técnicas de reproducción asistida tinciones para la evaluación de la
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UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR DECANATO DE ESTUDIOS PROFESIONALES COORDINACIÓN DE BIOLOGÍA TÉCNICAS DE REPRODUCCIÓN ASISTIDA. TINCIONES PARA LA EVALUACIÓN DE LA MORFOLOGÍA ESPERMÁTICA Por: Karina Delia Nieto Dionisio INFORME DE PASANTÍA Presentado ante la Ilustre Universidad Simón Bolívar como requisito parcial para optar al título de Licenciatura en Biología Sartenejas, Abril de 2010 UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR DECANATO DE ESTUDIOS PROFESIONALES COORDINACIÓN DE BIOLOGÍA TÉCNICAS DE REPRODUCCIÓN ASISTIDA. TINCIONES PARA LA EVALUACIÓN DE LA MORFOLOGÍA ESPERMÁTICA . Por: Karina Delia Nieto Dionisio Realizado con la asesoría de: Tutor Académico: Prof. René Utrera Tutor Industrial: Dra. María Teresa Urbina INFORME DE PASANTÍA Presentado ante la Ilustre Universidad Simón Bolívar como requisito parcial para optar al título de Licenciada en Biología Sartenejas, Marzo de 2010 2 Resumen La infertilidad se define como la imposibilidad de una pareja de lograr un embarazo después de un año de vida sexual activa, sin utilizar anticonceptivos. El 15-20% de las parejas en edad reproductiva son infértiles, de las cuales 50% presentan un factor masculino. El diagnóstico se realiza a través del espermograma, que incluye el estudio de la concentración, movilidad y morfología espermáticas. La morfología espermática (ME) anormal se ha asociado con infertilidad y bajas tasas de embarazo. Se compararon los resultados de ME por tinción con DiffQuik y con Testsimplets®, en muestras seminales de 30 pacientes de la unidad de fertilidad UNIFERTES, ubicada en la Clínica el Ávila, Altamira, Caracas – Venezuela. No existen diferencias significativas en el porcentaje de espermatozoides morfológicamente normales, siguiendo el criterio estricto de Kruger, entre ambas tinciones. Sí se obtuvieron diferencias significativas en cuatro defectos morfológicos de dieciséis entre tinción: cabeza piriforme, pieza media doblada, irregular o con gota citoplasmática. Se observó que se podría analizar el tipo de células redondas en semen con Testsimplets® en vez de con el test de peroxidasa. Se concluye que Testsimplets® permite ahorrar tiempo y mejorar la eficiencia del laboratorio de Andrología en la entrega de resultados, importante en la evaluación clínica; pero es mucho más costoso que Diff-Quik. IV A mis padres A mi mejor amigo A mis mejores amigas V En este trabajo que culmina cinco años y medio de estudios, quiero agradecer sinceramente a las siguientes personas, que fueron parte importante de mi vida durante esos años (y más). Todo mi agradecimiento, cariño y amor a mis padres, por ser como son. A David Ospino, mon meilleur ami, por su apoyo y paciencia, y por ceder. A las chicas Degamark: A Gabriela Marques, por su linda amistad de 17 años so far, pronto serán bodas de porcelana! A Debora Deutsch, por ser una gran amiga, una chica práctica y por darme siempre su apoyo. A Martha Rodríguez, socia de gelatinas, por darme su gran amistad y compañía, y al chico Degamark Daniel Levy, por su apoyo y sinceridad, y a todos por su comprensión, las tardes de Wii y los almuerzo-cenas que alegran siempre el día. A la familia Ospino-Mantilla, por aceptarme y tenderme su ayuda cuando lo necesité. A todas y todos aquellos amigas(os) que hice en la universidad, biólogos y no biólogos, por ser los mejores compañeros de estudios que cualquier podría desear. A mi madrina Luisa, a antiguos(as) amigos(as) y profesores y todos aquellos que fueron parte de mi vida durante mis años escolares, y siguieron siendo parte de ella en estos años universitarios. Si estás leyendo esto, eres alguien importante para mí. A las chicas del laboratorio de Andrología, enfermeras, secretarias y doctores por su ayuda y simpatía durante la realización de mi pasantía. Finalmente, mi enorme agradecimiento a mis tutores por ofrecerme parte de su tiempo y todo su apoyo. VI Contenido Introducción ................................................................................................................................................... 16 Descripción de la empresa ............................................................................................................................. 20 1 2 3 Bases fisiológicas del estudio andrológico y de la fecundación humana............................................... 21 1.1 Anatomía del testículo ................................................................................................................... 21 1.2 Espermatogénesis .......................................................................................................................... 22 1.3 Capacitación y reacción acrosómica .............................................................................................. 25 1.4 Fecundación ................................................................................................................................... 26 1.5 Forma del espermatozoide normal ................................................................................................ 29 1.5.1 Cabeza .................................................................................................................................... 29 1.5.2 Flagelo .................................................................................................................................... 30 Características del Laboratorio de In Vitro............................................................................................. 32 2.1 Construcción, ubicación, equipos y materiales del Laboratorio de In Vitro: ................................. 32 2.2 Medios de cultivo utilizados en el Laboratorio de In Vitro ............................................................ 35 Técnicas observadas en la empresa ....................................................................................................... 37 3.1 Espermograma ............................................................................................................................... 38 3.1.1 La licuefacción ........................................................................................................................ 39 3.1.2 La viscosidad de la muestra.................................................................................................... 39 3.1.3 La presencia o ausencia de moco........................................................................................... 40 3.1.4 El volumen .............................................................................................................................. 40 3.1.5 El pH ....................................................................................................................................... 40 3.1.6 El color de la muestra ............................................................................................................. 40 3.1.7 La presencia o ausencia de detritus celular o bacterias......................................................... 41 3.1.8 La cantidad y tipo de células redondas .................................................................................. 41 3.1.9 La aglutinación espermática y la prueba inmunológica MAR Test ........................................ 42 3.1.10 La concentración espermática ............................................................................................... 43 3.1.11 La movilidad espermática....................................................................................................... 45 3.1.12 La vitalidad espermática......................................................................................................... 46 3.1.13 La morfología espermática (ME) ............................................................................................ 47 3.1.14 La integridad del acrosoma .................................................................................................... 47 VII 4 3.1.15 La Recuperación de Espermatozoides Móviles (R.E.M.): ....................................................... 48 3.1.16 La sobrevida espermática....................................................................................................... 49 3.2 Análisis de la Fragmentación del ADN............................................................................................ 49 3.3 Técnicas de Reproducción Asistida ................................................................................................ 52 3.3.1 Inseminación Intrauterina (IIU) .............................................................................................. 52 3.3.2 Fecundación in Vitro (FIV) ...................................................................................................... 54 3.3.2.1 Aspiración Folicular……………….…………………………….…………….………..………………….……….54 3.3.2.2 Transferencia de embriones…………….……………………………………………………………………….55 3.3.3 ICSI .......................................................................................................................................... 57 3.3.4 Diagnóstico Genético Preimplantacional (DGP) ..................................................................... 59 3.4 Vitrificación de embriones ............................................................................................................. 59 3.5 Prueba de embarazo ...................................................................................................................... 61 Comparación de dos técnicas de evaluación de la morfología espermática ......................................... 63 4.1 Importancia del estudio de la morfología espermática (ME) ........................................................ 63 4.2 ¿Qué factores pueden afectar la morfología espermática? .......................................................... 67 4.2.1 Químicos................................................................................................................................. 67 4.2.2 Físicos y Fisiológicos ............................................................................................................... 68 4.2.3 Genéticos................................................................................................................................ 70 4.3 Aneuploidías espermáticas y ME. .................................................................................................. 72 4.4 Embriones aneuploides .................................................................................................................. 72 4.5 Estudio de la ME ............................................................................................................................. 74 4.6 Sistemas de clasificación para medir la morfología espermática humana .................................... 75 4.6.1 OMS ........................................................................................................................................ 75 4.6.2 Criterio estricto de Kruger ...................................................................................................... 77 4.7 Técnicas para evaluar la morfología espermática.......................................................................... 80 4.7.1 Tinciones ................................................................................................................................ 81 4.7.2 Analizadores computarizados ................................................................................................ 84 4.7.3 Análisis basado en la birrefringencia espermática ................................................................. 87 4.7.4 Selección por microscopía de alto aumento para IMSI.......................................................... 92 4.8 Materiales y Métodos .................................................................................................................... 95 4.9 Comparación y Resultados ............................................................................................................. 97 4.9.1 Defectos morfológicos observados en las muestras .............................................................. 97 4.9.2 Comparación de espermatozoides normales entre tinciones Testsimplets® y Diff-Quik .... 101 VIII 4.9.3 Comparación de espermatozoides piriformes y alargados entre tinciones Testsimplets® y Diff-Quik 103 4.9.4 Defectos morfológicos ......................................................................................................... 104 4.9.5 Comparación entre leucocitos/células redondas espermáticas .......................................... 106 4.10 Discusión ...................................................................................................................................... 107 5 Conclusiones y recomendaciones ........................................................................................................ 113 6 Referencias ........................................................................................................................................... 114 IX Índice de tablas Tabla 3.1 Nomenclatura de algunas variables espermáticas. (OMS, 1999) ................................................................... 45 Tabla 4.1 Estudios que analizan la asociación entre parámetros seminales y los resultados in Vitro. Modificado de Coetzee et al. (1998). ...................................................................................................................................................... 63 Tabla 4.2 Los resultados de ANOVA mixto muestran la influencia de los ovocitos y los espermatozoides en la morfología embrionaria y en la tasa de clivaje de los blastómeros. Tomado de Salumets et al. (2002). ...................... 64 Tabla 4.3 Variables dependiendo de la ME en muestras de pacientes tratados mediante ICSI. Modificado de De Vos et al. (2003). ................................................................................................................................................................... 65 Tabla 4.4 Correlación por ANOVA entre algunos parámetros seminales y el desarrollo y calidad de los blastocistos. La ME está correlacionada con el desarrollo del blastocisto. NS: No significativo. Tomado de Miller y Smith (2001). . 66 Tabla 4.5 Morfología estricta de Kruger y resultados de ICSI. DE: desviación estándar. Se observan los grupos según su % de espermatozoides morfológicamente normales y los resultados obtenidos en varios pasos de ICSI. Modificado de French et al. (2009). ................................................................................................................................................... 67 Tabla 4.6 Resultados de embarazo clínico entre un grupo normal y un grupo teratozoospérmico. Tomado de Dubey et al. (2008). ................................................................................................................................................................... 73 Tabla 4.7 Tasa de fecundación por ovocito y proporción observada de embarazos en los distintos grupos basados en el porcentaje de espermatozoides morfológicamente normales. Modificado de Kruger et al. (1986). Se observa un umbral de proporción de embarazos entre el grupo I y los demás................................................................................. 78 Tabla 4.8 Comparación entre los criterios estricto y de la OMS para analizar la ME. ................................................... 79 Tabla 4.9 Comparación de las tasas de fecundación, embarazo, implantación y aborto obtenidos de grupos tratados mediante ICSI e IMSI (inyección intracitoplasmática de espermatozoides morfológicamente seleccionados). a b Modificado de Antinori et al. (2007). P = 0.004; P = 0.007........................................................................................... 94 Tabla 4.10 Fotografías de características morfológicas espermáticas observadas durante el estudio. ........................ 97 Tabla 4.11 Fotografías de células redondas observadas en ambas tinciones. ............................................................. 100 Tabla 4.12 Resumen estadístico de los datos de espermatozoides normales contados de acuerdo a ambos tratamientos. ................................................................................................................................................................ 102 Tabla 4.13 Prueba-t para comparar las medias de los datos de espermatozoides normales para ambos tratamientos.102 Tabla 4.14 Comparación de cabezas alargadas y piriformes observadas con Testsimplets® y Diff-Quik. ................... 103 Tabla 4.15 Defectos morfológicos con diferencias estadísticas entre tinciones. .......................................................... 105 Tabla 4.16 Resumen estadístico del contaje de células redondas de la línea espermática (LE) y de la línea blanca (LB), tanto en el test de peroxidasa (per) como en el kit de Testsimplets® (ts). ........................................................... 106 Tabla 4.17 Prueba-t para comparar las medias del número de células redondas de las líneas blanca y espermática, evaluadas tanto en el test de peroxidasa como con el kit de Testsimplets®. ............................................................... 106 X Índice de figuras Figura 1.1 Partes del testículo humano. Tomado de: Ballescá (1999). ........................................................................ 21 Figura 1.2 Proceso de espermatogénesis dentro del túbulo seminífero. Modificado de: Pagés y Aller 2006. ............ 23 Figura 1.3 Proceso de espermiogénesis. La imagen representa los cambios que sufre la espermátide para convertirse en espermatozoide; así como la morfología final y normal del mismo. Modificado de: Gilbert 2005. ..... 