pastorextm meningitis - Bio-Rad

PASTOREXTM MENINGITIS
25 ensayos
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61610
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61614
61616
61618
61717
DETECCIÓN DE ANTÍGENOS SOLUBLES E IDENTIFICACIÓN
DE NEISSERIA MENINGITIDIS A, C, Y/W135, B/E.COLI K1,
HAEMOPHILUS INFLUENZAE b, STREPTOCOCCUS
PNEUMONIAE, STREPTOCOCCUS B
1- VALOR CLÍNICO
La meningitis bacteriana es una infección de las meninges y los principales
organismos causantes son: Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae,
Haemophilus influenzae tipo b, y Streptococcus grupo B. La meningitis es una
enfermedad grave, por lo que es importante diagnosticar rápidamente la
infección a fin de iniciar el tratamiento indicado. La técnica clásica de
identificación mediante cultivo, aunque esencial para el antibiograma y la
confirmación del diagnóstico, es lenta y puede dar resultados falsos negativos
si el espécimen ha sido transportado y conservado en condiciones
inadecuadas, o si se ha iniciado una terapia antibiótica antes de la recogida de
muestra. Las técnicas inmunológicas para detectar antígenos solubles
liberados por los organismos causantes en los líquidos biológicos, como el
líquido cefalorraquídeo, la orina, el suero, durante la infección, permiten un
diagnóstico más rápido. Los antígenos solubles que pueden detectarse con
este kit son los polisacáridos específicos para determinados serogrupos o
serotipos: Streptococcus pneumoniae (83 tipos); Haemophilus influenzae tipo
B, Neisseria meningitidis grupo A, grupo B / E. coli K1, grupo C, grupo
Y/W135, y Streptococcus grupo B. El antígeno polisacárido específico para el
Meningococcus serogrupo B es muy poco antigénico y siempre ha sido muy
difícil obtener anticuerpos de conejo reproducibles específicamente dirigidos
contra este antígeno. La tecnología de anticuerpos monoclonales aplicada a la
preparación de antígenos polisacáridos bacterianos específicos permite
producir anticuerpos monoclonales de ratón capaces de reconocer de forma
específica y reproducible el antígeno polisacárido del Meningococcus
serogrupo B. Este antígeno polisacárido específico para el Meningococcus
serogrupo B es idéntico a un antígeno polisacárido encontrado con E. coli K1.
Esta homología antigénica entre el Meningococcus B y el E. coli K1 permite
diagnosticar los casos de meningitis por E. coli en neonatos, un 80 % de los
cuales son de la cepa K1. Debe subrayarse que E. coli y el Streptococcus B
son las principales bacterias responsables de la meningitis en los neonatos y
bebés prematuros, y que la infección meningocócica es extremadamente rara
en este segmento de edad.
2- PRINCIPIO
El antígeno contenido en el espécimen comprobado se identifica utilizando
partículas de látex recubiertas con anticuerpos homólogos específicos. En
presencia del antígeno homólogo, las partículas de látex se aglutinan. En
ausencia del antígeno, permanecen en una suspensión homogénea.
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3- PRESENTACIÓN
1. PASTOREXTM MENINGITIS kit de 25 ensayos, código 61607, formado
por:
• Reactivo 1 (R1): N. meningitidis B/E.coli K1
1 botella con 0,40 ml de látex rojo sensibilizado con anticuerpo monoclonal
murino específico para N. meningitidis grupo B/E.coli K1.
• Reactivo 2 (R2): control negativo para N. meningitidis B/E.coli K1
1 botella con 0,40 ml de látex rojo sensibilizado con anticuerpo monoclonal
murino específico para toxoide tetánico.
• Reactivo 3 (R3): H. influenzae b
1 botella con 0,40 ml de látex blanco sensibilizado con anticuerpos de
conejo específicos para H. influenzae type b.
• Reactivo 4 (R4): S. pneumoniae
1 botella con 0,40 ml de látex verde sensibilizado con anticuerpos de
conejo específicos para S. pneumoniae.
• Reactivo 5 (R5): Streptococcus B
1 botella con 0,40 ml de látex amarillo sensibilizado con anticuerpos de
conejo específicos para Streptococcus B.
