MATERIAL DE REFERENCIA MICROBIOLÓGICO

MATERIAL DE REFERENCIA
MICROBIOLÓGICO
ielab es una empresa dedicada a la prestación de servicios y productos para la
aplicación de la Calidad en los laboratorios de ensayo, donde pensamos que la calidad
es sinónimo de tranquilidad y confianza. Ofrecemos la organización de ejercicios de
intercomparación, kits de diagnóstico molecular y materiales de referencia
microbiológicos y físico-químicos.
Le invitamos a visitar nuestra página web: http://www.ielab.es, donde encontrará
nuestra información más actualizada, y detallada y la disponibilidad de nuestros
productos y servicios.
Nuestra amplia gama de material de referencia microbiológico ha sido especialmente
diseñada para la validación de métodos y procesos internos de control de calidad,
facilitando tareas que son realizadas en los laboratorios de ensayo.
CARACTERÍSTICAS DEL PRODUCTO
Los materiales de referencia ielab se cuantifican mediante ensayos de certificación
realizados por laboratorios acreditados por ENAC conforme a la norma UNE-EN
ISO/IEC 17025. Para su producción se siguen las pautas establecidas en la ISO
GUIDE 34 y en el documento ILAC-G-12:2000. Todo el material suministrado viene
acompañado de una Guía Rápida de Uso y del correspondiente Certificado de Análisis.
BACuali es un material cualitativo en el que se certifica la identidad de la cepa
bacteriana suministrada. Apropiado para validar métodos cualitativos y para la
realización de controles de calidad en los que no se requiera cuantificación.
BACuanti es un material cuantitativo en el que cada pastilla contiene un número
determinado de células viables y cultivables, que se obtiene a partir de un estudio
de certificación en el que participan 7 laboratorios acreditados en base a la ISO 17025.
Es el material adecuado para validación de métodos y controles de calidad cuantitativos.
BAControl es un material cuantitativo en el que cada pastilla contiene un número
determinado de células viables y cultivables, obtenido por el propio fabricante en las
condiciones de ensayo especificadas en el certificado de análisis. Es el material
apropiado para la realización de controles de calidad rutinarios, tales como controles
de proceso, creación de gráficos de control o controles de calidad de medios de
cultivo.
BACuanti-PCR es un material cuantitativo especialmente diseñado para PCR y
en el que cada pastilla contiene un número determinado de células inactivadas,
certificándose el número de unidades genómicas por pastilla. Permite un control de
proceso analítico completo, desde la muestra inicial hasta el análisis final.
BACuanti-DNA es un material cuantitativo de DNA que se suministra en formato
liófilo en un vial, certificándose la cantidad en µg/vial. Diseñado para la validación y
control de calidad de la fase de amplificación por PCR.
doc 003-02.10
www.ielab.es
MATERIAL DE REFERENCIA MICROBIOLÓGICO
VENTAJAS DEL MATERIAL DE REFERENCIA MICROBIOLÓGICO
ielab FRENTE A OTROS MATERIALES
Material de referencia disponible:
Citrobacter freundii, Clostridium perfringens,
Enterococcus faecium, Escherichia coli, Legionella
jordanis, Legionella pneumophila, Listeria
monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa,
Salmonella spp. Candida albicans, Aspergillus niger,
Staphylococcus aureus, Fasciola hepática, Fasciola
gigantica, Ascaris lumbricoides, Taenia solium,
Trichuris sp. Schistosoma sp., Dyphyllobothrium
sp., (...)
Sencillez: preparación extremadamente sencilla
gracias al formato en pastillas que se suministra
en un dispositivo plástico estéril de muy fácil uso
o en viales individuales.
Rapidez: tiempo de reconstitución de tan solo
10 minutos.
Seguridad: manipulaciones y riesgo de
contaminación reducidos al mínimo.
Calidad: el material se acompaña de una Guía
Rápida de Uso y de Certificado de Análisis.
Trazabilidad: cepas trazables a Colecciones de
Cultivos Tipo y con menos de dos pases desde
la cepa original.
Flexibilidad: diferentes formatos y 2 rangos de
concentración.
