Agentes desinfectantes a base de cobalto son ineficaces para E

Revista Latinoamericana el Ambiente y las Ciencias
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4(7): 23-31 2013
Agentes desinfectantes a base de cobalto son ineficaces para E. coli enteropatógena
Disinfecting agents based on cobalt are ineffective for Enteropathogenic E. coli
*Avelino Flores Fabiola1,2, Calyeca Sánchez3, E. I. Castañeda Roldán1,2.
1
CICM-ICUAP, 2Posgrado en Ciencias Ambientales, 3Facultad de Ciencias Químicas.
Benemérita Universidad Autónoma de Puebla. Edif. 103-J, Ciudad Universitaria, San Manuel,
Puebla, Pue., México. Tel/fax (222) 229 5500 ext 2537, email: [email protected]
RESUMEN. Escherichia coli es un organismo indicador ampliamente usado para la
calidad microbiológica del agua, pero también es un agente causal de diarrea y otras
enfermedades entéricas. Hay muy pocos estudios que proporcionen información amplia y
adecuada sobre la sobrevivencia de E. coli enteropatogénica en presencia de desinfectantes
a base de cobalto, que se usa en aguas residuales, lo que constituye el objetivo de esta
investigación. Se ha reportado que el límite máximo permisible en aguas residuales para
cobalto, es de 0.2 mg/L. En este trabajo se utilizaron diferentes concentraciones (0.01, 0.05,
0.1, 0.15, 0.20, 0.25 mg/L) de cloruro de cobalto. La sobrevivencia de los microorganismos
en el medio ambiente se relaciona con la expresión de factores de virulencia que le ayudan
a adaptarse, entre ellos destacan el flagelo y la formación de biopelículas. Las cepas
utilizadas fueron una cepa patógena de EPEC silvestre (E2348/69), una cepa E2348/69
mutada en el gen fliC (AGT01) y una cepa de E. coli no patógena (DH5). Las cepas se
crecieron en medio LB con diferentes concentraciones de cobalto y antibiótico en el caso de
la mutante, se incubaron a 37º C, con agitación continua (200 rpm) El crecimiento de las
cepas se midió a una OD600. Se midió la transcripción flagelar por ensayos degalactosidasa, la movilidad en placas con agar LB al 0.25% y la formación de biopelículas
sobre cubreobjetos circulares de vidrio en placas de 24 pozos. Los resultados obtenidos
mostraron que las diversas concentraciones de cobalto no afectaron el crecimiento
bacteriano ni la movilidad de EPEC, la transcripción flagelar se incrementó a todas las
concentraciones utilizadas. E. coli DH5 presentó un decremento gradual en su
crecimiento, la menor movilidad a 0.15 mg/L y una mayor transcripción flagelar a 0.2
mg/L. EPEC y E. coli DH5 no formaron biopelículas pero si agregados en presencia de
cobalto, todo ello sugiere que EPEC podría sobrevivir en aguas residuales tratadas con cobalto.
ABSTRACT. Escherichia coli is widely used, as an indicator organism for the
microbiological quality of water is also an important causative agent of diarrhea and other
enteric diseases. Few studies that provide full and accurate information on the survival of
enteropathogenic E. coli in presence of disinfectants cobalt, which is the aim of this
Recibido: febrero, 2013.
Aprobado: mayo, 2013
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research. It has been reported that the maximum permissible in wastewater cobalt, is 0.2
mg/L. In this paper we used different concentrations (0.01, 0.05, 0.1, 0.15, 0.20, 0.25 mg/L)
of cobalt chloride. The survival of the microorganisms in the environment is related with
the expression of virulence factors. These factors help to bacterial adaption stand out
between them the flagella and the formation of biofilms. Bacteria strain used were wild
type EPEC (E2348/69), fliC mutant of EPEC strain (AGT01) and E. coli nonpathogenic
(DH5).Strains were grown in LB medium with different concentrations of cobalt and
antibiotic in the case of the mutant, were incubated at 37°C with agitation continuous (200
rpm). The growth of the strains was measured at OD600. Flagella transcription was
measured by -galactosidase assays, motility in 0.25% agar plates containing LB media and
biofilm formation on circular glass coverslips on 24 well plates. The results showed that the
different cobalt concentrations did not affect the growth of bacteria or EPEC motility,
flagella transcription in all concentrations used were increased. E coli DH5showed a
gradual decrease in growth, the less motility at 0.15 mg/L and flagella transcription at
concentration 0.2 mg/L. There was not biofilm formation, but EPEC and K-12 formed
clusters in cobalt presence, everything strongly suggests that EPEC could survive in
wastewater treated with disinfectants of cobalt.
