x o 50x con el
concentrador Amicon™ (o equivalente). Calentar a 80-100°C durante 3-5 min. Dejar enfriar. Realice el ensayo.
Procedimiento del ensayo
Nota! Agite bien los reactivos antes de usar.
Poner una gota de cada reactivo en diferentes
óvalos del porta. Fig. 1.
Poner una gota de la muestra en cada
gota de reactivo en el porta. Fig. 2.
Fig. 2
Fig. 1
Mezclar las gotas suave y
completamente con una asa desechable.
Usar una asa nueva para cada reactivo.
Fig. 3.
Fig. 4
Fig. 3
Balancear el porta y leer el resultado dentro
del minuto. Fig. 4.
Estabilidad de la reacción final
La reacción de coaglutinación es estable, pero las buenas prácticas de laboratorio señalan que los resultados deben
leerse dentro del minuto. (Observe que la desecación de los reactivos puede ser malinterpretada como reacción
positiva).
Calibración
No es necesario ningún tipo de calibración.
Control de calidad
Control positivo
•
Control positivo Phadebact® CSF Positive, disponible a través de MKL Diagnostics AB. El kit contiene antígenos de
cultivos puros, en viales separados, de S. pneumoniae, H. influenzae tipo b, Neisseria meningitidis and S.
agalactiae (Strep B).
•
El ensayo con los controles positivos es igual que con la muestra calentada.
•
Como alternativa pueden usarse cepas de referencia establecidas, p. ej. S. pneumoniae (ATCC 6303), H.
influenzae tipo b (ATCC 10211), N. meningitidis (ATCC 13077) y S. agalactiae (ATCC 12401).
Control negativo
El uso simultáneo de los cuatro reactivos con la muestra, da un control negativo intrínseco ya que los casos de
infección múltiple son raros.
Aspecto de la reacción
Ausencia de reacción
Reacción positiva
RESULTADOS
Resultado positivo
Una reacción significativamente más intensa de uno de los reactivos en comparación con los otros tres reactivos
constituye un resultado positivo.
Resultado negativo
La ausencia de reacción con por lo menos uno de los reactivos indica que la muestra no esta infectada con
Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae tipo b, Streptococcus agalactiae o Neisseria meningitidis o que
la cantidad de antígeno es insuficiente. Use un test diferente como cultivo o CIE.
Resultados indeterminados
El resultado es indeterminado si la coaglutinación con dos o mas reactivos es de igual intensidad y rapidez. En este
caso el espécimen no podrá ser identificado con Phadebact® CSF Test. Use un test diferente como cultivo o CIE.
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
Los métodos inmunológicos como el de coaglutinación, usados en identificación de Haemophilus influenzae,
Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae y Neisseria meningitidis, contienen anticuerpos dirigidos
contra los antígenos capsulares de los microorganismos. Por esta razón los microorganismos desposeídos de
cápsula no reaccionan en el test inmunológico. Ciertos tipos de S.pneumoniae tienen antígenos similares al de
H. Influenzae tipo b lo cual ocasiona reacción cruzada (9). La frecuencia de reacciones cruzadas es generalmente
baja. Se realizó un estudio de 4 muestras de H. influenzae y 9 muestras de S. pneumoniae (108 organismos/mL)
con Phadebact® CSF Test. No se observaron reacciones cruzadas (11). Cabe destacar que al igual que con CIE, el
resultado negativo con Phadebact® CSF Test no excluye la posibilidad de nfección por meningitis bacteriana (12).
Como con todo test, el diagnóstico clínico definitivo no deberá basarse únicamente en el resultado aislado de una
sola prueba, sino que deberá hacerse por el médico especialista luego de la evaluación completa de los resultados
clínicos y de laboratorio.
