“Uso de un hidrolizado de cáscaras de naranja

Universidad Veracruzana
Facultad de Ciencias Químicas
Ingeniería Ambiental
“Uso de un hidrolizado de cáscaras de naranja-toronja
y dos cepas de levadura para la obtención de
bioetanol”
Tesis
Que para acreditar la Experiencia Recepcional
Presenta:
Marina Guadalupe Moheno de la Cruz
Directora:
M.C. Yolanda Cocotle Ronzón
Dedicatoria:
Este trabajo no es el fruto de mi propio esfuerzo, los corazones de las personas
más importantes de mi vida, palpitaron incesantes, esperando que este momento
llegara.
A la primera persona que creyó en mí, que me cuidó y que estuvo conmigo hasta
el último día de su vida mi papá Tomás Moheno Alor.
A mi padre, Lázaro Moheno Velázquez, porque sin su ejemplo yo no podría ser
quien soy. Por la infinita confianza que ha depositado en mí y sobre todo por el
amor que sentimos.
A mi madre, Regina de la Cruz Álvarez, por ser mi fortaleza en los momentos de
desesperación. Porque aunque estamos lejos, siempre te siento cerca, por ser la
mujer que yo un día seré.
A mi mamá Agustina Velázquez Gallegos, por enseñarme a ser terca y por todo
el apoyo que me ha brindado desde que inicié este sueño.
A mis hermanos Tomás y Abigail, por los momentos que hemos vivido juntos,
porque son un pedazo de mi alma.
Agradecimientos
A la M.C. Yolanda Cocotle Ronzón, por guiarme en este proyecto, por su apoya
y gran paciencia para conmigo.
A todos mis tíos que siempre estuvieron al pendiente de mí, por sus consejos y
buenos deseos, en especial a mi tío Carmen Moheno Velázquez y a su familia por
abrirme las puertas de su casa todos estos años.
Al Dr. Ernesto Juárez Loera
Al M. I. Cuitláhuac García Jiménez
Al Mtro. Francisco. E. Hernández Ortiz
Este trabajo se realizó en el Laboratorio No. 34 “Proyectos e Investigación”,
Facultad de Ciencias Químicas, de la Universidad Veracruzana campus Xalapa en
colaboración con en el laboratorio de Bioingeniería de la Unidad de Investigación y
Desarrollo en Alimentos (UNIDA) del Instituto Tecnológico de Veracruz.
Resumen
El procesamiento de los frutos cítricos genera anualmente millones de toneladas
de residuos, los cuales son vendidos a bajos precios como alimento animal o son
vertidos causando severos problemas de contaminación. El hidrolizado obtenido
de este material lignocelulósico puede ser utilizado como un medio de
fermentación para la producción biotecnológica de etanol. En este trabajo se
realizó un estudio preliminar con el objetivo de establecer un proceso para la
obtención de etanol a partir de un hidrolizado ácido de cáscaras de naranja (Citrus
sinensis) y toronja (Citrus paradisi) y dos levaduras: Candida tropicalis y Pichia
stipitis, las cuales son capaces de fermentar xilosa, el carbohidrato más abundante
en el hidrolizado. Se llevaron a cabo fermentaciones en lote de 48 horas en
matraces de 125 mL conteniendo 50 mL de medio de fermentación los cuales
fueron inoculados con las cepas de las levaduras activadas de manera individual o
en cocultivo, en una relación de 106 células /mL. Se incubaron a 30°C, en agitación
constante a 200 rpm y se tomo una muestra cada ocho horas para determinar por
HPLC los g/L de etanol, xilosa, xilitol, ácido acético y glucosa. También se hizo un
seguimiento del pH en el medio de fermentación. Los resultados obtenidos
sugieren que el cocultivo es la mejor opción para la obtención del bioetanol ya que
se obtuvo una mayor eficiencia de bioconversión cuando se compara con la
obtenida con las levaduras probadas por separado.
Índice
1. INTRODUCCIÓN .............................................................................................. 1
2. MARCO TEÓRICO .............................................................................................. 3
2.1 Biocombustibles ............................................................................................. 3
2.1.2 Biocombustibles líquidos ............................................................................. 5
2.1. 3 Panorama mundial de los biocombustibles ................................................ 7
2.2 Bioetanol ........................................................................................................ 8
2.2.1 Bioetanol de primera generación ................................................................ 9
2.2.2 Bioetanol de segunda generación ............................................................... 9
2.2.3 Bioetanol de tercera generación ............................................................... 11
2.3 Producción de bioetanol de segunda generación ....................................... 11
2.3.1 Usos del etanol como biocarburante ........................................................ 12
2.4 Materias primas para la obtención de bioetanol ........................................... 13
2.4.1 Materiales ricos en azúcares..................................................................... 13
2.4.2 Materiales amiláceos ................................................................................ 14
2.4.3 Materiales lignocelulósicos ....................................................................... 14
2.5 Pretratamiento de biomasa lignocelulósica .................................................. 15
2.5.1 Hidrolisis ácida .......................................................................................... 16
2.6 Fermentación ............................................................................................... 17
2.7 Microorganismos utilizados ............................................................................. 19
2.7.1 Pichia stipitis ............................................................................................. 22
2.7.2 Candida Tropicalis .................................................................................... 25
2.7.3 Fermentación en sistema cocultivo .......................................................... 25
2.8 La agroindustria de naranja y toronja en México ............................................. 26
2.8.1 Aprovechamiento y valorización de residuos de la agroindustria de cítricos
naranja-toronja ................................................................................................... 27
2.9 Composición de residuos cítricos naranja-toronja como material lignocelulósico
........................................................................................................................ 29
2.9.1 Pectinas .................................................................................................... 30
2.9.2 Celulosa .................................................................................................... 30
2.9.3 Hemicelulosa............................................................................................. 31
i
2.9.4 Lignina ...................................................................................................... 31
2.10 Uso de residuos de naranja y toronja para la obtención de bioetanol ....... 32
3. JUSTIFICACIÓN ............................................................................................. 33
4. OBJETIVO GENERAL....................................................................................... 34
4.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................ 34
5. HIPÓTESIS ....................................................................................................... 34
6. MATERIAL Y MÉTODOS .................................................................................. 35
26.1 Obtención de harina de cáscaras de naranja toronja ................................. 36
6.2 Hidrólisis ácida de la harina de cáscaras de naranja-toronja ....................... 36
6.3 Microorganismos .......................................................................................... 37
6.3.1 Conservación de las cepas ....................................................................... 37
6.3.2 Activación de las cepas ............................................................................. 38
6.4 Medio de fermentación .................................................................................... 38
6.5 Preparación del inóculo para fermentación ..................................................... 38
6.6 Fermentación .................................................................................................. 40
6.7 Determinación de los componentes del hidrolizado de cáscara de naranjatoronja y productos de la fermentación por HPLC .......................................... 40
7. Resultados ........................................................................................................ 41
7.1 Composición del hidrolizado de cáscara de naranja-toronja ........................ 41
7.3 Consumo de xilosa y glucosa por Candida tropicalis IEC5-ITV, Pichia stipitis
NRRL-Y7124 y el cocultivo de ambas ............................................................ 44
7.4 Producción de xilitol por C. tropicalis IEC5-ITV, Pichia stipitis NRRL-Y7124 y
el cocultivo ...................................................................................................... 46
7.4 Consumo de ácido acético por C. tropicalis IEC5-ITV, Pichia stipitis NRRLY7124 y el cocultivo de ambas cepas ............................................................. 47
7.5. Rendimiento ................................................................................................ 50
7.5.2 Eficiencia de Bioconversión ...................................................................... 50
8. Conclusiones ..................................................................................................... 52
9. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................. 53
ii
Índice de Tablas
Tabla 1. Los tipos de biomasa y sus características ............................................ 3
Tabla 2. Biocombustibles con una aplicación real o potencial ............................ 5
Tabla 3. Características del bioetanol y biodiesel ................................................ 6
Tabla 4. Rendimiento de biocombustibles por hectárea ...................................... 8
Tabla 5. Contenido de celulosa, hemicelulosa y lignina (como porcentaje en
peso de biomasa seca) de diferentes materiales lignocelulósicos. .................. 15
Tabla 6. Porcentaje de azúcares en diferentes hidrolizados de residuos
agrícolas.................................................................................................................. 16
Tabla. 7 Principales microorganismos productores de etanol con aplicación
industrial .................................................................................................................. 21
Tabla 8. Fermentación microbiana de hidrolizados de diferentes materiales
lignocelulósicos ...................................................................................................... 24
Tabla 9. Porcentajes de Celulosa, hemicelulosa y lignina en desechos cítricos
................................................................................................................................. 30
Tabla 10. Medio de conservación utilizado para C. tropicalis IEC5-ITV........... 37
Tabla 11. Medio de conservación para P. stipitis NRRL-Y7124 ....................... 37
Tabla 12. Composición sel medio de activación para C. tropicalis y P. stipitis 38
Tabla 13. Composición del hidrolizado de cáscaras de naranja-toronja .......... 41
Tabla14. Consumo de xilosa por Pichia stipitis NRRL-Y7124, Candida
tropicalis IEC5-ITV o un cocultivo de ambas en relación 1:1 presente en un
hidrolizado de cáscaras de naranja y toronja .............................................................. 44
Tabla 15. Valores de pH obtenidos en el caldo de fermentación a base de
HCNT y dos especies de levadura ....................................................................... 48
iii
Índice de figuras
Figura 1. Biocombustibles desde la materia prima hasta el final ................................. 4
Figura 2. Productores de bioetanol en miles de millones de litros ............................... 7
Figura 3. Procesos de fermentación con sacarosa y con biomasa lignocelulósica. ... 10
Figura 4. Reacción para la obtención de bioetanol ................................................... 12
Figura 5. Proceso de fermentación para la obtención de etanol a partir de diferentes
sustratos. .................................................................................................................. 18
Figura 6. Representación esquemática del metabolismo de la D-xilosa en
levaduras. ................................................................................................................. 22
Figura 7. Diagrama de trabajo para la obtención de etanol a patiir de un hidrolizado
de cáscaras de naranja-tronja................................................................................... 35
Figura 8. Cáscaras de naranja-toronja secadas en horno de convección ................. 36
Figura 9. Candida tropicalis IEC5-ITV (A) y Pichia stipitis NRRL-Y7124 (B) ............. 42
Figura 10. ................................................................................................................. 43
Figura 11. Consumo de xilosa por Pichia stipitis NRRL-Y7124 (A), Candida tropicalis
IEC5-ITV (B) o un cocultivo de ambas (C) en relación 1:1 contenida en un hidrolizado
de cáscaras de naranja y toronja .............................................................................. 45
Figura 12. Consumo de glucosa presente en un HCNT por Candida tropicalis IEC5ITV (A), Pichia stipitis NRRL-Y7124 (B) y un cocultivo con ambas cepas (C) ........... 46
Figura 13. Producción de xilitol por Candida tropicalis IEC5-ITV (A), Pichia stipitis
NRRL-Y7124(B) y un cocultivo con ambas cepas (C) a partir de un hidrolizado de
cascaras de naranja-toronja...................................................................................... 47
Figura 14. Consumo de ácido acético presente en un HCNT por Candida tropicalis
IEC5-ITV (A) ............................................................................................................. 48
Figura 15. Productividad volumétrica de xilitol (QP) calculada para cada una de las
levaduras evaluadas: Ct= Candida tropicalis IEC5-ITV; Ps= Pichia stipitis NRRL
Y7124; Cc= cocultivo ................................................................................................ 49
Figura 16. Rendimiento (YP/S) calculado para cada una de las cada una de las
levaduras evaluadas: Ct= Candida tropicalis IEC5-ITV; Ps= Pichia stipitis NRRL
Y7124; Cc= cocultivo ................................................................................................ 50
Figura 17. Eficiencia de bioconversión (η%) calculada para cada una de las levaduras
evaluadas: Ct= Candida tropicalis IEC5-ITV; Ps= Pichia stipitis NRRL Y7124; Cc=
cocultivo ................................................................................................................... 51
iv
1. INTRODUCCIÓN
Los biocombustibles han experimentado una fuerte expansión gracias a los
incentivos otorgados por los poderes públicos y a algunas ventajas como la
capacidad para reducir la dependencia energética exterior, la mayor creación de
empleos, especialmente en zonas rurales e industriales, o el menor impacto
ambiental en comparación con los combustibles fósiles.