• Reactivo 6 (R6): N. meningitidis A
1 botella con 0,40 ml de látex azul sensibilizado con anticuerpos de conejo
específicos para N. meningitidis grupo A.
• Reactivo 7 (R7): N. meningitidis C
1 botella con 0,40 ml de látex rojo sensibilizado con anticuerpos de conejo
específicos para N. meningitidis grupo C.
• Reactivo 8 (R8): N. meningitidis Y/W 135
1 botella con 0,40 ml de látex rosa sensibilizado con anticuerpos de conejo
específicos para N. meningitidis Y/W 135
• Reactivo 9 (R9): Control polivalente negativo
1 botella con 0,40 ml de látex ciruela sensibilizado con inmunoglobulinas
IgG de conejo no inmunizado.
• Reactivo 10 (R10): Control polivalente positivo
Control positivo: extracto antigénico liofilizado para reconstituir con 1 ml de
agua estéril. Contiene los antígenos polisacáridos de N. meningitidis A, C,
B, Y/W135, H.influenzae b, Streptococcus B, y S.pneumoniae. Volumen
suficiente para 20 reacciones.
Todos los reactivos contienen timerosal al 0,02 %.
Los reactivos R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, y R9 contienen menos de 0,1%
de azida sódica.
• Tarjetas de aglutinación desechables.
• Bastoncillos desechables.
29
2. PASTOREX TM MENINGITIS ENSAYOS EN LÁTEX INDIVIDUALES
(25 ensayos cada uno):
• Ensayo simple en látex (sin control)
- N. meningitidis A (R6)
- N. meningitidis C (R7)
- N. meningitidis B / E. coli K1 (R1)
- Streptococcus B (R5)
- Streptococcus pneumoniae ( R4)
- Haemophilus influenzae b (R3)
código 61608
código 61610
código 61611
código 61613
código 61614
código 61616
• Control PASTOREXTM Meningitis
Kit de reactivos control para ensayo simple en látex (para 2 x 25 ensayos)
código 61618
- 2 botellas cuentagotas con 0,40 ml de control polivalente negativo (R9)
- 2 botellas de control polivalente positivo liofilizado (R10) para reconstituir con
- 1 ml de agua estéril.
- 2 botellas cuentagotas con 0,40 ml de control negativo para N.m.B / E.coli
K1 (R2)
- tarjetas desechables.
- bastoncillos desechables.
3. Diluyente PastorexTM Meningitis
1 botella con 40 ml de diluyente para tratamiento con suero
código 61717
4- ALMACENAMIENTO
Todos los reactivos son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la
etiqueta, si se conservan a una temperatura de entre 2 y 8º C y en ausencia de
contaminación microbiana (incluso una vez abierto). El control positivo
polivalente reconstituido (R10) es estable durante 1 mes a 2 – 8º C (en
ausencia de contaminación microbiana) o más si se toma la alícuota y se
congela a –20º C inmediatamente.
Conserve las botellas de reactivo de látex en posición erguida.
NO DEBEN CONGELARSE LOS REACTIVOS DE LÁTEX
5- MATERIAL NECESARIO NO SUMINISTRADO
•
•
•
•
•
•
30
Pipeta para distribuir una gota (de 40 a 50 µl) del espécimen.
Tubos de hemólisis o Eppendorf
Incubador en seco o baño de agua a 100º C.
Centrífuga para tubos de hemólisis o Eppendorf
Baño desinfectante
Agua destilada estéril, estéril salina o diluyente (código 61717)
6- PRECAUCIONES
La calidad de los resultados depende de observar estrictamente las Buenas
Prácticas de Laboratorio (GLP).
• Todos los reactivos y la muestra deben utilizarse a una temperatura
ambiente entre 18 y 25°C.
• No toque la superficie de reacción de las tarjetas de aglutinación.
• Cambie la pipeta o la punta desechable para cada muestra comprobada.
• Agite las botellas de látex antes de su uso
• Limpie la punta del frasco cuentagotas del reactivo a fin de obtenergotas
bien calibradas.
• Mantenga la botella de reactivo en posición vertical para depositar lasgotas.