CARACTERISTICAS DEL ENSAYO
Sensibilidad y especificidad
Se analizaron un total de 362 muestras cefalorraquídeas de pacientes presuntivos de meningitis (10, 11), de los
cuales 324/362 (90%) fueron correctamente identificados. La especificidad fue del 99% (155/157 verdaderos
negativos). La sensibilidad fue la siguiente :
H. influenzae type b
S. agalactiae
S. pneumoniae
N. meningitidis
74/85
14/17
32/38
39/65
87%
82%
84%
60%
El resultado de muestras de suero y/u orina de pacientes con diagnóstico de meningitis bacteriana, fue confirmado
por CIE y/o cultivo de líquido cefalorraquídeo dando los siguientes resultados:
Muestras de suero
No. de pacientes
Positivo por
coaglutinacíon
H. influenzae tipo b
49
41 (84%)
S. pneumoniae
15
10 (67%)
S. agalactiae
12
9 (75%)
N. meningitidis
15
8 (53%)
Muestras de orina
No. de pacientes
Positivo por
coaglutinacíon
H. influenzae tipo b
83
S. pneumoniae
19
73 (88%)
4 (21%)
S. agalactiae
37
32 (86%)
N. meningitidis
21
3 (14%)
NB: No todos los casos de meningitis bacteriana muestras residuos de antigeno
suero o en orina.
Reproducibilidad
Los reactivos usados en el test son controlados periodicamente con cepas estándar conocidas para asegurar su
reproducibilidad.
GARANTIA
Los resultados presentados aquí han sido obtenidos siguiendo exactamente el procedimiento descrito. Cualquier
cambio o modificación en el procedimiento no recomendado por MKL Diagnostics AB puede afectar los resultados,
en cuyo caso MKL Diagnostics AB declina toda responsabilidad de garantía expresada, implícita o establecida por
la ley, inclusive la responsabilidad implícita para venta o condiciones de uso. En dicho caso MKL Diagnostics AB y
sus distribuidores autorizados, no se harán responsables por cualquier daño directo, indirecto o por consecuencia.
Referencias:
1.
Infectious diseases. Second edition, ed. Paul Hoeprich, Harper & Row Publishers Inc 1977.
2.
Bailey and Scott´s diagnostic microbiology. Ed. by Finegold S M, Martin W J, Scott E G. The CV Mosby
Company, Saint Louis 1978.
3.
Herweg J C, Middlekamp J N and Hartmann A F Sr: Simultaneous mixed bacterial meningitis in children. J
Pediatr 63: 76-83, 1963.
4.
Baker C J: Group B Streptococcal Infections in Neonates. Pediatrics in review 1:1 (1979).
5.
Christensen P, Kahlmeter G, Johnson S and Kronvall G: New method for the serological grouping of
streptococci with specific antibodies adsorbed to protein A-containing staphylococci. Inf Imn 7 (1973) 881-885.
6.
Kronvall G: A rapid slide agglutination method for typing pneumococci by means of specific antibodies adsorbed
to protein A-containing staphylococci. J Med Microbiol (1973) 187-190.
7.
Olcén P: Serological methods for rapid diagnosis of Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis and
Streptococcus pneumoniae in cerebrospinal fluid: A comparison of Co-agglutination, Immunofluorescence and
Immunoelectroosmophoresis. Scand J Infect Dis 10 (1978) 283-89.
8.
Manual of Clinical Microbiology, 4 ed. Ed. by Lennette E H, Balows A, Hausler Jr. W J & Shadomy Jean,
Washington DC (Am Soc Microbiology) 1985.
9.
Ibid page 336.
10. Wasilavskas B L & Hampton KD: Determination of Bacterial Meningitis: a Retrospective study of 80
Cerebrospinal Fluid Specimens Evaluated by Four In Vitro Methods. J Clin Microbiology (1982) 531-535.
11. Data on file, MKL Diagnostics AB.
12. Rapid Diagnosis in Infectious Disease Ed. Michael W Ryfel Boca Roton, Florida (CRC Press Inc) 1979.
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