En la actualidad la mayoría de los biocombustibles líquidos se manufacturan a
partir de cultivos alimentarios, incluida la palma aceitera, la caña de azúcar, el
maíz, las semillas de colza, la soja, el trigo y otros cultivos. Por lo general, el
bioetanol de primera generación se produce a partir de azúcar vegetal o almidón y
el biogasóleo, de aceite vegetal, (Organización de las Naciones Unidas para la
Agricultura y la Alimentación, 2008).
Ante un panorama mundial creciente en cuanto a escasez de materias primas,
energía y fenómenos relacionados con la no biosostenibilidad, efecto invernadero
y problemas sociológicos relacionados con el mundo agrario, forestal y rural, la
biomasa lignocelulósica, y en particular la de elevada capacidad de producción, se
presenta como una fuente de materia prima sostenible cada vez más necesaria.
En el mundo se producen aproximadamente 1600 millones de toneladas por año
de residuos sólidos (Buenrostro, 2006) los cuales generan graves problemas, no
sólo por el deterioro progresivo del medio ambiente, sino también desde el punto
de vista económico puesto que los costos de recolección, transporte y disposición
final son cada vez mayores.
En México según las cifras del Plan Nacional de Desarrollo 2007-2012, indican
que al año se generan en el país alrededor de 40 millones de
toneladas de
residuos, de los cuales 35.5 millones corresponden a residuos sólidos urbanos, de
éstos el 50% son residuos orgánicos. Por esta razón, se está impulsando el
1
estudio de la producción de bioetanol de segunda generación, el cual es producido
a partir de biomasa lignocelulósica residual, compuesta por dos polímeros de
carbohidratos: la celulosa (35-50%) y la hemicelulosa (15-25%), y un polímero
fenólico, la lignina (20-25%) (Olsson y Hahn, 1996).
En la agroindustria veracruzana, frutas como la naranja y toronja, tienen gran
influencia en el mercado, sus cáscaras que representan entre el 45 y 60 % del
peso de la fruta, son utilizadas en la alimentación de ganado pero
mayoritariamente son desechadas, desaprovechando así el valor que éstas tienen
como fuente potencial de productos de valor agregado. En el presente trabajo se
establece de manera preliminar un proceso biotecnológico para la obtención de
etanol a partir de cáscaras de naranja y toronja y dos cepas de levaduras que
fermentan xilosa, el componente mayoritario de los hidrolizados lignocelulósicos.
2
2. MARCO TEÓRICO
2.1 Biocombustibles
Por su origen, se podría decir que los biocombustibles son una fuente de energía
renovable, ya que son una forma de energía solar transformada. Se identifican con
aquellas fuentes de energía obtenidas a partir de biomasa mediante su
procesamiento químico, térmico o biotecnológico. Entre ellos se puede mencionar
el biodiesel, bioetanol, biogás y biohidrógeno.
Hoy en día la biomasa abarca aproximadamente el 10% de la demanda mundial
de energía. Es una fuente renovable ya que es rica en carbohidratos y estos
pueden ser convertidos por microorganismos en biocarburantes, de los cuales solo
el bioetanol es producido a escala industrial. La biomasa puede clasificarse como
se muestra en la Tabla1
Tabla 1. Los tipos de biomasa y sus características
Tipo de biomasa
Características
Biomasa primaria
Materia orgánica formada directamente de
seres fotosintéticos. Comprende biomasa
vegetal, residuos agrícolas y forestales.
Producida por heterótrofos que utilizan en
su nutrición biomasa primaria. La
constituyen materia fecal o carne de
animales.
Producida por los seres que se alimentan
de
biomasa
secundaria,
restos
y
deyecciones de animales carnívoros.
Producida por ecosistemas silvestres; 40%
de la biomasa que se produce en la tierra
proviene de los océanos.
Se puede extraer de residuos agrícolas,
forestales y de actividades humanas.
Recibe esta denominación cualquier cultivo
agrícola cuya finalidad es proporcionar la
biomasa para producir biocombustibles.
Biomasa secundaria
Biomasa terciaria
Biomasa natural
Biomasa residual
Cultivos energéticos
Fuente: Salinas y Gazca, 2009.
3
Los biocombustibles se pueden clasificar según la fuente de la cual se derivan:
productos forestales, agrícolas y pesqueros o desechos municipales, así como de la
agroindustria. Se clasifican también según su tipo en: sólidos, como leña, líquidos, como
etanol y biodiesel o gaseosos, como el biogás. Se utilizan principalmente como fuente de
energía de vehículos de motor y producción de electricidad (Figura 1).
Figura 1. Biocombustibles desde la materia prima hasta el final
Fuente: FAO, 2008.
Pueden ser sustituidos de forma parcial o total en los combustibles de origen fósil,
aparecen como fuente de energía alternativa, para usarse en el caso de que los
precios de los hidrocarburos se eleven o a largo plazo se agoten. Una segunda
finalidad de su uso es que contribuyen a frenar el calentamiento global, ayudando
a reducir las emisiones de CO2
4
.2.1.1 Biocombustibles producidos por microorganismos.
Algunos biocombustibles, principalmente alcoholes y ésteres líquidos, pueden ser
producidos por microorganismos, y deben cumplir los criterios necesarios para los
combustibles modernos, es decir alta eficiencia energética en motores de
combustión y capacidad para alimentar a un transporte (vehículo). Todos los
procesos de fermentación microbiana requieren de una fuente de energía para
alimentar a los microorganismos, generalmente se suministra en forma de
azúcares (Antoni et al., 2007). En la Tabla 2 se muestra una lista seleccionada de
biocombustibles generados por microorganismos con una producción potencial, su
estatus y su aplicación en la ingeniería.
Tabla 2. Biocombustibles con una aplicación real o potencial
Biocombustible
Proceso
Estatus
Aplicación en
la ingeniería
Biometanol
Termoquímico/microbiológico
Planta piloto
Mezcla pura
Bioetanol
Microbiológico
Industrial
Mezcla pura
Biobutanol
Microbiológico
Planta piloto
Mezcla pura
Biometano
Microbiológico
Industrial
Mezcla pura
Biohidrógeno
Microbiológico
Laboratorio
Bioetanol
Biodiesel
Físico/químico (enzimático)
Industrial
Mezcla pura
Fuente: Antoni et al., 2007.
2.1.2 Biocombustibles líquidos
Los biocombustibles líquidos se utilizan principalmente en el sector de transporte,
aun cuando su producción sólo cubre una parte de la demanda mundial, se estima
que en un futuro su uso y producción aumente en los siguientes años. Los más
importantes, debido al crecimiento de su producción son el bioetanol y el biodiesel.
5
La producción de bioetanol que utiliza como materia prima la biomasa
lignocelulósica ha tenido auge en los últimos años por ser un subproducto de valor
agregado (biomasa residual), entre estos se encuentran; residuos forestales,
pastos, bagazo de caña, entre otros. Por otro lado el biodiesel es producido a
partir de aceites vegetales y grasas animales, siendo la colza, el girasol y la soja
las materias primas más utilizadas para este fin. En la tabla 3 se exponen algunas
de las características el bioetanol y el biodiesel como biocombustibles líquidos.
Tabla 3. Características del bioetanol y biodiesel
Bioetanol

Biodiesel
Producido principalmente en países

de América; Brasil y EUA.

Alemania y Francia.
Utilizado en mayor proporción como
Debido a la alta comprensión de los
motores diesel pueden ser de un
MTBE. La gasolina aumenta de 35-
20 a 30% más eficientes que los
40% su octanaje y el combustible
motores de gasolina.

En
ciudades
tropicales
como
En ciudades de Europa se usa el
Malasia e Indonesia el biodiesel se
trigo como materia prima para la
produce a partir de aceite de palma.

obtención de bioetanol.


aditivo en gasolina para sustituir el
mejora su eficiencia térmica.

Producido en países de Europa;
Los terpenoides derivados de la
Mayor densidad de energía, menor
ruta de los isoprenoides, ácidos
presión
grasos,
de
vapor,
menos
ésteres
o
alcanos
de
higroscópicos y por lo tanto menos
cadena larga se han sugerido para
corrosivos. Estas propiedades son
obtener
las que permiten la mezcla con
microorganismos.
biodiesel
a
partir
de
combustibles convencionales.
Fuente: Solomon, 2010.
Las propiedades del biodisel son prácticamente las mismas que las del gasóleo
de automoción en cuanto a densidad y número de cetano. Además, presenta un
punto de inflamación superior. Por todo, el biodisel y el bioetanol pueden utilizarse
6
en mezclas para su uso en motores e incluso sustituirlo totalmente si se adaptan
éstos convenientemente (García y García, 2006).
2.1. 3 Panorama mundial de los biocombustibles
El biodiesel y el bioetanol son biocombustibles que se producen en todo el mundo
en cantidades importantes. Cerca de 48,7 x 106 de m3/año
de bioetanol se
produjeron a nivel mundial en 2005, de los cuales, el 72% se generó en Brasil y
los E.U.A (Masiero, 2008). Este último país multiplicó su producción en la última
década y pasó a ser el país con la mayor producción de etanol a nivel mundial en
2005. La Figura 2 se muestra los ocho países más importantes productores de
bioetanol como combustible carburante en 2005, que en conjunto son los
responsables de más del 91% de la producción mundial de este combustible.