25 Figura 1.4 Formación del acrosoma. Modificado de: O’Day 2008............................................................................... 25 Figura 1.5 Proceso de unión de los pronúcleos. Tomado de: Pagés y Aller (2006). ..................................................... 27 Figura 1.6 Embrión en división. Etapas de 2, 4, 6 y 8 células. Tomado de: Pagés y Aller 2006. .................................. 28 Figura 1.7 Viaje de los espermatozoides desde el testículo (derecha) hasta el sistema reproductor femenino (izquierda). Tomado de Luconi et al (2006). ................................................................................................................. 29 Figura 1.8 Fisiología de un espermatozoide normal. Se observa la cabeza, pieza media, flagelo, segmento final, acrosoma, núcleo, centriolos, mitocondrias, axonema y membrana celular. .............................................................. 31 Figura 3.1 A. Gran cantidad de células redondas en una muestra seminal fresca, evaluada a 400x en un microscopio de contraste de fases. B. Célula redonda de la línea blanca (flecha blanca) y célula redonda espermática (fecha negra), durante el test de Peroxidasa, a un aumento de 400x. .................................................................................... 42 Figura 3.2 Aglutinación espermática y prueba de MAR test. En la figura A, se observan espermatozoides aglutinados al microscopio óptico a un aumento de 400x. En la figura B, se observan dos portaobjetos sobre los cuales se realiza la prueba de MAR test: la gota azul corresponde a partículas con IgG, la gota roja corresponde a partículas con IgM, la gota verde corresponde a partículas con IgA. Cada gota tiene alrededor una gota de muestra seminal y una de antisuero de cada Ig. .................................................................................................................................................... 43 Figura 3.3 Cámara de Neubauer para calcular la concentración espermática (A). En la figura B se observa la cuadrícula central de la cámara, en un microscopio de contraste de fases a un aumento de 400x. Los cuadros rojos remarcan aquellos cuadros donde se contarán los espermatozoides. ......................................................................... 44 Figura 3.4 Evaluación espermática al microscopio de contraste de fases a un aumento de 400x. .............................. 46 Figura 3.5 Evaluación de la vitalidad espermática al microscopio óptico a un aumento de 400x. Se observan espermatozoides vivos (sin teñir, círculo azul) y muertos (teñidos, círculo rojo). ......................................................... 47 Figura 3.6 Evaluación de la integridad del acrosoma en espermatozoides. En la figura A se observa un espermatozoide con el acrosoma intacto. En la figura B se observa un espermatozoide reaccionado. Se observa en un microscopio óptico a un aumento de 400x. ............................................................................................................. 48 Figura 3.7 Recuperación de espermatozoides móviles, luego de centrifugar la muestra a través de un gradiente de densidad (figura A), y lavar el pellet obtenido en medio especial (figura B). ............................................................... 49 Figura 3.8 Tanque de nitrógeno líquido y pajuelas con muestras seminales congeladas. En el Laboratorio de in Vitro, se utilizan unos tanques iguales pero en las pajuelas estarán los ovocitos y los embriones criopreservados. ............ 61 Figura 3.9 Pruebas cualitativas de embarazo, en las cuales se les agrega unas gotas de suero sanguíneo al círculo del lado derecho. Si se observan dos marcas rojas, la paciente está embarazada. ..................................................... 62 XI Figura 4.1 Distribución porcentual de embriones normales y anormales, luego de realizar un DGP, entre un grupo normal y un grupo teratozoospérmico. Tomado de Dubey et al. (2008). ..................................................................... 74 Figura 4.2 Tipos de defectos en cabeza, cuello, pieza media y flagelo. Modificado de: OMS (1999). .......................... 77 Figura 4.3 Técnica para realizar el frotis para la evaluación de la morfología espermática. Tomado de OMS, 1999.81 Figura 4.4 Soluciones de la tinción de Diff-Quik. De izquierda a derecha: fijador, solución 1 con eosina Y, y solución 2 con azul de metileno..................................................................................................................................................... 82 Figura 4.5 Kit de Testsimplets® de la empresa Waldeck. Se puede observar la lámina donde se colocará la muestra seminal, la caja contenedora de las láminas, y la caja contenedora de los cubreobjetos............................................ 83 Figura 4.6 Regresiones lineales significativas (P < 0.05) entre la tasa de fecundación y los parámetros morfométricos de la cabeza de espermatozoides seleccionados por swim-up, para pacientes tratados mediante ICSI (a y b); y entre el establecimiento del embarazo y los parámetros morfométricos de espermatozoides seleccionado por swim-up, para pacientes que siguen la IIU (c y d) (a, área: r = -0.661; b, perímetro; r = -0.573; c, área de la cabeza: r = -0.619; d, perímetro de la cabeza: r = -0.595). Tomado de Soler et al. (2005). ........................................................................ 86 Figura 4.7 Gráfica de la tasa de fecundación (eje de ordenadas) dependiendo del porcentaje medio de espermatozoides con cabezas con forma normal (oval) en eje de abcisas (r = 0.696. P < .001). Modificado de ElGhobashy y West (2003)............................................................................................................................................... 87 Figura 4.8 Birrefringencia. (A) En un material isótropo, un haz de luz se refracta en un rayo emergente. (B) En un material anisótropo, un haz de luz se refracta en dos rayos de luz de diferentes velocidades: Uno rápido y otro lento. La diferencia de los índices de refracción de estos rayos se denomina retardancia. Modificado de: Gianaroli et al. b 2008 . ........................................................................................................................................................................... 89 Figura 4.9 Bajo luz polarizada, se puede diferenciar entre espermatozoides en los cuales la reacción acrosómica ocurrió (A) o no (B), o espermatozoides con un patrón de birrefringencia alterado (C). En B, es evidente la birrefringencia en la pieza media, así como en la cabeza, acrosoma y núcleo. En C, la alteración de la birrefringencia b se debe a la presencia de una vacuola en la cabeza y en la pieza media. Modificado de Gianaroli et al. (2008 )....... 90 Figura 4.10 Comparación de resultados entre el grupo control (barras negras) y grupo de estudio (barras grises). (A) Tasa de embarazo por transferencia de embrión en relación a la calidad de la muestra seminal. (B) Tasa de implantación en relación a la calidad de la muestra seminal. OAT=oligoastenoteratospérmicos (Tomado de: a Gianaroli et al. (2008 )). ............................................................................................................................................... 91 Figura 4.11 Un espermatozoide normal móvil a alto aumento (x6100), sin teñir y sin fijar. La base de la cabeza se señala con una flecha roja y una B. Tomado de Cassuto et al. (2009). ........................................................................ 92 Figura 4.12 Correlación entre la tasa de fecundación en ICSI y dos parámetros de MSOME. (a) Espermatozoides morfológicamente normales. (b) Espermatozoides con núcleo morfológicamente normal. Tomado de Bartoov et al. (2002). .......................................................................................................................................................................... 94 Figura 4.13 Gráfico de caja y bigotes de porcentaje de espermatozoides normales calculados en una lámina de Testsimplets® (abajo), y teñidos con Diff-Quik (arriba). ............................................................................................. 101 Figura 4.14 Porcentaje promedio de espermatozoides con defectos de cabeza alargada y piriforme, según la tinción utilizada. ..................................................................................................................................................................... 104 XII Figura 4.15 Gráfico de caja y bigotes de porcentaje de espermatozoides piriformes calculados en una lámina de Testsimplets® (abajo), y teñidos con Diff-Quik (arriba). ............................................................................................. 104 Figura 4.16 Promedios de defectos morfológicos observados que presentaban diferencias significativas entre tinciones. .................................................................................................................................................................... 105 Figura A.1 Esquema de la realización del proyecto de pasantía…………………………………………………………………………….130 Figura A.2 Corte sagital de la cabeza de un espermatozoide humano. Se puede observar la cabeza espermática (CE) de lado, y la pieza media (PM). Tomado de: De Jonge y Barratt (2006)………………………………………………………………..130 XIII Lista de símbolos µl Microlitros XIV Lista de abreviaturas DGP Diagnóstico Genético Preimplantacional FIV Fecundación in Vitro ICSI Inyección intracitoplasmática de espermatozoides Ig Inmunoglobulina IIU Inseminación intrauterina ME Morfología espermática OMS Organización Mundial de la Salud ROS Reactive Oxygen Species o Especies óxido-reactivas TRA Técnicas de Reproducción Asistida XV Introducción 1 Introducción La Organización Mundial de la Salud reconoce que la infertilidad es una enfermedad del sistema reproductivo y la define como la imposibilidad de una pareja de lograr un embarazo después de un año de vida sexual activa, sin utilizar anticonceptivos (Zegers-Hochschild et al., 2009). Debido a que la mayoría de las parejas desea formar una familia y tener un hijo, la presencia de la infertilidad puede tener un impacto negativo sobre el desarrollo del individuo, aunque no sea un factor que amenace su vida (Brugo-Olmedo et al., 2003). La infertilidad ha sido un problema social y médico importante que ha acompañado desde siempre al ser humano, y dependiendo de las concepciones socioculturales alrededor del significado de todo lo concerniente a la reproducción, su impacto ha sido mayor o menor en las sociedades (Álvarez Díaz, 2007). En la antigüedad, las civilizaciones adoraban a deidades de la fertilidad, representadas al principio en estatuas y figurinas femeninas, pero eventualmente Aristóteles (384 – 332 a.C.) sugirió la presencia de órganos especializados para cada sexo, una edad y un período fértiles, estableciendo así la transformación desde la adoración de dioses a la deducción de los requerimientos reproductivos (Barany, 2008). Actualmente, el 15-20% de las parejas en edad reproductiva son infértiles (BrugoOlmedo et al., 2003). Cuando la pareja no logra concebir un hijo luego de cierto tiempo, visita al ginecólogo, quien procederá a realizarles una cuidadosa historia clínica y un exhaustivo examen médico, básicamente para determinar que la mujer ovula, que el semen del hombre es normal y que el canal genital es normal (Pérez y Lucena, 2008). Alrededor del 50% de estas parejas serán diagnosticadas con un factor masculino (Hellani, 2005), el otro 50% presentarán un factor femenino, y 10% del total presentarán factores mixtos. Las causas de la infertilidad pueden ser múltiples, pero las más aceptadas son las causas genéticas y ciertas alteraciones anatómicas del útero, como las malformaciones, las adherencias intrauterinas (Vanrell, 1999), la obstrucción de las trompas, los problemas en la ovulación y los problemas masculinos, entre otros. Las demás causas siguen en discusión ya que sólo en la mitad 2 de los casos “se establece un diagnóstico etiológico seguro” (Vanrell, 1999). Entre estas causas discutibles se pueden encontrar la presencia de infecciones, como por toxoplasmosis, por clamidias, por herpes o citomegalovirus; los trastornos inmunológicos, como la presencia de anticuerpos antiespermáticos en la pareja; las enfermedades sistémicas, como las enfermedades cardiovasculares; la presencia de drogas, como el tabaco y el alcohol; los químicos tóxicos y las radiaciones ionizantes; la presencia de diabetes mellitus u otras endocrinopatías; y en el caso del hombre, la presencia de alteraciones en la meiosis, de alteraciones mecánicas o funcionales que impidan la eyaculación, y la calidad seminal pobre (Vanrell, 1999). El examen que brinda la visión más amplia de la capacidad reproductiva del hombre, y el que hasta ahora sigue siendo la forma de detectar el factor masculino, es el espermograma, que incluye el estudio de la concentración, movilidad y morfología espermáticas (Munuce, 2008; Vásquez y Vásquez, 2007). La pobre calidad seminal está representada entonces por parámetros anormales, como concentración espermática baja (denominada oligozoospermia), movilidad espermática baja (astenozoospermia) y morfología espermática (ME) anormal (teratozoospermia). La Organización Mundial de la Salud (OMS) ha estandarizado los procedimientos para el análisis del semen humano para unificar criterios entre los diferentes laboratorios (OMS, 1999). Dependiendo de los resultados obtenidos de los exámenes, el ginecólogo procederá a indicarle a la pareja cuál puede ser la mejor técnica en Reproducción Asistida, sea una inseminación artificial, una fecundación in vitro o una inyección intracitoplasmática de espermatozoides, para lograr el tan preciado objetivo de concebir un bebé sano. Las técnicas de reproducción asistida (TRA) tales como la inseminación intrauterina (IIU), la fecundación in Vitro (FIV) convencional, y especialmente la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI), permiten a las parejas con características espermáticas deficientes tener un embarazo. Hace varios años, algunas de estas parejas tenían que utilizar donación de semen para lograr un hijo (Benchaib et al., 2003). El porcentaje de espermatozoides morfológicamente anormales ha sido asociado con las tasas de fecundación, clivaje embrionario, implantación e infertilidad en humanos (Branzini et 3 al., 2008; El-Ghobashy y West, 2003; Salumets et al., 2002, Huang et al., 2005). Otros estudios proponen además que esta relación pueda verse afectada por otras variables, como la concentración espermática o los riesgos de las técnicas utilizadas (French et al., 2009; Keegan et al., 2007; Miller y Smith, 2001). Existen diversos métodos para evaluar la ME en una muestra seminal: desde fijar sobre un portaobjetos la muestra seminal, teñirla posteriormente y evaluarla a un aumento de 1000x, pasando por la evaluación a alto aumento de los espermatozoides sin teñir (con aumentos hasta de 6000x), hasta la evaluación de las células espermáticas basándose en la birrefringencia propia de las estructuras celulares (Gianaroli et al., 2008ª; Gianaroli et al., 2008b). Dos de las tinciones más utilizadas son la de Diff-Quik y la de Testsimplets®. Según una encuesta realizada por Ombelet et al. (1997) de 170 personas que respondieron en el mundo: 33,5% usa tinción Papanicolau, 22,9 % usa tinción Diff-Quick, 4,7% usa tinción Shorr y sólo 6,5% usa Testsimplets®. Además del poco uso de Testsimplets® en el mundo, existe muy poca información publicada disponible acerca de este test y son trabajos que se realizaron con otros sistema de clasificación de ME diferentes al criterio estricto de Kruger, mucho antes de que éste fuera publicado y de que fuera aceptado por la OMS. Los estudios publicados son: Schirren et al. (1977), que compararon el estudio de la ME con Testsimplets® con Papanicolaou, y no obtuvieron diferencias significativas entre ambos resultados. Calamera y Vilar (1979), compararon los resultados obtenidos al analizar la ME entre Testsimplets® y las tinciones de Pappenheim y de Couture, y tampoco observaron diferencias significativas. Schoenfeld et al. (1981) compararon los resultados de ME obtenidos al teñir las muestras con Hematoxilina-Eosina y utilizando Testsimplets®, y no observaron diferencias significativas entre ambos métodos. Otros autores (Henkel et al., 2008) sí observaron diferencias significativas entre Testsimplets® y otras tinciones, como Papanicolaou y Shorr. La carencia de información acerca de Testsimplets® hace necesaria la comparación con otras técnicas de tinción reconocidas como Papanicolau y Diff-Quick. La tinción de Diff-Quick fue introducida por Kruger et al. en 1987a y es la utilizada en UNIFERTES. 4 Diff-Quik es una tinción rápida si se compara con Papanicolaou. En varios trabajos se reportó que Diff-Quik era un método confiable, especialmente para análisis computarizados porque al parecer las computadoras reconocen mejor las anomalías espermáticas cuando se trabaja con esta tinción (Barroso et al., 1999; Coetzee et al., 2001; Soler et al., 2003; Hidalgo et al., 2006). Sin embargo, otros autores encontraron que había un mayor porcentaje de formas normales con Diff-Quik (Menkveld et al., 1997; Root et al., 1998; Coetzee et al., 1997). Siendo ambas tinciones, Diff-Quik y Testsimplets®, tinciones tipo Romanovsky (Stevens y Lowe, 2006), las diferencias entre contaje de epermatozoides morfológicamente normales y anormales debe ser parecida entre ambos. El objetivo general de este trabajo de pasantía es conocer, comprender y aplicar técnicas de diagnóstico de la infertilidad masculina y procedimientos de Reproducción Asistida. Los objetivos específicos son: Comprender la realización de un espermograma, conocer las técnicas de reproducción asistida que se practican en los laboratorios de andrología y embriología humanas y realizar un proyecto de investigación en la empresa. En este caso, se desea comparar los resultados de la evaluación de ME mediante dos tinciones: Diff-Quik y Testsimplets®. 