• Cambie la varilla de mezclado para cada reacción
• Introduzca todos los materiales desechables utilizados en un recipientepara
residuos que pueda someterse a autoclave o en un baño dedesinfectante.
• El control positivo polivalente debe reconstituirse con agua estérildestilada
evitando toda contaminación.
INSTRUCCIONES DE HIGIENE Y SEGURIDAD
Respete siempre las técnicas y precauciones establecidas relativas a la
protección contra riesgos microbiológicos.
• Todas las mezclas tomadas deben ser consideradas como potencialmente
infecciosas.
7- PROCEDIMIENTO: LCR, suero, orina
Muestras
Las muestras deben procesarse tan pronto como sea posible después de su
recogida. Si esto es imposible, se pueden almacenar durante algunas horas
entre +2 y +8°C, o más tiempo a -20°C (En este caso, mantenga sólo el
sobrenadante a –20°C después de la centrifugación). Evite repetidas
congelaciones / descongelaciones. Se deben realizar con prioridad exámenes
bacteriológicos (cultivos) para evitar la contaminación de la muestra. El mínimo
volumen de muestra para el ensayo con el kit de látex es 0,5 ml.
A) PREPARACION DE MUESTRAS CLINICAS.
PRECAUCIÓN : si utiliza un baño maría, use tubos herméticos para impedir
que el agua penetre en los tubos. Utilice un incubador seco si es posible.
a) LCR (Líquido cefalorraquídeo)
Si el LCR es muy turbio o contiene células rojas de la sangre, centrifúguelo
durante 5 minutos a 350 g y recoja el sobrenadante.
31
• Caliente la muestra durante 3 minutos a 100°C (incubador seco o baño
maría). Permita que la muestra se enfríe a la temperatura ambiente y
entonces realice una centrifugación durante 5 minutos a 3.000 g o un
filtrado utilizando un filtro con un tamaño de 0,45 µm.
b) SUERO
• Añada 3 volúmenes (1,5 ml) de diluyente (código 61717) por un volumen
(0,5 ml) de suero.
• Caliente durante 3 minutos a 100°C en un baño maría o incubador seco.
• Centrifugue durante 5 minutos a 3.000 g.
PRECAUCIÓN : No use muestras de plasma. No se ha ensayado la
interferencia debida a sobrecarga de albúmina, lípido, hemoglobina y
bilirrubina. Los mejores resultados se obtienen usando suero fresco.
c) ORINA
Para aumentar la concentración de antígeno, antes del ensayo, se puede
concentrar la muestra hasta 25 veces en una membrana tipo Amicon B15
(Amicon France).
• Calentar la orina durante 3 minutos a 100°C (incubador seco o baño maría).
• Centrifugar durante 5 minutos a 3.000 g o filtre utilizando un filtro de 0,45
µm.
• Testar el sobrenadante con el LCR tratado con calor. (Cf. 7 – A)
B) PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA
• Coloque una gota (de 40 a 50 µl) del sobrenadante de muestra pretratado
en cada círculo de la tarjeta de aglutinación
• Agite suavemente los frascos de reactivo de látex.
• Sujetando el frasco en posición vertical, coloque una gota de cada reactivo
de látex en la tarjeta desechable siguiendo el modelo de distribución
indicado: R9, R6, R7, R1 y R2 en los círculos blancos, y R8, R3, R4 y R5 en
los círculos negros.
• Mezcle los reactivos de látex y la muestra usando una varilla; use una varilla
diferente para cada látex.
• Gire la tarjeta (~120 rpm) con cuidado durante 10 minutos y esté atento a la
aparición de aglutinación visible a simple vista en un plazo máximo de
10 minutos (se puede usar un agitador orbital a una velocidad de ~120
rpm).
8- PROCEDIMIENTO: HEMOCULTIVO
Para una orientación supuesta, compruebe la morfología y la tinción de Gram.
• Tome de 1 a 2 ml de un hemocultivo positivo.
• Centrifugue durante 5 minutos a 2000g.
32
• Coloque una gota (de 40 a 50 µl) de sobrenadante en cada círculo de la
tarjeta desechable, que deben corresponderse con los reactivos de látex
sometidos a prueba, según la tinción de Gram.
