Antígenos de fluido vesicular de Cysticercus tenuicollis detectados

REBIOL. Vol. 29, N° 1: enero - junio, 2009
Organo oficial de la Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad Nacional de Trujillo. Trujillo-Perú
Artículo original
Antígenos de fluido vesicular de Cysticercus
tenuicollis detectados mediante la técnica de
Western blot utilizando anticuerpos IgY e
IgG
Cysticercus tenuicollis vesicular-fluid antigens dtectd by Western
blot technique using IgG and IgY antibodies
Julio A. Cabrera1, Elmer E. Castillo1, Juan C. Colina1, Juan A.
Guzmán1 y César A. Jara2
1
Exalumnos de la Escuela AP de Microbiología y Parasitología de la Universidad Nacional de Trujillo (UNT).
Trujillo. Perú. 2Departamento de Microbiología y Parasitología-UNT
RESUMEN
Se determinó a las bandas inmunoreactivas del fluido vesicular de Cysticercus tenuicollis mediante la
técnica de Western blot utilizando anticuerpos IgY obtenidos en Gallus gallus Hy Line y Black Sex
Link e IgG obtenidos en Oryctolagus cuniculus inmunizados experimentalmente y se compararon con
las bandas del fluido vesicular de C. cellulosae obtenidas usando la misma metodología.
Los antígenos se obtuvieron por centrifugación del fluido vesicular de 10 especímenes de C.
tenuicollis obtenidos de Ovis aries naturalmente infectados y sacrificados en el Camal Municipal “El
Porvenir”, Trujillo, Perú y los anticuerpos IgG en dos ejemplares de O. cuniculus y los YgY en
gallinas ponedoras HyLine y BlackSexLinK inmunizados con los antígenos y 31 sueros positivos a
otras parasitosis, proporcionados por el laboratorio Escalabs EIRL de Trujillo, para determinar
reacciones cruzadas. La técnica de Western Blot se hizo con antígenos tratados con sulfato de sodio
(SDS) y utilizados a una concentración de 0.05 ug/Ml, siguiendo el protocolo propuesto por
Escalante (1999).
Se encontró seis bandas inmunoreactivas: 65.6; 58.2; 51.7; 39.1; 13.4 y 9.7 Kda, de las cuales loa
de 9.7 y 39.1 KDa son similares a las registradas en el fluido vesicular de C. tenuicollis, por lo podrían
usarse como bandas de tamizaje.
Palabras clave: Cysticercus cellulosae, Cysticercus tenuicollis, fluido vesicular, Western blot
ABSTRACT
Immunoreactive bands of Cysticercus tenuicollis-vesicular fluid by Western blot technique using IgY
and IgG antibodies obtained in Gallus gallus HyLine and BlackSexLink strains and in rabbit,
Oryctolagus cuniculus, experimentally immunized were determined. Antigens were obtained by
centrifugation of vesicular fluid of C. tenuicollis collected from Ovis aries naturally infected and
sacrified in “El Porvenir” (Trujillo, Peru) Slaughterhouse and antibodies in hens and rabbit, besides,
were used antibodies against other parasitoses proporcionated by escalabs Laboratory (Trujillo,
Peru). It was found six reactive bands in both antibotie types: 65.6; 58.2; 51.7; 39.1; 13.4 y 9.7 Kda,
of them 9.7 and 39.1 bands were compatible with regarded from C. cellulosae cysticerci.
Key words: Cysticercus tenuicollis, Cysticercus celluilosae, Western blot, IgG, IgY, fluido vesicular
INTRODUCCIÓN
La cisticercosis humana es una infección causada por la etapa larvaria de Taenia solium,
éstas pueden alojarse en varios tejidos y órganos del huésped, lo que determinará los
diferentes cuadros clínicos1,2,3, siendo la de mayor importancia la neurocisticercosis4,6 que
consiste en la localización de la larva en el SNC causando diferentes síntomas como
convulsiones, aracnoiditis, hipertensión intracraneal, hidrocefalia no comunicante, ceguera
y llevar hasta la muerte4,5,7. Es una enfermedad propia de países pobres en donde influyen
las prácticas tradicionales de crianza de cerdo y las malas condiciones sanitarias e
higiénicas8,9.
El diagnóstico clínico de la neurocisticercosis es difícil debido a que los signos y síntomas
que presenta la enfermedad son comunes en otros desordenes biológicos siendo necesario
correlacionar los los antecedentes epidemiológicos y clínicos, los hallazgos radiográficos y
las pruebas inmunológicas7,10.