5 Descripción de la empresa 2 Descripción de la empresa La pasantía larga se desarrolló en el centro UNIFERTES, ubicado en el Anexo de la Clínica El Ávila, piso 4. Av. San Juan Bosco, Altamira, Caracas, Venezuela. UNIFERTES es una unidad de fertilidad de amplia trayectoria, fundada en el año 1987 por el Dr. Jorge Lerner Biber, la bióloga Aitziber Martínez y la enfermera Gilcoria Ramírez. Actualmente está acreditada por la Red Latinoamericana de Reproducción Asistida (www.redlara.com) por cumplir con las normas de calidad y eficiencia para la ejecución de técnicas de reproducción asistida. Históricamente, UNIFERTES fue el primer laboratorio en Venezuela en obtener: El primer bebé probeta por Embrión Congelado El primer bebé probeta por Donación de Óvulos El primer bebé probeta por Transferencia de Blastocistos La tutora empresarial fue M.Sc. María Teresa Urbina, bióloga, Magister Scientiarum en Biología Reproductiva de la Universidad Simón Bolívar (Caracas, Venezuela). Directora Regional de la Red Latinoamericana de Reproducción Asistida (Colombia, Ecuador y Venezuela). Presidenta de PLAFAM Asociación Civil para la Planificación Familiar. Miembro de la Sección de Bioética de la Sociedad de Obstetricia y Ginecología de Venezuela. Miembro de la Asociación Venezolana de Medicina Reproductiva y Embriología. Miembro de la Asociación Americana de Medicina Reproductiva. Miembro de la Sociedad Europea de Reproducción Humana y Embriología. Miembro de la Asociación Latinoamericana de Derecho Médico. Miembro de la Sociedad Venezolana de Derecho Médico. 6 CAPÍTULO 1 1 Bases fisiológicas del estudio andrológico y de la fecundación humana. 1.1 Anatomía del testículo Los testículos humanos son dos órganos ovoides contenidos en el escroto, y cubiertos por una sólida cápsula de tejido conectivo fuerte denominada tunica albugínea (Ballescá, 1999; Holstein et al., 2003). Los testículos humanos tienen dos funciones esenciales: son los responsables de la producción y maduración de los espermatozoides (espermatogénesis), y de la síntesis y secreción de las hormonas sexuales (esteroidogénesis) (Figura 1.1) (Álvarez Lleó, 2003). Ambas funciones tienen lugar en dos compartimientos distintos; la espermatogénesis se efectúa en los túbulos seminíferos, mientras que el tejido peritubular es el sustrato para la producción hormonal (Álvarez Lleó, 2003). Figura 1.1 Partes del testículo humano. Tomado de: Ballescá (1999). 7 Los túbulos seminíferos son una red de tubos enrollados que llevan los espermatozoides al epidídimo a través de los conductos eferentes y desembocan al final en el rete testis (Rosales et al., 2006b; Holstein et al., 2003). Tienen un diámetro de 300 micras, y están constituidos por el epitelio germinal y el tejido peritubular (lamina propia) (Marina, 2003; Rosales et al., 2006b). El epitelio germinal de los túbulos está constituido por dos tipos de células: germinales y somáticas o de Sertoli (Holstein et al., 2003). Las células germinales se encuentran en diferentes estadios de desarrollo (espermatocito, espermátide, etc.) y formarán el espermatozoide (Holstein et al., 2003). Las células somáticas o de Sertoli están localizadas en la base del túbulo seminífero y cumplen una función de “nodrizas” porque se unen entre sí y se encargan del cuidado y nutrición de las células germinales (Rosales et al., 2006b). También organizan la liberación de las espermátides maduras al lumen del túbulo, producen sustancias endocrinas y paracrinas para regular la espermatogénesis y secretan la proteína unidora de andrógenos (ABP por sus siglas en inglés) para mantener el epitelio de los túbulos (Holstein et al., 2003). En el tejido peritubular se encuentran las células de Leydig, encargadas de producir testosterona que, en conjunto con la hormona folículoestimulante (FSH), intervienen en la espermatogénesis que ocurre dentro del túbulo seminífero (Rosales et al., 2006b). 1.2 Espermatogénesis Es el proceso mediante el cual las espermatogonias, tras una serie de divisiones y diferenciación celular, dan lugar a espermatozoides (Marina, 2003). La temperatura óptima para el proceso de espermatogénesis es de 35 °C, de hecho a los 37.5 °C el proceso se detiene (Rosales et al., 2006b). La espermatogénesis está regulada hormonalmente por el eje hipófisis-hipotálamogónada (Olivera et al., 2006). Este proceso se inicia durante la gestación, cuando las células germinales primordiales llegan a la cresta genital de un embrión macho y son incorporadas a los cordones sexuales (Gilbert, 2006). Se distinguen tres fases durante la espermatogénesis (Marina, 2003): 8 A) Fase espermatogonial: Es la fase proliferativa (Marina, 2003). Las células germinales primordiales dan origen a las células madre de las espermatogonias (Marina, 2003; Sadler, 2007). A partir de estas células madre se forman las espermagotonias tipo A. Este tipo celular se divide mitóticamente para formar clones y permanecen en el compartimiento basal del túbulo seminífero (Marina, 2003; Sadler, 2007). La última división celular produce espermatogonias tipo B que pasan al compartimiento luminar y se transforman en espermatocitos I (Marina, 2003; Sadler, 2007). En el hombre se observan dos tipos de espermatogonias A: las claras y las oscuras, las cuales se diferencian dependiendo del color que tome su núcleo (claro u oscuro) (Rosales et al., 2006b). B) Fase espermatocitaria: Los espermatocitos I o primarios entran en una profase prolongada (en el cual ocurre la recombinación genética), seguida por la terminación rápida de la meiosis I y la formación de los espermatocitos II o secundarios (Sadler, 2007). Luego ocurre una segunda división celular produciéndose las espermátides haploides (Marina, 2003; Olivera et al., 2006). Los espermatocitos permanecen unidos entre sí por puentes citoplasmáticos y a la vez están en comunicación con las células de Sertoli; estas últimas, a partir de moléculas señalizadoras, inducen el proceso denominado espermiogénesis espermátides en espermatozoides (Figura 1.2) (Olivera et al., 2006). que convierte las 9 Figura 1.2 Proceso de espermatogénesis dentro del túbulo seminífero. Modificado de: Pagés y Aller 2006. C) Fase espermiogénica: En esta fase, en la cual ocurre la espermiogénesis, no hay división celular, sólo diferenciación celular (Figura 1.3) (Marina, 2003). Se reconocen cuatro fases características en esta transformación: la fase de Golgi, la de capuchón, la acrosomal y la de maduración (Olivera et al., 2006). Además ocurre la condensación de la cromatina, cambios metabólicos y la localización de las mitocondrias alrededor de la parte proximal del flagelo, formando la pieza media (Marina, 2003). a. En la fase de Golgi, dicha organela se acerca al núcleo y desprende vesículas que se unen hasta convertirse en el acrosoma, situado en la parte apical del núcleo (Figura 1.4) (Olivera et al., 2006). b. En la fase de capuchón, el acrosoma se aplana sobre el núcleo. Éste se compacta más, cambiando histonas por protaminas, y entrando a la Fase G0 del ciclo celular (Olivera et al., 2006). c. En la fase acrosomal, la espermátide gira haciendo que el acrosoma quede en dirección de la membrana basal; el citoplasma se mueve hacia la base de la cabeza y las mitocondrias se agrupan alrededor del axonema formando la pieza media (Olivera et al., 2006). Así, el espermatozoide adquiere su morfología definitiva (Olivera et al., 2006). d. En la fase de maduración, se elimina gran parte del citoplasma por desplazamiento del mismo hacia la pieza terminal, originando la gota citoplasmática (Olivera et al., 2006). 10 Figura 1.3 Proceso de espermiogénesis. La imagen representa los cambios que sufre la espermátide para convertirse en espermatozoide; así como la morfología final y normal del mismo. Modificado de: Gilbert 2005. Figura 1.4 Formación del acrosoma. Modificado de: O’Day 2008. En el hombre, un espermatozoide tarda en formarse alrededor de 74 días, y pueden producirse alrededor de 300 millones de espermatozoides diarios. 11 D) Espermiación: Es la liberación de los espermatozoides de su relación con la célula de Sertoli, quedando libres en la luz del túbulo seminífero para poder ser transportados a través de los tubos rectos, rete testis y conos eferentes hasta el epidídimo donde adquirirán su movilidad completa (Marina, 2003; Sadler, 2007). 1.3 Capacitación y reacción acrosómica En mamíferos, los espermatozoides recién eyaculados son móviles y viables, pero son incapaces de fecundar al ovocito (Risopatrón et al., 2005). Para lograr esta función debe ocurrir el proceso de capacitación que se produce al interactuar los espermatozoides con factores capacitantes presentes en el tracto reproductivo femenino (Risopatrón et al., 2005). Entre estos factores se encuentran los glicosaminoglicanos como condriotín sulfato, ácido hialurónico y heparina (Risopatrón et al., 2005). Esta interacción produce cambios bioquímicos en la membrana celular espermática, provocando modificación del pH intracelular, incremento de la permeabilidad para iones como el Ca2+, y modificación de los patrones de fosforilación de proteínas (Risopatrón et al., 2005). Los glicosaminoglicanos promueven la capacitación uniéndose y removiendo las proteínas del plasma seminal que se fijan por adsorción a la membrana plasmática del espermatozoide y que inhiben la capacitación (Risopatrón et al., 2005). La capacitación comienza cuando los espermatozoides se encuentran migrando en el útero y las trompas, y termina cuando se encuentra con el ovocito (Vanrell y Simón, 1999). El ovocito, que se libera durante el proceso de ovulación, se encuentra cubierto por células de la granulosa del cúmulo oóforo, formando el complejo cúmulo-corona radiada (Vanrell y Simón, 1999). Sólo los espermatozoides capacitados pueden pasar a través de las células de la corona radiada y experimentar la reacción acrosómica (Sadler, 2007). La reacción acrosómica es el proceso siguiente a la capacitación y comienza cuando la cabeza del espermatozoide se adhiere a la zona pelúcida del ovocito (Vanrell y Simón, 1999). Durante este proceso, se fusionan en varios puntos la membrana plasmática del espermatozoide y 12 la membrana acrosomal externa, ocasionando la salida de las enzimas acrosomales hacia el espacio extracelular (Silverberg y Turner, 2004). Esto ocasiona que ambas membranas se desintegren y que la membrana acrosomal interna quede expuesta sobre la cabeza espermática (Silverberg y Turner, 2004). La reacción acrosómica permite que el espermatozoide penetre la zona pelúcida debido a la acción hidrolítica de las enzimas acrosomales, y finaliza cuando el espermatozoide penetra al espacio perivitelino (Vanrell y Simón, 1999). 1.4 Fecundación La fecundación es el paso final de todo el viaje que realiza un espermatozoide desde el testículo hasta el tracto reproductor femenino, para obtener un nuevo individuo (Figura 1.7). La fecundación es un proceso por el cual dos células sexuales (gametos) se fusionan para crear un nuevo individuo con un genoma derivado de ambos padres (Gilbert, 2006). La fecundación lleva a cabo dos fines separados: la sexualidad (la combinación de genes derivados a partir de ambos padres) y la reproducción (la creación de un nuevo organismo) (Gilbert, 2006). En general, la fecundación ocurre en cuatro pasos, los cuales son: 1. Contacto y reconocimiento entre el espermatozoide y el gameto femenino (Gilbert, 2006). 2. Regulación de la entrada del espermatozoide en el gameto femenino. Éste permite la entrada y fecundación de un solo espermatozoide, e inhibe la entrada de otros (Gilbert, 2006). 3. Fusión del ADN del espermatozoide y del gameto femenino. Mientras el espermatozoide penetra al ovocito y forma el pronúcleo masculino, el ovocito reanuda la segunda división meiótica y forma el pronúcleo femenino. Ambos pronúcleos replican su ADN para comenzar la división celular, se unen (singamia) y pierden sus membranas nucleares (Figura 1.5) (Sadler, 2007). Figura 1.5 Proceso de unión de los pronúcleos. Tomado de: Pagés y Aller (2006). 13 4. Activación del metabolismo de la célula huevo o cigoto para dar comienzo al desarrollo. El factor activador probablemente sea transportado por el espermatozoide (Sadler, 2007). El centríolo, heredado del espermatozoide, organiza los microtúbulos en el cigoto y puede causar los movimientos del citoplasma durante el primer ciclo celular (Gilbert, 2006). Cuando el cigoto ha llegado al estadio de dos células experimenta una serie de divisiones mitóticas que producen un incremento del número de células (Sadler, 2007). Estas células, que se tornan más pequeñas con cada división de segmentación, se denominan blastómeros, y hasta la etapa de 8 células están agrupados de una forma laxa (Figura 1.6) (Sadler, 2007). Sin embargo, después de la tercera segmentación, el contacto de los blastómeros entre sí es máximo y forman una esfera compacta de células que se mantienen juntas a través de uniones estrechas (Sadler, 2007). Este proceso, denominado compactación, separa las células internas de las células externas (Sadler, 2007). Alrededor de 3 días después de la fecundación, las células del embrión compactado se dividen y forman una mórula de 16 células (Sadler, 2007). Los elementos centrales de la mórula constituyen la masa celular interna (MCI), que originará los tejidos propios del embrión; y la capa circundante forma la masa celular externa, que formará el trofoblasto, el cual contribuirá a formar la placenta (Sadler 2007). En el día 4 del desarrollo embrionario, la mórula cambiará su conformación, y pasará a denominarse blastocisto (Sadler, 2007). En esta etapa el embrión se implanta en el endometrio, alrededor del 6to día, y empezará el crecimiento tanto de la placenta como del embrión (Sadler, 2007). El parto normal usualmente se produce entre las 38va y 40va semana del desarrollo (Sadler, 2007). Figura 1.6 Embrión en división. Etapas de 2, 4, 6 y 8 células. Tomado de: Pagés y Aller 2006. 14 Figura 1.7 Viaje de los espermatozoides desde el testículo (derecha) hasta el sistema reproductor femenino (izquierda). Tomado de Luconi et al (2006). 1.5 Forma del espermatozoide normal Existen ciertas diferencias entre los espermatozoides de distintas especies de mamíferos, como la forma de la cabeza, pero generalmente, un espermatozoide de mamíferos consiste en una cabeza y una cola o flagelo (Figura 1.8) (Sutovsky y Manandhar, 2006). Ambos están cubiertos por una membrana plasmática espermática (Sutovsky y Manandhar, 2006). 1.5.1 Cabeza La cabeza espermática contiene un núcleo haploide empaquetado por protaminas, que son proteínas simples de bajo peso molecular, que se combinan fácilmente con los grupos aniónicos del esqueleto fosfodiéster del ADN para formar nucleoproteínas (Sutovsky y Manandhar, 2006; Teijón y Garrido, 2006). El empaquetamiento del ADN en espermatozoides de 15 mamíferos se aproxima a los límites físicos de la compactación molecular, haciendo de su cromatina el ADN eucariótico más condensado que se conoce (Sutovsky y Manandhar, 2006; Teijón y Garrido, 2006). Esta forma compacta es más hidrodinámica y facilita la movilidad y la penetración del espermatozoide a través de la membrana del ovocito (Sutovsky y Manandhar, 2006). El núcleo se encuentra cubierto por la reducida envoltura nuclear y la teca o matriz perinuclear (Sutovsky y Manandhar, 2006). En la parte anterior del núcleo, se encuentra el acrosoma. El acrosoma es una vesícula secretora modificada que contiene enzimas que digieren proteínas y glúcidos complejos, utilizadas para degradar y atravesar la cubierta externa del gameto femenino (Gilbert, 2006). El acrosoma consta de dos membranas: la acrosomal externa, que se encuentra por detrás de la membrana celular del espermatozoide, y la acrosomal interna, que rodea el núcleo espermático. La matriz acrosómica es la parte interna y en los mamíferos se han encontrado más de 20 enzimas hidrolíticas (Rosales et al., 2006a) 1.5.2 Flagelo Cada espermatozoide es capaz de viajar grandes distancias agitando su flagelo (Gilbert, 2006). El flagelo es una estructura cuya principal porción motora se denomina axonema (Gilbert, 2006). Éste está formado por microtúbulos que parten del centríolo localizado en la base del núcleo del espermatozoide (Gilbert, 2006). Los microtúbulos presentan un rearreglo único conocido como “9 + 2”, el cual se refiere a nueve parejas de microtúbulos periféricos y simétricos, conectados pareja a pareja por brazos de dineína a dos microtúbulos centrales por segmentos radiales (Sutovsky y Manandhar, 2006). El flagelo, que en humanos tiene una longitud de 55-60 µm, está constituido por cuatro regiones distintas: el cuello, la pieza media, y los segmentos principal y terminal (Álvarez Lleó, 2003). El cuello es una estrecha franja que conecta al flagelo con la cabeza; después del cuello, se observa una región llamada pieza media que contiene, bajo la membrana plasmática, mitocondrias dispuestas helicoidalmente que envuelven al axonema (Álvarez Lleó, 2003). Las mitocondrias están ordenadas consecutivamente formando un número de hélices paralelas, las 16 cuales están adheridas a un complejo filamentoso subyacente llamado retículo submitocondrial (Álvarez Lleó, 2003). Figura 1.8 Fisiología de un espermatozoide normal. Se observa la cabeza, pieza media, flagelo, segmento final, acrosoma, núcleo, centriolos, mitocondrias, axonema y membrana celular (Tomado de: Creation of Man). 17 CAPÍTULO 2 2 Características del Laboratorio de In Vitro Los espermogramas y las preparaciones de semen para IIU se realizan en el Laboratorio de Andrología. Las técnicas de reproducción asistida de alta complejidad se realizan en el Laboratorio de In Vitro (LIV). En los laboratorios se controla la calidad del aire, la iluminación, la construcción y el diseño del laboratorio, entre otros factores. En el LIV se deben controlar más aspectos, debido a la sensibilidad de los embriones a distintos factores físicos y químicos. Controlar los factores es necesario para maximizar la eficiencia de la fecundación in vitro (tasa de embarazos por transferencia de embriones) y así maximizar la probabilidad de lograr un embarazo (Urbina, 2008). 