USO DE FACTOR DE CRECIMIENTO DERIVADO DE PLAQUETAS

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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
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kInt. Cl. : A61K 38/27
11 Número de publicación:
2 123 004
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ESPAÑA
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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA
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kNúmero de solicitud europea: 92917382.1
kFecha de presentación : 10.04.92
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 584 286
kFecha de publicación de la solicitud: 02.03.94
T3
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54 Tı́tulo: Uso de factor de crecimiento derivado de plaquetas en la preparación de un medicamento
para el tratamiento de úlceras gastrointestinales.
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73 Titular/es: Creative Biomolecules, Inc.
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72 Inventor/es: Szabo, Sandor y
30 Prioridad: 12.04.91 US 685085
35 South Street
Hopkinton Massachusetts 01478, US
Brigham & Women’s Hospital
45 Fecha de la publicación de la mención BOPI:
01.01.99
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45 Fecha de la publicación del folleto de patente:
ES 2 123 004 T3
01.01.99
Aviso:
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Charette, Marc, F.
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74 Agente: Elzaburu Márquez, Fernando
En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes,
de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar
motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposición (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
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ES 2 123 004 T3
DESCRIPCION
La invención se refiere, en general, al uso de
factor de crecimiento derivado de plaquetas para
la preparación de un medicamento para el tratamiento de trastornos gastrointestinales (GI).
Fundamento de la invención
Las úlceras pépticas incluyen úlceras gástricas, que se presentan como lesiones en la pared
del estómago, y las úlceras duodenales, que son
lesiones profundas que se presentan en la pared
del duodeno, es decir, de la parte superior del
intestino delgado. La principal defensa del organismo frente a los efectos corrosivos de los potentes jugos digestivos gástricos es la capa mucosa de
bicarbonato que reviste el interior del duodeno
y del estómago. Las úlceras de duodeno son el
resultado de un desequilibrio en los factores que
mantienen la capa mucosa de bicarbonato natural, dando lugar a la destrucción del epitelio y
de los tejidos conjuntivos subyacentes. Aunque
la terapia antiulcerosa actual, incluyendo los productos antisecretorios tales como la cimetidina y
la ranitidina, parecen ser eficaces en la curación
de úlceras duodenales, se cree generalmente que
son eficaces porque reducen la secreción normal
de ácidos gástricos. Aunque la reducción de los
ácidos contribuye al cierre de la úlcera, también
interfiere la digestión normal. Hay estudios que
indican que entre el 40 y el 60 % de las úlceras
curadas con terapias actuales recurren antes de
un año de la terapia. Se cree que la alta tasa
de recurrencia de las úlceras puede ser atribuible,
al menos en parte, al reducido número de células
productoras de mucosidad en el tejido cicatricial
que queda en el sitio de la úlcera curada. Se cree
entonces que esta área es más vulnerable a la rotura cuando la acidez gastrointestinal vuelve a ser
normal.
La colitis ulcerosa es un enfermedad intestinal inflamatoria del revistimiento mucosal del colon y el recto, para la que hay pocos tratamientos eficaces. Es un trastorno debilitante crónico
con una morbilidad elevada y que puede conducir a un cáncer colorrectal. En su mayor parte,
la enfermedad está confinada a las capas mucosal y submucosal de la pared del colon, en donde
tienen lugar una inflamación grave de la mucosa
colorrectal, abscesos crı́pticos y úlceras múltiples.
Está caracterizada por deposiciones sangrientas,
diarrea, fiebre y anomalı́as de la función hepática.
Más del 50 % de los pacientes con colitis ulcerosa
crónica se someten a cirugı́a dentro de los dos
primeros años de su enfermedad para eliminar los
tejidos afectados.
La mucositis ulcerosa es un serio efecto colateral tóxico limitante de la dosis de muchas formas
de quimioterapia del cáncer. Las lesiones que se
presentan como consecuencia de esta condición
producen dolor acusado y pérdida de función en
los pacientes afectados. La rotura de la mucosa
oral tiene por resultado la apertura de una puerta
sistémica para los numerosos organismos que se
encuentran en la boca. En consecuencia, la cavidad oral es la fuente de sepsis más frecuentemente
identificable en el paciente de cáncer granulocitopénico. La actual terapia para la mucositis se
limita a la paliación, bien sea local o sistémica, o
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a una terapia antibacteriana tópica.