Palabras Clave: Escherichia coli enteropatógena, Transcripción flagelar, Sobrevivencia
bacteriana, Desinfectantes a base de cobalto.
Keywords: Enteropathogenic Escherichia coli, Flagella transcription, Bacteria survival,
cobalt disinfectant
INTRODUCCIÓN
Escherichia coli enteropatógena (EPEC), es miembro de un grupo de bacterias patógenas
causantes de diarrea infantil en todo el mundo y esto se debe a la expresión de diversos
factores de virulencia que le permiten adherirse, adaptarse y reproducirse en seres humanos
causando una infección que lesiona y altera la función de las células intestinales al
adherirse a ellas (Finlay, 1996; Rodríguez, 2002); dichos factores de virulencia están bajo
el control de un regulador global de virulencia (Nataro y Kaper, 1998; Kaper y col., 2004).
Algunos de los factores de virulencia que expresa EPEC son BFP (pilus formador de
bucles), diversos factores de adherencia y sus reguladores (Gomez-Duarte y Kaper, 1995;
Ibarra y col., 2003), flagelo y sus reguladores (Iyoda y col., 2006) y factores involucrados
en la formación de biopelículas, entre otros.
El flagelo bacteriano es un organelo superficial involucrado en la patogénesis en muchos
aspectos, destacando que permite el desplazamiento bacteriano hacia ambientes benéficos o
el alejamiento de nichos adversos (Josenhans y Suerbaum, 2002; Macnab, 2003, Vidal,
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2003), también está relacionado a la formación de biopelículas lo que contribuye a su
sobrevivencia en ambientes extraintestinales. (Germany, 1996),
La forma en que el medio ambiente y las características nutricionales modulan la
flagelación y la movilidad de E. coli K12 no patógena ha sido previamente estudiada (Adler
y Templeton, 1967), frecuentemente los sistemas de regulación que sensan y responden a
las condiciones ambientales también afectan la expresión de los genes de virulencia,
sugiriendo que el flagelo, la movilidad y la expresión de otros factores están
interrelacionados con su sobrevivencia (Gupta y Chowdhury, 1997; Schuhmacher y Klose,
1999).
Las enfermedades infecciosas gastrointestinales se relacionan con factores ambientales
tales como el uso y consumo de agua insalubre, las aguas residuales como fuente de
contaminación importante que diseminan una gran cantidad de microorganismos
principalmente los entéricos, dentro de los que destaca E. coli. La Organización Mundial de
la Salud (OMS) destaca que solo un 41% de la población mundial consume agua tratada y
desinfectada, considerada como segura (OMS-UNICEF, 2000).
La persistencia de las bacterias en el agua o en el suelo garantiza su sobrevivencia en el
ambiente aún en presencia de agentes adversos como desinfectantes y antisépticos. En
muchos casos, el tratamiento con agentes desinfectantes no elimina completamente los
microorganismos presentes, sólo reduce su número, retardando la acción indeseable de
ellos (Brady, 2003, Codony, 2003).
El cloruro de cobalto es un desinfectante con aplicación en aguas residuales. La Agencia de
protección al ambiente (EPA), recomienda que el límite máximo permisible en aguas
residuales para cobalto, sea de 0.2 mg/L y de 0.02 mg/L en el ambiente. El cobalto, que es
un elemento natural en el medio ambiente, puede entrar en aire, agua y depositarse sobre la
tierra; por lo que estamos expuestos a respirarlo, beberlo y comerlo (Sánchez, 2001). El
cobalto es benéfico para el humano ya que forma parte de la vitamina B 12 (Heldt, 2005),
pero su sobredosis disminuye la actividad de la tiroides y puede favorecer la formación de
bocio y causar alteraciones sanguíneas, trastornos del sistema nervioso, lesiones cardíacas y
fibrosis pulmonar crónica. La inhalación de polvo de cobalto predispone a padecer cáncer
(efecto carcinogénico comprobado, además de producir efectos cáusticos en la garganta y el
tracto gastrointestinal. Los riesgos de los compuestos del cobalto son relativamente bajos,
en comparación con otros metales pesados, pero una vez que ha entrado en el medio
ambiente no puede ser retirado; pudiendo reaccionar con otras sustancias o ser absorbido
por partículas del suelo o del agua, se moviliza bajo condiciones ácidas.
El objetivo del presente trabajo fue medir indirectamente la sobrevivencia de E. coli
enteropatogénica en presencia de un desinfectante a base de cobalto que se usa en aguas
residuales a través de cuantificar su crecimiento, y factores de virulencia como la expresión
de flagelo, la movilidad, transcripción flagelar y la formación de biopelículas.
