pract.1 al apendice C compteto.

MICROBIOLOGIA APLICADA
Manual de Laboratorio
PRACTICA Núm. 20
DETERMINACION DE CLOSTRIDIOS SULFITO REDUCTORES EN AGUA
I. OBJETIVO
Determinar la presencia de Clostridios sulfito reductores en agua por el método de
recuento en tubo.
II. INTRODUCCION
Los procedimientos bacteriológicos de rutina en el análisis de agua incluyen la
determinación de Clostridios sulfito reductores.
Se consideran Clostridios sulfito reductores aquellas bacterias de morfología
bacilar, Gram positivas, anaerobias estrictas, capaces de formar esporas y con
actividad sulfito reductora.
La determinación de éstos se basa en el recuento del número de colonias de
esporas con capacidad sulfito-reductora, desarrolladas en un medio específico,
incubadas en condiciones anaeróbicas durante un tiempo y a una temperatura
determinada.
III. MATERIAL Y SUBSTANCIAS
− 1 Muestra de agua (100 mL), ya sea de consumo “clorada”, "natural limpia" ó
"residual", por cada equipo.
− 4 Tubos de 18 x 159 mm estériles.
− Baño de agua con temperatura constante a 50 °C.
− Baño de agua con temperatura constante a 80 °C
− 4 Tubos de 20 x 200 mm conteniendo cada uno 15 mL de agar sulfitopolimixina-sulfadiazina (SPS) aun fundido, manteniéndolos en un baño de agua
a 50 °C con el objeto de que permanezcan a esa temperatura y al mismo
tiempo para eliminar el aire. (Apéndice A), (Fig. 20.1)
− 3 Pipetas de 10 mL estériles.
− Gradillas para tubos de 18 x 150 mm y de 20 x 200 mm.
− Mechero Bunsen.
− Cerillos ó encendedor.
− Parafina ó vaselina estéril.
135
MICROBIOLOGIA APLICADA
Manual de Laboratorio
IV. TECNICA
1. Agitar vigorosamente la muestra para homogeneizar.
2. A partir de la muestra previamente homogeneizada tomar alícuotas de 10 mL
con una pipeta estéril y depositarlas en cada uno de los tubos estériles.
3. Una vez que estos tubos contienen los 10 mL de agua, mantenerlos en un
baño de agua a 80 °C durante 5 minutos a efecto de que se destruyan las
formas vegetativas y permanezcan solamente las formas esporuladas. (Fig.
20.1)
4. Tomar los tubos con SPS agar a 50 °C y proceder a su inoculación profunda,
de la siguiente manera:
•
Con una pipeta estéril tomar 5 mL de dicha agua e introducirla hasta el fondo
del tubo que contiene el agar.
•
Con mucho cuidado se va depositando el agua a lo largo de todo el tubo
desplazando la pipeta al exterior procurando que el total de la muestra quede
en el agar y no se airee.
•
Rápidamente pasar el tubo a la llave del agua para enfriarlo.
•
Después añadir una capa de vaselina ó parafina estéril de unos 3 mm de
espesor para conseguir condiciones de anaerobiosis.
•
Este procedimiento se repite con los 3 tubos restantes.
•
Es aconsejable rotular cada tubo convenientemente.
NOTA:
Si se sospecha que el agua está muy contaminada, se puede inocular 5 mL de
muestra en un tubo y 5 mL de las diluciones 10-1, 10-2..........
5. Una vez inoculados todos los tubos, incubar a 37°C (±1°C) durante 24 h (±2 h).
6. Transcurrido el período de incubación, contar las colonias de color negro que
aparezcan en la totalidad de los cuatro tubos inoculados. (Fig. 20.2)
136
MICROBIOLOGIA APLICADA
Manual de Laboratorio
CALCULOS Y PRESENTACION DE RESULTADOS:
Efectuado el recuento en los tubos correspondientes, el resultado obtenido se
calculará de la siguiente manera:
- Si se han sembrado 20 mL de muestra, el resultado es directo.
- En caso de haber realizado diluciones, se aplica la siguiente fórmula:
Número de esporas de clostridios sulfito-reductores/20 mL =
(Número de colonias/volumen real de la muestra inoculada en mL) x 20.
LOS RESULTADOS SE EXPRESARAN ASI:
Número de esporas de clostridios sulfito-reductores: ____/20 mL.
EJEMPLOS:
a) Los resultados obtenidos en la determinación, en agua, de esporas de
clostridios sulfito-reductores son los que se especifican a continuación:
Volumen de muestra inoculada
(mL)
Tubo
Número de colonias
5
5
5
5
1
2
3
4
5
3
2
4
Número total de colonias: 5 + 3 + 2 + 4 = 14
Volumen total de muestra inoculada = 20 mL.
El resultado es directo y por tanto se expresará:
Número de esporas de clostridios sulfito-reductores: 14/20 mL.
b) En el análisis de una muestra de agua fue necesario efectuar diluciones para la
determinación de esporas de clostridios sulfito-reductores, obteniendo los
siguientes resultados:
137
MICROBIOLOGIA APLICADA
Manual de Laboratorio
Volumen de muestra inoculada
(mL)
Tubo
Número de colonias
5
0.5
0.05
0.005
1
2
3
4
Incontables
13
7
0
Los tubos en los cuales se ha realizado el recuento de colonias son los números 2
y 3, por tanto:
§
Número total de colonias: 13 + 7 = 20
Suma de los volúmenes de muestra inoculados: 0.5 + 0.05 = 0.55
§
Se aplica la fórmula general:
(20 colonias/0.55 mL) x 20 = 727
§
El resultado se expresará:
Número de esporas de Clostridios sulfito-reductores: 727/20 mL.
V. CUESTIONARIO
1. ¿Por qué las colonias de clostridios sulfito reductores son de color negro en el
agar SPS?
2. ¿A qué se debe la posible presencia de Clostridios sulfito reductores en agua?
3. ¿En qué otro medio se pueden encontrar difundidos los Clostridios?
4. ¿A qué se atribuye la patogenicidad de los Clostridios?
5. Mencionar 5 especies de Clostridios.
138
MICROBIOLOGIA APLICADA
Manual de Laboratorio
139
MICROBIOLOGIA APLICADA
Manual de Laboratorio
140