E.U.A
16067
Brasil
16214
Unión Europea
2296
India
1700
África del Sur
390
Ucrania
245
Arabia Saudita
170
Argentina
165
Japón
113
Figura 2. Productores de bioetanol en miles de millones de litros
Fuente: Masiero, 2011
Los rendimientos de biocombustibles por hectárea se observan en la Tabla 4.
Estos datos se utilizaron para poder pronosticar los procesos industriales en la
obtencion de diferentes biocombustibles y determinar nuevas tecnológias para su
7
producción, también se utilizaron para hacer un balance enérgetico de los gases
de efecto invernadero que se procucirán durante el ciclo de vida de los cultivos.
Tabla 4. Rendimiento de biocombustibles por hectárea
Tipo de
País
Cultivo
biocombustible
Biodiesel
Bioetanol
Biometanol
Combustible
(ha/año)
E.U.A
Colza
50.8
U.E
Soja
16.3
Alemania
Girasol/cebada
32.5/35.8
Tanzania
Aceite de palama
50.4
E.U.A
Maíz
186.0
U.E
Trigo
66.0
U.E
Remolacha
52.9
Brasil/India
Caña de azucar
137.5/112.1
Tanzania
Caña de azucar
173.0
Alemania
Trigo
54.1
Nueva zelanda
Rastrojo de maíz
36.2
Alemania
Trigo
84.6
Maíz para encilaje
23.2
Pastos de cultivo
154.4
Cultivos energéticos
115.3
Fuente: Antoni et al., 2007.
2.2 Bioetanol
El bioetanol es un producto químico obtenido a partir de la fermentación de los
azucares que se encuentran en productos vegetales, tales como cereales,
remolacha, caña de azúcar o biomasa lignocelulósica. Estos azucares se
encuentran formando parte de la estructura de carbohidratos como sacarosa,
almidón, hemicelulosa y celulosa.
8
Lo que hace que el bioetanol usado como biocarburante tenga un equilibrio neto
de emisiones de CO2 es que la materia prima utilizada para su producción son
azúcares que provienen de plantas que a su vez crecen gracias al proceso de
fotosíntesis, en el que la luz del sol, el dióxido de carbono de la atmósfera, el agua
y los nutrientes de la tierra forman moléculas orgánicas complejas de azúcar, los
hidratos de carbono y la matriz lignocelulósica que se concentra en la parte fibrosa
de la planta. Esto forma parte del balance energético de la tierra, por ello cuando
se usa el bioetanol como carburante emite a la atmósfera el dióxido de carbono
que utilizó la planta para crecer y es por eso que ayuda a reducir los niveles de
CO2 en la atmósfera (Díaz et al., 2011).
Las tres principales clases de materia prima para la producción de bioetanol son el
azúcar (melaza, jugo de caña), almidones (maíz, trigo) y biomasa lignocelulósica
(paja de arroz, bagazos). Los almidones y azúcares para base de etanol hacen
referencia a la primera generación de bioetanol. Estos compuestos energéticos se
transforman en azúcares y a continuación se convierten en etanol por medio de
fermentación alcohólica. La lignocelulosa como materia prima puede ser adquirida
ya sea de cultivos de biomasa forestal o dedicada a los residuos de la agricultura.
2.2.1 Bioetanol de primera generación
El bioetanol de primera generación hace referencia a aquellos provenientes de
cultivos agrícolas destinados a la alimentación humana.
2.2.2 Bioetanol de segunda generación
El bioetanol de segunda generación no compite con la producción de alimentos ya
que para la producción del mismo se ocupa biomasa residual que está compuesta
principalmente de materiales lignocelulósicos, tales como residuos forestales,
herbáceos, desperdicios de papel etc.
El principal reto en la producción de etanol a partir de biomasa lignocelulósica es
el pretratamiento e hidrólisis de la materia prima. El complejo lignocelulósico está
9
compuesto principalmente de una matriz de carbohidratos formada de celulosa y
lignina enlazada por cadenas de hemicelulosa. En la Figura 3, se muestra una
comparación entre la fermentación de bioetanol de primera generación y la
fermentación de etanol de segunda generación.
Almidón
Hidrólisis
Glucosa/fructuosa
Fermentación
Bioetanol
Biomasa
lignocelulósica
Pretratamiento
Hidrólisis
Interrupción
de la biomasa
Glucosa,
xilosa,
otros
Fermentación
Bioetanol
Figura 3. Procesos de fermentación con sacarosa y con biomasa lignocelulósica.
Fuente: Jain et al., 2011.
10
2.2.3 Bioetanol de tercera generación
Esta tecnología consiste en la utilización de algas para producir bioetanol. Las
algas son organismos unicelulares procariotas y autotróficos que llevan a cabo la
fotosíntesis oxigénica y acumulan glucógeno (carbohidrato) como la principal
forma de carbono almacenado. El alga verdeazulada prolifera rápidamente y utiliza
de manera eficiente la radiación solar, CO2 y elementos inorgánicos, utiliza la
fotosíntesis como medio para capturar de manera eficiente la energía del sol para
convertirla en azúcar intracelularmente, lo que proporciona la energía para crecer
y reproducirse. Actualmente existen algas modificadas genéticamente para la
producción directa de etanol (Biofields, 2010).
2.3 Producción de bioetanol de segunda generación
El pretratamiento es la principal característica del bioetanol de segunda
generación, se realiza para desintegrar la matriz lignocelulósica de tal manera que
la celulosa reduzca su grado de cristalinidad y aumente la celulosa amorfa, que es
la más adecuada para el posterior ataque enzimático. Adicionalmente, la mayor
parte de la hemicelulosa se hidroliza durante el pretratamiento y la lignina se
libera o puede incluso descomponerse. En una etapa posterior, la celulosa
liberada es sometida a hidrólisis enzimática con células exógenas, lo cual hace
que se obtenga una solución de azúcares fermentables que contiene
principalmente glucosa, así como pentosas resultantes de la hidrólisis inicial de la
hemicelulosa. Estos azúcares son posteriormente convertidos en etanol mediante
microorganismos que pueden utilizar uno o varios azúcares presentes en el
material lignocelulósico pretratado e hidrolizado (Olsson, Hahn 1996; Sánchez y
Cardona, 2005; Ballat, 2011; Jain et al., 2011; Hallenbeck, 2012; Sakar et al.,
2012). La producción del etanol a partir de glucosa se puede simplificar en la
reacción que se muestra en la Figura 4.
11
C6H12O6
2C2H5OH +2 CO2
Figura 4. Reacción para la obtención de bioetanol
2.3.1 Usos del etanol como biocarburante
Existen tres formas de utilizar el etanol como biocarburante. La más utilizada de
estas es cuando el bioetanol se emplea en mezclas con gasolina convencional
para sustituirla como carburante en mayores o menores proporciones; no sustituye
totalmente a la gasolina, ya que esta le da a la mezcla estabilidad y resta
volatilidad. Las mezclas pueden ser E5, E10, E20 y hasta E95 (Hallenbeck, 2012),
indicando en número el porcentaje de etanol empleado en la mezcla: en medida
que se aumenta el contenido de etanol en la mezcla se reduce el impacto
contaminante, ya que libera menos CO2.
Otra manera de poder utilizar bioetanol como combustible es modificar las
características del motor del vehículo para usar mezclas con mayor contenido de
etanol. La tercera estrategia es utilizar el bioetanol como aditivo sustituyendo el
metil terbutil éter (MTBE) que es un aditivo utilizado para incrementar el nivel de
octanaje en la gasolina común pero que es altamente contaminante. Brasil es el
principal país pionero en la producción y utilización de bioetanol como combustible
carburante, en 1975 el gobierno brasileño inició el programa Pro-alcohol para
desarrollar el uso de alcohol etílico como combustible, así podía ser utilizado para
reemplazar MTBE, a diferencia de este el etanol es menos agresivo con el medio
ambiente ya que hace que la gasolina aumente su grado de biodegradabilidad.
De 1975 a 2000 Brasil produjo aproximadamente 5.6 millones de vehículos con
motores a prueba de etanol, aparte de los automóviles con motor capaz de
aceptar etanol, el gobierno aprobó la mezcla de etanol con gasolina en un 25% en
cada litro de gasolina (Moawad, 2012). El aspecto positivo de esta mezcla es que
12
se evita la emisión de110 millones de toneladas de dióxido de carbono en la
atmósfera.
De acuerdo con la Agencia para el Aceite de Brasil, en 2007, se han producido
492 toneladas de caña de azúcar y una porción de este material se utilizó para
generar 8.4 mil millones de litros de etanol puro y 13.9 millones de litros de etanol
hidratado. Es así como Brasil está a la vanguardia de desarrollo de
biocombustibles como fuente de energía alternativa renovable, así como Estados
Unidos y algunos países asiáticos (Masiero, 2011).
2.4 Materias primas para la obtención de bioetanol
El bioetanol puede ser producido a partir de materias primas que contienen
azúcares fermentables tales como caña de azúcar y remolacha azucarera,
materiales que son ricos en sacarosa. Otras materias primas incluyen algunos
polisacáridos que pueden ser hidrolizados para obtener azúcares asimilables por
microorganismos productores de etanol. El almidón es el principal polímero
utilizado actualmente para la producción de etanol, mientras que la biomasa
lignocelulósica es la materia prima más promisoria debido a su gran disponibilidad
y bajo costo (Kovalev et al., 2012).
2.4.1 Materiales ricos en azúcares
Como se ha mencionado, la caña de azúcar y la remolacha azucarera son las
principales materias primas ricas en azúcares asimilables para la fermentación
etanólica. El jugo extraído durante su procesamiento y melaza obtenida como
subproducto de la generación de azúcares son los sustratos más utilizados por las
industrias dedicadas a la generación de bioetanol (Sánchez et al., 2010). El cultivo
de la caña de azúcar prevalece en los países tropicales como Brasil, Colombia y
México. Por su parte la remolacha azucarera es principalmente empleada por
países europeos.
13
2.4.2 Materiales amiláceos
El almidón es un polímero compuesto exclusivamente por unidades de glucosa, lo
que lo constituye una materia prima muy importante para la producción de etanol.
Tradicionalmente esta materia prima se ha utilizado para la producción de bebidas
alcohólicas fermentadas, pero para su conversión en bioetanol con rendimientos
elevados es necesaria la degradación de almidón hasta glucosa.
Este tipo de materia prima es utilizado masivamente en Norte América y Europa
donde se utiliza el maíz, el trigo y otros cereales para la producción de etanol vía
fermentativa previo pretratamiento del material e hidrólisis del almidón. En países
tropicales otros cultivos ricos en almidón como tubérculos, pueden ser
implementados a nivel industrial para la generación de alcohol carburante, como el
caso de México donde se reportan estudios sobre la obtención de bioetanol
utilizando yuca como materia prima (Sánchez et al., 2010).