2.1 Construcción, ubicación, equipos y materiales del Laboratorio de In Vitro: El Laboratorio de In Vitro debe estar localizado al lado de la sala de obtención de ovocitos y transferencia de embriones, y separado del Laboratorio de Andrología (Urbina, 2008). El Laboratorio de In Vitro debe ser diseñado tipo Clean Room, en el cual se controlan la concentración de partículas suspendidas en el aire (≤ 100 partículas ≥ 0,5 µm en un pie cúbico de aire es lo ideal, según Boone et al. [1999]), la temperatura (20 °C – 27 °C), la humedad (aprox. 50%) y la presión del aire (Boone et al., 1999; De los Santos et al., 2002; Worrilow et al., 2001a; Worrilow et al., 2001b). Un laboratorio tipo Clean Room se define según la concentración y tamaño de las partículas y el tipo de corriente de aire que se genera (Boone et al., 1999; De los Santos et al., 2002; Worrilow et al., 2001a; Worrilow et al., 2001b). Existen cuatro tipos (Boone et al., 1999; De los Santos et al., 2002; Worrilow et al., 2001a; Worrilow et al., 2001b): 18 - De flujo convencional o no unidireccional, si el aire es suministrado por filtros en el techo. - De flujo unidireccional, si se hace pasar el aire a través de filtros de alta eficiencia. - De flujo mezclado, si también se usan cámaras de flujo laminar. - De aislantes de micro ambientes, si se usa una indumentaria especial para entrar al ambiente. Para el LIV, es suficiente un “cuarto limpio” con filtros HEPA (high efficiency particulate air) en las entradas de aire para evitar partículas menores de 0,5 µm, con flujo mezclado (con cámaras de flujo laminar) (Boone et al., 1999; De los Santos et al., 2002; Worrilow et al., 2001a; Worrilow et al., 2001b). Sin embargo, es mejor que contenga filtros en todo el techo del cuarto, para tener flujo unidireccional, o que contenga filtros ULPA (ultra low penetration air) (Boone et al., 1999; De los Santos et al., 2002; Worrilow et al., 2001a; Worrilow et al., 2001b). El sistema de ventilación del laboratorio debe ejercer una presión positiva (al menos 0.10-0.20 pulgadas de agua) (Cohen et al., 2004), en la cual se trata de conseguir que el flujo de aire vaya desde el laboratorio hacia el exterior, ocasionado por la diferencia entre las velocidades de emisión y captación del aire (Sáinz et al., 2000). Los rincones de las paredes del LIV deben ser redondeados para reducir la acumulación de polvo (Boone et al., 1999; De los Santos et al., 2002; Worrilow et al., 2001a; Worrilow et al., 2001b). Los materiales de revestimiento de las paredes y el mobiliario deben ser de vidrio, acero inoxidable o pintura epóxica y la ropa utilizada debe ser de poliéster, que no libera partículas (Boone et al., 1999; De los Santos et al., 2002; Worrilow et al., 2001a; Worrilow et al., 2001b). Se debe poner especial atención a los materiales ya que se ha encontrado que ciertos químicos contaminantes del aire pueden ser tóxicos para el embrión (Cohen et al., 1997; Cohen et al., 2004). Existen cuatro tipos de contaminantes del aire (Tomados de: Cohen et al., 1997): - Los compuestos orgánicos volátiles (COV): Aquella gama de hidrocarburos de bajo peso molecular que se encuentran en su mayoría en áreas urbanas. 19 - Moléculas inorgánicas pequeñas: Tales como N2O, SO2 y CO. - Sustancias derivadas de materiales de construcción: Se tienen a los compuestos orgánicos tales como los aldehídos de los adhesivos para suelo, bencenos, fenol y n-decano liberados por las losas de piso de vinil. - Otros compuestos contaminantes: Como aquellos liberados por los pesticidas o aerosoles que contienen butano o iso-butano como propelente. Los COV también se pueden producir por instrumentos específicos como los microscopios, los monitores de televisión, el mobiliario y los materiales (Cohen et al., 1997). Por ejemplo, el estireno, el cual es carcinógeno, posiblemente sea liberado por productos hechos de plástico de poliestireno, como las placas de Petri (Cohen et al., 1997). Los COV se pueden controlar permitiendo la entrada de aire del exterior a través de filtros de carbón activado o permanganato de potasio (Urbina, 2008). Además del control de contaminantes en el aire, también se debe controlar la iluminación en el laboratorio, la cual debe provenir de bombillos incandescentes, no fluorescentes (Boone et al., 1999; De los Santos et al., 2002; Worrilow et al., 2001a; Worrilow et al., 2001b). En el LIV, se debe tener al menos un microscopio estereoscópico para la obtención de ovocitos, un microscopio invertido para observar los gametos y embriones de forma precisa y rápida, y una cámara fotográfica para llevar el registro de los casos y continuar observando los embriones luego de guardarlos en la incubadora (Urbina, 2008). Siendo la incubadora el equipo más importante del LIV, ésta debe ser de buena calidad y, para evitar cambios en la temperatura y el pH en los medios de cultivo ocasionados por la frecuencia con que se abre la incubadora, debe haber suficientes en el laboratorio (dependiendo del número de casos de FIV que se realicen al año), puede usar puertas internas en la incubadora, puede usar cámaras de plástico dentro de la misma, e incluso utilizar las mini incubadoras COOK, que tienen una mezcla de gases de alta pureza de 5% O2, 6% CO2 y 89% N (Boone et al., 1999; De los Santos et al., 2002; Worrilow et al., 2001a; Worrilow et al., 2001b). 20 2.2 Medios de cultivo utilizados en el Laboratorio de In Vitro Finalmente, pero no menos importante, para optimizar el desarrollo in vitro del embrión y mantener su viabilidad, es esencial considerar el medio de cultivo embrionario (Cohen et al., 2004), el cual debe recrear las condiciones del medio natural del embrión y servirá para cultivar y mantener el desarrollo de los embriones obtenidos (Dorado et al., 2006). En los mejores laboratorios se pueden cultivar hasta blastocistos con técnicas y medios especiales. Para cultivar los embriones hasta el estadio de blastocisto, los dos sistemas de cultivo son el cocultivo y el cultivo secuencial (Dorado et al., 2006). El primero consiste en cultivar los embriones sobre una monocapa de células, sean autólogas (de la madre) o heterólogas, que les proporcionen las moléculas necesarias para el desarrollo del embrión (Dorado et al., 2006). El segundo consiste en cultivar embriones en diferentes medios con distinta composición de nutrientes según el estadio embrionario (Dorado et al., 2006) y es el método que se utiliza en UNIFERTES. El cocultivo es una técnica popular de fácil manejo y rápida difusión, pero con la desventaja que, si se utilizan células de donantes, el embrión puede contaminarse por patógenos o tóxicos, y si se utilizan líneas de células alteradas comerciales, ajenas a los epitelios ginecológicos, no se obtendrá un enriquecimiento hormonal del medio (Dorado et al., 2006). Según un estudio de Eyheremendy et al. (2010), el cocultivo endometrial autólogo es útil y ventajoso para el tratamiento de pacientes con falla de implantación repetida (Eyheremendy et al., 2010). Por otra parte, los medios de cultivo secuenciales aportan los nutrientes, oligoelementos y hormonas de las que carecen los cocultivos y permiten estandarizar su uso; sin embargo, tiene un coste elevado y no se da la interacción embrión-célula (Dorado et al., 2006). Este tipo de cultivo se lleva a cabo en dos medios distintos dependiendo de las necesidades metabólicas y nutricionales del embrión (Dorado et al., 2006). Uno de los medios más utilizados es el medio G1 (Vitrolife), el cual está basado en el nivel de carbohidratos presente en las trompas y aminoácidos esenciales para la división hasta el estadio de 8 células, y contiene EDTA, que secuestra los cationes divalentes tóxicos y contrarresta la actividad glicolítica del embrión (Dorado et al., 21 2006; Gardner et al., 1998). El segundo medio, de los más utilizados, es el medio G2 (Vitrolife), el cual se basa en el nivel de carbohidratos en el útero y contiene los aminoácidos esenciales y no esenciales necesarios para el desarrollo del embrión de 8 células hasta blastocisto, pero no contiene EDTA (Dorado et al., 2006; Gardner et al., 1998). Varios estudios han arrojado resultados favorecedores a la utilización del cultivo secuencial (Gardner et al., 1998; Ménézo et al., 1998; Schoolcraft et al., 1999). 22 CAPÍTULO 3 3 Técnicas observadas en la empresa Según la OMS, al cabo de un año de relaciones sexuales no protegidas la pareja debe acudir al especialista en fertilidad. Preferiblemente, uno que esté asociado a un centro acreditado por la Red Latinoamericana de Reproducción Asistida que es una asociación de profesionales que se encarga de supervisar y acreditar a aquellos centros que cumplan con las normas internacionales para garantizar la eficiencia de los tratamientos de fertilidad. El estudio de la pareja infértil se suele realizar simultáneamente, ya que la mitad de los casos ocurren por factor masculino, y la otra mitad por factor femenino. Un 10 % de los casos pudiera tener factor mixto y en muy pocos casos no se logra determinar la causa del problema. El estudio dura aproximadamente un mes, porque algunos exámenes se deben realizar en días determinados del ciclo menstrual. En el caso de la mujer, se le realizarán ciertos exámenes que tienen la finalidad de responder las siguientes dudas: - Si la mujer ovula: Para averiguar esto, la forma más simple es midiendo la temperatura corporal basal durante todo el ciclo menstrual (Pérez y Lucena, 2008). Para estudiar la ovulación, se realizan estudios hormonales como el de la hormona folículo estimulante (FSH), el estradiol, la hormona antimülleriana (HAM), y otros (Pérez y Lucena, 2008) y un ecosonograma transvaginal. - Si no presenta problemas anatómicos y funcionales uterinos y tubáricos: Lo cual se estudia realizando una histerosalpingografía (HSG), que evalúa la cavidad uterina, las trompas de Falopio y, en menor grado, el factor peritoneal (Santimone, 2008); una ecografía transvaginal, para evaluar la presencia de algún factor uterino; una laparoscopia, para determinar presencia o ausencia de factores tuboperotineales y/o una histeroscopia, para determinar si existe algún factor uterino (Ballesteros et al., 2002). 23 También se le realizan a la mujer estudios para determinar si sufre de algún proceso infeccioso, ocasionado por algún microorganismo de transmisión sexual o de la flora vaginal (Pérez y Lucena, 2008). En el caso del hombre, se le prescribe el examen de diagnóstico más importante y sencillo de todos (Vásquez y Vásquez, 2007). Este examen es el espermograma. El urólogo puede realizar un examen físico, con énfasis en el pene, escroto y testículo (Abitbol, 2008). También se pueden realizar exámenes para determinar la presencia o ausencia de infecciones del tracto genitourinario, y pruebas hormonales para determinar si existe alguna falla en el eje hipotálamohipófiso-gonadal (Abitbol, 2008). 3.1 Espermograma Es el examen paraclínico que brinda la visión más amplia de la capacidad fértil del hombre (Vásquez y Vásquez, 2007). El espermograma suministra información de los aspectos físicos relacionados con las glándulas, e información de las células, que están relacionadas con el testículo y otras células (Vásquez y Vásquez, 2007). En UNIFERTES, el espermograma se realiza siguiendo las pautas de la OMS. Para realizar este examen, el paciente masculino debe tomar una muestra seminal por masturbación, sea en la misma clínica o en su casa (si la toma en su casa debe traer la muestra a la clínica durante la siguiente hora después de tomada). La muestra debe llegar a la unidad de fertilidad debidamente identificada con el nombre del paciente, el día y hora de tomada la muestra, los días de abstinencia y si la colección de la muestra fue completa o incompleta. Se recomienda el método de masturbación para recoger la muestra, ya que el coito interrumpido presenta como desventaja que puede producir pérdida de parte de la muestra y contaminación del líquido seminal con las secreciones de la vagina (Vásquez y Vásquez, 2007). En caso que el paciente no pueda tomar la muestra por masturbación, se pueden utilizar condones especiales sin espermaticidas para tomar la muestra por relación coital (Vásquez y Vásquez, 2007). Debe tener, además, de 3 a 5 días de abstinencia, ya que se ha observado que a menores 24 días, disminuye la concentración espermática y aumenta el número de espermatozoides inmaduros en la muestra; a mayores días, aumenta la viscosidad seminal, y disminuye la movilidad y la viabilidad (Vásquez y Vásquez, 2007). Cabe resaltar que la morfología espermática no parece ser afectada por la duración de la abstinencia sexual (Mortimer et al., 1982b). Finalmente, la colección de la muestra debe ser completa, sin perder ninguna fracción de muestra seminal, debido a que la primera fracción de semen contiene 50% del total de espermatozoides en la muestra (Vásquez y Vásquez, 2007). Luego de obtener la muestra seminal, se analizarán sus características mediante los exámenes macroscópico y microscópico. El examen macroscópico comprende la evaluación de: 3.1.1 La licuefacción Inmediatamente luego de la eyaculación, el semen alcanza el estado semisólido (o “coagula”), por acción de las enzimas secretadas por las vesículas seminales (tipo proteínaquinasa) (Munuce, 2008). La falta de coagulación se asocia con anomalías en estas vesículas (Munuce, 2008). De 15 a 60 minutos después de la eyaculación (OMS, 1999), el coágulo debe licuar, debido a la acción de enzimas proteolíticas (fibrinolisina, fibrinogenasa y aminopeptidasa) originarias de la próstata (Munuce, 2008). La ausencia de esta licuefacción está asociada a una deficiencia de enzimas prostáticas (OMS, 1999). 3.1.2 La viscosidad de la muestra La viscosidad de la muestra puede aumentar por factores tales como infecciones del tracto reproductivo, disfunción prostática (Munuce, 2008) o muchos días de abstinencia sexual. Se evalúa haciendo caer el semen desde la pipeta hasta el contenedor. Si cae gota a gota, la viscosidad es normal; si se observa que la muestra cae formando un filamento o no pasa fácilmente por la pipeta, se considera que la viscosidad es alta o que hay presencia de “hiperviscosidad”, pudiendo existir una infección o proceso alérgico (OMS, 1999). El problema que causa la hiperviscosidad sobre el análisis de la muestra es que su presencia ocasiona que la distribución de los espermatozoides no sea homogénea, dificultando así la medición de la movilidad y concentración espermática (OMS, 1999). 25 3.1.3 La presencia o ausencia de moco El moco se observa como gránulos inmersos en la muestra. Su presencia está relacionada a procesos alérgicos y/o infecciosos y debe reportarse (OMS, 1999). 3.1.4 El volumen Se mide en tubos cónicos graduados y se considera normal si el valor del volumen se encuentra entre 2 ml y 5,5 ml (OMS, 1999). Existe hipospermia cuando el valor es menor a 2 ml, y puede deberse a niveles de testosterona bajos (Vásquez y Vásquez, 2007), o a agenesia u obstrucción de las vías seminales, si se acompaña de falta de espermatozoides en semen (OMS, 1999). Si, además de la falta de espermatozoides y de la hipospermia, el pH es ácido, puede ser resultado de una eyaculación retrógrada hacia la vejiga (Munuce, 2008). Por otra parte, la obtención de un volumen mayor a 5,5 ml se conoce como hiperespermia, la cual puede estar relacionada con una baja concentración espermática debida a procesos inflamatorios (OMS, 1999). La ausencia de líquido seminal externo se conoce como aspermia, y se presenta generalmente en pacientes diabéticos o en aquellos que tienen alguna lesión medular (Vásquez y Vásquez, 2007). 3.1.5 El pH Este parámetro espermático depende de las secreciones de las glándulas sexuales accesorias, siendo la próstata acidificante y las vesículas seminales alcalinizantes (Vásquez y Vásquez, 2007). El valor normal se sitúa entre 7,2 y 8 (OMS, 1999). Si el pH es mayor a 8, se debe sospechar de la presencia de una infección (Behre et al., 2001) y se debe investigar la presencia de prostatitis, vesiculitis o epididimitis (Munuce, 2008); si el pH es menor a 7,2 junto con ausencia de espermatozoides, puede indicar una malformación u obstrucción del epidídimo, de los vasos deferentes, de las vesículas seminales o de los conductos eyaculatorios (Behre et al., 2001). 26 3.1.6 El color de la muestra Un eyaculado normal debe tener un color blanco-gris opalescente homogéneo, sin embargo, el color puede cambiar por varias razones: Una coloración amarillenta puede indicar infecciones (Behre et al., 2001), orina o abstinencia prolongada (OMS, 1999); una coloración rojiza-marrón puede indicar la presencia de glóbulos rojos, denominado hematospermia (Behre et al., 2001); mientras que una apariencia translúcida se puede relacionar a una baja cantidad o ausencia de espermatozoides en la muestra (OMS, 1999). Por su parte, el examen microscópico, el cual se puede llevar a cabo con un microscopio de luz normal o con un microscopio de contraste de fases (Behre et al., 2001) consta de la evaluación de: 3.1.7 La presencia o ausencia de detritus celular o bacterias El líquido seminal puede transportar no sólo espermatozoides, sino que también algunos virus, hongos, bacterias y protistas (Vásquez y Vásquez, 2007). Algunos de éstos pueden observarse en el microscopio óptico; si se observan, se deben reportar y recomendar hacer un espermocultivo. 