La solicitud PCT n◦ PCT/US89/03467 describe el uso de un factor de crecimiento de fibroblasto ácido-resistente para tratar úlceras GI.
Sumario de la invención
La invención se basa en el descubrimiento de
que el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF: Platelet Derived Growth Factor) es
un potente estimulante del crecimiento del tejido
de granulación que está debajo de la capa epitelial que reviste todo el tracto gastrointestinal. La
invención proporciona un método de tratamiento
de una úlcera presente en el tracto gastrointestinal de un mamı́fero, que incluye administrar una
cantidad terapéuticamente eficaz de PDGF, o una
forma del mismo aceptable farmacéuticamente, al
tracto gastrointestinal de un mamı́fero. Como se
usa en el presente texto, el tracto gastrointestinal
se extiende desde la boca hasta el recto, inclusive;
es decir, dicho tracto es el canal alimentario.
El mamı́fero es, por ejemplo, una persona, y
las úlceras tratables gracias a la invención incluyen las que se encuentran en el ı́leon, que producen ileitis regional, las que se encuentran en el
colon, que producen colitis ulcerosa, enfermedad
de Crohn, proctitis y otras formas de enfermedad
intestinal inflamatoria (IBD: Inflammatory Bowel
Disease), las que se encuentran en la boca, en particular la mucositis oral provocada por la quimioterapia o la radioterapia, y úlceras pépticas tales
como las úlceras gástricas que se encuentran en
el estómago, o las úlceras que se encuentran en el
duodeno o el esófago. Preferentemente, el PDGF
se administra oralmente o rectalmente.
Como se usa en el presente texto, “PDGF” se
refiere a PDGF de origen natural, PDGF obtenido por técnicas de DNA recombinante usando
células hospedadoras eucarióticas o bien bacterianas, ası́ como mutantes de PDGF biológicamente activos, fragmentos de PDGF biológicamente activos y mutantes biológicamente activos de
fragmentos de PDGF biológicamente activos. Un
PDGF mutante o un fragmento de PDGF biológicamente activo conservará la región de PDGF
activa biológicamente, pero puede diferir en la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos nativos; es decir, a un fragmento de PDGF pueden faltarle secuencias de aminoácidos que no
son necesarias para la actividad biológica de la
proteı́na, y a un mutante de PDGF pueden faltarle aminoácidos que no son esenciales para la actividad biológica o pueden contener aminoácidos
adicionales, o pueden sustituir aminoácidos cuya
presencia no afecta a la actividad biológica de la
proteı́na.
Como se usa en el presente texto, “úlcera” se
refiere a una lesión abierta o rotura de la integridad del revestimiento epitelial del tracto gastrointestinal, que tiene por resultado la erosión
del tejido de granulación subyacente.
Otras caracterı́sticas y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente
descripción de las realizaciones preferidas, y a
partir de las reivindicaciones.
Descripción detallada de la invención
El PDGF es una hormona peptı́dica producida por las plaquetas de la sangre que influye sobre la regulación de numerosos sistemas
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biológicos, incluyendo la reparación de heridas,
arteriosclerosis, neoplasia, embriogénesis y fibrosis de la médula ósea. En la reparación de las
heridas, el PDGF desencadena respuestas tanto
quimiotácticas como mitogénicas en fibroblastos,
músculo liso y células gliales. Se cree que las
agresiones a los revestimientos endoteliales hacen
que las plaquetas se adhieran al tejido conjuntivo expuesto en el sitio de la lesión, para liberar
allı́ PDGF. Se cree que el PDGF liberado recluta
quimiotácticamente fibroblastos, monocitos, glia
y músculo liso para que migren al sitio de la herida. También se cree que el PDGF estimula la
sı́ntesis de DNA en estas células, aumentando ası́
su velocidad de proliferación.
El PDGF nativo es una molécula dı́mera compuesta de dos cadenas de polipéptido, uno o más
de los cuales pueden estar glicosilados. Las dos
cadenas (denominadas A o alfa y B o beta) son
homólogas pero no idénticas. Tienen pesos moleculares de aproximadamente 17.000 - 18.000
daltons y aproximadamente 13.000 - 14.000 daltons, respectivamente. In vivo, las cadenas A y
B son sintetizadas a partir de precursores más
grandes que son subsiguientemente procesados en
los términos amino y carboxilo. La cadena A
humana madura está compuesta por 110 o 125
aminoácidos y varias cadenas laterales de azúcar
unidas a N, dependiendo de la fuente del tejido
la longitud y la secuencia de aminoácidos. La cadena B humana totalmente procesada está codificada por el gen C-sis y contiene 112 aminoácidos.