2.4.3 Materiales lignocelulósicos
Los materiales lignocelulósicos son una fuente de gran disponibilidad, ya que es
un desecho agroindustrial, al igual que las materias primas amiláceas requieren de
tratamientos preliminares para la degradación de los polisacáridos a unidades de
azúcar asimilables por los microorganismos fermentadores. Los materiales más
estudiados y cuya potencialidad ha sido determinada son el bagazo de caña, el
rastrojo de maíz, pajas de cereales, residuos sólidos urbanos, pastos, entre otros.
En la Tabla 5 se muestran datos de los principales residuos agrícolas utilizados
para la obtención de bioetanol de segunda generación, así como el contenido de
su matriz de carbohidratos.
14
Tabla 5. Contenido de celulosa, hemicelulosa y lignina (como porcentaje en peso
de biomasa seca) de diferentes materiales lignocelulósicos.
Residuos
Celulosa
Hemicelulosa
Lignina
33.7-41.2
31.9-36
6.1-15.9
27-37.5
10-20
agrícolas
Mazorca de maíz
Bagazo de caña 40-41.3
de azúcar
Paja de trigo
32.9-50
24-35.5
8.9-17.3
Paja de arroz
36.2-47
19-24.5
9.9-24
Paja de cebada
33.8-37.5
21.9-24.7
13.8-15.5
Tallo de soya
34.5
24.8
19.8
Tallo de algodón
38.4
20.9-34.4
21.45
Fuente: Conde et al., 2012.
2.5 Pretratamiento de biomasa lignocelulósica
Los materiales lignocelulósicos como ya se había mencionado antes están
integrados principalmente por tres constituyentes poliméricos: la celulosa,
hemicelulosa (que en conjunto se llama holocelulosa) y lignina los cuales están
asociados los unos con los otros y son los que finalmente sirven de soporte
estructural de la pared celular. La celulosa es el compuesto orgánico de mayor
abundancia en la naturaleza, de gran importancia a nivel biológico y un polímero
de interés industrial. Se le denomina pretratamiento al conjunto de acciones para
mejorar el rendimiento en la obtención de azúcares fermentables desde la
biomasa inicial.
En general existen dos formas de manejo de la biomasa lignocelulósica para
preparación de azúcares fermentables. El primero de ellos, tiene como objeto la
conversión de la biomasa lignocelulósica indirectamente obteniendo holocelulosa y
lignina por separado, material que luego es degradado a un sustrato fermentable,
el segundo tipo en el cual el material lignocelulósico es sometido a una digestión
para obtener directamente un sustrato fermentable (Guarnizo et al., 2009)
15
Los pretratamientos están orientados hacia la modificación de la estructura
supramolecular y de esta manera separar lignina y la holocelulosa y /o la hidrolisis
de la holocelulosa en azúcares fermentables (Tabla 6).
Tabla 6. Porcentaje de azúcares en diferentes hidrolizados de residuos agrícolas.
Xilosa
Glucosa
Arabinosa
Galactosa
Manosa
(%)
(%)
(%)
(%)
(%)
Bagazo de caña de azúcar
75
14
11
-
-
Paja de arroz
67
21
12
-
-
Madera dura
27
11
5
14
43
Fibra de maíz
16
71
11
2
-
26-60
16-37
24-46
-
-
Hidrolizado
Fibra de xilano aislada de maíz
Fuente: Rangaswamy, 2003.
2.5.1 Hidrolisis ácida
Los pretratamientos ácidos implican el uso de soluciones de ácido sulfúrico diluido,
usualmente al 5% con rendimientos del 100% a 160°C, o concentrado al 77% a
más baja temperatura, con lo que se logra por hidrolisis ácida, la formación de
azúcares. Con el pretratamiento ácido, además de la hidrolisis ocurren reacciones
de condensación y eliminación que llevan a la formación de sustancias tóxicas
para las levaduras como el hidroximetilfurfural. No obstante se han propuesto
pretratamientos con hidrólisis ácida parcial para la obtención de azúcares
fermentables, por ejemplo, el pino (Loblolly pine) fue sometido a hidrolisis ácida
obteniéndose 75% de conversión en madera de azúcares fermentables, el resto
del material no degradado se llevó a hidrólisis enzimática alcanzando un 95% de
conversión global (Arrizon et al., 2010).
16
2.5.2 Hidrolisis enzimática
Después del pretratamiento ácido, alcalino o por hongos, la matriz lignocelulósica
puede sacarificarse enzimáticamente para obtener azucares fermentables. Los
microorganismos son fuentes potenciales de celulasas y hemicelulasas, que
pueden ser utilizadas para la hidrólisis del material lignocelulósico pretratado. Las
celulasas y hemicelulasas son enzimas especializadas en descomponer celulosa,
estas enzimas las producen microorganismos como bacterias y hongos, que son
los principales agentes de descomposición del planeta.
La mejora más importante que ha tenido la hidrolisis enzimática es la introducción
de la sacarificación y fermentación simultánea. Este bioproceso consiste en tres
pasos en uno, que son: producción de celulasas, hidrolisis enzimática de la
lignocelulosa y la conversión del hidrolizado en etanol (Guarnizo et al., 2009).
2.6 Fermentación
Básicamente, la bioconversión del complejo lignocelulósico en etanol incluye tres
procesos:
despolimerización
estructural
de
polisacáridos
en
azúcares
fermentables a través de procesos termoquímicos y rutas enzimáticas,
fermentación
de
estos
azúcares
en
etanol
y
recuperación
de
etanol.
La producción de etanol por acción de microorganismos sobre malta o extractos
de fruta ha sido llevada a cabo a gran escala por muchos años y fue el primer
proceso industrial para la producción de un metabolito microbiano. Es por vía
fermentativa que se obtiene la mayor cantidad de etanol a nivel mundial. El 95%
del etanol en el mundo se obtiene por fermentación a partir de materias primas
que contengan carbohidratos. Un esquema general de un proceso de
fermentación se muestra en la Figura 5.
Existen básicamente tres maneras de fermentación con microorganismos, para la
obtención de etanol, estas son: por lote, lote continuo y lote alimentado (Tejeda et
17
al.,
2011).
La
selección
del
modo
de
fermentación
depende
de
los
microorganismos que se utilizarán.
Fermentación
.
Microorganismo
Sustrato
Micronutriente
s
Identificación
y aislamiento
de cepa
Formulación
del medio
Adicionar y
mezclar
Preservación
de la cepa
Esterilización
y
acondicionamiento del
Fermentación
Condiciones
estériles
Recuperación
Interrupción
de actividad
celular
Aire estéril
Vapor
Operaciones
unitarias
diversas
medio
Propagación
del Mo.
Inoculación
del Mo.
Control de
temp.
Control de
pH
Medición
de O.D
Agitación
Figura 5.
Proceso de fermentación para la obtención de etanol a partir de
diferentes sustratos.
Fuente: Marriaga, 2009.
18
El sistema por lotes es el método más simple que se suele utilizar, pero tiene
algunas limitaciones, una de ellas es que la glucosa puede suprimir la
fermentación de xilosa, especialmente en la etapa inicial, porque la conversión de
xilosa se inhibe completamente cuando la concentración de glucosa es de 2.3 g/L
y superiores. En cambio en el sistema de fermentación por lote continuo la
concentración de glucosa se puede mantener suficientemente baja como para no
reprimir la utilización de xilosa. La ventaja que tiene el sistema de lote continuo es
que se puede controlar la tasa de glucosa mediante disolución para que la glucosa
se mantenga debajo de 2.3 g/L, por lo que la conversión de glucosa y xilosa es
rápida y simultánea. Sin embargo, este enfoque puede limitarse si la cantidad de
etanol producido a partir de glucosa excede la tolerancia al etanol del
microorganismo utilizado para la fermentación de xilosa. Cuando la glucosa se
encuentra por agotarse, la alta concentración de etanol (alrededor de 30g/L)
puede inhibir el proceso de fermentación de xilosa (Jojima et al., 2010). La
fermentación en lote continuo en flujo de salida puede evitar la acumulación de
etanol y otros metabolitos inhibidores del sistema.
2.7 Microorganismos utilizados
Como se ha mencionado el hidrolizado del material lignocelulósico son mezclas
complejas de distintos monómeros como pentosas y hexosas (Tabla 7), junto con
otros compuestos que pueden actuar como inhibidores para los microorganismos.
La glucosa derivada principalmente de la fracción celulósica, determina toda la
posición de la estructura lignocelulósica, es el sustrato
más importante que
utilizan los microorganismos que pueden producir alcohol a nivel industrial como
Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Shaccaromyces cerevisiae y
Zimmomona mobilis, las especies de microorganismos que pueden degradar
glucosa en alcohol son más comunes que los microorganismos que pueden ser
capaces de degradar azúcares derivados de la hemicelulosa ( xilosa, arabinosa,
manosa, galactosa) además son sustratos menos eficientes en términos de
productividad y rendimiento (Jojima et al., 2010). Es por esto que se deben de
19
elegir microorganismos que posean las siguientes propiedades: fermentación
eficiente de pentosas y hexosas de preferencia que sean capaces de digerir estos
azúcares simultáneamente, alta tolerancia a los inhibidores, resistencia contra
contaminación microbiana, alta productividad y rendimiento.
Por otra parte algunas pentosas como la xilosa que es uno de los componentes
fundamentales de la hemicelulosa, son difíciles de degradar por ciertos
microorganismos como bacterias. Existen pocas especies de bacterias que tienen
esta capacidad como el caso de Clostridium thermocellum (Weber et al., 2010).
De la misma manera se han evaluado microorganismos con capacidad de
hidrolizar la celulosa, de asimilar pentosas y de trabajar en condiciones
termofílicas, ya que el incremento de temperatura acelera los procesos
metabólicos
y
disminuye
las
necesidades
de
refrigeración.
Entre
los
microorganismos de este tipo se encuentran levaduras como Pichia stipitis,
Candida shehatae, Candida tropicallis y Pachysolen tannophilus. En la tabla 7 se
muestra los microorganismos que se han utilizado para la producción industrial de
etanol.
La
capacidad
de
los
microorganismos
para
metabolizar
pentosas,
es
independiente del rendimiento de estos azúcares y su productividad ya que tanto
el rendimiento como la productividad de etanol son bajos, esto se ha atribuido a
una variedad de fenómenos incluyendo la represión de catabolitos de carbono y
desequilibrio en el metabolismo celular redox de pentosas y la absorción
ineficiente de algunos azúcares (Jojima, et al., 2010). La importancia de cada uno
se estos varia con el microorganismo en cuestión.