3.1.8 La cantidad y tipo de células redondas En el eyaculado invariablemente se observarán otras células además de los espermatozoides, que en general se refieren como “células redondas” (Figura 3.1) (OMS, 1999). Incluyen células epiteliales, células inmaduras de la línea espermática, y leucocitos o células de la línea blanca (OMS, 1999). Según la OMS, un eyaculado normal no debe contener más de 5 x 106 células redondas/ml (OMS, 1999). Un alto número de leucocitos en una muestra seminal indica la presencia de “leucocitospermia”, la cual puede estar asociada a una infección y a una pobre calidad espermática (OMS, 1999). Generalmente, se observan leucocitos del tipo neutrófilos en los eyaculados humanos. El número de leucocitos no debe ser mayor de 1 x 106/ml (OMS, 1999) y es muy importante cuantificarlos (Munuce, 2008). Las células redondas de la línea espermática incluyen a las espermátides redondas, a los espermatocitos y las espermatogonias (OMS, 1999). La presencia de estas formas inmaduras pueden indicar desórdenes en la espermatogénesis o en 27 las funciones de los túbulos seminíferos, varicocele o disfunción de las células de Sertoli (OMS, 1999). Existen diferentes técnicas para diferenciar y cuantificar el número de células redondas en una muestra, y una de ellas es el Test de Peroxidasa. Utiliza una solución de bencidina a la que se le adiciona peróxido de hidrógeno, y posteriormente la muestra seminal (Sánchez et al., 2003). Este test se basa en la presencia de la enzima peroxidasa intracelular en los leucocitos, principalmente en los granulocitos polimorfonucleares, y su ausencia en las células espermáticas inmaduras; y en la capacidad de la enzima para catalizar la reacción de oxidación de la bencidina por el peróxido de hidrógeno (OMS, 1999; Sánchez et al., 2003; Vásquez y Vásquez, 2007). Esta técnica tiene la ventaja que es relativamente fácil de realizar, pero no detecta a aquellos polimorfos activados que han liberado sus gránulos, ni detecta otros tipos de leucocitos, como los linfocitos que no tienen peroxidasa (OMS, 1999). A B Figura 3.1 A. Gran cantidad de células redondas en una muestra seminal fresca, evaluada a 400x en un microscopio de contraste de fases. B. Célula redonda de la línea blanca (flecha blanca) y célula redonda espermática (fecha negra), durante el test de Peroxidasa, a un aumento de 400x. 3.1.9 La aglutinación espermática y la prueba inmunológica MAR Test Esta prueba se refiere a la observación de aglutinaciones de espermatozoides unidos entre sí a través del microscopio, que pueden deberse a la presencia de anticuerpos antiespermáticos en el semen (Mahmoud y Comhaire, 2000; Behre et al., 2001). Para determinar semi-cuantitativamente la presencia de anticuerpos antiespermáticos en semen, se puede aplicar el Test de Reacción de Antiglobulinas Mixto (o MAR Test por sus siglas en inglés) (Mazumdar y Levine, 1998), el cual consiste en mezclar una muestra fresca de semen y partículas de látex 28 cubiertas con IgG o IgA humano, junto con un antisuero anti-IgG humano monoespecífico (Figura 3.2) (OMS, 1999). La formación de aglutinaciones mixtas de espermatozoides unidos a partículas de látex indica la presencia de anticuerpos IgG e IgA en la superficie de la membrana celular del espermatozoide (OMS, 1999). Así, si 50% o más de los espermatozoides móviles presentan partículas adheridas a ellos, indica la presencia de anticuerpos antiespermáticos (OMS, 1999). Este test se puede llevar a cabo de forma directa o de forma indirecta. En el método directo, se detectan los anticuerpos antiespermáticos en semen, mientras que en el método indirecto (para pacientes con baja concentración espermática), se utilizan espermatozoides de un donante sano como antígenos a los cuales se les unirán los anticuerpos antiespermáticos si están presentes en suero sanguíneo descomplementado del hombre y de la mujer (Bohring y Krause, 2002; Mahmoud y Comhaire, 2000). La importancia de este examen radica en que la presencia de anticuerpos antiespermáticos ha sido asociada a una baja movilidad y alteraciones en la misma, puede afectar la penetración del moco cervical, y su unión a la cabeza de los espermatozoides puede hacerlos más vulnerables a ser fagocitados en el tracto reproductor femenino (Lombardo et al., 2001). A B Figura 3.2 Aglutinación espermática y prueba de MAR test. En la figura A, se observan espermatozoides aglutinados al microscopio óptico a un aumento de 400x. En la figura B, se observan dos portaobjetos sobre los cuales se realiza la prueba de MAR test: la gota azul corresponde a partículas con IgG, la gota roja corresponde a partículas con IgM, la gota verde corresponde a partículas con IgA. Cada gota tiene alrededor una gota de muestra seminal y una de antisuero de cada Ig. 29 3.1.10 La concentración espermática La concentración espermática es un parámetro sujeto a mucha variabilidad aún en el mismo individuo, debido a que factores tales como los días de abstinencia sexual y las infecciones virales pueden afectarla (OMS, 1999). Para determinar la concentración espermática, en UNIFERTES se utiliza el hemocitómetro o cámara de Neubauer, en el cual se realiza el contaje de dos alícuotas de la muestra de semen, una en cada lado de la cámara de contaje (OMS, 1999). Se realiza una dilución de 1/20 diluyendo 5µl de semen homogeneizado en 95µl de agua destilada. Se añade 10µl de esta dilución a ambos retículos del hemocitómetro, cubiertas por un cubreobjetos. El contaje se realiza preferiblemente con un microscopio de contraste de fases, a una magnificación de 200 a 400x (OMS, 1999). Se cuentan espermatozoides completos (cabezas con cola), y el contaje debe realizarse de la siguiente manera: se cuentan los espermatozoides de 5 cuadrantes; el del centro y los de los cuatro extremos; y si un espermatozoide se encuentra en la línea que divide dos cuadros adyacentes, se cuenta si está sobre las líneas superior e izquierda, para evitar conteos repetidos (Figura 3.3) (OMS, 1999). B A Figura 3.3 Cámara de Neubauer para calcular la concentración espermática (A). En la figura B se observa la cuadrícula central de la cámara, en un microscopio de contraste de fases a un aumento de 400x. Los cuadros rojos remarcan aquellos cuadros donde se contarán los espermatozoides. El reporte se realiza como número de espermatozoides por milímetro, y la muestra se considera normal si presenta 20 x 106 espermatozoides/ml o más (Munuce, 2008). Cuando la concentración espermática es menor a 20 x 106 esp/ml se denomina oligozoospermia; cuando no hay ningún espermatozoide se denomina azoospermia (Tabla 3.1) (Vásquez y Vásquez, 2007). En 30 el caso de azoospermia, se centrifuga la muestra para concentrarla, y se vuelve a evaluar la concentración espermática; además, se realizan varios espermogramas más. En el caso de la oligozoospermia, puede existir un origen secretor, obstructivo o mixto; mientras que la azoospermia puede ser evidencia de eyaculación retrógrada, bloqueo de las vías seminales (azoospermia obstructiva) o falla en la producción testicular (azoospermia secretora) (OMS, 1999). Tabla 3.1 Nomenclatura de algunas variables espermáticas. (OMS, 1999) Normozoospermia Eyaculado normal según la definición de la OMS, con las siguientes características: más de 20 x 106/ml espermatozoides, más de 50% de espermatozoides móviles, más de 14% de espermatozoides con morfología normal según el criterio estricto de Kruger. Oligozoospermia Concentración de espermatozoides menor de 20 x 106/ml Astenozoospermia Menos del 50% de espermatozoides con progresión moderada o menos del 25% de espermatozoides con movimiento progresivo rápido lineal Teratozoospermia Más del 85% de espermatozoides con morfología anormal Globozoospermia Espermatozoides sin acrosoma, presentando cabezas redondas en vez de elípticas Oligoastenoteratozoospermia Significa perturbación de las tres variables (concentración, movilidad, morfología) Azoospermia Ausencia de espermatozoides en el eyaculado Aspermia No hay eyaculado 3.1.11 La movilidad espermática La movilidad espermática es un análisis estándar pero también es un parámetro funcional (Eliasson, 1978). Se basa en el hecho de que el espermatozoide tiene una estructura flagelar que le permite desplazarse en el líquido seminal, en la cavidad vaginal, útero y trompas uterinas (Vásquez y Vásquez, 2007). Se evalúa en la muestra en fresco con una magnificación de 31 400 a 600x, a temperatura ambiente, durante los 60 minutos siguiente a la eyaculación (Figura 3.4) (Behre et al., 2001) y se cuentan 100 espermatozoides (OMS, 1999). Se clasifica, de acuerdo a la OMS, en cuatro categorías: Grado a: que son espermatozoides móviles rápidos y con movilidad rectilínea. Grado b: son lentos y con desplazamientos no rectilíneo. Grado c: cuando no hay desplazamiento del espermatozoide pero sí hay movilidad flagelar. Grado d: cuando el espermatozoide se encuentra inmóvil (OMS, 1999). Una muestra tiene movilidad normal si 50% o más de sus espermatozoides son grado a + b, y si hay más de 25% grado a (OMS, 1999). Si es menor de 50%, se denomina astenozoospermia (Tabla 3.1) (OMS, 1999). El contaje de espermatozoides en el microscopio se realiza de la siguiente manera: En todo el campo o en un área definida del mismo, se cuentan primero los espermatozoides con movilidad grados a y b, luego aquellos grado c y finalmente los de grado d (OMS, 1999). Las alteraciones de la ultraestructura del flagelo, la presencia de defectos citogenéticos, algunas drogas, las infecciones de transmisión sexual, el varicocele, el frío, muchos días de abstinencia, los anticuerpos antiespermáticos y las alteraciones en la morfología espermática se cuentan como algunas de las numerosas causas que pueden ocasionar un bajo porcentaje de movilidad grado a y b; (Eliasson, 1978; OMS, 1999; Vásquez y Vásquez, 2007). Figura 3.4 Evaluación espermática al microscopio de contraste de fases a un aumento de 400x. 32 3.1.12 La vitalidad espermática Es una prueba que se utiliza para discernir entre los espermatozoides inmóviles, cuántos de ellos están vivos y cuántos están muertos (Figura 3.5) (Vásquez y Vásquez, 2007). Se realiza el Test de Eosina, que consiste en mezclar en un portaobjetos una gota de eosina y una de semen. Este test se basa en la pérdida de capacidad de permeabilidad de la membrana celular de los espermatozoides cuando éstos mueren, permitiendo así el paso libre de los fluidos; de esta manera, los espermatozoides muertos se observarán al microscopio teñidos de rosado, mientras que los vivos no se teñirán (Vásquez y Vásquez, 2007). Figura 3.5 Evaluación de la vitalidad espermática al microscopio óptico a un aumento de 400x. Se observan espermatozoides vivos (sin teñir, círculo azul) y muertos (teñidos, círculo rojo). 3.1.13 La morfología espermática (ME) De todos los parámetros seminales, la morfología espermática (ME) ha sido consistentemente el mejor indicador de la fertilidad masculina (Coetzee et al., 1998; Menkveld y Kruger, 2002). Se ahondará más en la relación entre ME y tasas de embarazo más adelante. 3.1.14 La integridad del acrosoma Se ha observado una relación entre la integridad acrosómica y la tasa de fecundación (Tavalee et al., 2007). La integridad acrosómica se evalúa a través de una tinción de un frotis de la muestra seminal fresca sobre un portaobjetos, utilizando la tinción SPERMAC. Primero, se debe fijar la muestra con el fijador del kit a base de formolina, por 5 minutos. Luego de dejar secar la lámina, 33 se colorea el frotis con los colorantes A, B y C, en ese orden. El colorante A, de color rojo, se deja por 2 minutos. El colorante B, de color amarillo, y el C, de color verde, se dejan por 1 minuto. Los tres colorantes se enjuagan con agua corriente. De esta manera, el acrosoma se teñirá de verde, el post-acrosoma de rojo y la membrana, la cual debe observarse definida y continua, de verde. Se deja secar la lámina nuevamente y se observa al microscopio de luz con un aumento de 400x, bajo aceite de inmersión (Figura 3.6). Se cuentan 100 espermatozoides y se clasifican en normales (con el acrosoma intacto) y en reaccionados (con el acrosoma dañado, coloreado de rojo y/o con la membrana discontinua o difusa). La probabilidad de fecundación será alta si los espermatozoides normales son mayores del 40%. La misma probabilidad será buena si los espermatozoides normales están entre el 16% y el 40%, y será baja si es menor a 16%. A B Figura 3.6 Evaluación de la integridad del acrosoma en espermatozoides. En la figura A se observa un espermatozoide con el acrosoma intacto. En la figura B se observa un espermatozoide reaccionado. Se observa en un microscopio óptico a un aumento de 400x. 3.1.15 La Recuperación de Espermatozoides Móviles (R.E.M.): Esta prueba permite obtener espermatozoides con buena movilidad por varias técnicas de recuperación espermática como lo son la migración ascendente (swim up), gradientes de densidad u otros tipos de migración (swim down, etc.) (Penna-Videau, 2008). En UNIFERTES se realiza por gradientes de densidad SpermGrad (Vitrolife) de dos capas (de 90% y de 40%). Se colocan 0,5 ml de la capa de 90% en un tubo cónico de 15 ml, y sobre éste con cuidado 0,5 ml de la capa de 40% (Figura 3.7). Luego, se añade la muestra de semen sobre la capa de menor densidad. En esta etapa se determina el volumen de la muestra. Luego se lleva el tubo a 34 centrifugación por 12 minutos a 300g. Con una pipeta Pasteur estéril, se toma el pellet del fondo del tubo y se agrega a otro tubo cónico de 15 ml con 4 ml de medio HAM’S F10 suplementado con HSA (albúmina humana) al 0,05%. Se mezcla para homogeneizarla bien y se vuelve a centrifugar por 5 minutos a 300g. Finalmente, se desecha el sobrenadante y se resuspende el pellet en 1 ml de medio HAM’S F10 suplementado con HSA al 0,05% para proceder a evaluar la movilidad y la concentración espermáticas finales de la muestra. A B Figura 3.7 Recuperación de espermatozoides móviles, luego de centrifugar la muestra a través de un gradiente de densidad (figura A), y lavar el pellet obtenido en medio especial (figura B). 3.1.16 La sobrevida espermática Éste es el último paso en un espermograma. Se refiere al porcentaje de espermatozoides con movilidad progresiva después de un período de incubación de 18 a 20 horas en medio HAM’S F10 suplementado con HSA al 0,05%. La sobrevida se evalúa al día siguiente de haber realizado el REM, en el último tubo cónico que contiene la suspensión de espermatozoides móviles. La concentración en este tubo no debe ser más de 200 mil esp/ml, para evitar que se agoten los nutrientes del medio de cultivo. Para ajustarla se hace una dilución con el mismo medio de incubación (HAM’S F10 suplementado con 0,05% HSA). Para que la muestra se considere normal, se deben obtener 60% o más de espermatozoides móviles 18 a 20 horas después. 35 3.2 Análisis de la Fragmentación del ADN Además de todos los parámetros seminales estudiados en el espermograma para determinar la calidad seminal, existe uno que ha despertado mucho interés en los últimos años: la fragmentación de la molécula de ADN del espermatozoide. Este parámetro tiene un interés evidente ya que la transferencia de la molécula de ADN íntegra e intacta desde el espermatozoide al óvulo, es fundamental para lograr la gestación de un individuo normal (Gosálvez et al., 2008). Se conoce bien que la presencia de defectos en el material genético espermático, tales como anomalías en la condensación de la cromatina durante la maduración del espermatozoide, la integridad de la molécula de ADN asociada con la presencia de roturas tanto de doble cadena como de cadena sencilla del ADN, o la presencia de anomalías cromosómicas, como las aneuploidías o las reordenaciones genómicas estructurales, se asocian estrechamente con la infertilidad (Cortés-Gutiérrez et al., 2007) y con la transmisión de estos defectos a la descendencia en el momento de la fecundación (Gosálvez et al., 2008). Las principales causas de la fragmentación del ADN espermático incluyen: la apoptosis en el epitelio del túbulo seminífero, defectos en la remodelación de la cromatina durante el proceso de espermiogénesis, los daños al ADN inducidos por radicales de oxígeno durante la migración espermátca desde el túbulo seminífero hasta el epidídimo, la activación de las caspasas espermáticas y endonucleasas, los daños inducidos por la quimioterapia y la radioterapia, y los efectos de tóxicos ambientales (Sakkas y Álvarez, 2010). Durante las dos últimas décadas se han desarrollado varios ensayos para analizar la fragmentación del ADN espermático. Entre estos ensayos se encuentran: el TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated Nick end-labeling), Cometa, CMA3, in-situ Nick translation, DBD-FISH (DNA breakage detection fluorescence in situ hybridization), SCD (Sperm Chromatin Dispersion), y el SCSA (Sperm chromatin structure assay) (Fernández et al., 2005; Sakkas y Álvarez, 2010). 