PROCEDIMIENTO.
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Cepas y condiciones de cultivo. Las cepas empleadas en este estudio fueron: E. coli
E2348/69 que es un cepa patógena de EPEC, la cepa AGT01 que es la cepa de E. coli
E2348/69 mutada en el gen de la flagelina (fliC) y la cepa E. coli DH5 (no patógena), se
utilizaron para monitorear su sobrevivencia en presencia de un desinfectante de cobalto.
Las cepas que se utilizaron para los ensayos de transcripción flagelar se mencionan en la
tabla I, las cuales fueron transformadas con la fusión transcripcional fliC::lacZ. Las cepas
se crecieron en medio Luria Broth (LB) sin o con ampicilina y/o kanamicina según fue
necesario, y adicionados con diferentes concentraciones de cloruro de cobalto (tabla 2) la
incubación fue a 37°C en agitación continua a 200 rpm. Para los ensayos de crecimiento
microbiano, movilidad y de formación de biopelículas se utilizaron las cepas sin
transformar, es decir EPEC E2348/69, EPEC AGT01, y E. coli DH5.
Crecimiento bacteriano. Un inóculo de 200 µL de cada cepa de E. coli (EPEC E2348/69,
EPEC AGT01, y E. coli DH5, proveniente de un cultivo de 21 h (OD600 =1) fue adicionado
a 5 mL de caldo LB conteniendo diferentes concentraciones de cloruro de cobalto. A la
cepa AGT01 se le agregó kanamicina, el crecimiento se midió después de 4 h de incubación
a una OD600. En el experimento se empleó un control sin adición de cobalto y se comparó
con el crecimiento en presencia de cobalto.
Tabla I. Cepas utilizadas en este estudio. Se incluyeron cepas: silvestre, nativa y
transformada con la fusión transcripcional.
Cepa
original
Características
Cepa transformada con
fusión transcripcional
fliC::lacZ
E2348/69
EPEC silvestre patógena
FA1
AGT01
Cepa E2348/69 mutada en el gen fliC,
resistente a kanamicina
FA2
DH5
Cepa de E. coli no patógena
PL1
Transcripción flagelar. Esta característica se midió a través del ensayo de
galactosidasa, para el cual 100 L de un cultivo de las diferentes cepas cultivadas por 21
h se inocularon a 5 mL de caldo LB con o sin las diferentes concentraciones de la sustancia
a ensayar y con o sin los antibióticos correspondientes, los cultivos se incubaron 4 h a 37°C
y a 200 rpm, al finalizar la incubación los tubos se colocaron en hielo por 20 min. Después
se tomaron de cada cultivo 500 L y se agregaron a 500 L de Buffer Z, se agregó
cloroformo y SDS al 0.1 % y se mezcló, se incubó a temperatura ambiente, a esta mezcla se
le adicionaron 200 L de ONPG (orto-nitro-fenil-galactopiranosido) y se mezcló
nuevamente, se incubó la reacción a temperatura ambiente hasta la aparición de un color
amarillo. Se detuvo la reacción al agregar 500 L de Na2CO3 1M. Las lecturas se llevaron a
cabo en espectrofotómetro para aplicar la ecuación de Miller (Miller, 1972).
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Tabla 2. Concentraciones empleadas de desinfectante a base de cobalto para los
ensayos de sobrevivencia, transcripción flagelar, expresión de flagelo y movilidad de
EPEC y K-12.
Sustancia
Cloruro de cobalto
Concentraciones empleadas (mg/L)
0.01
0.05
0.01
0.15
0.20
0.25
Pruebas de movilidad: Se llevaron a cabo en agar LB al 0.25% con la adición de las
diferentes concentraciones de cloruro de cobalto, cada placa se sembró por picadura en el
centro sin tocar el fondo de la placa y se incubó 12 h a 37° C, después de la incubación se
midieron los halos de movilidad.
Todos los ensayos se realizaron en tres tiempos diferentes y por triplicado para garantizar
su confiabilidad y reproducibilidad. El análisis estadístico utilizado fue la prueba de
Kruskal-Wallis a un valor de significancia de p< 0.05.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
Los parámetros evaluados fueron crecimiento bacteriano, transcripción flagelar, movilidad
o funcionalidad flagelar y formación de biopelículas en presencia de cloruro de cobalto.