• Agite suavemente los frascos de reactivo de látex seleccionados para la
prueba.
• Sujetando el frasco en posición vertical, coloque una gota de cada reactivo
de látex seleccionado en la parte exterior de las gotas de sobrenadante.
• Mezcle los reactivos de látex y la muestra usando una varilla; use una varilla
diferente para cada látex.
• Gire la tarjeta a ~120 rpm durante 5 minutos. Durante este período de
5 minutos, compruebe si aparece aglutinación.
Algunos medios de hemocultivo pueden presentar reacciones inespecíficas o
problemas de interpretación. Como control negativo, use un hemocultivo
inoculado con sangre estéril o con un microorganismo diferente a los
detectados por PASTOREX™ Meningitis.
9- INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
REACCIÓN POSITIVA
Una reacción positiva es indicada por una aglutinación fina que se puede
observar a simple vista, en comparación con los controles negativos.
La intensidad de la aglutinación y el tiempo de aparición dependen de la
concentración de antígeno en la muestra sometida a prueba.
Una discordancia entre una prueba de antígeno positiva y un cultivo negativo
se puede explicar por la ausencia de bacterias viables en la muestra del
cultivo (tratamiento antibiótico iniciado antes de que se haya obtenido la
muestra o condiciones de transporte no adecuadas para la supervivencia de
bacterias frágiles).
En la mayor parte de los casos, una reacción positiva con látex antiN. meningitidis B/E. coli K1 en un recién nacido o un lactante prematuro indica
infección por E. coli K1. En un individuo de más edad, es más probable que se
trate de Meningococo B. El cultivo de la muestra debe confirmar el
diagnóstico.
REACCIÓN NEGATIVA
Suspensión homogénea, sin aglutinaciones.
RESULTADOS NO INTERPRETABLES
Una reacción es ininterpretable si la muestra se aglutina con los controles
negativos de látex (R2 o R9) o con más de un reactivo de látex del kit. En este
caso, es aconsejable repetir la prueba con otra muestra y esperar al resultado
del cultivo. (Muy raras veces, una infección puede deberse a dos especies de
bacterias diferentes).
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10- PROCEDIMIENTO: AGRUPAMIENTO DE CEPAS BACTERIANAS
AISLADAS EN AGAR (colonias de un cultivo reciente y puro)
No se puede usar látex Y/W135 para este agrupamiento de cepas de
bacterias. Para determinar estos grupos, se recomienda usar antisueros
convencionales (Kit Y, W135, 29E: Ref # 58704, 3 x 1ml)
Para una orientación provisional antes de realizar la prueba:
• Compruebe la morfología y la tinción de Gram.
• Para bacterias gramnegativas, haga la prueba de oxidasa (positiva para
N. meningitidis, negativa para E. coli K1).
• Para cocos grampositivos, realice una prueba de catalasa. (No realice
pruebas en cepas positivas para catalasa).
Cepas de S. pneumonia y Haemophilus influenzae no encapsuladas no
pueden ser identificadas mediante esta técnica.
a) Agrupamiento: N. meningitidis (A, B y C solamente), H. influenzae, E. coli,
S. pneumoniae
• Coloque una gota de 30 µl de solución salina estéril en un círculo de la
tarjeta desechable.
• Muestra:
- Para Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae y Escherichia coli, el
equivalente a un asa de 1 µl, que es un máximo de 2 a 3 colonias.
- Para Streptococcus pneumoniae, el equivalente a un asa de 5 µl, que es
un mínimo de 10 a 12 colonias.
• Emulsione con cuidado las colonias de la muestra de tal forma que se
obtenga una suspensión homogénea.
• Agite suavemente el frasco de reactivo de látex elegido para la
identificación; sujetando el frasco en posición vertical, coloque una gota de
este látex en la parte exterior de la gota de suspensión bacteriana.
• Mezcle el látex y la suspensión usando una varilla.
• Gire la tarjeta a (~120 rpm).
• Observe la aparición de cualquier aglutinación clara en menos de
2 minutos,
• Confirme la identificación de las especies usando pruebas bioquímicas
convencionales.
b) Agrupamiento: Estreptococo B (colonias ß-hemolíticas)
• Suspenda 5 colonias en 2 ml de caldo de Todd Hewitt.