36 En UNIFERTES, la evaluación de la fragmentación del ADN espermático se realiza utilizando la técnica de SCD mediante el uso del kit Halosperm®. Este kit contiene: o 10 portaobjetos pretratados (A) o 10 tubos Eppendorf con agarosa (B) o 1 tubo con 1 ml de solución desnaturalizante (HCl) (C) o 2 frascos con 60 ml (c/u) de solución de lisis (D) El test de SCD se basa en el principio de que el espermatozoide con ADN fragmentado falla al producir el halo característico que se observa en espermatozoides con ADN no fragmentado, luego de la denaturalización ácida y la remoción de las proteínas nucleares. El halo corresponde a loops relajados de ADN unidos a la estructura residual nuclear, o nucleoides. La presencia de roturas en el ADN promueve la expansión del halo de los nucleoides (Fernández et al., 2003). El análisis de la fragmentación del ADN espermático se realiza utilizando una muestra seminal fresca y homogeneizada. Se comienza midiendo la concentración espermática con la cámara de Neubauer, y, dependiendo de la concentración obtenida, se ajusta a 5-10 millones de espermatozoides/mililitro diluyendo con medio HAM F-10 suplementado con HSA al 0,05%. Luego, se toma uno de los portaobjetos ya pretratados (A) y se enfría en la nevera. Se disuelve la agarosa del (B) en agua hirviendo durante 5 minutos. Luego se equilibra la temperatura de la agarosa (B), 5 minutos en la incubadora (37ºC). Se transfiere 60µl de la dilución de la muestra en la agarosa, se resuspende y se deposita 20µl de esta suspensión en la cara tratada del portaobjetos enfriado (A). Se cubre con cubreobjetos de 22x22mm. Luego, se introduce la lámina 5 minutos en la nevera para melificar la muestra, en posición horizontal. Para el procesamiento de la muestra, se prepara la solución desnaturalizante: 80µl de (C) en 10 ml de agua destilada. En la lámina (A), se retira el cubreobjetos deslizándolo suavemente y se introduce la lámina en una placa de Petri con los 10 ml de la solución desnaturalizante. Se incuba a temperatura ambiente por 7 minutos. Se retira la lámina 37 cuidadosamente (en posición horizontal) con una pinza y se transfiere a otra placa con 10 ml de la solución de lisis (D). Se incuba por 25 minutos a temperatura ambiente. Luego, se retira la lámina y se introduce en una placa con agua destilada durante 5 minutos. Se introduce el portaobjetos en placas con etanol 70%, 90% y 100% durante 2 minutos en cada uno. Se deja secar al aire. Una vez seca, la lámina puede almacenarse a temperatura ambiente durante meses antes de teñir para observar al microscopio. Finalmente, se tiñe la muestra en el portaobjetos de la siguiente manera: Se prepara la solución stock del colorante de Wright (HiMedia): 1 g del colorante + 50 ml glicerol + 50 ml de metanol absoluto. Se prepara justo antes de usar, la siguiente solución: 4ml del stock + 3ml de acetona + 2ml de Buffer fosfato (1/15M, pH 6.5) + 31 ml de agua destilada. Luego, se agregan 10 ml de la solución anterior sobre la muestra y se deja actuar durante 3 minutos. Pasado este tiempo, se agregan 10 ml de buffer fosfato, se sopla ligeramente para mezclar bien y se deja actuar durante 5 minutos más. Luego se lava la lámina con agua destilada y se deja secar al aire. Finalmente, se realiza la evaluación de la muestra, observando la lámina al microscopio de campo claro en objetivo de inmersión. Se recorren varios campos en la lámina y se cuentan 500 células clasificándolas según el halo de dispersión en: o Halo Grande o Halo Mediano o Halo Pequeño o Sin Halo o Sin halo y degradados 38 Los espermatozoides de halo grande y medianos se consideran normales y los de halo pequeño, sin halo o degradados se consideran fragmentados. Los resultados se expresan en porcentaje de espermatozoides fragmentados. 3.3 Técnicas de Reproducción Asistida 3.3.1 Inseminación Intrauterina (IIU) La inseminación artificial consiste en “el depósito de forma no natural de espermatozoides en el tracto reproductor de la mujer”, con el fin de obtener un embarazo (Levy et al., 2008). Se divide en dos grupos (Levy et al., 2008): - Inseminación homóloga: Cuando el semen procede de la pareja - Inseminación heteróloga o de donante: Cuando el semen procede de un donante. Las primeras inseminaciones en seres humanos se remontan hasta el siglo XVIII con John Hunter, aunque el primer caso confirmado de inseminación con donante fue llevado a cabo en 1884, por William Pancoast (Ríos, 2006). Existen distintos métodos para realizar una inseminación artificial, las cuales son: - Inseminación artificial intravaginal: Es el método menos practicado, y consiste en depositar el semen en la vagina. Puede resultar útil para aquellas parejas en las cuales la mujer está sana, pero el hombre no puede eyacular dentro de la vagina, sino por masturbación (Ríos, 2006). - Inseminación artificial intracervical: Consiste en el depósito de semen en el canal cervical (Ríos, 2006). - Inseminación artificial intrauterina (IIU): Es el método más usado y consiste en la inyección de una muestra de semen ya preparada en el laboratorio, dentro de la cavidad uterina a través del canal cervical, utilizando un catéter fino (Ríos, 2006). - Otros: Existen otros métodos como la inseminación intraperitoneal (se depositan los espermatozoides en el fondo de saco de Douglas, ya que el cuello uterino resulta 39 infranqueable) y la intrafolicular (se depositan los espermatozoides en un folículo preovulatorio) (Ríos, 2006; Levy et al., 2008). La IIU es la que mejores resultados ofrece. Actualmente, los demás tipos de inseminación se encuentran en desuso. La IIU se recomienda para aquellas parejas que presenten alguna de las siguientes causas (Tomadas de: Levy et al., 2008): - Si la pareja masculina no puede depositar el semen en la vagina por causas morfológicas (hipospadias), fisiológicas (eyaculación retrógrada o impotencia de origen neurológico) o psicológicas (impotencia de origen psicológico o eyaculación precoz). - Si la pareja masculina presenta algún parámetro seminal alterado, se indica una inseminación artificial homóloga. - Si la pareja femenina presenta algún problema cervical, endometriosis o disfunción ovulatoria. - Finalmente, si la pareja masculina presenta azoospermia no obstructiva, sufre alguna enfermedad de transmisión sexual, si existe un fallo previo de ICSI, si hay predisposición a enfermedades genéticas que no se estudian en el Diagnóstico Genético Preimplantacional, si hay incompatibilidad Rh con isoinmunización anterior o la mujer no tiene pareja, se puede indicar una IIU con donante. 3.3.2 Fecundación in Vitro (FIV) La Fecundación in Vitro es un tratamiento de la infertilidad que consiste en obtener varios ovocitos de los ovarios para fecundarlos con los espermatozoides en el laboratorio; y luego los embriones formados se transfieren al útero (Vanrell y Cívico, 1999) para su implantación y el desarrollo del embarazo (Gilbert, 2006). La FIV fue desarrollada en los años 70 del siglo XX como tratamiento de infertilidad de aquellas mujeres con las trompas de Falopio bloqueadas o dañadas (Gilbert, 2006). Después de 40 muchos intentos, el 25 de julio de 1978 nació Louise Brown, el primer bebé por FIV (Gilbert, 2006). El procedimiento de FIV en UNIFERTES, se realiza de la siguiente manera: 1. Se estimula a los ovarios para que produzcan más ovocitos maduros de lo normal. 2. Se recuperan los ovocitos mediante una aspiración folicular. 3. Se recoge una muestra de semen, y se obtienen los mejores espermatozoides por REM. Luego, en una placa de Petri que contengan los ovocitos se coloca una muestra del REM de espermatozoides y se incuban a temperatura corporal. 4. Si se obtiene una fecundación, se transfieren el o los embriones obtenidos al útero de la madre. En UNIFERTES, la FIV se realiza en medios secuenciales. La FIV está indicada para aquellas pacientes femeninas con obstrucción ovárica o que sufran de endometriosis, disfunción ovulatoria, factor inmunológico, insuficiencia ovárica prematura, algún factor de las trompas de Falopio, tengan cáncer y deseen tener hijos en un futuro (se les puede tratar con la FIV y luego criopreservar sus embriones) o que los pacientes masculinos tengan baja concentración espermática, baja movilidad, menos de 4% de formas espermáticas normales según el criterio estricto de Kruger, o con fallas de IIU (Lerner, 2008). 3.3.2.1 Aspiración folicular Este procedimiento, realizado en la sala de quirófano adyacente al LIV, consiste en aspirar, por vía transvaginal, a los ovocitos que se encuentren en folículos maduros, para su utilización en las TRA, como lo son la FIV o el ICSI (Pagés et al., 2006). Primero, se induce la formación de múltiples folículos con la administración de gonadotropinas (Pagés et al., 2006). Cuando los folículos, evaluados por un ultrasonido, miden de 16-18 mm, se indica la administración de gonadotropina coriónica humana (HCG), que imita la oleada endógena de hormona luteinizante (LH) (Pagés et al., 2006; Trías y Lerner, 2008), y así 41 poder aspirar los líquidos foliculares para obtener ovocitos 35-36 horas más tarde (Trías y Lerner, 2008). La técnica para aspirar los líquidos foliculares más sencilla, relativamente segura, con una alta tasa de recuperación de ovocitos, y que no requiere anestesia general, es la aspiración folicular guiada por transductor transvaginal (Trías y Lerner, 2008). Esta técnica consiste en la inserción por vía vaginal de un transductor cubierto con un condón estéril, junto con una guía de aspiración en la parte superior del transductor, a través de la cual se insertará una aguja que será quien penetre el folículo para su aspiración (Pagés et al., 2006). La aspiración folicular se puede realizar mediante una bomba de vacío o con inyectadoras estériles hasta su colapso total (Pagés et al., 2006). Luego de aspirar los folículos, el líquido folicular (algunas veces de color rojizo por la irrigación sanguínea en el folículo) se transferirá al LIV, en el cual el embriólogo contará e informará a los ginecólogos del número de ovocitos aspirados, y le quitará el cúmulo a los ovocitos en tres cortes utilizando una aguja, para eliminar todo rastro de sangre ya que es tóxica para los ovocitos. Finalmente, se colocarán dentro de unas gotas de medio, contenidas en aceite mineral en la placa, y se llevará a incubación. 3.3.2.2 Transferencia de embriones La transferencia de embriones y la implantación son unos de los momentos de mayor trascendencia dentro de los procedimientos de FIV (Pagés y Aller, 2006). Se transfiere la menor cantidad de embriones de la mejor calidad, para disminuir la ocurrencia de embarazos múltiples que pueden aumentar la morbilidad y mortalidad materno-infantil (Medina, 2008). Cuando se transfieren los embriones en estadio de blastocisto, se evalúa la calidad de los mismos, que se basa en: la expansión del blastocele; si éste inicia su expansión, ocupa la mitad del embrión, ocupa casi todo el embrión, o llena todo el embrión, observándose además una zona pelúcida muy delgada; si el trofoectodermo inicia su salida de la zona pelúcida, o si el blastocisto sale completamente de la zona pelúcida (Medina, 2008). 42 Los dos últimos estadios se suelen ver al día 5 (Medina, 2008). A partir del grado de expansión 3 los blastocistos se clasifican de acuerdo a su masa celular interna (MCI) en: muchas células, firmemente compactadas; varias células, agrupadas más débilmente; o en muy pocas células (Medina, 2008). Finalmente, el trofoectodermo se clasifica en: muchas células que forman un epitelio bien cohesionado; pocas células que forman un epitelio poco cohesionado; o muy pocas células (Medina, 2008). La técnica más utilizada para la transferencia de embriones consiste en la inserción de un catéter cargado con los embriones en medio de cultivo por vía transvaginal, pasando por el orificio cervical interno, hasta dentro del útero, donde los embriones serán colocados (Jiménez y Rosales, 2008). Se utiliza un catéter con punta ecogénica para poder ver el recorrido del mismo mediante una ecografía, y así no tocar el fondo uterino, lo que puede producir contracciones o lesiones endometriales que dificulten la implantación (Jiménez y Rosales, 2008). Al finalizar la transferencia embrionaria, el catéter es llevado al LIV, donde el embriólogo revisará en la lupa la punta del mismo, para evaluar que no se devolvieron los embriones luego de la inyección, si hay sangre o moco. Para promover la implantación se puede utilizar el medio EmbryoGlue® (Vitrolife), que contiene ácido hialurónico para mantener tanto el desarrollo embrionario tardío como la implantación (www.vitrolife.com). 3.3.3 ICSI La Inyección Intracitoplasmática de Espermatozoides (ICSI por sus siglas en inglés: intracytoplasmatic sperm injection) es una FIV muy especializada que consiste en la inyección de un solo espermatozoide en el citoplasma de un ovocito (Gilbert, 2006). Está indicado para pacientes con un factor masculino severo, como baja concentración espermática, baja movilidad espermática, ME anormal y ausencia de espermatozoides en el eyaculado (Olivieri, 2008). 43 La inyección del espermatozoide se logra utilizando un microscopio equipado con dos micromanipuladores hidráulicos, acoplados a dos brazos que sostienen unas micropipetas (Olivieri, 2008). Durante la inyección, los ovocitos son estabilizados con una micropipeta de holding, que mide 60 µm de diámetro; y los espermatozoides son inyectados con una micropipeta de inyección o de ICSI, el cual mide 7 µm de diámetro (Olivieri, 2008). El microscopio debe ser invertido con una óptica que permita contraste y una sensación tridimensional, para trabajar con un aumento entre 200 X y 400 X, y que además tenga una platina de calentamiento para mantener las condiciones de temperatura a 37 °C (Olivieri, 2008). El ángulo de las pipetas en referencia a la placa debe ser de 30° a 35°. La placa donde se encuentran los gametos, debe contener además unas gotas de polivinilpirrolidona (PVP) que servirá para contener los espermatozoides escogidos para la inyección disminuyendo su movilidad, mientras se prepara la posición del ovocito. Antes de la inyección, se inmovilizan totalmente los espermatozoides con un corte con la punta de la micropipeta al flagelo, para romper la membrana del flagelo para que se detenga y haya una buena decondensación cromosómica. También está indicado especialmente para aquellas pacientes con bajo número de ovocitos recuperados, o que en un FIV anterior tuvieron fallas de fecundación, que presente algún factor inmunológico, que la reacción acrosómica o la capacitación sean defectuosas, y para aquellos casos para estudio genético, en que los embriones deban ser sometidos a un diagnóstico genético preimplantacional (Olivieri, 2008). El PICSI (Physiologic ICSI) y el IMSI (Intracytoplasmatic Morphologically Selected Sperm Injection), por su parte, son maneras de seleccionar a los espermatozoides que van a ser inyectados en los procedimientos de ICSI. El PICSI es una técnica que consiste en el uso de placas de Petri especiales que contienen gotas de ácido hialurónico, en las que se selecciona el espermatozoide a inyectar de la manera como sigue: se vierte la muestra seminal capacitada en estos discos en donde los espermatozoides con menor fragmentación del ADN se adhieren al ácido hialurónico y son 44 seleccionados para realizar el ICSI (Kably Ambe y Estévez González, 2009). Un estudio realizado por Parmegiani et al. (2010) ha demostrado que los espermatozoides seleccionados por su unión al ácido hialurónico presentan bajos porcentajes de fragmentación de ADN y de anomalías cromosomales, comparados con aquellos que se recuperaron del PVP (Parmegiani et al., 2010). El ácido hialurónico es un constituyente mayoritario de la matriz del cúmulo del ovocito, y parece jugar un papel crítico en la selección de espermatozoides funcionalmente capacitados durante la fecundación in vivo (Worrilow et al., 2009). En el centro de la placa de Petri se agrega 5 µl de medio especial para ICSI, como G-Mops® Plus con HSA de Vitrolife, donde se colocarán los ovocitos a ser inyectados (Olivieri, 2008). El IMSI, por su parte, se basa en la microinyección en un ovocito de un espermatozoide con un núcleo normal definido por el criterio estricto de la morfología, seleccionado a un aumento de 6000x cuando el ICSI normal se realiza a 400x (Berkovitz et al., 2005). Más adelante, se explicarán las formas de evaluar la morfología espermática, y se profundizará más en el IMSI. 3.3.4 Diagnóstico Genético Preimplantacional (DGP) El diagnóstico genético preimplantacional, o DGP, es un “procedimiento mediante el cual se estudian los defectos genéticos o cromosómicos en embriones de 6 a 8 células obtenidos a partir de fecundación in vitro, antes de transferirlos al útero” (Aguirre, 2008). El DGP detecta enfermedades monogénicas utilizando la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediante marcadores fluorescentes; para estudiar las anomalías cromosómicas tanto estructurales como numéricas, se utiliza la técnica de la hibridización in situ fluorescente (FISH) (Aguirre, 2008). 3.4 Vitrificación de embriones La criopreservación de embriones producidos en un ciclo de FIV brinda a la paciente otra oportunidad de tener un bebé luego de un solo tratamiento de inducción de la ovulación, sin la necesidad de pasar nuevamente por dicho tratamiento y los riesgos que esto implica, y 45 permitirle a la madre espaciar sus embarazos (Rosemberg, 2008). Los dos métodos de criopreservación de embriones más utilizados en los laboratorios de RA son: La congelación lenta y la vitrificación. La vitrificación es un proceso que produce una solidificación vítrea de las células vivas, evitando completamente la formación dañina de cristales de hielo tanto durante el enfriamiento como durante la descongelación (Kuleshova y Lopata, 2002). Algunas ventajas sobre la congelación lenta radica en la poca cantidad de nitrógeno líquido a usar, la no utilización de equipos caros, y la rapidez de su realización (Loutradi et al., 2008). Sin embargo, las principales preocupaciones son la necesidad de utilizar altas concentraciones de soluciones crioprotectoras que puedan ocasionar un shock osmótico, afectando la supervivencia del embrión; y el uso de sistemas abiertos en vitrificación, que permite el contacto directo entre los embriones y el nitrógeno líquido, planteando el riesgo de transmisiones virales (Loutradi et al., 2008). El fenómeno de vitrificación fue investigado y descrito por primera vez al final del siglo XIX, cuando el fundador de la criobiología, Luyet, reconoció el potencial de alcanzar un estado libre de hielo, detenido estructuralmente para la criopreservación (Kuleshova y Lopata, 2002). Aunque se ha estado logrando un protocolo que minimice la invasión al embrión (Tomari et al., 2006), una forma de realizar la vitrificación del embrión es con el medio RapidVitTM Blast (Vitrolife), libre de DMSO. Este producto contiene tres medios para la vitrificación de embriones en estadio de clivaje, que tienen en común la presencia de búffer MOPS, penicilina como agente antibacterial y albúmina sérica humana. El medio Vitri1 Blast no contiene crioprotectores; el medio Vitri2Blast contiene como crioprotectores al glicol etileno y al propanediol; y el medio Vitri3Blast contiene como crioprotectores al glicol etileno, al propanediol y al Ficoll®. Los pasos a seguir para vitrificar en UNIFERTES son: 1. Se colocan 0,5 ml de cada uno de los medios en una placa cuadrada con cuatro pozos, a 37°C de temperatura. 