El PDGF biológicamente activo puede existir
también como un dı́mero AA o BB que tiene un
peso molecular de aproximadamente 35.000 daltons o aproximadamente 32.000 daltons, respectivamente.
La invención reside en el uso de factor de crecimiento derivado de plaquetas para la preparación
de un producto farmacéutico o un medicamento
para ser usado en el tratamiento no parenteral de
úlceras del tracto gastrointestinal. El tracto GI,
de la boca al recto, contiene una capa de epitelio que cubre el tejido de granulación. Ası́, todo
el tracto GI, la boca, esófago, estómagio, intestinos superior e inferior, y colon, contienen estos
tipos de células similares. Por consiguiente, el
tratamiento de una úlcera, p. ej. del ı́leon, mediante la administración de PDGF según la presente invención, será también aplicable al tratamiento de úlceras de otras regiones del tracto GI,
p. ej. la boca. Se describen más adelante experimentos en los que una úlcera del duodeno fue
tratada con PDGF según la invención, y curada
más rápidamente que una úlcera no tratada, y
experimentos en los que puede probarse el PDGF
para el tratamiento de una mucositis oral y una
colitis ulcerosa. El tratamiento con PDGF, gracias a la invención, es aplicable a una úlcera en
cualquier región del tracto GI. El método de tratamiento en su forma más simple incluye administrar al tracto GI de un mamı́fero una cantidad terapéuticamente eficaz de PDGF o de un derivado
o sal del mismo aceptable farmacéuticamente, por
vı́a parenteral, pero más preferentemente por vı́a
oral o rectal.
El PDGF puede prepararse a partir de plaquetas humanas, o producirse por medio de técnicas
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de DNA recombinante, o bien puede obtenerse
de fuentes comerciales. La preparación de PDGF
a partir de plaquetas humanas se describe en la
bibliografı́a. Véase, por ejemplo, Heidin et al.,
(1979) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76: 37223726; Antoniades et al., (1979) Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A. 76: 1809-1813), Antoniades et al., patente de EE.UU. n◦ 4.479.896, y Lipton et al.,
patente de EE.UU. n◦ 4.350.687. Además, el
PDGF puede ser producido recombinantemente
usando células eucarióticas, tales como levaduras, Publicación EP n◦ 0177957, o bien usando
células procarióticas, tales como E. coli, transformadas (Charette et al., solicitud de patente
de EE.UU. serie n◦ 07/155.066, presentada el 11
de febrero de 1988, cedida al mismo cesionario).
El PDGF es también disponible comercialmente
de la Amgen Corporation (Thousand Oaks, CA),
PDGF, Inc. (Boston, MA), Collaborative Research, Inc. (Waltham, MA) y Creative BioMolecules, Inc. (Hopkinton, MA).
La preparación de PDGF para su administración se realiza por técnicas convencionales. Por
ejemplo, pueden obtenerse preparados lı́quidos,
comprimidos o cápsulas empleando aditivos tales como vehı́culos aceptables farmacéuticamente
(p. ej. lactosa, almidón de maı́z, anhı́drido silı́cico ligero, celulosa microcristalina, sacarosa),
aglutinantes (p. ej. almidón en forma alfa, metilcelulosa, carboximetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, polivinilpirrolidona), agentes desintegrantes (p. ej. carboximetilcelulosa cálcica, almidón, hidroxipropilcelulosa de baja sustitución), agentes tensioactivos [p.
ej. Tween 80 (Kao-Atlas), Pluronic F68 (Asahi
Denka, Japón); copolı́mero de polioxietileno-polioxipropileno)], antioxidantes (p. ej. L-cisteı́na,
sulfito sódico, ascorbato sódico), lubricantes (p.
ej. estearato de magnesio, talco), y similares.
También se obtienen preparados rectales por
técnicas convencionales, por ejemplo empleando
una base oleosa tal como un glicérido de ácidos
grasos superiores [p. ej. manteca de cacao, Witepsoles (una base semisintética) Dynamite Nobel, Alemania], un glicérido de ácidos grasos medios [p. ej. Myglioles (Dynamite Nobel)] o un
aceite vegetal (p. ej. aceite de sésamo, aceite de
soja, aceite de maı́z, aceite de algodón, aceite de
oliva).
