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FTIR,UV-VIS:Nuevos Desarrollos y Aplicaciones en Espectroscopia FTIR,UV-VIS Regina Orenga Champion LSG Molecular Spectroscopy CAG EMEAI | Agilent Restricted | Page 1 • FTIR. Breve Recordatorio •Diferentes tipos de Espectrofotómetros FTIR •Acoplamiento de: – Análisis Superficial: ATR – Por Temperatura: – GC-FTIR – TGA-FTIR – Visual:Microscopio-FTIR CAG EMEAI | Agilent Restricted | Page 2 Consideraciones Generales Técnica FTIR • La espectroscopía FT-IR, es una técnica de uso común y de alto valor en la identificación de todo tipo de materiales sintéticos y naturales. • Es una técnica apta para el análisis de sólidos, líquidos y gases y complementa la información estructural que proporciona sobre los compuestos estudiados con la posibilidad de realizar análisis cuantitativos. CAG EMEAI | Agilent Restricted | Page 3 Introducción. Espectroscopía IR La energía IR produce vibraciones moleculares O H H Cuando la frecuencia de la luz IR alcanza la frecuencia de vibración del enlace, se produce la absorción O H H La cantidad de energía absorbida es proporcional a la fortaleza del enlace O H Cada tipo de enlace químico, vibra a una frecuencia específica de manera natural H En conjunto de absorbancias IR para una muestra, está referida como su espectro IR Io I O H H CAG EMEAI | Agilent Restricted | Page 4 FT-IR • Rangos: – NIR; 4.000 cm-1 a 14.000 cm-1 (2.500 nm a 700 nm) – Mid-IR; 4.000 cm-1 a 400 cm-1 (2,5 µm a 25 µm ) – FIR; 400 cm-1 a 10 cm-1 (25 µm a 1.000 µm ) ΰ= (cm-1) 1 E=h cΰ 5 CAG EMEAI | Agilent Restricted | Page 5 INTERFEROMETRO CAG EMEAI | Agilent Restricted | Page 6 Introducción. Espectro Infrarrojo El espectro IR de una muestra es una gráfica de la cantidad de energía IR (eje y) que es absorbida a determinadas frecuencias (eje x) en la región IR del espectro electromagnético. Absorbance Cada muestra tiene un espectro IR único; de manera que un espectro IR puede servir como una huella dactilar de un compuesto. 4000 3500 3000 2500 2000 Wavenumber 4000 3500 3000 2500 2000 Wavenumbers (cm-1) 1500 1500 1000 500 (cm-1) 1000 CAG EMEAI | Agilent Restricted | Page 7 Interpretación de espectros IR La frecuencia que absorben los grupos fucionales corresponden a la fortaleza del enlace, cuanto más fuerte es el enlace, absorbe a frecuencias más altas, y viceversa. Cada grupo funcional absorbe a una determinada frecuencia, de manera que es posible elucidar la estructura química del material con su espectro IR. Permite, por tanto, la creación e identificación en librerias. 1750 cm-1 C=O Stretch 0.30 Absorbance 0.25 0.20 3300 cm-1 N-H Stretch 1540 cm-1 N-H Bending 2900 cm-1 C-H Stretch 0.15 0.10 0.05 0.00 4000 3000 Wavenumber (cm-1) 2000 1000 CAG EMEAI | Agilent Restricted | Page 8 Interpretación de espectros IR CAG EMEAI | Agilent Restricted | Page 9 Información cualitativa y cuantitativa • Búsqueda en librerías Identificación Estructural Identificación de muestras desconocidas Control de calidad de producto terminado, materia prima, etc Un compuesto químico puede ser identificado mediante la búsqueda en librerías comerciales o generadas por el usuario Concentración por FTIR • Cuantificación 0.24 Medida de la concentración 0.16 Absorbance Análisis de aceites, fuel, etc. IR spectral overlay of turbine oil 5-4300ppm 0.08 0.00 -0.08 3900 3700 3500 Wavenumber 3300 3100 La calibración permite predecir la concentración mediante espectros IR CAG EMEAI | Agilent Restricted | Page 10 Instrumentación en FTIR • CONFIGURACION INSTRUMENTAL : Tipos de Fuentes Tipos de Beam splitters Tipos de Detectores •DIFERENTES TIPOS DE ESPECTROFOTOMETROS FTIR: Portátiles: EXOSCAN 4000 5500 Cary 630 