2. Se transfieren los embriones desde el cultivo hasta el medio Vitri1 Cleave, donde se dejan de 5 a 20 minutos. Mientras tanto, se debe preparar la escalerilla de congelamiento, el vial, el crioloop de nylon y la cantidad necesaria de nitrógeno líquido. 46 3. Luego se cambian los embriones al medio Vitri2 Cleave, en la cual se quedarán por dos minutos. Durante este paso, se coloca el vial sobre la escalerilla y ésta se prepara sobre el nitrógeno líquido. 4. Cuando falten 30 segundos, se coloca una gota de 20 µl de Vitri3 Cleave en el tercer pozo. 5. Cuando falten 10 segundos, se recogen los embriones y se transfieren, junto con una mínima cantidad de Vitri2 Cleave, al tercer medio, en la cual permanecerán por 5 – 10 segundos, ya que es tóxico para los embriones. 6. Finalmente, Vitrolife recomienda mover los embriones varias veces en la gota del tercer medio, y cuando falten 5-10 segundos, se colectan los embriones en un volumen mínimo y se montan en el crioloop, el cual se colocará dentro del vial, que a su vez irá directamente al nitrógeno líquido (Figura 3.8). El tiempo total de transferencia de los embriones dentro de la gota hasta que son vitrificados no debe exceder de 30 segundos, ya que el tercer medio es tóxico para los embriones cuando se dejan mucho tiempo en él. Figura 3.8 Tanque de nitrógeno líquido y pajuelas con muestras seminales congeladas. En el Laboratorio de in Vitro, se utilizan unos tanques iguales pero en las pajuelas estarán los ovocitos y los embriones criopreservados. 3.5 Prueba de embarazo La prueba de embarazo se puede realizar el día 10 de la transferencia de los embriones. Se miden los niveles sanguíneos de la gonadotropina coriónica humana (hCG), la cual se 47 produce, en condiciones normales, por el tejido trofoblástico de la placenta (García et al., 2002). Se realizan dos tipos de prueba: La primera prueba que será la cualitativa, y la segunda que será cuantitativa. Para la realización de la prueba de embarazo cualitativa, se recibe un tubo con suero de la paciente y se toma una prueba de embarazo cualitativa (Wondfo Biotech Co., Ltd.) de la nevera y se coloca en la incubadora a 37ºC por 5 minutos. Mientras tanto, el tubo se centrifuga durante 5 minutos a 1500 rpm. Se rotula la prueba de embarazo con el nombre de la paciente y la fecha de realización de la prueba. Se colocan 5 gotas de suero en la zona indicada en la prueba de embarazo. Se deja correr la prueba durante 5 minutos, y finalmente se lee el resultado según las instrucciones del fabricante (Figura 3.9). Finalmente, se envía el tubo con el resto del suero de la paciente a un laboratorio especializado para que le realicen la prueba cuantitativa. Figura 3.9 Pruebas cualitativas de embarazo, en las cuales se les agrega unas gotas de suero sanguíneo al círculo del lado derecho. Si se observan dos marcas rojas, la paciente está embarazada. 48 CAPÍTULO 4 4 Comparación de dos técnicas de evaluación de la morfología espermática 4.1 Importancia del estudio de la morfología espermática (ME) Se han realizado numerosos estudios que demuestran que la ME es el mejor pronosticador del potencial de fertilidad masculina (Tabla 4.1) y que está relacionado con la tasa de FIV. Tabla 4.1 Estudios que analizan la asociación entre parámetros seminales y los resultados in Vitro. Modificado de Coetzee et al. (1998). Autores Clasificación Mahadevan & Eliasson Trouson (1984) Jeyendran et Método de tinción Amarillo de eosina (1971) al. Williams (1986) (1964) Kruger et al. (1986) Criterio Mejor pronosticador Formas espermáticas anormales y movilidad Papanicolau Acrosoma normal Papanicolau ME normal Diff-Quik ME normal Papanicolau ME normal y características del estricto Kruger et al. (1988) Criterio estricto Chan et al. (1989) OMS (1987) movimiento espermático asistido por computadora Sevenster et al. Criterio (1990) estricto Barlow et al. (1991) OMS (1987) Papanicolau ME normal Eosina-nigrosina ME normal y movilidad swimup Kobayashi (1991) et al Criterio estricto Diff-Quik ME normal 49 Enginsu et al. (1992) Criterio estricto Diff-Quik ME normal Papanicolau ME normal Papanicolau ME normal y OMS (1987) Yang et al. (1995) Criterio estricto Figueredo et al. Criterio (1996) Hernandez estricto et al. Criterio estricto (1996) Menkveld et al. Criterio & ME normal Hematoxilina Verde brillante Papanicolau (1996) estricto Vawda et al. (1996) Criterio Papanicolau, estricto Spermac, ME normal e índice acrosómico ME normal Diff- Quik Como se verá a continuación, numerosos estudios tratan de determinar cierta relación entre una ME anormal y un desarrollo embrionario deficiente, en casos de FIV. Salumets et al. (2002) realizaron un estudio para evaluar el efecto de los ovocitos y de los espermatozoides sobre el desarrollo embrionario temprano, y, aunque no observaron efectos significativos de la ME sobre la morfología del embrión, sí observaron una correlación entre la ME y la calidad de clivaje de los blastómeros (Tabla 4.2). Tabla 4.2 Los resultados de ANOVA mixto muestran la influencia de los ovocitos y los espermatozoides en la morfología embrionaria y en la tasa de clivaje de los blastómeros. Tomado de Salumets et al. (2002). 50 En cuanto a ICSI, una investigación realizada por De Vos et al. (2003) evaluó el efecto de la ME del espermatozoide a ser inyectado (utilizando el criterio estricto) en procedimientos de ICSI sobre la tasa de fecundación, implantación y en el desarrollo del embrión. Compararon los resultados entre pacientes que tenían una ME normal y algunos que presentaban una teratozoospermia severa, sin espermatozoides morfológicamente normales disponibles, y encontraron que había diferencia en la tasa de fecundación, pero no observaron diferencias en la calidad de clivaje. De Vos et al. (2003), sugieren en base a la tasa de implantación (Tabla 4.3), la cual era más baja en el grupo de pacientes teratozoospérmicos que en pacientes normales, que podrían existir anomalías cromosómicas de los embriones, heredadas de los espermatozoides. La alta tasa de embarazo bioquímico que observaron al usar espermatozoides no eyaculados provenientes del testículo y del epidídimo, sugiere que, aunque un espermatozoide se vea morfológicamente normal, puede cargar defectos escondidos que interfieran con el desarrollo embrionario y así excluir un embarazo viable. La calidad espermática pobre se ha relacionado a la integridad nuclear espermática: en hombres con anormalidades espermáticas, se observan más espermatozoides con problemas en el empaquetamiento de la cromatina y con más fragmentación endógena de las cadenas de ADN (Sakkas et al., 1998; Irvine et al., 2000; Tomlinson et al., 2001), y esto se ha relacionado con los resultados del embarazo (Larson et al., 2000). De esta manera, concluyen que la ME se correlaciona con la tasa de fecundación mas no con la calidad del clivaje. La tasa de embarazo y la tasa de implantación fueron más altas en los pacientes normospérmicos. Tabla 4.3 Variables dependiendo de la ME en muestras de pacientes tratados mediante ICSI. Modificado de De Vos et al. (2003). 51 ME normal ME anormal P valor No. de ovocitos inyectados. 4871 815 Tasa de fecundación (%) 71.7 ± 25.9 60.7 ± 36.2 P = .058 Tasa de embarazo por ciclo (%) 36.7 20.2 P = .001 9.6 ± 23.3 P = .013 7.2 ± 19.8 P = .006 Tasa de implantación por embrión transferido 18.7 ± 31.6 (%) Tasa de nacimientos vivos por embrión 14.7 ± 28.2 transferido (%) Miller y Smith (2001), quisieron evaluar el efecto de los parámetros espermáticos sobre el desarrollo hasta blastocistos in Vitro, en pacientes asignados a FIV e ICSI. Trabajaron con dos grupos de pacientes: pacientes con calidad seminal normal, que iban a FIV, y pacientes con oligoastenoteratozoospermia, que iban a ICSI. Observaron que muchos embriones del ICSI detuvieron su desarrollo en los estadios de 5 y 8 células, momento en el cual el ADN paterno se activa (Tabla 4.4). La ME se encontró correlacionada significativamente con el desarrollo del blastocisto y la calidad del mismo. Tabla 4.4 Correlación por ANOVA entre algunos parámetros seminales y el desarrollo y calidad de los blastocistos. La ME está correlacionada con el desarrollo del blastocisto. NS: No significativo. Tomado de Miller y Smith (2001). Sin embargo, algunos autores como French et al. (2009), que realizaron un estudio con 1074 ciclos de ICSI, no observaron que el bajo porcentaje de espermatozoides morfológicamente 52 normales tuviese algún efecto sobre parámetros tales como tasa de fecundación, embarazo e implantación del embrión (Tabla 4.5). Concluyen que la selección microscópica del espermatozoide morfológicamente “normal” durante el procedimiento de ICSI, permite excelentes resultados incluso en muestras de pacientes teratozoospérmicos severos. Tabla 4.5 Morfología estricta de Kruger y resultados de ICSI. DE: desviación estándar. Se observan los grupos según su % de espermatozoides morfológicamente normales y los resultados obtenidos en varios pasos de ICSI. Modificado de French et al. (2009). % ME normal 0% 1% 2% 3% 4% 5%-7% >7% Transferencias 138 167 137 129 113 236 154 Tasa de fecundación 75% 75% 77% 77% 74% 76% 77% embarazo 60% 59% 56% 49% 57% 54% 56% Tasa de clínico Tasa de implantación 36% 39% 32% 31% 41% 34% 33% Tasa de abortos 4% 5% 9% 5% 5% 5% 4% 4.2 ¿Qué factores pueden afectar la morfología espermática? 4.2.1 Químicos Tabaco del cigarrillo, alcohol in vitro, cocaína, plomo, cadmio: Mendiola et al., 2009, informan sobre el desarrollo de muchos estudios en los cuales se estudian el efecto de los estilos de vida de los pacientes y su calidad seminal. Encontraron que el tabaco del cigarrillo y algunas drogas recreacionales como la cocaína afectan la ME. En un estudio realizado por Donnelly et al. (1999) encontraron que en estudios in vitro, el alcohol tiene un efecto adverso sobre la ME, y este efecto es dosis-dependiente. No se conoce si existe un umbral de ingesta de alcohol seguro para la ME y la calidad seminal. Finalmente, se han llevado a cabo numerosos estudios que determinan los efectos de factores ocupacionales y ambientales sobre la calidad seminal y la ME. 53 Entre estos factores se observó un efecto dañino del plomo, cadmio, hidrocarburos como el tolueno y el benceno, y el molibdeno, sobre la ME (Meeker et al., 2008; Mendiola et al., 2009). Antiepilépticos: En un estudio realizado por Isojärvi et al. (2004), sobre el efecto de las drogas antiepilépticas, tales como el valproato, la carbamazepina y la oxcarbazepina sobre la calidad seminal. Se observó una mayor frecuencia de espermatozoides morfológicamente anormales en pacientes tratados con estas drogas, que en el grupo control (que no tomaban estas drogas). Ácidos perfluoroalquilos (PFAAS por sus siglas en inglés): Nordstromm et al., (2009) realizaron un estudio para observar los efectos de los ácidos perfluoroalquilos, que son productos de degradación de muchos compuestos polifluorinados (PFC) utilizados en productos comerciales e industriales, sobre la función testicular. Se observó un efecto negativo sobre la ME. Pesticidas: Chemes y Rawe (2003) informan también sobre varios estudios realizados para determinar los efectos de tóxicos ambientales y ocupacionales sobre la calidad seminal. Además de los ya nombrados anteriormente, también observan un efecto dañino de los pesticidas sobre la calidad seminal y la ME. Quimioterapia: Gandini et al. (2006), estudiaron el efecto a corto y largo plazo de la quimioterapia sobre la espermatogénesis, en pacientes con cáncer testicular, y observaron que para la ME, de 0 a 24 meses post-tratamiento, el porcentaje de espermatozoides anormales no cambiaba. Luego de los 24 meses, disminuía el porcentaje de espermatozoides anormales. 4.2.2 Físicos y Fisiológicos Radioterapia: En el mismo estudio sobre quimioterapia de Gandini et al. (2006), también evaluaron el efecto a corto y largo plazo de la radioterapia sobre la espermatogénesis, en pacientes con cáncer testicular, y observaron que para la ME, de 0 a 12 meses después del tratamiento, el porcentaje de espermatozoides anormales aumentaba. Entre los 12 y 24 meses, disminuía el porcentaje de espermatozoides anormales. 54 Calor, Celulares: Mendiola et al. (2009) también informan sobre varios estudios en el que han encontrado efectos negativos de la exposición al calor y el uso continuo de celulares sobre la calidad seminal y la ME, sin embargo, sugieren realizar más estudios al respecto. Varicocele: En un estudio realizado por Portuondo et al. (1983), en el cual evalúan la calidad seminal de pacientes fértiles e infértiles, éstos últimos con y sin varicocele, observaron que el porcentaje de espermatozoides morfológicamente normales disminuye en el grupo infértil, e incluso hay diferencias entre los grupos con y sin varicocele. Se observó además un aumento del defecto cabeza alargada en el grupo con varicocele. Edad: Pasqualotto et al. (2005) realizaron un estudio en el que evalúan los niveles hormonales y el volumen testicular en pacientes de edad avanzada. Observaron una disminución del porcentaje de espermatozoides morfológicamente normales en pacientes mayores de 45 años, siguiendo el criterio de la OMS. Si ocurriesen cambios degenerativos en el epitelio germinal debido al envejecimiento, puede verse afectada la ME. Generación de especies óxido-reactivas (ROS por sus siglas en inglés): Said et al. (2005) realizaron un estudio en el cual observaron una relación entre el índice de deformación espermática (SDI) y el daño al ADN espermático. Oliva y Multigner (2006) observaron que la ingesta de Ketotifeno podría disminuir la generación de ROS por las células de la línea blanca, una que el Ketotifeno podría actuar previniendo la liberación de mediadores inflamatorios por los linfocitos, y reduciendo el efecto inflamatorio de la histamina, al bloquear el receptor de histamina 1, presente en el tracto reproductor masculino. Hipotiroidismo: En un estudio realizado por Krassas et al. (2008), en el cual investigaron el impacto del hipotiroidismo sobre la espermatogénesis humana y la calidad seminal, se observó que esta enfermedad tiene un efecto adverso sobre la calidad seminal, y principalmente sobre la ME. Hiperprolactinemia, infecciones seminales, fiebre, tumores testiculares y enfermedad inflamatoria de Bowel: Chemes y Rawe (2003) informan además sobre varios 55 estudios en los cuales se ha observado una relación negativa entre la presencia de infecciones seminales, fiebre, la enfermedad de Bowel y tumores testiculares, sobre la calidad seminal y la ME, al observar un aumento de vacuolas nucleares en la cabeza espermática. En pacientes con hiperprolactinemia, se ha reportado un aumento de espermatozoides con doble cabeza y doble flagelo (Baccetti et al., 1978). Otros: En el estudio realizado por Auger et al. (2001), en el cual evaluaron la calidad seminal de más de 1000 hombres de cuatro ciudades de Europa y su relación con su historia médica, estilo de vida y ambiente, se observó un aumento de los defectos morfológicos espermáticos y se relacionó al tratamiento médico de la madre durante el embarazo, al alto peso al momento del nacimiento, y a tratamientos previos de criptorquidia. También se observaron variaciones significativas entre algunos defectos y su relación con el estrés, el tiempo semanal en el trabajo, la postura que toma en el trabajo (parado, sentado), y si se encontraban expuestos a soldadura de metales. 4.2.3 Genéticos Algunos defectos morfológicos podrían tener un origen genético. Algunos de estos defectos son: el defecto de cabeza redonda, la presencia de un miniacrosoma, el defecto de flagelo corto, el defecto de flagelo separado de la cabeza, y el síndrome de Kartagener, que causa espermatozoides inmóviles y otras variaciones fenotípicas (Baccetti et al., 2001). También, la displasia de la vaina fibrosa (DFS) puede ser una enfermedad de origen genético (Baccetti et al., 2005). Displasia de la vaina fibrosa (Dysplasia of the fibrous sheath o DFS): Es un defecto genético espermático, caracterizado por el desarrollo displásico del axonema y del citoesqueleto periaxonémico, y causa defectos morfológicos en el flagelo del espermatozoide y baja movilidad. Se han estudiado algunos casos de pacientes que sufren esta enfermedad y se ha observado una baja calidad seminal (Baccetti et al., 2005; Chemes y Rawe, 2003). Esta enfermedad puede coexistir con otras enfermedades respiratorias, por patologías del flagelo de los cilios respiratorios (Brugo-Olmedo et al., 2003). 