El uso de la tomografía axial computarizada11, el ultrasonido (para cerdos)12 y la
resonancia magnética han mejorado el diagnóstico de la neurocisticercosis, sin embargo
estas técnicas no son accesibles a la mayoría de la población debido al alto costo 9; por ello
se están realizando pruebas diagnósticas, económicas y prácticas orientadas a la
identificación de anticuerpos de la larva siendo las más usadas aquellas que presentas
elevada sensibilidad y especificidad, como es el caso de las pruebas de Elisa y de Western
blot13,14.
La inmunoelectrotransferencia o Western Blot es un método muy sensible para la
detección de proteínas específicas en mezclas completas por que combinan la selectividad
de la electroforesis en gel de poliacrilamida con la sensibilidad del inmunoensayo15.
Mediante esta técnica se encontró las bandas antigénicas en el fluido vesicular de C.
cellulosae: 42, 35, 31, 24, 23, 18, 17, 14 y 13 kDa, los cuales han sido reconocidos en suero
de pacientes con cisticercosis confirmada con una sensibilidad de 91% y especificidad de
100%16.
Además de la evidentes similitudes morfológicas entre varias especies de cisticercos,
algunos autores han demostrado similitudes inmunológicas entre los antígenos de C.
cellulosae y C. longicollis 17,18,19, en una afanosa búsqueda de fuentes de antígenos para el
diagnóstico de neurocisticercosis debido a que es dificultosa la obtención de huevos de T.
solium. Otros autores han realizado investigaciones con C. fasciolaris 20 y C. tenuicollis16,21,.
En este mismo sentido, resulta útil conocer si otros cisticercos pueden ser también fuente
de antígenos de utilidad en el diagnóstico de la cisticercosis, como es el caso de C.
tenuicollis. Esta larva tiene distribución cosmopolita, según estudios efectuados en la década
de los 80. Esta larva infecta aproximadamente el 28,5% de ovinos y al 40,0% de caprinos
procedentes de zonas de la sierra y sacrificados en camales del norte del Perú, hecho que
permite señalar que es de fácil hallazgo22.
En los últimos años se ha desarrollado una técnica para producir anticuerpos
policlonales en Gallus gallus “Gallina” mediante la inmunización con antígenos de parásitos
23
, los anticuerpos son recuperados de la yema de huevo y son de tipo IgY, una especie de
IgG de mamífero, que es transferido de la gallina a los huevo al igual que los IgG son
transferidas a los fetos a través de la placenta y el calostro. Al comparar la estructura de
ambas inmunoglobulinas aviar y mamíferas, se observa que funcionan de igual manera,
diferenciándose en la masa molecular, por otra parte, la IgG aviar posee gran similitud en
su secuencia de ADN con la IgE humana, lo que permite que ambas IgG (IgY en aves) no
presenta reacción cruzada, sin embargo, a pesar de tener mucha similitud la IgG de
mamíferos con la de las aves, a la inmunoglobulina aviar se le denomino IgY.
Además de los aspectos referentes al bienestar animal, la cantidad de anticuerpos
producida por una gallina es mucho mayor que la cantidad de anticuerpos que pueden
obtenerse de un conejo. Es importante también, que debido a la distancia filogenética entre
aves y mamíferos, las gallinas producen anticuerpos mas específicos contra antígenos
mamíferos que los mismos mamíferos; por lo que los anticuerpos IgY resultan adecuados
para ensayos inmunológicos, pues disminuyen los falsos positivos al no interactuar con los
IgG de mamíferos, con el factor reumatoide o con los receptores de fijación de
complemento de los mamíferos 24
En la presente investigación se determinaron a las bandas inmunoreactivas, mediante la
técnica de Western blot, del fluido vesicular de Cysticercus tenuicollis usando IgY e IgG
obtenidos en gallinas, Gallus gallus HyLine y en conejos, Oryctolagus cuniculus, inmunizados
experimentalmente y se compararon con sueros positivos a helmintiasis y con las bandas
diagnósticas registradas para la cisticercosis por C. cellulosae.
MATERIAL Y MÉTODOS
Antígenos.