Para ciertas enfermedades del tracto GI inferior, tales como úlceras pépticas y colitis ulcerosa y otras formas de enfermedades intestinales inflamatorias, se prefiere que la composición de PDGF esté recubierta con un copolı́mero
entérico tal como ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa, acetato-ftalato de celulosa o copolı́mero
de ácido metacrı́lico para proteger más al PDGF
frente al ácido y a las enzimas digestivas tales
como la pepsina. Esta composición recubierta
pasa ası́ al área del tracto GI en la que se optimiza su valor terapéutico.
La invención proporciona también la administración de composiciones farmacéuticas que comprenden PDGF o sus sales y uno o más agentes que estabilizan, potencian o afectan de otra
manera a la eficacia terapéutica del PDGF. Tales agentes incluyen: (i) agentes estabilizantes tales como glicosaminoglicano, que incluyen hepa3
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rina, sulfato de glucano tal como sulfato de dextrano, ciclodextrinas sulfatadas tales como tetradecasulfato de beta-ciclodextrina y sulfato de β1,3-glucano; (ii) agentes antisecretores tales como
antagonistas de receptores de H2 (tales como cimetidina, ranitidina, famotidina, roxatidina acetato), antagonistas del receptor de la muscarina
(p. ej. pirenzepina), inhibidores de la bomba de
protones (ATPasa (p. ej. omerrazona); (iii) agentes citoprotectores tales como sales coloidales de
bismuto (p. ej. De-Nol), derivados de sucralfato
y de prostaglandina; y (iv) antiácidos tales como
gel de hidróxido de aluminio, hidróxido de magnesio y bicarbonato sódico. Tales agentes pueden
ser administrados bien sea separadamente o como
componentes de la composición.
La cantidad relativa de agentes estabilizantes/potenciadores y PDGF puede variar dependiendo de diversos factores, incluyendo el agente
usado, el estado del paciente y el modo de administración. En general, la relación en peso de
estabilizante a PDGF es aproximadamente de 0,1
a 100, lo más preferentemente de 0,2 a 20, preferentemente de aproximadamente 0,5 a 4.
Los agentes estabilizantes que pueden usarse
de acuerdo con la presente invención incluyen glicosaminoglicanos tales como heparina, fragmentos de heparina, sulfatos de glucano tales como
sulfato de dextrano, sulfato de ciclodextrina y
sulfato de β-1,3-glucano. El sulfato de glucano
empleable en la presente invención puede estar
también en forma de sal. Como sal puede emplearse cualquier catión aceptable farmacéuticamente, p. ej. sodio, potasio, amonio, trimetilamonio, y similares.
Los agentes antisecretores preferidos son ranitidina y cimetidina. La cantidad de agente antisecretor usado variará de acuerdo con los factores anteriormente descritos. Por ejemplo, cuando
se usa para tratar úlceras pépticas, una composición preferida incluye de aproximadamente 10
a 300 µg de PDGF, preferentemente 100 µg de
PDGF, y de aproximadamente 20 a 600 mg de
agente antisecretor, preferentemente 200 mg de
agente antisecretor.
Los antiácidos preferidos incluyen gel de hidróxido de aluminio, bicarbonato sódico e hidróxido de magnesio. El antiácido puede tomarse
junto con el PDGF o puede ser incorporado como
componente de la propia composición de PDGF.
La cantidad de antiácido debe estar generalmente
entre 0,5 y 5,0 g por tratamiento.
La cantidad de agente citoprotector usada dependerá de varios factores, incluyendo el agente
usado. Generalmente, se usa entre 2,5 y 5 µg de
derivado de prostaglandina por adulto humano, y
0,5 µg de sucralfato por adulto humano.
Un ejemplo representativo de un preparado de
PDGF es PDGF en combinación con el estabilizante sulfato de glucano. Cuando el componente
de proteı́na PDGF de la presente invención se
pone en contacto con sulfato de glucano en un
medio acuoso, esto se realiza preferentemente en
presencia de un ácido carboxı́lico di- o tri-básico,
para dar un PDGF aún más estabilizado. Los
ejemplos de ácido carboxı́lico dibásico incluyen
el ácido tartárico, ácido maleico, ácido málico y
ácido fumárico. Los ejemplos de ácido carboxı́lico
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tribásico incluyen ácido cı́trico y ácido isocı́trico.