El cobalto no afectó de forma significativa el crecimiento de EPEC a las diferentes
concentraciones de cobalto empleadas, aunque se observó un ligero incremento a la
concentración recomendada por la EPA, con respecto al cultivo no adicionado; para el caso
de E. coli DH5no patógena se observó una disminución dosis dependiente hasta 0.25
mg/L, esto pudo ser debido a que en un inicio el cobalto es utilizado por los
microorganismos para la biosíntesis de la vitamina B12 (Heldt, 2005) pero cuando es
excesivo, le es tóxico y es eliminado a través de un sistema transportador secundario de
cobalto y niquel, lo que hace posible que algunos microorganismos crezcan de forma
similar a todas las concentraciones empleadas (fig. 1A), existen algunos estudios realizados
con cepas de E. coli DH en presencia de cobalto que reportan su disminución en el
crecimiento (Blundell y Wild, 1969; Ranquet y col, 2007), pero no existen reportes para
EPEC.
La transcripción flagelar se incrementó significativamente desde la primera concentración
de 0.01 mg/l para EPEC y para E. coli DH5 se observó un incremento significativo en la
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transcripción flagelar a la concentración de 0.2 mg/L (fig. 1B), la transcripción flagelar está
relacionada con la síntesis de RNA y para el caso de cobalto Blundell y Wild reportaron
que E. coli no patógena a pesar de que disminuye su crecimiento incrementa la producción
de RNA. La movilidad para EPEC se incrementó ligeramente a la concentración de 0.15
mg/l a diferencia de E. coli DH5que mostró una disminución significativa a la misma
concentración (fig. 1C). Los datos obtenidos en este estudio sugieren que la regulación de
flagelo en presencia de cobalto para EPEC y E. coli DH5pueden ser diferentes.
EPEC y E. coli DH5no formaron biopelículas en presencia de cobalto pero si agregados
(datos no mostrados).
1A
2A
2500
Unidades Miller
OD600
0,45
0,4
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
2B
1B
2000
1500
1000
500
0
0
0,01
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
mg /L
0
Concentraci ón
ónde
deCloruro
Clorurode
deCobalto
Cobalto
K12
AGT01
Movilidad ( cm )
EPEC
0,01
0,05
0,1
0,15
0,2
Concentración de Cloruro de Cobalto
FA1
5
4,5
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
PL1
0,25
mg/L
FA2
1C
2C
0
0,01
0,05
0,1
0,15
0,2
Concentraci
ón de de
Cloruro
dedeCobalto
Concentración
cloruro
cobalto
EPEC
AGT01
0,25
mg/l/L
mg
K12
Figura 1. Características de sobrevivencia de las cepas de E. coli estudiadas a diversas
concentraciones del desinfectante a base de cobalto. El crecimiento de las cepas medido a
una OD600 no se vio afectado a las concentraciones utilizadas de cobalto para EPEC, pero
E. coli DH5 disminuyó gradualmente (A). La producción de -galactosidasa que
representa la transcripción flagelar se incrementó a todas las concentraciones para EPEC y
para E. coli DH mostró un pico máximo a 0.2 mg/L (B). La movilidad máxima para
EPEC se observó que coincidió a la concentración de 0.15 mg/L, no así para E. coli DH5a
cuya movilidad disminuyó significativamente a 0.15 mg/L (2). Todos los ensayos se
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realizaron por triplicado en tres tiempos diferentes, lo que garantiza su confiabilidad y
reproducibilidad.
CONCLUSIONES
El cobalto no afectó el crecimiento ni la funcionalidad flagelar de EPEC a las dosis
empleadas, a diferencia de E. coli K-12.
La transcripción flagelar de las cepas de E. coli se vió favorecida en presencia de cobalto a
las dosis probadas.
Siendo E. coli el microorganismo más representativo de los coliformes y el más abundante
en el agua residual, no se recomienda el uso de cloruro de cobalto como desinfectante de
este tipo de agua, dado que la acción sobre este microorganismo es nula a las
concentraciones recomendadas de uso.
BIBLIOGRAFÍA
Adler, J., y Templeton, B. 1967. The effect of environmental conditions on the motility of
Escherichia coli. J Gen Microbiol. 46: 175-184.
Blundell M. R. y Wild D. G. 1969. Inhibition of Bacterial Growth by Metal Salts: A survey
of effects on the synthesis of ribonucleic acid and protein Biochem. J. 115: 207-212.
Brady M. J., Lisay C. M., Yurkovetskiy A. V., y Sawan S. P. 2003. Persistent silver
disinfectant for the environmental control of pathogenic bacteria. Am J Infect Control, 31:
208-214.
Codony F., Domenico P., y Mas J. 2003. Assessment of bismut tilos and convencional
disinfectants on drinking water biofilms. J Appl Microbiol, 95: 288-293.