Laboratorio Cary Serie 600 Cary 630 CAG EMEAI | Agilent Restricted | Page 11 CONFIGURACION INSTRUMENTAL FUENTES DE IR BEAM SPLITTER Ideal es el que tramsmite 50% de Energia incidente y refleja al espejo movible el otro 50% CAG EMEAI | Agilent Restricted | Page 12 CONFIGURACION INSTRUMENTAL:DETECTORES DETECTORES Depende de la región del espectro deseado La sensibilidad relativa La velocidad y las caracteristicas del procesado de la señal Detectores MID-IR y FAR-IR Detectores NEAR-IR Tipo Rango Temperatura Silicio 25000-8600 Ambiente InSb 11000-1800 Nitrogeno liq SePb 11000-2000 Ambiente InGaAs 10000-4000 Ambiente CAG EMEAI | Agilent Restricted | Page 13 DIFERENTES TIPOS DE INSTRUMENTACION Cary 670 P e r f o r m a n c e Cary 680 Cary 660 Cary 630 CAG EMEAI | Agilent Restricted | Page 14 AGILENT CARY 630 IBO ( Instrument Bussines Outlook) medalla de oro 2012 al Cary 630 ✪INNOVADOR: Accesorios de muestreo exclusivos que se montan y desmontan en segundos sin necesiidad de alineación ✪INTUITIVO: Software en español, guia a los usuarios en las diferentes etapas del programa, alertas de colores que facilitan la comprobación de las muestras para garantizar que cumplen las especificaciones ✪FLEXIBLE: Sistema optomecánico resistentes, probado en todo tipo de condiciones mediambientales CAG EMEAI | Agilent Restricted | Page 15 AGILENT CARY FTIR630 Facilidad de Intercambio. Chip de Reconocimiento en todos los Accesorios: Transmisión Uso :Tabletas TumblIR 100µ Module ZnSe Paso óptico fijo 100 µ Uso: Muestras líquidas, Ceras Dial Path Paso óptico regulable Reflectancia Difusa Uso:Polvos ATR de Diamante CAG EMEAI | Agilent Restricted | Page 16 AGILENT CARY FTIR 630 KBr beamsplitter for lab environments Spectral range: 7000 – 350cm-1 ZnSe beamsplitter for harsh environments – gatehouse, factory floor Spectral range: 5100 – 600cm-1 CAG EMEAI | Agilent Restricted | Page 17 Feature – Optimised Energy in Fingerprint Region Benefit – Better quality spectra = better library match Beamsplitter optimised to give high energy throughput in “fingerprint” region Mayor sensibilidad en las zonas más interesantes del espectro CAG EMEAI | Agilent Restricted | Page 18 Feature – High Scan Speed Benefit – Faster/Better Spectra It means….same quality data faster, or better quality data in the0.35same time 0.33726 0.30 Cary 630 ATR Abs/Noise Ratio = 265 0.29822 Competitor ATR Abs/Noise Ratio = = 102 Absorbance 0.25 0.20 Single Reflection Diamond ATR 5 second collect Mineral Oil 0.15 0.10 0.05 0.00 3800 3600 3400 3200 3000 2800 2600 2400 2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 Wavenumber Absorbance 0.003 0.002 0.00127 0.00292 0.001 Over 2.5x higher Abs/Noise! 0.000 -0.001 -0.002 3900 3800 3700 3600 3500 3400 3300 3200 3100 3000 2900 2800 2700 2600 2500 Wavenumber CAG EMEAI | Agilent Restricted | Page 19 ACOPLAMIENTO DE OTRAS TECNICAS :ATR •Es una técnica de análisis superficial •Permite analizar compuestos puros sin que las bandas de absorción aparezcan saturadas •No se necesita ninguna preparación de la muestra , simplemente un corte de un grosor suficiente para colocar la muestra en el cristal de ATR •Para muestras sólidas y líquidas CAG EMEAI | Agilent Restricted | Page 20 ACOPLAMIENTO DE OTRAS TECNICAS: ATR Propiedades Cristal de Diamante Cristal de SeZn Rango de Transmisión con camino óptico de 1 mm 30000 <2 15000-461 Rango de ATR con camino óptico de 1 30000-50 mm Indice de Refracción a 1000 cm-1 2,4 15000-651 Espesor de Penetración en micras a 45º y a 1000 cm-1 2,0 2,0 pH 1-14 5-9 Solubilidad en agua Insoluble Insoluble Tª maxima ºC 550 300 Pto Ebullición ºC 3547 1526 Dureza kg/mm2 8820 120 Reactivos y materials prohibidos H2SO4 