20
Tabla 7. Principales microorganismos productores de etanol con aplicación
industrial
Especie microbiana
Levaduras
Microorganismo
Saccharomyces
cerevisiae
Sustratos
Condiciones
fermentables
fermentación
Glucosa
Fructuosa
Sacarosa
Maltosa
Anaeróbico
30-37°C
Saccharomyces pombe
Kluyveromyces
Glucosa
marxianus
Pichia stipitis
Anaeróbico
30-35°C
Anaeróbico
40-45°C
Glucosa
Xilosa
Microaerofílico
26-35°C
Microaerofílico
20-31°C
Xilosa
Glicerol
Glucosa
Fructuosa
Sacarosa
Glucosa
Celulosa
Microaerofílico
Xilosa
Anaeróbico
60°C
Candida shehatae
de
Candida tropicallis
Pachysolen tannophilus
Bacterias
Zymomona mobilis
Clostridium
thermohydrosulfuricum
Anaeróbico
30°C
Anaeróbico
55-65°C
Clostridium
thermosaccharolyticum
Clostridium
thermocellum
Termoanaerobacter
thermosaccharolyticum
Fuente: Elaboración propia
21
La vía de bioconversión
de glucosa y xilosa a etanol presente en los
microorganismos utilizados se muestra en la Figura 6.
D-xilosa
NADPH
NADP
Xilitol
NADP
NADPH
D-xilulosa
ATP
ADP
D-xilulosa-5-fosfato
Vía de las pentosas fosfato
Vía de la fosfocetolasa
Gliceraldehido-3-fosfato
Etanol
Vía de Embden-Meyerhoff
NADH
Piruvato
CO2
Acetaldehído
NAD
Etanol
Ciclo de Krebs
Figura 6. Representación esquemática del metabolismo de la D-xilosa en
levaduras.
Fuente: Silva et al., 2005.
2.7.1 Pichia stipitis
La levadura Pichia stipitis se aisló de madera en descomposición y en las larvas
de los insectos que habitan en maderas, es uno de los microorganismos más
estudiados en la fermentación de xilosa. Las cepas de P. stipitis producen bajas
cantidades de celulasas y hemicelulasas (enzimas encargadas de descomponer
22
celulosa y hemicelulosa) para descomponer la madera en azúcares monoméricos.
También es capaz de producir etanol a partir de glucosa, galactosa, manosa,
xilosa y celobiosa con altos rendimientos y baja cantidades de xilitol (Agbogbo y
Wenger, 2006).
Los resultados de la fermentación de xilosa con esta levadura muestran que
pueden ser producidos 61g de etanol/L en medios sintéticos y 41g/L en madera
de álamo pretratada. La productividad máxima de etanol es alrededor de 0,9 g/L
(La Grage, et al., 2010). Entre otras características que posee P. stipitis se puede
mencionar que tiene la capacidad de consumir ácido acético y reducir el anillo de
furano en furfural e hidroximetilfurfural (HMF), por tanto puede limpiar algunas de
las toxinas que se generan en el pretratamiento de la biomasa celulósica
(Agbogbo, et al., 2008).
Recientemente fue publicado, la secuencia del genoma de P. Stipitis (Jeffries, et
al., 2007). Esta mostró numerosos genes para la bioconversión tales como:
xilanasa, endo-1, 4 β-glucanasa, exo-1, 3- β-glucosidasa, β-manosiadasa, y αglucosidasa. La presencia de estos genes en P. stipitis ofrece características muy
útiles para la sacarificación y fermentación simultánea de celulosa y hemicelulosa.
En comparación con S. cerevisiae, las tasas de consumo de azúcar en P. Stipitis
son menores y esto parece estar relacionado con el transporte de azúcares. En
medios óptimos que contienen 150 g/L de xilosa se pueden obtener un máximo de
61 g/l de etanol con un rendimiento de 41% de etanol (Weber, et al., 2010). P.
stipitis muestra una producción de etanol óptima en condiciones microaerófilas y
bajo condiciones aeróbicas no hay producción de etanol, incluso con exceso de
azúcar. La productividad de etanol ha sido evaluada en diferentes hidrolizados con
rendimientos que oscilan de 31 a 48% de etanol (Agbogbo y Coward, 2008).
En la Tabla 8 se observa el rendimiento de etanol, producido por diferentes
microorganismos utilizando diferentes hidrolizados de materiales lignocelulósicos.
23
Tabla 8. Fermentación microbiana de hidrolizados de diferentes materiales
lignocelulósicos
Complejo
Hidrolisis
lignocelulósico
Azúcar en Microorganismo Producción Rendimiento
el
de
etanol de
hidrolizado
(g/L)
etanol
(g/L/h)
(g/L)
Madera suave
Abedul
Sauce
Álamo
Madera dura
Picea
Pino
Residuos
agroindustriales
Bagazo de caña
de azúcar
Paja de trigo
Rastrojo
de
maíz
Residuos
sólidos
municipales
Periódico
Acida
Explosión
de vapor
Óxido de
azufre
NA
10
S. cerevisiae CBS 8066
E. coli K011
NA
4.6
0.43
0.51
31
E. coli B(pLo1 297)
14.9
0.48
Ácida
Óxido de
azufre
NA
75.3
S. cerevisiae CBS 8066
E. coli K011
NA
32.0
0.44
0.43
Acida
30.29
C.shehatae NCIM3501
8.67
0.48
Acida
Acida
NA
42
P. stipitis NRRL y-7124
P. stipitis CBS 6054
15
0.41+- 0.01
0.37-0.44
14.77
0.39
Enzimática 38.21
S. cerevisiae
Fuente: Chandel y Singh, 2011
24
2.7.2 Candida Tropicalis
Una de las levadura recomendada para la fermentación de mezclas de glucosa y
xilosa es C. tropicalis, este microorganismo es capaz de metabolizar compuestos
fenólicos, es decir, puede degradar cualquier compuesto proveniente de la lignina
lo que hace que no haya inhibición por este tipo de compuestos en el proceso de
fermentación.
Un estudio para la obtención de bioetanol a partir de un hidrolizado de bagazo de
arroz y una cepa de C. tropicalis reportó que la concentración de xilitol aumento
después de 12 horas en fermentación, esto debido a que las células, convirtieron
inicialmente la glucosa en etanol, después de gastar la glucosa, dependían
únicamente de xilosa como fuente de carbono y es por esto que se produjo xilitol,
lo cual indica que las células de C. Tropicalis, pueden convertir eficientemente
únicamente el 75% del sustrato en etanol (Singh, 2010).
2.7.3 Fermentación en sistema cocultivo
El sistema de fermentación en cocultivo, se refiere a la fermentación utilizando dos
microorganismos de diferentes especies. Cada par seleccionado de los
microorganismos tendrá su propios parámetros óptimos tales como: temperatura,
pH, ambiente aeróbico o anaeróbico y tamaño de inoculo. Por lo tanto es
importante encontrar los intervalos óptimos de funcionamiento para los parámetros
del proceso y los rangos aceptables de sustrato que puede permitir la actividad
óptima de cada cepa en el cocultivo. Ya que a diferencia de la producción de
etanol con una sola cepa de microorganismo, los cocultivos pueden diferir
respecto al pH, temperatura y las necesidades de oxígeno.
Los retos para el uso de cocultivo a escala industrial son varios como lo es la
cofermentación de hexosas y pentosas. Otro de los principales desafíos en el
proceso de cocultivo es la tolerancia de etanol en la fermentación de xilosa con
levaduras, un ejemplo de esto se da cuando se trabaja con P. stipitis ya que la
inhibición de etanol se produce cuando se alcanza una concentración de 30 g/L
25
(Jojima, et al., 2010). La rápida formación de etanol a partir de glucosa en el
sistema cocultivo aumenta la posibilidad de fermentación de xilosa a etanol. La
mejora para la producción de etanol con glucosa y xilosa puede depender de la
disminución de la influencia de etanol a través de la selección de cepas más
tolerantes al etanol o el uso de sistemas de eliminación de etanol acoplados a la
fermentación.
Por lo tanto los compromisos en los parámetros del proceso son muy necesarios,
por ejemplo la competencia por oxígeno resultó en la baja conversión de xilosa a
etanol en el cocultivo con S. cerevisiae y P. stipitis (Chen, 2011). El uso de una
cepa mutante de Saccharomyces, deficiente en respiración (no consume oxígeno)
puede proporcionar condiciones favorables para que la levadura fermente xilosa.
La combinación más utilizada en la corriente del cocultivo es el par de P. stipitis y
S. cerevisiae; este par tiene mejor compatibilidad y mejor rendimiento de
fermentación con respecto a la combinación de levaduras y bacterias como Z.
mobilis
2.8 La agroindustria de naranja y toronja en México
La naranja (Citrus sinensis) mexicana es uno de los productos de mayor
rentabilidad en los agronegocios, dado su importante consumo en el país y en el
extranjero, así como su gran utilización industrial para la obtención de jugos y
extractos. Actualmente junto con la toronja (Citrus paradasi), representan el 71.4%
de la producción de cítricos en el país, abarcando casi un tercio del total de áreas
destinadas a la fruticultura (Escalante, 2009).
México se coloca en la quinta posición como productor de naranja y toronja en el
mundo con 4.4 millones de toneladas/año, cifra que significó un record en el 2008,
según la Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y
Alimentación (SAGARPA). Veracruz es la principal región productora de naranja y
26
toronja ya que representa casi el 50% de la superficie total de naranja sembrada
en el país. Los principales municipios citricultores que integran ésta región son:
Álamo (27,000 ha de producción), Tihuatlán (8,900 ha), Castillo de Teayo (5,500
ha) y Tuxpan (3,600 ha), los cuales suman una superficie total aproximada de 40,
000 ha en producción. Otros estados productores son San Luis Potosí y
Tamaulipas y con menos producción Sonora, Yucatán, Tabasco y Nuevo León.
Por otra parte, es una realidad que por la estacionalidad de la producción, el
mercado del producto fresco está saturado y por lo tanto la generación de residuos
de este producto aumenta día con día, es por esto que se requiere de aplicar
tecnología para un aprovechamiento integral del residuo, para obtener diversos
subproductos.
2.8.1 Aprovechamiento y valorización de residuos de la agroindustria de
cítricos naranja-toronja
La industria procesadora de cítricos (naranja y toronja) emplea grandes volúmenes
de fruta, y sus desechos incluyen corteza, pulpa y semillas. Estos residuos en un
alto porcentaje se usan en algunos países para la manufactura de una serie de
subproductos como aceites fijos y volátiles, ceras, resinas, productos pécticos,
celulosa, alimento para ganado, fertilizantes, ácido acético, cítrico y láctico
(Gutiérrez et al., 2002).
La industria farmacéutica aprovecha los residuos cítricos fundamentalmente para
la extracción de aceites esenciales, (terpenos del flavedo), pectina del albedo y
obtención de flavonoides (hesperidina y naringenina) (Rincón et al., 2005).