Los ácidos carboxı́licos antes mencionados pueden también estar en forma de sal. También es
posible añadir ácido carboxı́lico nativo a un medio
acuoso, al que se añade una cantidad adecuada de
un álcali o un ácido para ajustar el pH en el valor
deseado.
La puesta en contacto del componente de
proteı́na PDGF con sulfato de glucano y además
con ácido carboxı́lico en un medio acuoso se
realiza mezclando estos materiales en un medio
acuoso. El medio acuoso está formado preferentemente por agua destilada, solución salina
fisiológica, solución de glucosa, tampones tales como tampón de fosfato y tampón de trishidroximetilaminometano-HCl. Puede mezclarse
una solución acuosa de componente de proteı́na
de PDGF, una solución acuosa de sulfato de glucano y una solución acuosa de ácido carboxı́lico,
o puede disolverse en agua una mezcla de estos
materiales en forma sólida. El mezclado de estos materiales se realiza a temperaturas que están
entre 3 y 10◦ C, más preferentemente de aproximadamente 5 a 9◦ C. El tiempo requerido para el
mezclado suele estar en el intervalo de aproximadamente 1 a 30 minutos. La composición resultante puede ser liofilizada, procedimiento durante
el cual puede formarse y recuperarse un complejo. Para separar y recuperar la composición
de PDGF estabilizada resultante, puede usarse un
método de filtración en gel usando gel de Sephadex o un método de cromatografı́a de intercambio
iónico usando DEAE- o CM- Toyopearl. Alternativamente, la composición de PDGF estabilizada
puede usarse tal cual sin separación ni recuperación.
Dosificación y modo de administración
El modo de administración preferido para
úlceras GI según la invención es oralmente, p.
ej. en comprimidos, cápsulas, tabletas o goma
masticable, o rectalmente mediante supositorios
o enemas.
La dosificación del PDGF requerido para tratar úlceras GI en pacientes adultos humanos es
generalmente de aproximadamente 0,1 µg a 30
mg por dı́a, preferentemente de aproximadamente
0,1 µg a 10 mg por dı́a, más preferentemente de
aproximadamente 1,0 µg a 3 mg por dı́a, y lo más
preferentemente de aproximadamente 10 µg a 300
mg por dı́a. Para dministración oral, pueden formularse de 10 µg a 150 µg de PDGF o de su sal
como comprimido o como cápsula junto con un
portador o diluyente aceptable farmacéuticamente, u otro vehı́culo adecuado. Tal formulación se
administra de una a cuatro veces al dı́a para llevar
la dosificación al margen preferido.
La invención se entenderá mejor con referencia
a los ejemplos que siguen.
Tratamiento con PDGF de la úlcera de duodeno
inducida
En los experimentos que siguen, se indujeron
úlceras en ratas y después fueron tratadas con
PDGF.
Ratas hembra Sprague-Dawley (150-200 gramos) recibieron el ulcerógeno duodenal cisteamina-HCl en una dosis de 25 miligramos (mg) por
100 gramos (g) de peso corporal mediante sonda
intragástrica 3 veces el mismo dı́a. Adicionalmen-
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te se administró cortisona por via subcutánea a
cada rata, a una dosis individual de 5 mg de cortisona por 100 g de peso corporal, para reducir
la mortalidad resultante de la administración de
cisteamina-HCl.
Tres dı́as después de la administración de
cisteamina-HCl, se determinaron mediante laparotomı́a las ratas que tenı́an úlceras de duodeno
penetrantes y perforantes, se aleatorizaron en
grupos testigo y se trataron con PDGF.
El grupo 1 incluyó nueve ratas con úlceras.
Las nueve ratas del grupo 1 no recibieron PDGF
y se trataron solamente con solución salina. Las
ratas fueron tratadas con el vehı́culo de solución
salina mediante la alimentación por sonda intragástrica dos veces al dı́a, hasta la autopsia el
dı́a 21, que es cuando se midieron las úlceras y se
tomaron secciones histológicas.
El grupo 2 incluyó cinco ratas, cada una de
las cuales recibió 100 ng de PDGF por 100 g de
peso corporal mediante alimentación por sonda
intragástrica, dos veces al dı́a, hasta la autopsia
el dı́a 21, que es cuando se midieron las úlceras y
se tomaron secciones histológicas.