K2Cr2O7 concentrado Limpieza con Agua, acetone, alcoholes ligeros Alcalis, ácidos, agentes oxidantes y acomplejantes Agua, acetona, alcoholes ligeros 2,4 CAG EMEAI | Agilent Restricted | Page 21 ACOPLAMIENTO FTIR -TGA CAG EMEAI | Agilent Restricted | Page 22 ACOPLAMIENTO FTIR TGA TGA-FT-IR= TGA+FT-IR Combina el análisis cuantitativo con el análisis cualitativo • TGA • Mide el peso de la muestra durante la descomposición térmica • Estudios de Tª de Evaporación, Tª de Descomposición • Pérdida de Peso por evaporación (humedad, disolventes, plastificantes) • Pérdida de peso por descomposición y la velocidad de la pérdida de peso • FTIR • L Adquiere on line el espectro de la muestra, mide en tiempo real las emisiones de gas de la muestra CAG EMEAI | Agilent Restricted | Page 23 ACOPLAMIENTO TGA_FTIR Caracteristicas: ⌘Muestreo activo, modificando las velocidades de succión en funcion de la temperatura, para asi tener constante el aumento de moléculas en la celda de gases sin afectar al experimento de TGA ⌘Celda termostatizada (hasta 350ºC) Limpieza de la celda, las partículas y los productos de condensación son eliminados por succión y la gravedad ⌘Linea de Transferencia Termostatizada hasta 350ºC Evita la condensación, la contaminación y mantiene limpio el sistema y además asegura la transferencia cuantitativa de moléculas CAG EMEAI | Agilent Restricted | Page 24 ACOPLAMIENTO TGA –FTIR-GCMS CAG EMEAI | Agilent Restricted | Page 25 MICROSCOPIA DE IMAGENES FTIR Para qué utilizamos la Microscopía Infrarroja: • Permite al usuario ver muestras muy pequeñas (tamaño de micras) • Obtener espectros infrarrojos muy precisos en esas muestras pequeña. • Conocer la distribución de diferentes componentes en una muestra Puede medir: • Reflectancia • Transmisión, • ATR, Modos de Medida 1.Single point – Análisis Puntual 2.Mapping : Single point y Linear Array 3.2-D Focal Plane Array (FPA) Imaging CAG EMEAI | Agilent Restricted | Page 26 Single Point - Análisis puntual (I) MMMUESTRA GRANDE DE 250x250 Se recoge 1 espectro de la zona de la muestra visualizada 250 um Apertura Area total medida en rojo. El espectro resultante es una media de la composición de esa zona (hasta 250x250 um) CAG EMEAI | Agilent Restricted | Page 27 Single Point - Análisis puntual MUESTRA PEQUEÑA 50x50 Se recoge 1 espectro de la zona de la muestra visualizada 50 um Cerramos la ventana de apertura al máximo para evitar interferencia de otras zonas, obtenemos el espectro de la zona roja La resolución espacial típica es 10-20 micras, afecta el límite de difracción espacial. CAG EMEAI | Agilent Restricted | Page 28 610 is a “single point” microscope – it focusses on one measurement spot at a time Absorbance 0.8 0.4 0.0 4000 3000 2000 1000 Wavenumber (cm-1) 0.8 0.4 Absorbance Absorbance 0.8 0.0 4000 3000 2000 Wavenumber (cm-1) 1000 0.4 0.0 4000 3000 2000 1000 Wavenumber (cm-1) CAG EMEAI | Agilent Restricted | Page 29 Mappping (I) 1: Mapping Single Point Adquisición automatizada de espectros (uno a uno) definida con un grid a una resolución espacial definida por una máscara. Unos cientos de puntos pueden llevar horas. 2: Mapping Linear array Adquisición de espectros a través de una fila de detectores (1x16). Más rápido que single point mapping, pero mucho más lento que los sistemas de imagen FPA. CAG EMEAI | Agilent Restricted | Page 30 610 Single Point Mapping IR Analysis 340 mm Using a motorised stage, the 610 is capable of mapping a large area of sample, but each measurement point will typically take around 1 minute to collect a good spectrum, so if you have many measurement points a map can sometimes take many hours to collect. 