PCR convencional no es cuantitativo - U

PCR convencional o PCR de punto final
versus
PCR en Tiempo Real
PCR convencional no es cuantitativo
S Lobos C - U de Chile
1
PCR clásico
z
z
z
La cantidad de producto no
está relacionada con la
cantidad de DNA inicial
Herramienta cualitativa
(presencia o ausencia)
El bromuro de etidio es
poco sensible, cuando se
detecta ya se ha
sobrepasado la fase
exponencial
2
Fases de la PCR
z
z
z
Exponencial: En cada ciclo se dobla el producto.
Lineal: enlentecimiento,
enlentecimiento consumo de componentes
componentes, principio
de degradación.
Meseta: Parada de la reacción, agotamiento de
componentes, degradación de productos.
3
Fases de la PCR
Logarítmica
Lineal
4
Detección en la fase de meseta
Problemas de cuantificación
en la fase de meseta
5
Técnicas de cuantificación
z
Northern Blot
6
PCR Competitivo o PCR “Mimic”
Early expression of p53 responsive genes (24h)
Bax
CD95/Fas
GAPDH
L
C
6
8
10
12
M
Martín-Burriel et al. (2004)
7
Necesidad de PCR en tiempo real
N
Necesidad
id d d
de cuantificar
tifi
dif
diferencias
i d
de
expresión de un mRNA (RT
(RT--PCR)
z Disponibilidad de muy pequeñas
cantidades de mRNA en algunas
g
p
prácticas
laboratoriales::
laboratoriales
z
Células obtenidas de microdisección por láser
z Pequeñas cantidades de tejido
z Biopsias embrionarias
z Especimenes de gran valor
z
8
PCR en Tiempo Real
Nuevos q
químicos
Nuevas plataformas
instrumentales
Detección de productos
PCR en tiempo real
Permite observar la
cinética
de la reacción
9
Detección en la fase exponencial
10
PCR en Tiempo Real
Toma los datos mientras se producen.
z Cuantificación más exacta sin necesidad
de métodos laboriosos.
z Existe
E i t una relación
l ió cuantitativa
tit ti entre
t la
l
cantidad inicial y la cantidad de producto
PCR en un ciclo dado.
z
Curso PCR 2010
11
Polymerase chain reaction (PCR)
12
Polymerase chain reaction (PCR)
13
Polymerase chain reaction (PCR)
14
Fluorocromos:: SYBR Green
Fluorocromos
z
z
z
Se intercala en el
surco menor del ADN
de doble cadena y
emite fluorescencia.
No es equimolecular
equimolecular..
Necesaria curva de
disociación.
15
Curva de disociación
Tª Melting:
- Composición de bases del
fragmento
g
- Tamaño del fragmento.
-Tm dimeros < Tm fragmento
16
Curva de disociación
Muestras problema
Controles negativos y sin RT
17
Ventajas e inconvenientes
z
PCR con SYBR G
Green:
Más barato
z Los mismos reactivos sirven para analizar
cualquier fragmento
z La especificidad viene dada únicamente por
los primers
z No es equimolecular
z Se necesita realizar una curva de disociación
z
18
Sondas TaqMan
z
z
z
z
z
Actividad 5’ exonucleasa de la Taq polimerasa.
Reporter:: FAM, VIC.
Reporter
Quencher:: TAMRA.
Quencher
Importante tªm (~70ºC).
Equimolecular..
Equimolecular
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Real Time PCR: Sonda TaqMan
S Lobos C - U de Chile
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Polymerase chain reaction (PCR)
Fluorocromo + Quencher (absorbe la energía del fluorocromo cuando está
cerca fluorocromo no fluoresce)
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S Lobos C - U de Chile
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Ventajas e inconvenientes
z
PCR con Sondas TaqMan:
TaqMan:
Más caro
z Utilización de sondas específicas para cada
fragmento a analizar
z La especificidad viene dada por los primers y
la sonda
z Es equimolecular
z No necesita curva de disociación
z
23
Aplicaciones de la PCRPCR-TR
z
Cuantificación:
Absoluta
z Relativa
z
D t
Determinación
i
ió d
de mutaciones.
t i
z Ensayos ++- Diagnóstico
z
24
Glosario de términos
z
C
Cuantificación:
tifi
ió
z
Absoluta:
z Resultado
final con unidades (carga viral, copias
de mensajero, copias de un gen,...).
z Se
S necesita
it una curva patrón
t ó absoluta.
b l t
z
Relativa:
z Resultado
sin unidades. Proporciona un
porcentaje de incremento o disminución
(expresión génica).
z Se necesita curva patrón (al menos para prueba
de primers).
primers).