Eltinger T., Surh J., Moore L. y Smith A. C. 2005. Secondary transporters for nickel and
cobalt ions: theme and variations. BioMetals, 18: 399-405.
Finlay BB, Ruschkowski S, Stein M, Reinshcheid DJ, Stein MA. 1996. Enteropathogenic
E. coli explotation of host epithelial cell. Ann NY Acad Sci 1996:26-31.
Gemany Y, Begand E, Duval P, Le Bouguenec C. 1996. Prevalence of enteropathogenic,
enteroaggregattive, and diffusely adherent E. coli among isolates from children with
diarrhea in New Caledomia. J Infect Dis,174:1124-6.
29
Revista Latinoamericana el Ambiente y las Ciencias
4(7): 23-31 2013
Gomez-Duarte, O.G., and Kaper, J.B. 1995. A plasmid-encoded regulatory region activates
chromosomal eaeA expression in enteropathogenic Escherichia coli. Infect Immun 63:
1767-1776.
Gupta, S., and Chowdhury, R. 1997. Bile affects production of virulence factors and
motility of Vibrio cholerae. Infect Immun 65: 1131-1134.
Hambidge A. 2001. Reviewig efficacy of alternative water treatment techniques. Health
Estate, 55: 23-25.
Heldt D., Lawrence M., Lindenmeyer E., Deery E., Healthcote P., Rigby S. E. y Warren M.
J. 2005. Aerobic synthesis of vitamin B12: ring contraction and cobalt chelation. Biochem
Soc Trans, 33: 815-819.
Ibarra, J.A., Villalba, M.I., and Puente, J.L. 2003. Identification of the DNA binding sites
of PerA, the transcriptional activator of the bfp and per operons in enteropathogenic
Escherichia coli. J Bacteriol 185: 2835-2847.
Iyoda, S., Koizumi, N., Satou, H., Lu, Y., Saitoh, T., Ohnishi, M., and Watanabe, H. 2006.
The GrlR-GrlA regulatory system coordinately controls the expression of flagellar and
LEE-encoded type III protein secretion systems in Enterohemorrhagic Escherichia coli. J
Bacteriol 188: 5682-5692.
Josenhans, C., y Suerbaum, S. 2002. The role of motility as a virulence factor in bacteria.
Int J Med Microbiol 291: 605-614.
Kaper, J.B., Nataro, J.P., and Mobley, H.L. 2004. Pathogenic Escherichia coli. Nat Rev
Microbiol 2: 123-140.
Kim J., Cho M., Oh B., Choi S., y Yoon J, 2004. Control of bacterial growth in water using
synthesized inorganic disinfectant. Chemosphere, 55: 775-780.
Macnab, R.M. 2003. How bacteria assemble flagella. Annu Rev Microbiol 57: 77-100.
Miller, J.H. 1972. Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold
Spring Harbor Laboratory
Nataro, J.P., y Kaper, J.B. 1998. Diarrheagenic Escherichia coli. Clin Microbiol Rev 11:
142-201.
OMS-UNICEF, 2000. Primera Reunión global de AIEPI. Diálogo sobre la atención
infantil, (2):5.
Ranquet C., Ollagnier-de-Choudens S., Loiseau L., Barras F. y Fontecave M. 2007. Cobalt
Stress in Escherichia coli. The effect on the iron-sulfur proteins. J Biol Chem, 282(42):
30442–30451.
Rodríguez-Angeles G; 2002. Principales características y diagnóstico de los factores de
virulencia de los patogrupos de Escherichia coli.; Salud Púb Méx; 44: 465-481
Sánchez, R. 2001. Evaluación de herbicidas y procesos del suelo (Sorghum bicolor (L)
Moech) bajo sistemas de labranza: Convencional y Mínima en Chaguaramas (Estado
Guárico). Tesis MSc, Facultad de Agronomía, Universidad Central de Venezuela. Maracay,
Venezuela. 153 p.
30
Revista Latinoamericana el Ambiente y las Ciencias
4(7): 23-31 2013
Schuhmacher, D.A., y Klose, K.E. 1999. Environmental signals modulate ToxT-dependent
virulence factor expression in Vibrio cholerae. J Bacteriol 181: 1508-1514.
Silver S, 2003. Bacterial silver resistance: molecular biology and uses and misuses of silver
compounds. FEMS Microbiol Rev, 27: 341-353.
Vidal-Granel J. E, 2003. Bacterias patógenas en el ser humano: Importancia de la virulencia
bacteriana. Consejo de Ciencia y Tecnología del Estado de Tabasco.1665-3505.
31