Servicio: preparación de material de referencia
con microorganismos según las necesidades del
cliente y a una concentración predefinida.
OTROS
PRODUCTOS ielab
DE SU INTERÉS
· Materiales de
referencia físicoquímicos
(documento 002-02.10)
· Kits de
diagnóstico
molecular
(documento 004-02.10)
· Ejercicios de
Intercomparación
(documento 001-02.10)
C/ Dracma, 16
Pol. Ind. Las Atalayas
03114 Alicante (España)
T +34 966 10 55 01
F +34 966 10 55 03
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[email protected]
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Aplicaciones Prácticas de Materiales de Referencia Microbiológicos al
Control Interno de Calidad
R. Múrtula, E. Soria, A. Yáñez, L. Martínez y V. Catalán*
Ielab Calidad S.L.U., Pol. Ind. Atalayas, C/Dracma 16-18, 03114 Alicante
*
Autor para correspondencia
Vicente Catalán
Ielab Calidad
[email protected]
SUMMARY
Nowadays, there is an increasing interest in introducing standards such as ISO 9000 or
ISO17025 in the case of testing laboratories. In any quality system there must exists actions based
on the systematic contrast of the activities implied in the quality control and it is useful and
important to use reference materials for it. For this reason, in this work we present a new
microbiological reference material in a tablet format, homogeneous, stable and with a certified
value that is suitable for the quality control in testing microbiological laboratories.
RESUMEN
Actualmente en el mercado existe un creciente interés por implantar en los laboratorios de
análisis normas de gestión de la calidad como Norma la ISO 9000 o la Norma ISO 17025. En
cualquier sistema de calidad deben existir acciones basadas en el contraste sistemático de las
actividades implicadas en el control de calidad, y para ello, en los laboratorios de ensayo es útil e
importante emplear materiales de referencia. En este trabajo describimos un nuevo material de
referencia microbiológico en formato pastilla, homogéneo, estable y con un valor certificado que
resulta adecuado para el control de calidad en los laboratorios de análisis microbiológicos.
INTRODUCCIÓN
La continua expansión del mercado y la proliferación de normas y ensayos analíticos, ha
hecho necesaria la implantación en los laboratorios de análisis de sistemas de gestión de la
calidad. De este modo se pretende, fundamentalmente, mejorar la gestión del laboratorio y
asegurar la trazabilidad de los resultados que se generan. En este sentido, es recomendable
implantar y mantener un sistema de gestión de la calidad apropiado para el ámbito de sus
actividades. La Norma ISO 17025 contiene todos los requisitos que tienen que cumplir los
laboratorios para demostrar que disponen de un sistema de gestión de calidad, que son
técnicamente competentes y que son capaces de producir resultados técnicamente válidos.
La acreditación, en base a esta norma, realizada por ENAC, es un proceso voluntario y
periódico de autoevaluación interna y revisión externa de las actividades realizadas por los
laboratorios y es la única forma que disponen los laboratorios de demostrar la validez de los
resultados que generan, reconociéndose formalmente que un organismo es técnicamente
competente para llevar a cabo tareas específicas. Los requerimientos necesarios para obtener
dicha acreditación incluyen el control estadístico de los resultados y, cuando se dispone de ellos,
el uso de materiales de referencia (Lightfoot et al., 2001).
La Norma ISO 17025 establece la realización de controles de calidad, tanto externos
como internos, de las actividades realizadas por el laboratorio para el aseguramiento de la calidad
de los resultados y la comprobación periódica de que se cumplen las exigencias del sistema de
gestión de calidad.
1
El control externo de calidad incluye la participación periódica en Ejercicios de
Intercomparación, de modo que se puedan comparar los resultados obtenidos por el laboratorio
con los alcanzados por otros laboratorios. Además, los Ejercicios de Intercomparación permiten
detectar desviaciones, controlar los resultados a lo largo del tiempo, detectar tendencias,
considerar acciones preventivas o correctivas cuando sea necesario y evaluar la competencia
técnica.