25
Glosario de términos
z
Referencia:
z
Señal utilizada para normalizar el experimento.
z
z
z
Pasiva: Fluorocromo en todos los tubos (ROX).
Activa: endógena ((housekeeping
housekeeping)) o exógena (construcción).
Calibrador:
z
Muestra q
que usamos p
para comparar
p
las demás.
26
Glosario de términos
z
Standard (patrón):
z
z
Muestra de concentración conocida que
nos permite construir la curva de
calibrado.
Threshold
Th h ld (umbral):
( b l)
z
Ct es el ciclo en el cual se detecta un
incremento significativo de ΔRn
(fluorescencia). El sistema empieza a
detectar la señal asociada al incremento
exponencial de producto PCR (Fase
exponencial)
27
Aplicaciones de la PCRPCR-TR
Glosario de términos.
z Cuantificación:
z
Absoluta
z Relativa
R l ti
z
Determinación de mutaciones.
z Ensayos ++z
28
Métodos de cuantificación
Curva estándar
z Delta Ct
z Método de Pfaffl
z
29
Curva estándar
30
Curva estándar
31
Curva Patrón
z
z
z
z
y=ax+b
y=
y
ax+b.. Y
ax+b
Y=Ct
Y=
Ct,, X
Ct
X=log
log [DNA]
[DNA].
Relaciona cada concentración con su Ct.
Propia de cada pareja de primers
primers..
La pendiente depende de la eficiencia de los
primers y no debería cambiar entre
experimentos:
z
z
z
z
100% (a=
(a=--3.32).
75% (a=
(a=--4).
Aceptable:--3 ≤ -4.
Aceptable:
a> -3 contaminación por fluorescencia.
32
Curva Patrón
z
Correlación ((R2)):
z
z
z
z
z
Nº de réplicas:
z
z
z
R2=1 (perfecta).
R2≥0.97 (0.99).
Seleccionar el umbral donde R2 sea máxima.
Mantener el umbral entre experimentos.
Al menos 2 réplicas por muestra.
Desviación estándar ≤ 0.38
Muestra:
z
z
Curva absoluta: muestra de [ conc
conc]] conocida.
Diluciones 1/5.
33
1. Cuantificación Absoluta
z
Validación de la curva patrón:
p
z
z
La precisión de la cuantificación dependerá de la
precisión de los patrones.
Patrones:
z
z
z
z
z
DNA plasmidial.
plasmidial.
DNA genómico.
genómico
Productos PCR.
Grandes oligonucleótidos comerciales.
Resultado final relativo a una unidad de interés:
z
z
z
z
Copias/ng de RNA
Copias/ng
Copias/g tejido
tejido, copias/ml sangre
sangre.
Copias/genoma.
Copias/ célula.
34
1. Cuantificación Absoluta
z
Posibles curvas de calibrado (Expresión
génica):
z
Productos de RTRT-PCR u oligonucleótidos:
z
z
z
DNA recombinante:
z
z
z
Rápido, conocimiento preciso de [DNA].
Inestable, problemas en la reamplificación.
reamplificación.
Muy estable, sin problemas de amplificación, talla
similar a transcritos.
Construcción del DNArec
DNArec,, no tiene en cuenta la
eficacia de la RT.
RNA recombinante:
z
z
Mimetiza la situación real de retrotranscripción (añadir
RNA background
background).
).
Muy inestable, clonación complicado, purificación,
problemas de almacenamiento.
35
1. Cuantificación Absoluta
z
P t críticos
Puntos
íti
de
d la
l curva patrón:
tó
DNA o RNA puro y muy concentrado.
z Exactitud en la medida de la concentración
inicial (7 veces).
z Pipeteo apropiado: dilución del DNA o RNA
original hasta concentraciones similares a las
muestras biológicas (106-1012).
z Estabilidad de las muestras patrón (RNA).
z
Curso PCR 2010
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2. Cuantificación Relativa
z
Curva patrón:
Sencillez en la preparación.
z La cantidad de producto (n veces) se refiere a
la obtenida en el calibrador (1x)
(1x).
z No hay unidades.
z Se puede utilizar cualquier tipo de patrón para
la obtención.
z
Curso PCR 2010
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2. Cuantificación Relativa
z
P t críticos
Puntos
íti
de
d la
l curva patrón:
tó
Dilución adecuada del RNA o DNA patrón.
z La utilización de las mismas muestras en
placas distintas permite comparar resultados.
z Se pueden utilizar patrones DNA para análisis
de RNA.
z Se necesitan curvas patrón para el gen de
estudio y el control endógeno.
z
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