El grupo 3 incluyó cinco ratas, cada una de
las cuales recibió 500 ng de PDGF por 100 g de
peso corporal mediante alimentación por sonda
intragástrica, dos veces al dı́a, hasta la autopsia
el dı́a 21, que es cuando se midieron las úlceras y
se tomaron secciones histológicas.
Las mediciones de las úlceras con y sin tratamiento con PDGF y en el grupo testigo se presentan en la Tabla 1.
TABLA 1
Grupo 1
Incidencia de úlceras:
Cráter de las úlceras:
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100 %
16,9 ± 6,8 mm2
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Grupo 2
Incidencia de úlceras:
Cráter de las úlceras:
Grupo 3
Incidencia de úlceras:
Cráter de las úlceras:
60 %
2,9 ± 1,1 mm2
(p=0,051)
29 %
2,05 ± 1,4 mm2
(p=0,048)
La histologı́a de las secciones duodenales de
animales tratados con PDGF reveló úlceras curadas con tejido de granulación prominente y denso
y una reepitelización parcial o completa.
Ası́, los resultados demuestran que la administración oral de PDGF puede acelerar significativamente la cicatrización de úlceras del tracto
GI.
Secreción de ácido gástrico y de pepsina de ratas
tratadas con PDGF
En los experimentos que siguen, se midieron
los niveles secretorios de ácido gástrico y de pepsina en ratas tratadas con PDGF y en ratas testigo.
El grupo 1 incluyó de ocho a diez ratas que
fueron mantenidas en ayunas durante 24 horas y
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a las que se administró vehı́culo de solución salina
y 30 mg de látex bajo anestesia con éter. Los
estómagos de las ratas fueron constreñidos con
una ligadura pilórica durante una hora.
El grupo 2 incluyó de ocho a diez ratas que
fueron mantenidas en ayunas durante 24 horas y
a las que se administró 500 ng de PDGF por 100
g de peso corporal mediante jeringa, por vı́a oral.
Los estómagos de las ratas fueron constreñidos
con una ligadura pilórica durante una hora.
Después se recogió el jugo gástrico de cada
rata de los grupos 1 y 2, se centrifugó y partes
alı́cuotas se procesaron haciendo la titulación de
ácido para calcular la producción de ácido y la
determinación de pepsina. El ácido gástrico se
midió a través de la acidez de los jugos gástricos
y los niveles de pepsina se determinaron siguiendo
ensayos de proteasa estándar, bien conocidos en la
técnica. Dado que la pepsina es la proteasa más
abundante en el estómago, el nivel de proteasa
total es una buena medida del nivel de pepsina.
Las partes alı́cuotas de los jugos gástricos fueron
analizadas mediante espectrofotometrı́a usando
albúmina como sustrato (Szabo, S. et al., Res.
Comm. Chem. Pathol. Pharmacol., 1977, 16,
311-323).
El grupo 1, las ratas testigo que recibieron
solución salina en vez de PDGF, tenı́an niveles
normales de pepsina gástrica. En el grupo 2,
que incluı́a las ratas tratadas con PDGF, no se
observó descenso alguno en el volumen de jugo
gástrico o de producción de ácido o pepsina. Ası́
pues, el tratamiento con PDGF de las úlceras del
tracto GI no afecta a los niveles normales de ácido
gástrico o pepsina en el tracto GI.
Tratamiento con PDGF de la mucositis oral
La musitis oral implica ulceraciones de la boca
como consecuencia, p. ej., de la radioterapia o
la quimioterapia. El curso de la mucositis ulcerosa puede dividirse en una fase destructiva y una
fase curativa. Dado que las células de la capa basal del epitelio oral se dividen a elevada velocidad, son sensibles a los efectos antimitogénicos y
tóxicos de la quimiterapia. Como resultado tienen lugar cambios atróficos que van seguidos por
ulceraciones. Esto constituye la fase destructiva.
Después de la formación de úlceras, las lesiones
se resuelven lentamente durante la fase curativa.
El PDGF es un conocido estimulante de la proliferación de células epiteliales. Su eficacia en la
reducción del tiempo de curación de la mucositis
puede evaluarse por procedimientos experimentales conocidos por los expertos en la técnica, de los
cuales se presenta a continuación un ejemplo.
El efecto del PDGF se ensayarán sobre hamsters sirios dorados macho, de 6-8 meses de edad
(Charles River Laboratories, Wilmington, MA).