Por su parte, el objetivo fundamental del control interno de calidad es permitir una
evaluación permanente del trabajo realizado, asegurando una coherencia de los resultados
obtenidos diariamente y el cumplimiento de los criterios establecidos, abarcando en consecuencia
todos los procedimientos realizados por un laboratorio. Además, es necesario que este control
interno incluya un programa de controles periódicos de todos los ensayos contenidos en el
alcance de su actividad, de modo que se pueda demostrar que la variabilidad entre analistas,
equipos, materiales, etc. están bajo control. Existen varias formas de llevar a cabo dicho control
interno, entre las cuales están la comparación del método evaluado con otros métodos, ya sean
normalizados, no normalizados o desarrollados por los propios laboratorios, también muy común
el empleo de muestras inoculadas con materiales de referencia, ya sean certificados o no.
Un material de referencia es aquel material o sustancia, en la cual uno o más valores de
sus propiedades son suficientemente homogéneos y están claramente establecidos como para
poder ser utilizados en la calibración de un aparato, la evaluación de un método de medida o la
asignación de valores a materiales (Guía ISO 30:1992, Términos y definiciones utilizados en
relación con los materiales de referencia). Un material de referencia certificado es aquel en el que
algunas de sus propiedades están certificadas por un procedimiento técnico válido, además debe ir
acompañado con un certificado o documento equivalente emitido por un órgano certificador.
De entre las aplicaciones de los materiales de referencia en los laboratorios de ensayo
destacan, el desarrollo y la validación métodos de ensayo (In’t Veld et al., 1996 y 1999), el
control de la exactitud de los resultados obtenidos en un laboratorio, ya que los valores de
incertidumbre de sus componentes son perfectamente conocidos, la calibración de equipos, el
control interno de la calidad del trabajo de un laboratorio, la detección de falsos negativos (In’t
Veld and Notermans, 1991), el uso como material para Ejercicios de Intercomparación o la
realización de estudios comparativos entre diferentes métodos. Por todo ello, los materiales de
referencia proporcionan la trazabilidad esencial en las mediciones (Mooijman et al., 1992; King,
2002) y son una herramienta muy útil como medida interna de calidad.
Los materiales de referencia deben ser homogéneos, es decir, cada una de las partes que
componen un lote del material deberá ser estadísticamente igual en sus propiedades; deben ser
estables ya que las propiedades deben mantenerse en los límites determinados, durante un tiempo
especificado y en unas condiciones establecidas de almacenamiento; deben ser lo más similares
posible a las muestras reales y deben ser trazables.
Los materiales de referencia fueron desarrollados primero en el campo de las medidas
físico-químicas y actualmente son fáciles de adquirir en el mercado. Por el contrario, en
microbiología, el proceso de preparación de materiales de referencia es más lento y complejo. La
inherente inestabilidad de los microorganismos y la dificultad de mantener su viabilidad e
integridad durante largos períodos de tiempo ha dificultado enormemente el desarrollo de
materiales de referencia microbiológicos (Méndez et al., 2002). Las muestras químicas también
presentan variaciones, pero generalmente por debajo del límite de detección, obteniendo así
resultados aparentemente homogéneos (Tillett and Lightfoot, 1995). La homogeneidad es una de
2
las características más complicadas de conseguir en microbiología ya que es muy difícil conseguir
una distribución normal en toda la muestra debido a las características intrínsecas de los
organismos vivos sobretodo cuando se trabaja con concentraciones bajas.
OBJETIVOS
En este trabajo se presenta el desarrollo, validación y certificación de materiales de
referencia microbiológicos, cualitativos y cuantitativos, de muy fácil utilización y que cumplen
con los requisitos de homogeneidad y estabilidad establecidos en la guía ISO 34:2000 (General
requirements for the competence of reference material producers).
RESULTADOS
El material de referencia se ha desarrollado a partir de cepas de Escherichia coli,
Enterococcus faecium, Citrobacter freundii, Clostridium perfringens, Salmonella enterica subsp.
enterica, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa y Legionella pneumophila, trazables a
diferentes Colecciones de Cultivo Tipo. Para su preparación, se realizaron cultivos exponenciales
de cada uno de los microorganismos, se incluyeron en suspensiones de conservación específicas y
se sometieron a un proceso de estabilización. Finalmente, el material de referencia obtenido
presenta un formato de pastilla, de muy rápida reconstitución y muy fácil utilización ya que viene
incluido en un dispensador plástico estéril y desechable.