Se obtuvieron del fluido vesicular de C. tenuicollis recolectados del mesenterio de Ovis
aries infectados naturalmente y sacrificados en el camal municipal de El Porvenir, TrujilloPerú. En el laboratorio los especímenes recolectados fueron lavados en placas petri con
suero fisiológico estéril con antibióticos (penicilina G sódica y gentamicina), luego con
jeringa tipo tuberculina se extrajo el fluído vesicular de los cisticercos colocando el fluído
extraído en tubos estériles para su centrifugación y conservación a -20°C. La concentración
de proteínas se determinó mediante el método de Bradfort25
Anticuerpos.
Los antígenos obtenidos del fluído vesicular fueron emulsificados en adyuvante de Freund,
(1mg/1mL) para inmunizar las gallinas y los conejos, por vía subcutánea, con 1 mL (840
g/mL) de fluido vesicular emulsificado en igual cantidad de adyuvante de adyuvante
completo de Freund, en la primera inoculación y con adyuvante incompleto de Freund las
tres restantes, a intervalos de siete días16. A los siete días de la última inoculación se
obtuvieron los IgG del suero de conejo y los IgY de la yema de los huevos, de acuerdo a
Na Ri Shin y cols 26, que consiste en separar la yema de la clara del huevo y homogenizarla
después de mezclarla con un volumen igual de PBS 0.01M pH 7.2. El homogenizado de la
yema fue mezclado vigorosamente con un volumen igual de cloroformo, luego se dejó
reposar por una hora a temperatura ambiente. Después de esta incubación, el
homogenizado fue centrifugado a 4500 rpm por 15 minutos obteniéndose el sobrenadante
que será guardado a -20 ºC hasta su uso.
También se obtuvieron 31 sueros positivos a otras parasitosis, que fueron
proporcionados por el Centro de Análisis e Investigación Escalabs, de los cuales: 10 fueron
positivos a cisticercosis, 04 a Teniasis por T. solium, 04 a Teniasis por T. saginata, 03 a
Hidatidosis, 03 a Fasciolasis, 04 a Difilobotriasis y 03 a Himenolepiasis
La técnica de Western blot
La ejecución de la técnica de “Western Blot” y la preparación de los reactivos se
realizaron siguiendo las indicaciones sugeridas por Escalante y cols16.
RESULTADOS
Luego de extraído el contenido vesicular de especímenes de Cysticercus tenuicollis y
medidas las concentraciones de proteínas por el método de Bradford, se encontraron
cantidades que variaron de 720 a 1000ug/mL. (Tabla 1).
Tabla 1. Concentración de proteínas del fluido vesicular de C. tenuicollis obtenidos de Ovis aries
naturalmente infectados
Espécimen
tenuicollis
M6
M5
de
C.
[Prot] ug/ml
760
700
M4
M3
M2
M1
1000
720
960
780
Ejecutada la técnica se observaron cinco bandas de: 65.6; 58.2; 51.7; 39.1y 9.7 KDa y seis
bandas: 66.5; 58.2; 51.7; 39.1; 13.4 y 9.7 KDa que corresponden a la segunda semana postinoculación de Gallus gallus razas Hy Line y Black sex link, respectivamente. Se observó,
asimismo seis bandas: 65.6; 58.2; 51.7; 39.1, 13.4 y 9.7 KDa y siete bandas: 65.6; 58.2;
51.7; 39.1, 30.8, 13.4 y 9.7 KDa correspondiente a la cuarta semana post-inoculación de
Gallus gallus razas Hy line y Black sex link.
El enfrentamiento del antígeno de fluido vesicular de C. tenuicollis con sueros positivos a
otros helmintos, tales como: larvas de T. solium y Echinococcus granulosus, T. solium T.
saginata, F. hepatica, H. nana y D. pacificum; se encontró que para la larva de T. solium
aparecen bandas de 9.3; 9.7 y 39.1 KDa; para T. solium, bandas de 8,6 y 9.7 KDa; para T.
saginata, bandas de 8.3, 8.6 y 9.7 KDa y para la larva de E. granulosus una banda de 8.3
KDa. En los demás parásitos no se presentó banda alguna. (Figura 3).
Fig.3 Bandas antigénicas de C. tenuicollis con bandas de otras parasitosis: (A) Larva de T. solium, (B) T. solium, (C) T.
saginata, (D) Larva de Echinococcus granulosus, (E) F, hepática, (F) H. nana, (G) D. pacificum, (H) Marcador
de peso molecular y (I) IgY de las cuartas inmunizaciones de Gallus gallus.