• Incube en baño maría a 37ºC durante entre 2 y 3 horas.
• Centrifugue durante 5 minutos a 3.000 g.
• Coloque una gota (de 40 a 50 µl) de sobrenadante en un círculo de la tarjeta
desechable.
34
• Agite suavemente el frasco de reactivo de látex; sujetando el frasco en
posición vertical, coloque una gota de este látex en la parte exterior de la
gota de reactivo.
• Mezcle el látex y la muestra usando una varilla.
• Gire la tarjeta (~120 rpm).
• Observe la aparición de cualquier aglutinación clara en menos de 1 minuto,
• Confirme la identificación de las especies usando pruebas bioquímicas
convencionales.
Para una extracción directa desde colonias aisladas, use el kit PASTOREX™
STREP (Código 61721)
11- CONTROL DE CALIDAD DE LA PRUEBA
Los reactivos de látex deben ser totalmente homogéneos después de
agitarlos.
El control polivalente positivo R10 se usa para verificar la inmunorreactividad
de cada látex.
• Para realizar esta prueba de control de calidad, coloque una gota (40 µl) del
control positivo (R10) en cada círculo de la tarjeta desechable.
• Agite suavemente los frascos de reactivo de látex.
• Sujetando el frasco en posición vertical, coloque una gota de cada reactivo
de látex en la tarjeta desechable siguiendo el modelo de distribución
indicado: R9, R6, R7, R1 y R2 en los círculos blancos, y R8, R3, R4 y R5 en
los círculos negros.
• Mezcle los reactivos de látex y el control positivo usando una varilla; use
una varilla diferente para cada látex.
• Gire la tarjeta a ~120 rpm durante 10 minutos. Durante este período de
10 minutos, compruebe si aparece aglutinación observando a simple vista
(compare las reacciones del látex de prueba con las reacciones de los
controles negativos de látex).
La intensidad de la aglutinación y la velocidad de aparición dependen de la
avidez de los anticuerpos/antígenos. Por lo tanto, las reacciones observadas
con cada látex son variables. Las del látex NmB/Coli K1 son más sutiles que
las de los otros.
• Una solución salina o el diluyente (código 61717) controla la ausencia de
aglutinación inespecífica en cada látex.
Para realizar esta prueba de control de calidad, se usa solución fisiológica o
diluyente R11 (código 61717) según el protocolo para el control positivo
polivalente (cf. el procedimiento anterior).
• Los reactivos de látex no deben usarse cuando no se aglutinan con control
positivo polivalente (R10) o cuando se aglutinan inespecíficamente con
solución salina o diluyente (código 61717) (esto podría deberse a unas
condiciones de conservación incorrectas del kit o a la contaminación del
reactivo de látex).
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12- CONTROL DE CALIDAD DEL FABRICANTE
Todos los reactivos fabricados se elaboran conforme a nuestro sistema de
calidad, que se extiende desde el momento de recepción de las materias
primas hasta la comercialización del producto. Cada lote se somete a
exámenes de control de calidad y únicamente se autoriza su introducción en
el mercado tras cumplir los criterios de aceptación predefinidos. Bio-Rad
conserva los expedientes relativos a la producción y el control de cada uno de
los lotes.
13- RENDIMIENTO DEL ENSAYO
SENSIBILIDAD
La sensibilidad de cada reactivo del kit se determinó mediante análisis de:
• antígenos purificados diluidos en solución salina
• muestras clínicas de fluido cerebroespinal documentadas mediante las
técnicas convencionales de análisis (cultivo, examen microscópico)
• cepas aisladas del cultivo sobre agar Mueller Hinton, agar chocolate + PVS,
agar Columbia + sangre de cordero al 5% .
