Tecnicas BQ 2006_GUIA PRECIPITACION

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UNIVERSIDAD PERUANA CAYETANO HEREDIA
FACULTAD DE CIENCIAS Y FILOSOFIA
DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA, BIOLOGIA MOLECULAR Y FARMACOLOGIA
PRACTICAS DE LABORATORIO DE BIOQUIMICA
2006
Clase 10: Lunes 14 de Agosto
Coordinador: Carla Gallo
PRECIPITACIÓN DE PROTEINAS
Resumen: Precipitación etanólica de un extracto sonicado-homogenizado de E.coli transformada
inducida con IPTG para expresar pirazinamidasa recombinante de Mycobacterium tuberculosis. Se
obtendrá 4 precipitaciones a distintas concentraciones de etanol, y se les medirá la actividad de
pirazinamidasa mediante la prueba de Wayne.
Procedimiento:
Identifique el vial que está marcado como EXT (extracto). Este extracto es un lisado de E. coli que han
sido genéticamente modificados para producir pirazinamidasa en grandes cantidades.
Agite el vial EXT con la mano y luego llévelo a la centrifugadora y centrifugue a máxima velocidad por
10 minutos.
Mientras centrifuga, ubique los viales vacíos que se les ha suministrado, y haga los cálculos de la
cantidad de etanol que deberá ir colocando en 4 viales para obtener porcentajes de etanol según lo
descrito en la tabla a continuación.
Rotule los viales con los números 18, 34, 51 y 68. Estos números indican el porcentaje de etanol que
debe contener el vial cuando usted coloque en él 200 µl del sobrenadante que obtendrá del vial EXT
una vez que termine de centrifugar.
Utilice la tabla a continuación para realizar el cálculo y úsela como guía para los siguientes pasos.
%
ETANOL
18
34
51
68
VOL EXT
200
200
200
200
VOL ETANOL
PORCENTAJE W/W
18
34
51
68
SOLO EN ESTA OPORTUNIDAD CONSIDERE QUE EXT Y EL ALCOHOL TIENEN DENSIDAD = 1
Rotule también un juego más de 4 viales con los mismos números y márquelos con las letras SOB.
Rotule un vial adicional con la sigla CLA.
Al terminar de centrifugar la muestra EXT retire la fase líquida con mucho cuidado y transfiérala en el
vial marcado como CLA (clarificado). Tome de este envase alícuotas de 200 microlitros, y dispénselas
en los 4 viales que contienen el etanol cuya concentración usted calculó en el entretiempo para
precipitar las proteínas. Terminado de colocar el contenido de CAL a cada vial con alcohol, tápelos y
agítelos vigorosamente por 15 segundos (use un vortex si es posible) y deje reposar a temperatura
ambiente por 20 minutos.
Pasado este tiempo centrifugue los viales a máxima velocidad por 15 minutos. Retire el sobrenadante
delicadamente para no mover el pellet y coloque el líquido retirado en los eppendorff rotulados SOB y
su respectivo valor de porcentaje. Invierta sobre un papel toalla el vial con el pellet, y déjelo decantar
por 30 minutos.
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Mientras espera que decante el pellet, en la placa para ELISA de 96 pozos coloque en 8 pozos 50 µl de
buffer fosfato 0.1M pH 6.4 y 20 µl de sustrato PZA 40mM.
Resuspenda el pellet con 200 µl de buffer fosfato 0.1M pH 6.4. Es probable que no logre despegar el
pellet del fondo; por ello utilice un tip amarillo para mezclarlo con el buffer (cambie el tip entre cada vial).
Terminado de resuspender dispense 20µl de la muestra y colóquela en el pozo de la placa, haga lo
mismo con cada sobrenadante etanólico. Espere 20 minutos y coloque 10 µl de sulfato de amonio
ferroso al 20% (este debe estar recién preparado), luego casi inmediatamente añada 100 µl de buffer
glicina pH 3.4, 0.1M y observe la reacción.
Tome nota de los resultados y comente lo que ocurre.
Preguntas:
1. ¿La técnica es eficiente?
2. ¿Que efecto tiene el alcohol sobre la solución y la enzima finalmente?
CENTRIFUGACIÓN
Resumen: La práctica utilizará un procedimiento muy común para separar partículas, células u
organelas de medios líquidos. Separaremos usando una gradiente continua autogenerada células
sanguíneas del plasma como linfocitos y glóbulos rojos.
Nota: La muestra de sangre es real y es potencialmente infecciosa EXTREME EL CUIDADO CUANDO
LO MANIPULE.
Procedimiento:
Tome el vial que contiene la sangre y mezcle el contenido antes de trabajar, invierta el vial al menos por
30 segundos o cuente 20 veces la operación de agitar el vial por inversión, para asegurarse que la
muestra esta homogénea.
Tome el vial que está rotulado como P y agregue con una pipeta automática muy suavemente tocando
la punta contra la pared del vial muy cerca sobre el líquido transparente 150 µl de sangre sin crear
vórtices. Repita la operación sobre los otros dos viales que están rotulados XSU y ZSU.
Delicadamente sin agitar el contenido coloque los tres viales en una centrifuga (previamente contrapese
cada vial con otro con el mismo peso) y centrifugue a 1500 rpm por 15 minutos
Retire delicadamente los tres viales de la centrifugadora y observe los resultados.
Preguntas:
1. ¿Qué es el Percoll?
2. ¿Que es una gradiente de sucrosa?
3. ¿Qué densidad aparente tienen los viales rotulados como ZSU y XSU? (básese en los
resultados de la centrifugación, indique con < > o = la densidad con respecto al vial marcado
como P)
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DIALISIS
Resumen: Se dializará como demostración dos moléculas indicadoras de color (azul de bromofenol y
rojo congo). Se utilizará una membrana diálisis de cut-off 12,000-48,000.
Procedimiento:
Introducir una solución de azul de bromofenol en la membrana de diálisis previamente hidratada, así
también en otra membrana coloque rojo congo y por último en una tercera membrana una mezcla 1:1
v/v de ambos colorantes.
Observar que las clampas de seguridad están bien puestas antes de colocar la bolsa en el beaker para
diálisis.
Iniciar la diálisis frente a un volumen de 200 a 400 ml de agua desionizada. Mantener en agitación en
una plancha magnética, durante 24 horas. Muestrear el sobrenadante y cuantificar la absorbancia cada
30 minutos por las 3 primera horas o mas. Leer en el espectrofotómetro usando como blanco agua.
Al día siguiente coloque ácido HCl 9M (1ml por cada 200 ml de la solución de diálisis), observe que
pasa con la diálisis.
Preguntas:
1. Graficar los resultados: unidades de absorbancia vs. tiempo (horas). ¿Qué se puede decir de
estos resultados?
2. ¿Cuál es la estructura molecular del azul de bromofenol y del rojo congo? ¿este dato le da
alguna información relevante para explicar lo ocurrido en la práctica?
3. ¿Qué ocurre cuando existe HCl en el medio de diálisis?