En general los flavonoides pertenecen al grupo de los compuestos fenólicos y
frecuentemente se encuentran derivados de ésteres, éteres y glicósidos. Los
compuestos fenólicos han mostrado una amplia variedad de actividades
biológicas: antioxidante, antimicrobiana, antiinflamatoria, inmunomoduladora,
antiviral, antiproliferativa, antimutagénica, acciones vasodilatadoras, y prevención
de enfermedades coronarias y desórdenes neurodegenerativos (Londoño, 2011).
27
Específicamente, en cuanto a los flavonoides, la naringenina es el mayoritario en
la toronja y la hesperidina lo es en la naranja. Otros metabolitos importantes en
éstos cítricos son las cumarinas y ácidos orgánicos como el ácido cítrico y el
ascórbico.
Las aplicaciones terapéuticas de algunos de estos compuestos son ya conocidas y
utilizadas en el ámbito clínico. La mezcla micronizada de flavonoides Daflón, que
contiene 90% de diosmina y 10% de hesperidina es utilizada como un potente
medicamento flebotónico para el tratamiento de la insuficiencia venosa crónica.
Además son numerosos los productos fitoterapéuticos y alimentarios funcionales
comercializados en el mundo que contienen totalmente o como parte de sus
principios activos, una fracción de flavonoide, comúnmente llamada bioflavonoides
e incluso denominada genéricamente como vitamina P (Londoño, 2011).
En cuanto a los métodos de extracción de flavonoides, han surgido procedimientos
para su obtención a partir de cáscara de cítricos aplicados en industrias
farmacéuticas y de alimentos. Estos métodos están basados en el tratamiento
alcalino de las cáscaras de cítricos y posterior precipitación de hesperidina desde
soluciones acidificadas, con posteriores pasos de recristalización para aumentar la
pureza del producto comercial. Son varias las metodologías de extracción de
antioxidantes a partir de cáscaras de cítricos, entre ellas la extracción con
disolventes, extracción en medio alcalino, extracción asistida por ultrasonido y
extracción enzimática (Londoño, 2011).
Otro subproducto de valor agregado que se obtiene de los residuos de naranjatoronja son los aceites esenciales que son una combinación de compuestos
secundarios de las plantas como terpenos y compuestos fenólicos. Los terpenos
son una familia de compuestos derivados del isopreno, sintetizada por la misma
planta, gracias a una serie de reacciones metabólicas. Estas combinaciones de
sustancias no son de vital importancia para la planta pero son responsables del
olor característico de estos cítricos. En el caso de la naranja y toronja (Ayala et
al.,
2011) el compuesto de mayor presencia es el d-limoneno, y se reportan
concentraciones por alrededor del 90%.
28
Los métodos de extracción que generalmente se utilizan para obtener aceite
esencial son: hidrodestilación o prensado mecánico. EL primero consiste en hacer
ebullir una solución de CNR en agua, donde el vapor de la misma arrastrará
compuestos por afinidad, esta corriente posteriormente se hace pasar por un
intercambiador de calor y finalmente se separará por densidades quedando el
aceite esencial en la parte de arriba. En el caso del prensado se utiliza maquinaria
para romper la epidermis de la cáscara donde se encuentra el aceite,
posteriormente comienzan a crearse áreas con mucha presión por la acción de la
maquinaria, pero otras donde la presión es menor, provocando el flujo del aceite
por éstas y finalmente, la cáscara se raspa produciendo pequeños trozos de
residuos (Ayala et al., 2011).
Actualmente, existen varios estudios encaminados al aprovechamiento de la
fracción sólida de la naranja, como substrato de biorreacción en fase sólida para la
producción a bajo costo de ácidos orgánicos, particularmente ácido láctico
(Heliodoro
et al., 2008), el cual es ampliamente utilizado en la industria
alimentaria, médica, farmacéutica y cosmética, como materia prima para síntesis
orgánica, como purgante en forma de lactato de calcio o lactato de magnesio,
como removedor de sales de calcio en el curtido de pieles, en la producción de
plásticos biodegradables, agroquímicos, etc.
2.9 Composición de residuos cítricos naranja-toronja como material
lignocelulósico
Los residuos cítricos están compuestos principalmente de agua, azucares
solubles, fibra, ácidos orgánicos, aminoácidos, minerales, aceites esenciales,
flavonoides y vitaminas.
La fibra es el principal constituyente de los residuos de naranja-toronja y es un
material de la pared celular vegetal, en esta se puede encontrar: celulosa,
hemicelulosa, pectinas y lignina (Tabla 9). Las fibras son aquellos constituyentes
que dan firmeza, resistencia y textura fuerte a la estructura externa de las frutas.
29
Las pectinas conforman del 65 al 70% de la fibra total, la fibra restante está en
forma de celulosa, hemicelulosa y cantidades trazas de lignina (Milena et al.,
2008). En términos generales se puede decir que la fibra consta de: polisacáridos
estructurales o polisacáridos no almidón (celulosa, hemicelulosa, pectinas,
rafinosa, estafinosa), polisacáridos no estructurales (gomas y mucílagos) y
sustancias estructurales no polisacáridos (ligninas).
Tabla 9. Porcentajes de Celulosa, hemicelulosa y lignina en desechos cítricos
%(w/w) BS
%(w/w) BS
% (w/w) BS
Celulosa
Hemicelulosa
Lignina
10.86
2.62
13.8+-0.3
1.0+-0.3
Desechos cítricos 20.63
(bagazo y cáscara)
16.2+-0.5
Fuente: Sánchez et al., 2010
2.9.1 Pectinas
Las pectinas son polisacáridos no estructurales que se componen principalmente
de unidades de ácido galacturónico unidas por enlaces 1,4-α-glucosídicos. Son
sustancias blancas amorfas que forman en agua una solución viscosa;
combinadas en proporciones adecuadas con azúcar y ácidos forman una
sustancia gelatinosa utilizada como espesante (Valencia y Román, 2004).
2.9.2 Celulosa
Está conformada por subunidades de D-glucosa (monosacárido de gran
importancia en la fermentación), unidas por enlaces 1,4-β- glucosídicos. La
celulosa posee dos estructuras una cristalina (organizada) y otra amorfa. Las
capas de celulosa son “empaquetados” denominados fibrillas de celulosa. Estás
30
fibrillas de celulosa en su mayoría independientes y débilmente vinculados a
través de puentes de hidrógeno (Conde et al., 2012)
Cada cadena de celulosa está ligada a otras por puentes de hidrógeno que le
aportan rigidez al material. Si los enlaces son pocos la celulosa se considera
amorfa, mientras que una disposición especial de estos enlaces generan
diferentes formas cristalinas. Así la celulosa puede presentarse en cuatro
macroestructuras cristalinas denominadas celulosa I, II, III y IV. La celulosa I es la
que normalmente se encuentra en la pared celular. La clase II, es la más
termodinámicamente estable y resulta de la recristalización de la I o de su
mercerización en solución de hidróxido de sodio. Estás dos son las más
importantes al considerar los pretratamientos.
2.9.3 Hemicelulosa
Carbohidrato complejo y heterogéneo ya que su estructura posee diferentes
polímeros conformados por pentosas (xilosa y arabinosa), hexosas (manosa,
glucosa y galactosa), entrelazados entre sí glucosídicamente (Saha, 2003). La
hemicelulosa sirve de conexión entre la lignina y las fibras de celulosa.
La hemicelulosa suele ser un polímero de menor masa molar que la celulosa y
más fácilmente hidrolizable debido a su estructura predominantemente amorfa.
Las hemicelulosas, al igual que la celulosa, se han perfilado como fuente de
azúcares.
2.9.4 Lignina
Heteropolímero amorfo que consta de tres diferentes unidades de fenilpropano (pcoumaril, coniferil y alcohol sinapílico) que se mantienen unidos por diferentes
enlaces. El heteropolímero amorfo no es soluble en agua y es ópticamente activo;
todo esto hace que la degradación de la lignina sea muy complicada. Su función
en el ámbito estructural, es el de mantener unidos la celulosa y las hemicelulosas
entre sí (Arrizon et al., 2010).
31
2.10 Uso de residuos de naranja y toronja para la obtención de bioetanol
Las producción de naranjas es de 70 millones de toneladas en todo el mundo,
constituyen el fruto más consumido y representan el tercer fruto en extensión de
cultivo después de los plátanos y de las uvas (Escalante, 2009). Hoy en día se
encuentran cultivadas en todos los continentes, en zonas donde se tenga un clima
propicio, es decir abundancia de sol, agua y poca humedad ambiental, es por esto
que la producción de bioetanol a partir de residuos cítricos ha tenido mucho auge
en países tropicales como los que se reportan a continuación.
En 2009 la Universidad de Cartagena, Colombia, reportó un estudio sobre la
producción de bioetanol, a partir de cáscaras de naranja (Citrus sinensis) y piña
(Ananás sativus). En este trabajo se detectó el contenido de azúcares reductores
de los materiales lignocelulósicos de cada uno de los sustratos, después de un
pretratamiento ácido de las cascaras para obtener un jarabe glucosado, se
fermentó utilizando una cepa de Saccharomyces cerevisiae en un reactor de
agitación durante 7 horas. Se determinó el con tenido de etanol por cromatografía
de gases y se encontró finalmente que con las cáscaras de naranja se obtuvo
mayor contenido de etanol que con las cáscaras de piña (Tejeda, et al., 2009).
En Quito Ecuador, la Universidad Politécnica del Ejercito, hizo un estudio para la
obtención de bioetanol a partir de residuos de naranja Citrus sinensis,
provenientes del proceso agroindustrial en la provincia de Bolivar. En este
proyecto de investigación se realizó el pretratamiento de los desechos de naranja
con hidrólisis enzimática, mediante la acción de enzimas producidas por el hongo
Aspergillus sp. En los ensayos para fermentar loa azúcares provenientes de la
hidrólisis se ocuparon Saccharomyces cerevisiae y Zymomonas mobilis.
Finalmente se determinó mediante cromatografía de gases la concentración de
etanol (Albán y Freire, 2009).
32
3. JUSTIFICACIÓN
En 2008, se expidió en México la “Ley de promoción y desarrollo de los
bioenergéticos” la cual tiene como objetivos principales, promover la producción
de insumos para bioenergéticos, a partir de las actividades agropecuarias y
forestales del campo mexicano así como desarrollar, comercializar y utilizar
eficientemente los bioenergéticos, sin poner en riesgo la seguridad alimentaria del
país.