Antígenos o bacterias
reveladas en la muestra
Antígenos
diluido
(NaCl, 9 ‰)
LCR
Cepas
Concentración
límite detectada
Número de
muestras
analizadas
Número de
pruebas de
látex
positivas
Número de
muestras
analizadas
Número de
pruebas de
látex
positivas
N. meningitidis A
2,5 ng/mL
12
12
22
22
N. meningitidis B
62,5 ng/mL
10
10
1
1
16
16
-
-
ND
E. coli K1
N. meningitidis C
2,5 ng/mL
N. meningitidis Y
5 ng/mL
N. meningitidis W
2,5 µg/mL
-
-
S. pneumoniae
95 ng/mL
24
22
15
15
Streptococcus B
20 ng/mL
1
1
15
15
H. influenzae type b
0,1 ng/mL
34
33
17
17
36
3
3
ND
ND
ESPECIFICIDAD
La especificidad de cada reactivo se determinó mediante análisis de:
• LCR estéril (a) o LCR contaminado por bacterias responsables de
meningitis y diferentes a las detectadas por el ensayo de látex (b)
• Cepas pertenecientes a los géneros Neisseria, Branhamella, Moraxella,
Acinetobacter, Kingella, Klebsiella, Streptococcus, Haemophilus ensayadas
con látex heterólogo.
Latex test
LCR estéril (a)
LCR contaminado (b)
Cepas (c)
Número de Número de Número de Número de Número de
Número de
muestras
pruebas de
muestras
pruebas de
muestras pruebas de látex
analizadas látex negativas analizadas látex negativas analizadas
negativas
N. meningitidis A
52
52
50
N. m. B / E. coli K1
25
25
N. meningitidis C
52
52
56
S. pneumoniae
60
60
Streptococcus B
49
H. influenzae type b
61
50
122
122
41
40*
56
127
127
39
39
33
33
49
58
58
17
17
61
32
32
31
31
-
-
ND
LCR no seleccionado
N. meningitidis
Y/W 135
Número de muestras
analizadas
Número de pruebas de látex
negativas
40
40
*1 cepa de Klebsiella pneumoniae dio una reacción no específica.
CULTIVOS DE SANGRE
Los rendimientos de PASTOREXTM MENINGITIS se han ensayado en cultivos
de sangre. Los resultados de esta evaluación son:
• Sensibilidad: 100 % (4/4 incluyendo 2 cepas de S. pneumoniae y 2 cepas
de Streptococcus B).
• Especificidad: 100 % (37/37). Para los reactivos R3, R4, R5, R6, R7 y R8.
• Especificidad: 98,2% (54*/55). Para el reactivo R1. *Entre las 19 cepas de
estafilococos coagulasa-negativas ensayadas, 1 cepa dio una reacción no
específica, resultado no confirmado en la cepa ensayada a partir de
subcultivo en agar tras el procedimiento de agrupación.
37
14- LÍMITES DE LA TÉCNICA
• En numerosos casos, la técnica inmunológica de látex permite un
diagnóstico preliminar del organismo. Sin embargo, la concentración de
antígeno en la muestra puede quedar por debajo del límite inferior de
detección del látex y producir un resultado negativo. Puede ser útil en este
caso repetir la muestra posteriormente.
• Esta técnica no puede sustituir el cultivo de las bacterias, lo que por sí solo
permite establecer un resultado de susceptibilidad antimicrobiana.
• Considerando la amplia variedad de medios de cultivo de sangre, no se
pueden garantizar rendimientos en todos los medios. (Cf. 7-D).
• Los datos clínicos y bibliográficos relativos a la detección de antígenos en
sueros y orina usando reactivos de látex son limitados en la actualidad.
• Se ha informado de algunos ejemplos de bacterias no relacionadas que
tienen antígenos similares. La posibilidad de reacciones cruzadas debe
tenerse en cuenta siempre (1, 4, 5).
• Las diagnosis finales, como para todas las diagnosis de laboratorio, no se
pueden basar en los resultados de un único ensayo, sino en una visión
general de los datos clínicos y los resultados bioquímicos, citológicos e
inmunológicos.
• La detección de antígeno soluble en cultivo de sangre, así como el
agrupamiento de cepas aisladas sobre agar, debe completarse mediante
una identificación de las especies de la cepa bacteriana.
38
15- RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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Antibiotic Resistance in Spain : Update (1990 to 1996). J. Clin.
Microbiol.,1998, 36, 3447-3454
26
98
99
Bio-Rad
3, boulevard Raymond Poincaré
92430 Marnes-la-Coquette France
Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00
Fax.: +33 (0) 1 47 41 91 33
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