DISCUSIÓN
Los cisticercos, larvas de cestodos de la familia Taenidae, presentan líquido vesicular rico
en proteínas 27, como pudo comprobarse al medirla mediante el método de Bradford25. La
cantidad de proteínas halladas es menor a la hallada en otro trabajo que va desde los 1200 a
1900 KDa28 .
La ventaja del uso de las IgY es que no se produce daño en el animal para formarlas y es
de fácil extracción, debido a que se encuentran en mayor cantidad que otras proteínas en la
yema de huevo, entonces no es necesario el uso de sulfato de amonio Para precipitar
proteínas29, 30,31. Una desventaja es que las bandas formadas en el Western Blot no son muy
nítidas. La baja nitidez de las bandas se debe a la dilución preparada para el corrido,
diluciones de 1/25 dieron bandas más nítidas en trabajos realizados anteriormente. (3,6)
Las bandas 65.6, 58.2, 51.7, 39.1 y 9.7 KDa aparecen en la segunda semana postinoculación de la gallina Hy line (fig.1), lo mismo sucede con las bandas de 65.6, 58.2,
51.7, 39.1, 13.4 y 9.7 de la segunda semana post-post-inoculación de la gallina Black sex
link (fig. 2), debido a que los anticuerpos aparecen en la yema de huevo ocho días después
de la inoculación primaria de antígenos, alcanzando el máximo nivel a partir del día 12 (5),
por lo que podemos diferir de tales resultados al observar que en la determinación de
bandas de la cuarta semana post-inoculación aparecen una banda de 14.1 KDa para la
gallina Hy line y una banda de 27.5 KDa para la gallina Black sex link.
Las bandas obtenidas en la cuarta semana de cada gallina (fig. 1-2) coinciden las bandas
de 65.6; 58.2; 51.7; 39.1, 13.4 y 9.7 KDa; mientras que la banda 30.8 KDa solo se presenta
en la gallina de raza Black sex link, esto se debe a que la capacidad para generar respuesta
inmunitaria es diferente en cada individuo, que depende de las moléculas CPH-II que es
especifico para cada antígeno32. De todas las bandas encontradas en este trabajo la de 13.4;
30.8 KDa podrían tratarse de las bandas 31-29, 13-14 KDa encontrados en otros trabajo
realizados. 28,16
Al comparar las bandas de C. tenuicollis con las bandas de los sueros positivos a
cisticercosis (fig. 3) comparten las bandas 9.7 y 39.1 KDa. Siendo la más frecuente la banda
9.7. Las bandas 13.4 y 30.8 podrían tratarse de las bandas 14 y 29 KDa encontradas por
Calderon 28 y Escalante16,las bandas 30.8 y 65.6 podrían tratarse de las bandas de 29 y 66
KDa reportadas por Pinilla13; las bandas 65.6, 39.1 y 9.7 KDa se tratan de las bandas 64, 39
y 10 KDa encontradas por Seung 21 .Al comparar las bandas de C. tenuicollis con las
bandas positivas a cisticercosis aparecen solo dos bandas que vienen a ser los antígenos
comunes entre estos parásitos, la aparición de estas bandas difiere de otros trabajos13,21,28
que ven la semejanza entre los pesos moleculares, en que trabaja con anticuerpos
inducidos con su respectivos antígenos, por eso la mayor cantidad de bandas.
Las bandas encontradas que solo aparecen en otros trabajos, es debido a que los sueros
con los que se trabajan contienen algunas fracciones de antígenos del parásito y cada
individuo tienen una respuesta inmune diferente 32 por lo que aparecen diferentes bandas
En la figura 3 vemos que la banda de 9.7 KDa no es específica ya que puede tratarse de
la banda 9.7 – 8.6 KDa en T. solium, las bandas 8.3 – 8.6 – 9.7 KDa en T. saginata y 8.3
KDa en sueros positivos a hidatidosis, esto se debe a reacciones cruzadas, al igual como
sucede con las IgG de sueros positivos a cisticercosis, por presentar antígenos comunes; lo
que no sucede con las otras tres helmintiasis en donde no se presentó banda alguna.
La aproximación, como semejantes, de las bandas con pesos moleculares diferentes se
sustenta en un posible error en el cálculo de los pesos moleculares, o también la falta del
corrido de un pool de solución de yema de huevo donde se puedan observar la mayor
cantidad posible de bandas. 30
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