Los grupos de ensayo formados por los animales
incluirán un grupo testigo con placebo (1), un
grupo de dosis baja de PDGF (2) y un grupo de
dosis alta de PDGF (3). Cada grupo contendrá
12 animales.
El dı́a 0, los cinco grupos de animales comienzan el procedimiento de inducción de la mucositis.
Se inyecta intraperitonealmente 5-fluorouracilo
(60 mg/kg) los dı́as 0 y 5. El dı́a 2, la mucosa
de la bolca bucal derecha es irritada superficialmente con una aguja calibrada del número 18.
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Se deben inducir mucositis ulcerosas serias en al
menos el 80 % de los animales el dı́a 7.
El dı́a 5, los hamsters de los grupos 2 y 3
reciben dos veces diarias aplicaciones de PDGF
(aproximadamente 100-500 ng/100 g). Los animales siguen recibiendo PDGF hasta el dı́a 18.
Los animales del grupo 1 reciben placebo desde
el dı́a 0 al dı́a 18.
El testigo de vehı́culo o el material de PDGF
se administran después de un suave secado de la
mucosa de la bolsa malar, seguido por la aplicación uniforme sobre la superficie de la mucosa
del vehı́culo o del material de PDGF. Se utiliza
un recubrimiento basado en hidroxipropilcelulosa
para mantener el contacto del PDGF con la mucosa. Este recubrimiento proporciona al menos 4
horas de tiempo de contacto.
El dı́a 9, se sacrifican dos animales de cada
grupo para estudios histológicos. La mucosa de
la bolsa malar derecha y el tejido conjuntivo circundante se diseccionan y se fijan en formalina al
10 %. Los especı́menes se montan en parafina y se
preparan para examen histológico. Las secciones
se tiñen con hematoxilina y eosina y se examinan,
en estudio ciego, por un patólogo oral experto en
histologı́a del hamster. Se evalúan el alcance de
la atrofia, la infiltración celular, la rotura de tejido conjuntivo, el grado de ulceración y la epitelización.
Las úlceras orales se observan después en
cuanto a la evidencia de una curación acelerada
en relación con el grupo testigo. Los hamsters
restantes se examinan y se pesan diariamente, y
la bolsa malar bucal derecha se aparta y se fotografı́a.
Las fotografı́as de la bolsa malar se numeran,
se aleatorizan y se puntúan por el método ciego
por tres observadores frente a un panel de mucositis estándar. La puntuación media de la mucositis para cada grupo se determina para cada dı́a
del experimento. Las diferencias entre grupos se
determinan usando el análisis de la “t” de Student. Además, se evalúan los datos entre grupos
comparando el número de animales con mucositis
serias usando análisis estadı́stico de chi cuadrado.
También se determina la significación de las diferencias en los pesos diarios medios. Se espera que
tal tratamiento con PDGF reduzca las lesiones
curando el tejido ulcerado de la cavidad oral.
Tratamiento con PDGF de la colitis ulcerosa
La colitis ulcerosa implica úlceras de colon.
El efecto del tratamiento con PDGF sobre las
úlceras de colon puede evaluarse por procedimientos experimentales conocidos por los expertos en
la técnica, presentándose a continuación un ejemplo de tales procedimientos.
Se albergan cobayas de 500-550 g (Charles River Laboratories) en jaulas individuales y en salas a temperatura controlada, y se alimentan con
pienso para cobayas (Purina Co., St. Louis, MO)
y agua a voluntad. Después de 48 horas de reposo,
los animales se dividen en 3 grupos experimentales.
A los tres grupos se les suministra agua destilada con carragenina degradada (un polisacárido
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derivado de las algas marinas rojas, Glaxo Laboratories, Parı́s, Francia). La carragenina es un
conocido inductor de la colitis ulcerosa en las cobayas. En el grupo testigo (1), 20 cobayas reciben
agua que contiene 0 % de carragenina degradada.
En los grupos 2 y 3, 20 cobayas en cada grupo reciben agua que contiene 1 % y 5 % de carragenina
degradada, respectivamente. Esto continúa durante 30 dı́as. Durante este tiempo, los animales
son observados y pesados diariamente.
El desarrollo de colitis se determina usando
varios criterios: 1) presencia de heces sueltas
y/o sangrientas mediante inspección visual, 2)
detección de sangre oculta en las heces usando
Coloscreen III con revelador hemocult (Helena
Labs., Bumont, TX), y 3) pérdida de peso.