Cada lote preparado se sometió a diferentes controles de calidad, incluyendo los
correspondientes controles de esterilidad, de homogeneidad y de estabilidad. Los controles de
esterilidad se realizaron tanto de cada cepa empleada, como de cada mezcla preparada y de cada
lote fabricado. Los estudios de homogeneidad y de estabilidad se realizaron siguiendo la norma
ISO 13528 (Statistical methods for use in proficiency testing by interlaboratory comparisons). En
el caso de los estudios de homogeneidad, se analizaron por duplicado, mediante aislamiento en
cultivo, 10 pastillas elegidas al azar de cada lote y a los resultados obtenidos, se les aplicó el test
estadístico de Cochran (Cochran, 1954) y un análisis de varianza (ANOVA) de comparación de
medias, para comprobar que no existían diferencias entre réplicas ni entre pastillas (p-valor>0.05).
Otro criterio de homogeneidad que se debe cumplir es que la desviación estándar obtenida en
cada lote debe ser menor que 0.3 veces la desviación estándar diana, obtenida a partir de un
histórico de resultados de 10 años de los Ejercicios de Intercomparación Calitax-LABAQUA.
Previamente, se realizaron estudios de estabilidad a largo plazo conservando el material a
diferentes temperaturas (a -20ºC, a 4ºC y a temperatura ambiente) y durante un período de 9
meses (Figura 1). A los resultados obtenidos en los estudios de estabilidad se les aplicó un
ANOVA de comparación de medias, utilizando como hipótesis que las medias obtenidas en los
diferentes días, eran iguales con un 95% de probabilidad (p-valor > 0,05), es decir, que no se
encontraban en el tiempo diferencias significativas entre las pastillas (Figura 2).
Finalmente, una vez comprobado que cada lote preparado del material de referencia
cumplía los criterios establecidos de homogeneidad y estabilidad, se procedió a la certificación de
los mismos. En dicha certificación participaron siete laboratorios acreditados en base a la Norma
ISO 17025, los cuales analizaron, por duplicado, dos pastillas de cada uno de los lotes fabricados,
empleando el mismo método y las mismas condiciones de ensayo. A los datos obtenidos por los
siete laboratorios, se les aplicó una estadística robusta siguiendo la norma Guía ISO 35
(Certificación de materiales de referencia. Principios generales y estadísticos para su certificación)
y se calcularon la media robusta, su incertidumbre en porcentaje y su intervalo de confianza con
un 95% de probabilidad. Una vez analizados los resultados se elaboró el Certificado de Análisis
correspondiente a cada lote, siguiendo las indicaciones de la guía ISO 31 (Reference materials.
Contents of certificates and labels), donde se incluyen la descripción del lote (código,
3
microorganismo, cepa de procedencia, nº de lote, fecha de caducidad…), las condiciones de
conservación, de reconstitución y de análisis del estudio de certificación y los usos preferentes.
Este nuevo material de referencia se presenta en varias modalidades que se adaptan a las
diferentes necesidades de los laboratorios de análisis microbiológico. En el caso del material de
referencia cualitativo (BACuali®) se certifica la identidad de la cepa suministrada. En el material
de referencia cuantitativo (BACuanti®) cada pastilla contiene un número determinado y
certificado de células viables y cultivables y está indicado principalmente para la validación de
métodos microbiológicos y la preparación de auditorias externas, incluyéndose en el certificado
de análisis el valor medio por pastilla, su incertidumbre asociada y el intervalo de confianza del
95%. Por último, en el material de referencia bacteriológico (BAControl®) se dispone de un valor
por pastilla obtenido por el fabricante y está indicado fundamentalmente para la realización de
controles de calidad tales como controles de proceso, gráficos de control o controles de calidad de
medios de cultivo.