La industria procesadora de cítricos, desecha grandes cantidades de cáscaras de
naranja-toronja, que representan entre el 45 y 60% del peso total de la fruta, que
al no ser gestionados de manera conveniente provocan problemas ambientales
desaprovechando así el valor que éstas tienen como fuente potencial de insumo
para la elaboración de
productos de valor agregado ya que contienen
compuestos como azúcares fermentables solubles (glucosa, fructuosa y sacarosa)
y carbohidratos insolubles como pectinas, celulosa y hemicelulosa, los cuales
pueden ser hidrolizados a carbohidratos simples como, glucosa, galactosa,
arabinosa y xilosa. El uso de hidrolizados de residuos lignocelulósicos como las
cáscaras de naranja-toronja para la obtención biotecnológica de etanol constituye
una alternativa de uso de gran importancia social y económica
.
33
4. OBJETIVO GENERAL
Establecer de manera preliminar las condiciones para la obtención de etanol
utilizando un hidrolizado de cáscara de naranja y toronja y un cocultivo de Candida
tropicalis y Pichia stipitis
4.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Determinar las condiciones de hidrólisis de las cáscaras de naranja y
toronja

Determinar la composición química del hidrolizado de cáscaras de naranja y
toronja

Establecer las condiciones de fermentación del hidrolizado con Candida
tropicalis y Pichia stipitis.
 Determinar la eficiencia de bioconversión de xilosa a etanol
5. HIPÓTESIS
Es posible
establecer de manera preliminar las condiciones necesarias para
obtener bioetanol a partir de un hidrolizado de cáscaras de naranja y toronja y un
cocultivo de Candida tropicalis y Pichia stipitis.
34
6. MATERIAL Y MÉTODOS
El presente trabajo se realizó en el laboratorio 34 de Proyectos- Investigación de la
Facultad de Ciencias Químicas- Xalapa de la U.V. En la figura 7 se muestra el
diagrama de trabajo propuesto en este trabajo para la obtención de etanol a partir
de un hidrolizado de cáscaras de naranja-toronja.
Obtención de cáscaras de
naranja y toronja
Secado y molienda
Hidrolizado de las cáscaras
Determinación de la
composición química del
hidrolizado
Fermentación
Cuantificación de bioetanol
producido
Figura 7. Diagrama de trabajo para la obtención de etanol a partiir de un
hidrolizado de cáscaras de naranja-tronja.
35
26.1 Obtención de harina de cáscaras de naranja toronja
Las cáscaras de naranja
(Citrus sinensis) y toronja (Citrus paradasi), se
consiguieron en jugueras de la ciudad de Xalapa, Veracruz. Se les removió la
fibra, para que quedara unicamente la pared celular del fruto (cáscaras). Después
de esto se pesaron, secaron en un horno de convección Humboldt MFG.CO. y
finalmente se pulverizaron con ayuda de un mortero (Figura 8).
Figura 8. Cáscaras de naranja-toronja secadas en horno de convección
6.2 Hidrólisis ácida de la harina de cáscaras de naranja-toronja
Se mezclaron cantidades iguales de harina de cáscara de naranja y toronja y se
procedió a la hidrólisis en un matraz de 1000 mL, se añadió ácido sulfúrico al 2%
en una relación 1:5 colocando el matraz en el autoclave a 130°C durante 30
minutos. Se filtró y posteriormente se centrifugó a 2500 rpm a temperatura
ambiente por 20 min (Tejeda et al., 2009).
36
6.3 Microorganismos
Se utilizaron dos
levaduras: 1) Candida tropicalis IEC5-ITV aislada en el
Laboratorio de Bioingeniería de la Unidad de Investigación y Desarrollo de
Alimentos del Instituto Tecnológico de Veracruz a partir de bagazo de caña, 2)
Pichia stipitis NRRL-Y7124 proporcionada por el mismo laboratorio.
6.3.1 Conservación de las cepas
Las cepas se resembraron mensualmente en medios de conservación específicos,
el de Candida tropicalis IEC5-ITV contenía xilosa como fuente de carbono (Tabla
10) y el medio de conservación de Pichia stipitis NRRL-Y7124, glucosa (Tabla 11),
ajustando en ambos casos el pH a 5.5 y manteniéndolas a una temperatura de
4°C.
Tabla 10. Medio de conservación utilizado para C. tropicalis IEC5-ITV
Componente
Cantidad g/L
Agar
25.0
Extracto de levadura
10.0
D(+)Xilosa
20.0
Fuente: Gastélum,2007
Tabla 11. Medio de conservación para P. stipitis NRRL-Y7124
Componente
Cantida g/L
Agar
20.0
Extracto de levadura
10.0
D(+)Glucosa
20.0
Fuente:Gastélum, 2007
37
6.3.2 Activación de las cepas
Las cepas de C. tropicales IEC5-ITV y P. stipitis NRRL-Y7124 se activaron por
separado inoculando tres asadas de la levadura en 50 mL de un medio sintético
cuya composición se muestra en la tabla 12 y para Saccharomyces cerevisiae en
la tabla 13, contenidos en un matraz Erlenmeyer de 125 mL, ajustando el pH a 5.5,
incubando a 30°C, 24 horas a 150 rpm.
Tabla 12. Composición sel medio de activación para C. tropicalis y P. stipitis
Componente
Cantidad (g/L)
D(+)Xilosa
20.0
KH2PO4
5.0
(NH4)2SO4
2.0
Mg(SO4).7H2O
0.4
Extracto de levadura
1.0
Fuente: Gastélum, 2007
6.4 Medio de fermentación
El medio de fermentación utilizado fue el hidrolizado de cáscaras de naranjatoronja enriquecido con extracto de levadura (1.0 g/L), urea(3.0 g/L) y K 2HPO4 (5.0
g/L). Para evitar una disminución de la concentración de los componentes en el
medio de fermentación se esterilizaron por separado los azúcares del extracto de
levadura y urea, con esto también se evitan reacciones del tipo Maillard.
6.5 Preparación del inóculo para fermentación
Se activaron las levaduras en 50 mL de medio de activación contenido en un
matraz Erlenmeyer de 125 mL, inoculando con tres asadas de levadura
38
proveniente del medio de conservación e incubando a 30°C durante 24 horas a
250 rpm de agitación (Gastélum, 2007).
a) Determinación de viabilidad
Después de 24 horas de activación, se tomó una muestra de cada una de las
cepas cultivadas y se preparó una solución 1:1 con azul de metileo al 2%. Se dejó
reposar 10 min y posteriormente se llenó por capilaridad la cámara de Thoma, con
cada una de estas soluciones, la cámara de Thoma permite hacer un conteo de
celulas vivas y muertas utilizando el microoscopio en objetivo 40x (seco medio).
Para determinar la viabilidad del medio de activación se cuentan por separado las
células vivas, estás no se tiñen con el azul de metileno y las células muertas estan
completamente teñidas. A cada cultivo se le determino el porcentaje de viabilidad,
contando las células en 5 cuadros de la cámara de Thoma y aplicando la siguiente
formula:
%viabilidad=(células vivas/células totales) (100)
Donde:
Células totales= células vivas + células muertas
La viabilidad del cultivo debe ser mayor del 80% para ser utilizadas en la
fermentación.
b) Cuenta celular
El número de células se determinó por conteo empleando una cámara de Thoma.
Se preparó una solución 1:1 de medio de activación de 24 horas con azul de
metileno y se dejó reposar esta solución por 10 min. Posteriormente se lleno la
cámara de Thoma con dicha solución. Cada conteo fue realizado a partir de 5
cuadros de la cámara de Thoma. El volumen de cada cuadro es de 4x106. La
concentración de células (X) por mL de medio de fermentación está dada por la
ecuación:
39
X=(N)(D)(1x106) / (4)(n)
Donde:
N = Número de células contadas.
D = Disolución
n = número de cuadros grandes contados (5)
6.6 Fermentación
Se inocularon 6 x 106 células viables/mL a un matraz de 125 mL que contenían 50
mL de medio de fermentación enriquecido. Se realizó la fermentación en lote en
un agitador rotatorio a 250 rpm y 30°C por 48 horas. Los ensayos de fermentación
se llevaron a cabo de acuerdo a las condiciones indicadas en la tabla 14.
6.7 Determinación de los componentes del hidrolizado de cáscara de
naranja-toronja y productos de la fermentación por HPLC
Para la determinación de los productos de la hidrólisis y fermentación de la
cáscara de naranja-toronja: xilosa, glucosa, arabinosa y etanol se empleó un
cromatógrafo curter S, automuestreador 717 PLUS, controlador 600 con detector
de índice de refracción 2414 y adaptado a una columna Shodex 1011, usando una
fase móvil H2SO4 0.1N y velocidad de flujo de 0.6 ml/min a 55°C. Las muestras
fueron procesadas en el Laboratorio de Bioingeniería de la Unidad de Desarrollo
de Alimentos (UNIDA) del Instituto Tecnológico de Veracruz.
40
7. Resultados
7.1 Composición del hidrolizado de cáscara de naranja-toronja
Las condiciones para obtener el hidrolizado de las cáscaras de naranja-toronja
(HCNT) fueron similares a la propuesta para generar un hidrolizado de bagazo de
cáscara de piña (Méndez, 2010). Se procedió a la cuantificación de sus
componentes por HPLC, obteniéndose los resultados que se muestran en la Tabla
13.
Tabla 13. Composición del hidrolizado de cáscaras de naranja-toronja
Componente
Glucosa Xilosa Glicerol Acido
Etanol
acético
Hidrolizado
de
2.347
3.166
0
0.830
0
cáscaras
Aun cuando en la literatura consultada no se encontraron valores de referencia
con respecto al contenido de xilosa y glucosa en cáscara de naranja y toronja se
puede establecer que los determinados en este trabajo son bajos con respecto a
lo reportado para hidrolizados lignocelulósicos provenientes de otras fuentes como
cáscara de piña (Méndez, 2010) o bagazo de caña (Sánchez,2005) en donde se
determinaron concentraciones de
xilosa
entre 20-30
g/L, lo anterior puede
deberse a que el tiempo de hidrólisis fue insuficiente para liberar los azúcares
presentes en la celulosa y hemicelulosa. Como era lo esperado, la xilosa es el
principal carbohidrato presente en el HCNT, seguido de glucosa y ácido acético
(Agbogbo y Coward, 2008). P. stipitis y C. guillermondii son levaduras que tienen
la capacidad de fermentar xilosa (Agbogbo, 2006).
41
7.2 Producción de etanol por C. tropicalis IEC5-ITV, Pichia stipitis NRRLY7124 y el cocultivo de ambas
Candida tropicalis IEC5-ITV
(Figura 9 A) es una levadura autóctona que fue
aislada de bagazo de caña, en el laboratorio de Bioingeniería de la UNIDA del
Instituto Tecnológico de Veracruz. Esta cepa
ha mostrado capacidad para
sintetizar xilitol, un edulcorante de amplia aplicación en la industria alimentaria y
farmacéutica, pero también etanol a partir de xilosa obtenida de hidrolizados de
bagazo de caña de azúcar. Pichia stipitis por su parte (Figura 9 B) es capaz de
fermentar glucosa, xilosa, manosa, galactosa y celobiosa (Agbogbo y Coward,
2008).