El dı́a 25, cada animal es anestesiado con Ketamine (3-5 mg/kg) administrado por vı́a intramuscular, y se toma una biopsia de la mucosa
colorrectal de 3 mm usando un pequeño nasoscopio. Todas la muestras se fijan en formaldehı́do
al 15 % y se examinan histológicamente usando
hematoxilina y eosina. El diagnóstico patológico
de la colitis ulcerosa se establece por la presencia
de abscesos en cripta, infiltración linfocı́tica, congestión capilar de la lámina propia y ulceración
de la mucosa del colon (Onderdonk, Digestive Disease Science 30:40 (s), 1985). La gravedad de la
colitis ulcerosa se gradúa en una escala de 0 a 3 y
se expresa como ı́ndice patológico de acuerdo con
el sistema de puntuación estándar (Onderdonk et
al., Amer. J. Clin. Nutrition 32:258, 1979, Okayasu et al., Gastroenterology 98:694, 1990).
El dı́a 30, el 25 % de las cobayas en las que
se demostró histológicamente una colitis ulcerosa
son tratadas con PDGF, y el 25 % restante reciben agua destilada como testigo. El PDGF se
administra a una dosis baja de 100 ng/100 g en la
mitad de las cobayas, y la otra mitad recibe una
dosis alta (500 ng/100 g) de PDGF, administradas oralmente mediante una aguja de 3 mm con
bulbo, dos veces al dı́a, durante un perı́odo de 10
dı́as (dı́as 28-37).
Durante el tratamiento, los animales son evaluados clı́nicamente y se toma nota de las mejorı́as
en el peso corporal, la consistencia y la reducción
o ausencia de sangre en las heces. El dı́a 37, todos los animales son sacrificados con una sobredosis de pentobarbital (>200 mg/kg) y se extrae
el colon entero para estudiar la eficacia del tratamiento con PDGF en la curación de las úlceras
de colon inducidas por carragenina.
Se realiza análisis estadı́stico usando análisis
de varianza de medidas repetidas SAS (ANOVA),
bloqueando animales con comparación por parejas post-hoc por el test de Newman-Keuls. Un
nivel de significación de p<0,05 se acepta como
significativo. La organización y al análisis de los
datos son asistidos por el Clinfo Data Management and Analysis System (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA). Se espera que el
tratamiento con PDGF induzca una curación siginificativa del tejido del colon ulcerado.
Otras realizaciones de la invención están dentro de las reivindicaciones que siguen.
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ES 2 123 004 T3
REIVINDICACIONES
1. Un método para preparar un producto farmacéutico o medicamento para ser usado en el
tratamiento no parenteral de úlceras del tracto
gastrointestinal, en el que el producto farmacéutico o medicamento se formula usando factor de
crecimiento derivado de plaquetas.
2. El método según la reivindicación 1, en el
que dicho producto farmacéutico o medicamento
se formula para el tratamiento de úlceras presentes en el estómago.
3. El método según la reivindicación 1, en el
que dicho producto farmacéutico o medicamento
se formula para el tratamiento de una úlcera péptica o una ulcera gástrica.
4. El método según la reivindicación 1, en el
que dicho producto farmacéutico o medicamento
se formula para el tratamiento de úlceras presentes en el ı́leon.
5. El método según la reivindicación 1, en el
que dicho producto farmacéutico o medicamento
se formula para el tratamiento de úlceras presentes en el duodeno.
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6. El método según la reivindicación 1, en el
que dicho producto farmacéutico o medicamento
se formula para el tratamiento de úlceras presentes en el colon.
7. El método según la reivindicación 6, en el
que dicho producto farmacéutico o medicamento
se formula para el tratamiento de la colitis ulcerosa.
8. El método según la reivindicación 1, en el
que dicho producto farmacéutico o medicamento
se formula para el tratamiento de úlceras presentes en la boca.
9. El método según la reivindicación 8, en el
que dicho producto farmacéutico o medicamento
se formula para el tratamiento de la mucositis
oral.
10. El método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho producto
farmacéutico o medicamento se formula para administración oral.
11. El método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho producto
farmacéutico o medicamento se formula para administración rectal.
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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva
del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD
2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicación
del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del
7-10-1992, no producirán ningún efecto en España
en la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como tales.
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Esta información no prejuzga que la patente esté o
no incluı́da en la mencionada reserva.
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