CONCLUSIONES
Los estudios estadísticos realizados demuestran que el nuevo material de referencia
microbiológico desarrollado es homogéneo y estable cuando se conserva durante largos períodos
de tiempo a -20ºC. Además, cumple con los requisitos establecidos en la Guía ISO 34:2000, su
reconstitución es muy rápida (10 minutos en agua estéril a temperatura ambiente) y su utilización
muy sencilla, minimizando la manipulación y el riesgo de contaminaciones. Se acompaña
también de una Guía Rápida de Uso y su correspondiente Certificado de Análisis. Es aplicable a
diferentes microorganismos y en varios rangos de concentración, siendo una herramienta muy útil
para los laboratorios de ensayos microbiológicos en los procesos de normalización, validación y
control interno de calidad, tanto de métodos tradicionales basado en cultivo como de métodos
moleculares basados en PCR.
BIBLIOGRAFÍA
Cochran W. G. 1954. Some methods for strengthening the common X2-tests. Biometrics. 10:
417-451.
In’t Veld, P.H., and Notermans, S. 1991. Use of reference material (spray-dried milk artificially
contaminated with Salmonella typhimurium) to validate detection methods for Salmonella. J.
Food Protection. 55: 855-858.
In’t Veld, P.H., van Strijp-Lockefeer, N.G., Havelaar, A.H., and Maier, E.A. 1996. The
certification of a reference material for the evaluation of the ISO method for the detection of
Salmonella. J. Appl. Bacteriol. 80: 496-504.
In’t Veld, P.H., Havelaar, A.H., and van Strijp-Lockefeer, N.G. 1999. The certification of a
reference material for the evaluation of methods for the enumeration of Bacillus cereus. J. Appl.
Microbiol. 86: 266-274.
King, B. 2002. The selection and use of reference materials, a basic guide for laboratories and
accreditation bodies. Eurolab-Eurachem. 3: 1-10.
Lightfoot, N.F., Richardson, I.R., and Harford, J.P. 2001. The use of lenticules™ for the
process control of enumeration techniques in food and environmental microbiology. J. Appl.
Microbiol. 91: 660-667.
4
Méndez, J., Cofre, J., Lucena, F., Contreras, N., Mooijman, K., and Araujo, R. 2002.
Conservation of phage reference material and water samples containing bacteriophages of enteric
bacteria. J. Virological Methods. 106: 215-224.
Mooijman K.A., In’t Veld P.H., Hoekstra J.A., Heisterkamp S.H., Havelaar A.H.,
Notermans S.H.W., Roberts D., Griepink B., and Maier E.A. 1992. Development of
microbiological reference materials. Commission of the European communities, Community
Bureau of Reference, Brussels, Report EUR 14375 EN.
Tillett, H.E., and Lightfoot, N.F. 1995. Quality control in environmental microbiology
compared with chemistry: what is homogeneous and what is random? Wat. Sci. Tech. 31: 471477.
FIGURAS
LOG ufc/pastilla
ESTABILIDAD LOTE PEC160
4.4
4.2
4
3.8
3.6
3.4
3.2
3
2.8
2.6
2.4
2.2
2
1.8
1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
E.c o li Tª
a m b.
E.c o li
Ne ve ra
E. c o li
C o nge la do r
0
7
14
21
28
35
42
49
56
63
70
77
84
91
98
105 112 119
126 133 140 147 154 161 168 175
DIAS
Figura 1. Estudio de estabilidad, a largo plazo, del lote PEC160 de E. coli a diferentes
temperaturas de conservación (ambiente, 4ºC y -20ºC).
Means and 95,0 Percent LSD Intervals
RESULTADOS
1,8
1,7
1,6
1,5
1,4
0
7
14
21
28
38
42
49
57
63
70
77
84
DIAS
DIAS
Box-and-Whisker Plot
0
7
14
21
28
38
42
49
57
63
70
77
84
1,3
1,4
1,5
1,6
1,7
1,8
RESULTADOS
Figura 2. Estudio de estabilidad del Lote PLP18065 de L. pneumophila, ANOVA a largo
plazo (p-valor=0,5898)
5