0.3 K 340 mm Response 0.2 0.1 0.0 -0.1 -0.2 Contour map & 2-D image @ 1733cm-1 3500 3000 2500 2000 Wavenumber 1500 1000 CAG EMEAI | Agilent Restricted | Page 31 ¿Qué es Imagen en FTIR? En cada posición de la imagen hay un espectro En cada punto del espectro hay una imagen La imagen en cada punto del espectro está definida por la química de la muestra CAG EMEAI | Agilent Restricted | Page 32 FPA Imaging is like taking an IR “Photograph” of the sample. A 64x64 element FPA collects 4096 spectra simultaneously! Visible image 1737 cm-1 0.20 Row = 31 Col = 53 EVA 500 mm Absorbance 0.15 0.10 0.05 0.00 3600 3400 3200 3000 2800 2920 cm-1 2600 2400 2200 Wavenumber 2000 1800 1600 1400 1200 100 1200 100 0.25 660 mm PE (a result of EVA & PA subtraction Row = 23 Col = 39 70 mm Absorbance 0.20 from entire image) 0.15 0.10 0.05 0.00 3600 3290 cm-1 0.30 Complete area collected in 1 minute! 3200 3000 2800 2600 2400 2200 Wavenumber 2000 1800 1600 1400 PA Row = 29 Col = 16 0.25 Absorbance 70mm 3400 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 3600 3400 3200 3000 2800 2600 2400 2200 Wavenumber 2000 1800 CAG EMEAI | Agilent Restricted 1600 | 1400 1200 Page 33 1 Imagen FTIR. 2-D Focal Plane Array (FPA) (I) Progresión de la técnica.. Mapping Single point • 1 espectro/scan • Movimiento de la muestra para crear el mapa Mapping Linear Array • 16 espectros/línea scan • Movimiento de la muestra para crear el mapa Imagen - 2-D Focal Plane Array (FPA) • La imagen se recoge como una fotografía “snap shot” • 1 segundo para recoger 4096 espectros (64x64 pixel FPA) Colección de datos mucho más rápida Mayor resolución espacial Mayor sensibilidad CAG EMEAI | Agilent Restricted | Page 34 Imagen FTIR. 2-D Focal Plane Array (FPA) (II) Análisis de muestras grandes Mapping Linear Array Cary 620 Imagen Química En 20 min hemos analizado un 5% de la imagen En 20 min hemos analizado un 100% de la imagen a una resolución espacial de 5.5 um CAG EMEAI | Agilent Restricted | Page 35 APLICACIONES Estudio de Procesos Biológicos a Tiempo Real Comportamiento de la B-Lactoglobulina A frente a T Conformaciones de la Lipogenasa en distintos medios orgánicos Estudio de Tejidos Biológicos Distribución celular y subcelular de un tejido de una planta Estudios de investigación en la enfermedad de Alzheimer Estudios de investigación en Cáncer Caracterizar procesos biológicos dinámicos: Plegamiento de proteínas Transiciones de membrana en células Monitorizar rápidamente cambios conformacionales CAG EMEAI | Agilent Restricted | Page 36 Estudio de Procesos Biológicos a Tiempo Real (III) Conformaciones de la Lipoxigenasa en diferentes medios Se emplea FTIR de imagen para estudiar la reacción de la lipoxigenasa con y sin un sustrato (ac. linoleico) y su bioconversión al peróxido correspondiente. D2O (Lipoxigenasa) Interfase Hexano (Ac linoleico) Imagen Visual Imagen Química Espectro IR de la reacción CAG EMEAI | Agilent Restricted | Page 37 Estudio de Tejidos Biológicos (I) Heterogeneidad de un tejido Las imágenes por FTIR de imagen permiten determinar en este tejido de una planta la distribución celular y sub-celular. Para conocer esta distribución se obtienen las imagenes químicas a : •1650 cm-1 – distribución de proteínas •1730 cm-1 – distribución de lípidos •1050 cm-1 – distribución de carbohidratos CAG EMEAI | Agilent Restricted | Page 38 Estudio de Tejidos Biológicos (II) Investigación de la Enfermedad del Alzheimer Ejemplo del estudio del tejido cerebral del hipocampo de un ratón. El FTIR de imagen permite detectar las placas (contienen proteinas b-amiloides) y ovillos (contienen una proteína llamada tau) que parecen ser las responsables de los daños producidos en las neuronas en el tejido