A
B
Figura 9. Candida tropicalis IEC5-ITV (A) y Pichia stipitis NRRL-Y7124 (B)
Inicialmente se utilizó como medio de fermentación el HCNT diluido en una
proporción 1:1 con agua estéril sin adicionar ningún nutriente, debido a que se
pensó que el ácido acético presente podía inhibir el crecimiento de las levaduras.
Después de 24 h se encontró que no hubo crecimiento, por lo que se decidió no
diluirlo y adicionarles extracto de levadura, urea y fosfato monobásico que
estimularan el crecimiento microbiano. La decisión de adicionar estos nutrientes
42
fue con base a la mejoría de producción de biomasa observada en Candida
tropicalis IEC5-ITV utilizando un hidrolizado de bagazo de caña (Gastélum, 2007)
y a lo reportado por Agbogbo y Coward (2008) quienes observaron un estímulo del
crecimiento de varias especies de Pichia por la adición de varios compuestos
entre los que se encuentran los aquí agregados.
Cuando el medio de fermentación fue HCNT enriquecido sin diluir se favoreció la
producción de etanol (Figura 10) tanto en el caso en donde se utilizó una sola
cepa de levadura como en el cocultivo, el cual se inoculó en una relación 1:1.
Figura 10. Producción de etanol por Pichia stipitis NRRL-Y7124 (A), Candida
tropicalis IEC5-ITV (B) o un cocultivo de ambas (C) en relación 1:1 y
un hidrolizado de cáscaras de naranja y toronja como medio de
fermentación
43
En todos los casos la producción de etanol, fue casi en la misma concentración
(aproximadamente 1 g/L). Si bien los valores obtenidos son bajos, lo cual era
esperado puesto que la concentración de xilosa presente en el hidrolizado de
cáscaras de naranja y toronja era baja, resulta prometedor el uso de estos
microorganismos para la producción de etanol si se considera que esta cantidad
se obtuvo a partir de 3 g/L de xilosa, Méndez (2010) utilizando hidrolizado de
cáscara de piña obtuvo a partir de una concentración de xilosa de 20 g/L, en el
mejor de los casos 5 g/L de etanol.
7.3 Consumo de xilosa y glucosa por Candida tropicalis IEC5-ITV, Pichia
stipitis NRRL-Y7124 y el cocultivo de ambas
El consumo de xilosa a las 48 horas, en todos los casos, fue superior al 80%
(Tabla 14), aparentemente P. stipitis la consumió más rápido de manera individual
que en cocultivo. Los mayores rendimientos de etanol a partir de xilosa reportados
en la literatura
se han obtenido con Pichia stipitis, C. shehatae y Pichia
tannophilus (Agbogbo, 2006).
Tabla 14. Consumo de xilosa por Pichia stipitis NRRL-Y7124, Candida tropicalis
IEC5-ITV o un cocultivo de ambas en relación 1:1 presente en un
hidrolizado de cáscaras de naranja y toronja
Levadura
Consumo de xilosa (%)
C. tropicalis IEC5-ITV
90.9
Pichia stipitis NRRL-Y7124
96.7
Cocultivo
87.9
En la Figura 11 se puede observar que C. tropicalis consumió la xilosa presente
en el HCNT casi totalmente hasta las 24 h mientras que P. stipitis y el cocultivo a
las 8 h. Esto puede indicar que P. stipitis tiene como sustrato preferencial xilosa
44
mientras que en C. tropicalis
lo es la glucosa, la cual una vez agotada es
sustituida por la xilosa como fuente de carbono.
Figura 11. Consumo de xilosa por Pichia stipitis NRRL-Y7124 (A), Candida
tropicalis IEC5-ITV (B) o un cocultivo de ambas (C) en relación 1:1
contenida en un hidrolizado de cáscaras de naranja y toronja
La glucosa, otro azúcar presente en el medio de fermentación, se consumió
totalmente a las 8 h en todos los casos (Figura 12). Esto se justifica ya que la
glucosa es una fuente de carbono preferente por los microorganismos (Weber,
2010) y estuvo presente en el medio de fermentación en baja concentración
(alrededor de 1-2 g/L).
45
Figura 12. Consumo de glucosa presente en un HCNT por Candida tropicalis
IEC5-ITV (A), Pichia stipitis NRRL-Y7124 (B) y un cocultivo con ambas
cepas (C)
7.4 Producción de xilitol por C. tropicalis IEC5-ITV, Pichia stipitis NRRLY7124 y el cocultivo
Dependiendo de las condiciones de cultivo, la xilosa puede ser bioconvertida por
algunas levaduras a etanol o xilitol. En este estudio tanto C. tropicalis como P.
stipitis también sintetizaron xilitol al inicio de la fermentación (Figura 12), pero
aparentemente después fue consumido. Lo anterior puede deberse a que el xilitol
pudo haber sido empleado por los microorganismos como fuente de carbono
46
7.4 Consumo de ácido acético por C. tropicalis IEC5-ITV, Pichia stipitis
NRRL-Y7124 y el cocultivo de ambas cepas
El ácido acético es otro compuesto que invariablemente se genera al hidrolizar
materiales lignocelulósicos, esto se debe a la liberación de los grupos acetilo
unidos a la materia prima
Figura 13. Producción de xilitol por Candida tropicalis IEC5-ITV (A), Pichia stipitis
NRRL-Y7124(B) y un cocultivo con ambas cepas (C) a partir de un
hidrolizado de cascaras de naranja-toronja
Algunos autores lo consideran como un compuesto tóxico a las levaduras
productoras de etanol (Rodríguez et al., 2001; Martínez et al., 2002), sin embargo
en este trabajo se encontró que P. stipitis y el cocultivo lo consumieron totalmente
en las primeras ocho horas mientras que C. tropicalis IEC5-ITV (Figura 14) lo hizo
a las 24 horas. Estudios previos con C. tropicalis IEC5-ITV (Sánchez, 2010) han
47
mostrado que el ácido acético no sólo no le resulta tóxico sino que lo utiliza como
fuente de carbono; se ha reportado que Candida guillermondii también consume
ácido acético
cuando se utiliza como medio de fermentación hidrolizado de
bagazo de caña (Díaz, 2011). El consumo de ácido acético estuvo relacionado con
un aumento de pH a lo largo de la fermentación (Tabla 15).
0.07
Acido acético (g/L)
0.06
0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
0
0
8
16
24
32
40
48
Tiempo de fermentación (g/L)
Figura 14. Consumo de ácido acético presente en un HCNT por Candida
tropicalis IEC5-ITV (A)
Tabla 15. Valores de pH obtenidos en el caldo de fermentación a base de HCNT
y dos especies de levadura
pH
Tiempo (h)
C. tropicallis
P. stipitis
Cocultivo
8
5.2
5.5
5.1
16
5.3
5.5
5.3
24
5.3
6.1
5.6
32
6.2
5.4
6.3
40
5.8
6.7
6.3
48
5.5
7.6
6.3
48
8.5 Determinación de parámetros fermentativos
Varios parámetros tales como la producción de etanol, productividad volumétrica
de etanol
y eficiencia de bioconversión de sustratos a productos, entre otras
medidas se utilizan para evaluar los procesos de fermentación.
8.5.1 Productividad volumétrica
En la Figura 15 se observan los resultados de productividad volumétrica de etanol
(gramos de etanol obtenidos por litro de medio de fermentación en una hora),
obtenidos con las dos levaduras de manera individual y en cocultivo No se
encontraron diferencias significativas de este parámetro en las diferentes
condiciones probadas en este parámetro. Los valores obtenidos con respecto a
este parámetro son bajos pero no se pueden comparar con los reportados en la
literatura debido a que las condiciones de fermentación son diferentes.
0.025
Qp (g/L.h)
0.02
0.015
0.01
0.005
0
Ct
Ps
Cc
Figura 15. Productividad volumétrica de xilitol (QP) calculada para cada una de
las levaduras evaluadas: Ct= Candida tropicalis IEC5-ITV; Ps= Pichia
stipitis NRRL Y7124; Cc= cocultivo
49
7.5. Rendimiento
La Figura 16 muestra los resultados obtenidos al calcular el parámetro
rendimiento, es decir gramos de etanol obtenido por gramo de xilosa consumida
se observa que C. tropicalis muestra una mejor conversión de xilosa a etanol,
mejorándose de manera notable (28%) cuando se utiliza el cocultivo. los valores
obtenidos entran en los rangos reportados en la literatura (0.47-0.5 g/g).
0.6
0.55
0.5
0.43
Y (g/g)
0.4
0.35
0.3
0.2
0.1
0
Ct
Ps
Cc
Figura 16. Rendimiento (YP/S) calculado para cada una de las cada una de las
levaduras evaluadas: Ct= Candida tropicalis IEC5-ITV; Ps= Pichia
stipitis NRRL Y7124; Cc= cocultivo
7.5.2 Eficiencia de Bioconversión
Este es el parámetro más importante en los procesos de fermentación ya que
indica de manera general la capacidad que tiene el sistema, bajo las condiciones
establecidas, de realizar la bioconversión de xilosa a etanol. En la Figura 17 se
presentan los resultados obtenidos.
50
70
60
η (%)
50
40
30
20
10
0
Ct
Ps
Cc
Figura 17. Eficiencia de bioconversión (η%) calculada para cada una de las
levaduras evaluadas: Ct= Candida tropicalis IEC5-ITV; Ps= Pichia
stipitis NRRL Y7124; Cc= cocultivo
Resulta interesante el hecho de que aparentemente Candida tropicalis IEC5-ITV,
Pichia stipitis NRRL Y7124 y el cocultivo producen casi la misma cantidad de xilitol
(1 g/L), sin embargo al observar las eficiencias de bioconversión es evidente que
el cocultivo es la mejor opción para la generación de etanol a partir de hidrolizado
de cáscara de naranja y toronja, por lo que es necesario continuar con la
realización de estudios tendientes para la optimización del proceso que de manera
preliminar se ha propuesto en este trabajo
51
8. Conclusiones
Los resultados obtenidos con respecto a la composición del medio de
fermentación hace necesario mejorar las condiciones de hidrólisis.
La producción de etanol fue similar tanto en el cocultivo como mediante el uso de
cada una de las levaduras probadas de manera individual sin embargo la
eficiencia de bioconversión fue mayor para el cocultivo.
El rendimiento en la obtención de etanol a partir de cáscaras de naranja y toronja
es muy bajo, sin embargo teniendo en cuenta que hubo una deficiente hidrolisis y
que as cáscaras son un residuo no aprovechado a gran escala puede constituirse
en una alternativa de interés.
52
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