enfermo. Cerebro con Alzheimer Cerebro sano CAG EMEAI | Agilent Restricted | Page 39 Estudio de Tejidos Biológicos (II) Investigación de la Enfermedad del Alzheimer Ejemplo del estudio del tejido cerebral del hipocampo de un ratón. - Se recogen aproximadamente 100.000 espectros a alta resolución espacial (5.5 mm) de una sección de un tejido de 1.4 mm x 2.2 mm. En la imagen en 3-D se observan la distribución en el contenido en lípidos, basándose en la absorbancia a 1734 cm-1 (correspondiente a grupos C=O) Esta tecnología permite estudiar la composición química de tejidos cerebrales y el desarrollo de placas asociadas a la enfermedad de Alzheimer. En los espectros IR se observa la diferencia en lípidos que contiene la materia gris y la materia blanca basado en los cambios de los grupos CH2 y CH3. CAG EMEAI | Agilent Restricted | Page 40 ESPECTROFOTOMETRIA UV.VIS: •Consideraciones Generales •Tipos de Espectrofotómetros según esquema óptico Cary60 Cary 7000 UMS CAG EMEAI | Agilent Restricted | Page 41 Espectre UV-Vis 10 100 200 300 400 500 600 Red Orange Yellow Green Blue Violet Near UV 10 - 200 nm 200 - 380 nm 380 - 780 nm 780 - 3200 nm Far UV Far UV Near UV Visible Near IR 700 800 Wavelength (nm) Los espectrofotómetros UV-VIS, suelen estar en el rango de 190 a 900 nm CAG EMEAI | Agilent Restricted | Page 42 Tipos de Espectrofotómetros MonoHaz Pseudo doble Haz Detector referencia Beams plitter CARY 60 CAG EMEAI | Agilent Restricted | Page 43 Espectofotómetro doble haz real 100% Light Monochromator Reference Source lamps Chopper como Beamsplitter El chopper es un disco rotatorio que modula la intensidad y permite q la luz vaya a la muestra y a la referencia casi simultaneamente 100% Light Detector (PMT) Sample Agilent Cary 100,300,4000,5000, 6000i,7000 UMS CAG EMEAI | Agilent Restricted | Page 44 Espectofotómetre Diode Array Source lamps Sample Diode-Array-Detector (or CCD detector) Agilent 8453 CAG EMEAI | Agilent Restricted | Page 45 CARY 60 Lámpara de Xenon No se requieren Cubetas Haz Focalizado, análisis de muestras muy pequeñas Adquisición de datos muy rápida. 24,000 nm/min; 80 puntos/sec CAG EMEAI | Agilent Restricted | Page 46 LAMPARA PULSANTE DE XENON •UNA SOLA LÁMPARA para todo el rango UV-Vis: 190-1100 nm. •Funciona a PULSOS: se enciende sólo en el momento de hacer la medida •Protege a las muestras de posible fotodegradación •. Ausencia de fotodegradación o marcadores colorimétricos (azul de metileno, 664 nm) •Largo tiempo de vida (bajo coste de mantenimiento). •No requiere calentamiento previo. •ALTA INTENSIDAD: •Inmune a luz ambiente (facilidad de uso, no hay restricción en el tamaño de muestras) •HAZ DE LUZ MUY FOCALIZADO, adecuado para: • Microvolúmenes (hasta 5 ul en cubeta). • Tray cell • Sondas de fibra óptica. CAG EMEAI | Agilent Restricted | Page 47 Accessorios Cary 60 CAG EMEAI | Agilent Restricted | Page 48 FIBRA OPTICAS No requiere cubetas . Evita aparicion de burbujas, derrame de muestras Mejora el flujo de trabajo llevando el instrumento a la muestra Medida de muestras frías, calientes o con formas irregulares -Cinéticas en medios complejos -Mínima pérdida de sensibilidad -Sin mantenimiento -Amplia gama de fibras disponible -Máxima productividad Mejora el flujo de trabajo y minimiza al preparación de muestra Mide muestras a baja temperatura directamente del frigorífico! CAG EMEAI | Agilent Restricted | Page 49 APLICACIONES MEDIDAS EN DISOLUCIÓN ONLINE CINÉTICAS MEDIDAS VOLUMENES PEQUEÑOS,DNA/RNA MEDIDAS DE MUESTRAS SÓLIDAS CAG EMEAI | Agilent Restricted | Page 50 Cary 7000 UMS Modos de Medida 6 Modes 1 System Perform all these measurements on the Cary 7000 UMS CAG EMEAI | Agilent Restricted | Page 51