56 Síndrome de Kartagener: Aunque los pacientes que sufren el síndrome de Kartagener presentan espermatozoides morfológicamente normales, estos espermatozoides son inmóviles y presentan el flagelo rígido (Baccetti et al., 2001; Chemes y Rawe, 2003). Debido a esta observación, se realizaron más estudios para averiguar por qué el flagelo de estos espermatozoides inmóviles estaba rígido, aunque no presentaba ningún defecto morfológico. Encontraron que los defectos eran internos: se reportaron numerosos defectos del axonema, como la falta de los brazos de dineína, ausencia de uno o dos microtúbulos centrales, falta de axonema, entre otros síntomas característicos de este síndrome (Chemes y Rawe, 2003). Los pacientes con este síndrome también pueden presentar bronquiectesis, sinusitis y situs invertus, en la cual los órganos viscerales se alinean del lado incorrecto del cuerpo y puede incluir la dextrocardia (Kay e Irvine, 2000; Chemes y Rawe, 2003). Mutaciones homocigotas del gen SPATA16: Dam et al. (2007) realizaron un estudio en el que describen un gen que podría estar relacionado con la presencia de globozoospermia en humanos, o el defecto de cabezas redondas, que no presentan acrosoma. El gen SPATA16 produce una proteína que se localiza en el aparato de Golgi y en las vesículas proacosómicas que son transportadas al acrosoma en espermátides redondas y alargadas durante la espermiogénesis (Dam et al., 2007). Síndrome de Usher: Esta enfermedad es un subtipo de retinitis pigmentosa (un grupo de desórdenes heterogéneos, que causa degeneración progresiva de fotorreceptores), heredada de forma recesiva, en la cual existe degeneración retinal indistinguible de la retinitis pigmentosa, y que también puede causar enfermedades congénitas de la audición. Los axonemas están presentes en los vellos celulares del aparato auditivo. Por lo tanto, también se estudia la calidad seminal de los pacientes que sufren de este síndroma, ya que el axonema es un organelo muy importante del espermatozoide. Se ha observado que este síndrome puede causar colas dobladas y cortas (Hunter et al., 1986). Ausencia del exón 1 del gen del receptor de andrógeno: En un estudio realizado por Mesquita et al. (2009) sobre una población brasileña, examinaron el exón 1 del gen del receptor de andrógeno. Cuando muta, puede afectar la espermatogénesis y llevar a sufrir de infertilidad masculina. Observaron que si faltaba amplificación del exón 1 de este gen en PCR, se observaban 57 defectos morfológicos en el espermograma. Aún faltan muchos estudios para determinar las mutaciones que pueden afectar la calidad seminal y la ME. Disomías de los cromosomas 7, 18, YY y XY y microdeleciones del cromosoma Y: Varios estudios sugieren una relación entre estos tipos de aneuploidías en espermatozoides, y la presencia de anormalidades morfológicas espermáticas y una severa teratozoospermia (Chemes y Rawe, 2003; Hellani et al., 2005). Sugieren, además, que aquellos pacientes con teratozoospermia severa pueden tener un alto riesgo de producir progenie aneuploide o de bebés varones con microdeleciones del cromosoma Y (Chemes y Rawe, 2003; Hellani et al., 2005). 4.3 Aneuploidías espermáticas y ME. Algunos estudios han mostrado una correlación entre las anomalías cromosómicas o aneuploidías espermáticas y los espermatozoides con la morfología anormal. Por ejemplo, Prisant et al. (2007), estudiaron el estatus del núcleo de espermatozoides con algunas anomalías morfológicas (como la cabeza alargada) mediante FISH. Demostraron una compactación deteriorada de la cromatina en estos espermatozoides, y un aumento ligero de aneuploidías cromosómicas. Devillard et al. (2002), por su parte, estudiaron el contenido citogenético de espermatozoides con cabezas macrocéfalas, mediante FISH, y obtuvieron una correlación entre este tipo de defecto de cabeza y una constitución cromosomal poliploide. Viville et al. (2000) también encontró una alta incidencia de anormalidades cromosómicas en asociación con espermatozoides con el defecto morfológico de cabeza macrocéfala, estudiando mediante FISH a cuatro pacientes que iban a ICSI y eran teratozoospérmicos severos. Aunque Lee et al. (1996) no encontraron aumento de anomalías cromosómicas en espermatozoides con cabezas macrocéfalas y microcéfalas. 4.4 Embriones aneuploides 58 Se evaluó si los pacientes teratozoospérmicos o con mayor porcentaje de espermatozoides con defectos morfológicos, tenían un riesgo elevado de producir embriones aneuploides. Dubey et al. (2008), realizaron un estudio retrospectivo en 52 pacientes para evaluar el impacto de la ME sobre las tasas de aneuploidía embrionaria, implantación y embarazo clínico. Los pacientes de FIV-DGP fueron divididos en dos grupos según su ME en: grupo teratozoospérmico y grupo normal. Observaron una mayor tasa de euploidía, implantación y embarazo clínico por ciclo y por transferencia en el grupo normal que en el teratozoospérmico (Tabla 4.6), lo que sugiere que la ME juega un rol importante. Tabla 4.6 Resultados de embarazo clínico entre un grupo normal y un grupo teratozoospérmico. Tomado de Dubey et al. (2008). No encontraron diferencias entre las tasas de anomalías cromosómicas entre ambos grupos, pero sí obtuvieron un mayor porcentaje de embriones normales en el grupo normal que en el grupo teratozoospérmico (Figura 4.1) 59 Figura 4.1 Distribución porcentual de embriones normales y anormales, luego de realizar un DGP, entre un grupo normal y un grupo teratozoospérmico. Tomado de Dubey et al. (2008). Observaron una relación entre la ME anormal, un aumento de complejos anormales cromosómicamente, las tasas de embarazo clínico y de implantación. Sugieren que la ME anormal pueda convertirse en un riesgo relativo o un marcador de prognosis pobre para los ciclos exitosos de DGP y de FIV. La ME, como se ha observado, parece jugar un papel muy importante en los resultados de las TRA y en el desarrollo del embrión. La presencia de espermatozoides aneuploides o que presentan daños en el ADN podrían dar lugar a embriones aneuploides o con daños en el ADN, que pueden causar fallas en la implantación, abortos, y nacimientos de niños con defectos cromosómicos o genéticos. Si la ME anormal pudiese ser un indicador indirecto de la presencia de anomalías cromosómicas, entonces se hace evidente que realizar un estudio adecuado de la ME del paciente que se someterá a alguna TRA, es una necesidad. 4.5 Estudio de la ME Aunque la alta variabilidad morfológica del espermatozoide humano, tanto en un mismo eyaculado como entre individuos (Álvarez Lleó, 2003), hace que la evaluación de la ME se dificulte, las observaciones de espermatozoides recuperados del tracto reproductor femenino y de la superficie de la zona pelúcida en el ovocito, han ayudado a definir la forma de un espermatozoide morfológicamente normal (OMS, 1999). De cualquier manera, de entre todos los parámetros seminales, ha sido la ME el mejor indicador de la fertilidad masculina (Coetzee et al., 1998). De hecho, algunos estudios proponen que la importancia de la ME, relacionada con el potencial de fecundación, pueda deberse a la inhabilidad del espermatozoide morfológicamente anormal para llevar el material genético normal al citoplasma del ovocito (Silverberg y Turner, 2004). A partir de grabaciones de video, han observado que parece ser que los espermatozoides morfológicamente anormales tienden a tener una movilidad disminuida o ausente. Esto podría deberse a una ineficiencia hidrodinámica debido a la forma de la cabeza, a anormalidades en la estructura del flagelo que podría prevenir el movimiento normal, y/o a deficiencias en la producción energética necesarias para la movilidad (Silverberg y Turner, 2004). 60 Los principales defectos de la evaluación de la ME han sido el alto número de sistemas de clasificación utilizados para describir aquellos factores que, en conjunto, constituyen un espermatozoide morfológicamente normal o anormal; los distintos procedimientos de tinción utilizados, de los cuales algunos ni siquiera permiten evaluar todo el espermatozoide (Eliasson, 1978), y la naturaleza subjetiva de la evaluación (Coetzee et al., 1998). 4.6 Sistemas de clasificación para medir la morfología espermática humana Algunos de los sistemas de clasificación más utilizados para evaluar la morfología espermática son: Eliasson, OMS, Williams, criterio estricto de Tygerberg o de Kruger, David y Jouannet, Freund, Fredricsson y Düsseldorf (Coetzee et al., 1998). Se explicarán los dos más utilizados a nivel mundial: El sistema de la OMS y el criterio estricto de Kruger. 4.6.1 OMS De acuerdo a la OMS, una muestra de semen con una calidad espermática normal es aquella con un porcentaje de espermatozoides morfológicamente normales mayor o igual a 30% (Vazquez-Levin et al., 1998). La OMS ha publicado manuales en los años 1980, 1987, 1992 y 1999, para estandarizar los procedimientos para el análisis seminal en los laboratorios de andrología alrededor del mundo (Nallella et al., 2006). Este análisis se realiza de la siguiente manera: - Para que un espermatozoide sea considerado normal, la cabeza, cuello, pieza media y cola deben ser normales. La cabeza debe ser ovalada. Tomando en cuenta el encogimiento leve que ocasiona la fijación y la tinción, la longitud de la cabeza debe ser de 4.0-5.0 µm y el ancho de 2.5-3.5 µm. La relación longitud/ancho debe ser de 1.50 a 1.75. Estos rangos son los límites de 95% de confianza para la tinción de las cabezas espermáticas por Papanicolaou (OMS, 1999). 61 - La estimación de la longitud y ancho del espermatozoide se puede realizar con un micrómetro ocular. El acrosoma debe abarcar 40%-70% del área de la cabeza. La pieza media debe ser delgada, con menos de 1 µm de ancho, aproximadamente 1 y medias veces la longitud de la cabeza, y unida axialmente a ella. Las gotas citoplasmáticas deben medir menos de la mitad del tamaño de la cabeza normal. La cola debe ser recta, uniforme, más delgada que la pieza media, sin enrollamientos y aproximadamente 45 µm de longitud. Todos los espermatozoides con características alejadas a estas se consideran anormales (OMS, 1999). Las siguientes categorías de defectos deben hacerse notar (Figura 4.2) (OMS, 1999): a. Defectos en la cabeza: Cabeza larga, pequeña, cónica, piriforme, redonda, amorfas, cabezas vacuoladas (>20% del área de la cabeza ocupada por áreas vaculares sin teñir), cabezas con áreas acrosomales pequeñas (<40% del área de la cabeza), y dobles cabezas, o cualquier combinación de ellos. b. Defectos del cuello y zona media: cuello doblado (el cuello y cola forman un ángulo de más de 90% el eje largo de la cabeza), una inserción asimétrica de la zona media en la cabeza, zona media gruesa o irregular, zona media anormalmente delgada (sin vaina mitocondrial), o cualquier combinación de ellos. c. Defectos de la cola: Es decir, corta, múltiple, con forma de horquilla, colas rotas, colas dobladas (>90°), colas con ancho irregular, colas enrolladas, o cualquier combinación de ellos. d. Gotas citoplasmáticas: Si ocupan más de la mitad del área de una cabeza espermática normal. Las gotas se localizan usualmente en la pieza media. 62 Figura 4.2 Tipos de defectos en cabeza, cuello, pieza media y flagelo. Modificado de: OMS (1999). Sólo aquellos espermatozoides reconocibles con una cola se consideran en un conteo morfológico diferencial; aquellas células inmaduras incluyendo el estadio de espermátide redonda no se cuentan como espermatozoides. Espermatozoides sin cabeza o sin cola no se cuentan como espermatozoides pero se cuentan separadamente. Las colas enrolladas pueden estar asociadas con baja movilidad espermática o indicar que el espermatozoide ha estado expuesto a estrés hipo-osmótico (OMS, 1999). Ocasionalmente, muchos de los espermatozoides pueden tener un defecto estructural específico tal como falla de la placa basal para unirse al núcleo al polo opuesto del acrosoma, haciendo que las cabezas y colas se despeguen en la espermiación. Las cabezas se absorben y sólo las colas se encuentran en el semen dando el defecto “cabeza de alfiler”. Las cabezas de alfiler (colas libres) no se cuentan como defectos de la cabeza ya que ellos raramente sólo poseen alguna cromatina o estructuras en la cabeza anteriores a la placa basal (OMS, 1999). 4.6.2 Criterio estricto de Kruger 63 Los trabajos de Thinus Kruger proponen un criterio más estricto en la evaluación de la ME, ya que consideran a los espermatozoides borderline como anormales (Munuce, 2008). Se conoce como el criterio estricto de Kruger o criterio de Tygerberg (nombre del hospital donde trabaja Kruger). Fue descrito por primera vez por Menkveld (Menkveld, 1987), y se basa en la morfología de espermatozoides post-coitales encontrado a nivel del os cervical interno (un orificio que se abre a la cavidad uterina y desde donde se extiende el conducto cervical). Adicionalmente, la morfología de los espermatozoides que se encontraron unidos fuertemente a la zona pelúcida del oocito humano, vistos bajo condiciones del ensayo de hemizona e in vitro, es la misma de los espermatozoides encontrados en el moco cervical en el os cervical interno en el test post-coital (Menkveld y Kruger, 1996). En un estudio realizado por Mortimer et al. (1982a), también se observó un aumento de la ME normal en aquellos espermatozoides recuperados de los oviductos del tracto reproductor femenino. El valor de referencia es 14%, porque se ha observado que pacientes por debajo de este límite disminuyen sus posibilidades de FIV de un 88.3% a un 49.4% (Munuce, 2008), y disminuye también la proporción de embarazos (Tabla 4.7). El grupo teratozoospérmico se puede dividir en: 4-14% grupo con buen pronóstico; y <4% grupo con pobre pronóstico (Coetzee et al., 1998; Munuce, 2008). Sin embargo, no todas las clínicas alrededor del mundo se rigen por este criterio; algunas aún utilizan el de la OMS, que evalúa la morfología de un modo menos estricto, donde el valor de referencia resulta en 50% normales, muy superiores al estricto (Munuce, 2008). Lo interesante del método de Kruger era que ofrecía un valor que podía predecir el resultado de la tasa de FIV (Kruger et al. 1986). Este criterio es más estricto que el de la OMS ya que el nivel al cual una muestra seminal se considera normal si tiene al menos 14% de espermatozoides con formas normales (Vazquez-Levin et al., 1998). Tabla 4.7 Tasa de fecundación por ovocito y proporción observada de embarazos en los distintos grupos basados en el porcentaje de espermatozoides morfológicamente normales. Modificado de Kruger et al. (1986). Se observa un umbral de proporción de embarazos entre el grupo I y los demás. 64 Total Grupo I Grupo II Grupo III Grupo IV (0%- (15%- (31%- (46%- 14%) 30%) 45%) 60%) No. Total de ovocitos 104 324 309 69 806 Ovocitos fertilizados 38 264 252 63 617 81 82 91 Tasa de fecundación/ovocito 37 (%) Proporción de embarazos (%) 0 11.4 (si 1-2 ovocitos transferidos) 25.8 (si ≥3 o más ovocitos transferidos) Para hacer la evaluación de la ME según Kruger, se evalúan extendidos de una muestra de semen fresco teñidos con la coloración de Papanicolau modificada para espermatozoides. El espermatozoide debe presentar una configuración ovalada donde la incorporación acrosómica debe ser de forma adecuada y ocupar de 40% a 70% de la cabeza, sin defectos en la pieza media, o cola (Teppa-Garrán y Palacios-Torres, 2004). Kruger et al. (1987b) reveló que en aquellas parejas sometidas a procedimientos de FIV, la tasa de fecundación fue de 49.4% en el grupo que tenía menos de 14% de espermatozoides con formas normales, a diferencia de 88.3% cuando la morfología era mayor del 14% (P < 0.0001). A continuación se presenta una tabla comparativa (Tabla 4.8) entre el criterio de evaluación espermática por la OMS y el criterio estricto (modificado de Menkveld et al., 1996): Tabla 4.8 Comparación entre los criterios estricto y de la OMS para analizar la ME. Criterios para espermatozoides morfológicamente normales Criterio de Kruger Cabeza Configuración oval lisa Criterio de la OMS Configuración oval lisa El acrosoma debe cubrir entre 40% El acrosoma debe cubrir más de un y 70% de la cabeza por la parte tercio de la superficie de la cabeza. anterior. Longitud 3-5 µm.. Pap D-Q Ancho 2-3 µm ó entre 1/2 y 2/3 de la longitud de la cabeza. 65 Longitud 3-5 µm 5-6 µm Son normales las formas dudosas de la Ancho 2-3 µm 2.5-3.5 cabeza µm ovaladas sin anormalidades toscas. normal y/o cabezas casi Ancho de la cabeza debe medir entre 3/5 y 2/3 de la longitud normal de la cabeza. Son anormales las formas dudosas de la cabeza normal y/o cabezas casi ovaladas sin anormalidades toscas. Cuello Debe estar intacto y sin implantaciones. Pieza Unido axialmente, delgado, aprox. 1 Delgado, menos de 1/3 del ancho de la media µm de ancho y 1 ½ veces la longitud cabeza, de la cabeza. regular, derecho y con alineado contorno con el eje Sin gotas citoplasmáticas de más de longitudinal de la cabeza y aprox. 7 a la mitad del tamaño de la cabeza. 8 µm de largo. Sin gotas citoplasmáticas de más de la mitad del tamaño de la cabeza. Cola Uniforme, ligeramente más delgado Delgado, sin enrollamientos y debe que la pieza media, sin presentar un contorno regular. Al enrollamientos, y aprox. 45 µm de menos 45 µm de largo. largo. 4.7 Técnicas para evaluar la morfología espermática La evaluación de la ME, de acuerdo a la OMS (1999), se debe realizar sobre frotis de la muestra fresca seminal (OMS, 1999). El portaobjetos debe ser limpiado con 70% de etanol y secado con gasa, no papel (para no dejar partículas), antes de colocarle una gota de semen (de 5 a 20 µl) (OMS, 1999). Se realiza el frotis colocando otro portaobjetos sobre la gota con un ángulo 66 de 30°, la cual se dispersa por todo el lado inclinado del portaobjetos, y se empuja hacia delante sobre el segundo portaobjetos, para extender la muestra seminal (Figura 4.3) (Kruger y Franken, 2004; OMS, 1999). Figura 4.3 Técnica para realizar el frotis para la evaluación de la morfología espermática. Tomado de OMS, 1999. Luego de realizar el frotis, se procede a teñir la muestra con alguna de las tinciones nombradas a continuación. 4.7.1 Tinciones Los métodos de tinción son muy variados, pero los más utilizados son el de Diff-Quik, el de Papanicolaou, el de Shorr, el de Giemsa, el de Spermac y el de Testsimplets (Kruger y Franken, 2004). La tinción de Giemsa no se usa tan comúnmente como los demás, ya que los espermatozoides sin acrosoma teñidos pueden aparecer como normales y los flagelos pueden no teñirse (Menkveld y Kruger, 1996). El método de Papanicolaou ofrece una buena definición tanto de células espermáticas como de otros tipos celulares (Kruger y Franken, 2004). Esta tinción colorea al acrosoma de azul claro, la región post-acrosomal de azul oscuro, la pieza media de verde y el flagelo de rojo, pero su tiempo de procesamiento es de 2 horas (Kruger y Franken, 2004, Coetzee et al., 1998). El 67 método de Spermac tiñe la porción nuclear de rojo, mientras que el acrosoma, la pieza media y el flagelo se tiñen de verde (Kruger y Franken, 2004). La tinción de Diff-Quik (Figura 4.4), por su parte, colorea al acrosoma de morado pálido, mientras que la región post-acrosomal, la pieza media y el flagelo se tiñen de morado oscuro (Kruger y Franken, 2004). El análisis morfológico con esta tinción provee de resultados similares comparándolo con Papanicolaou (Menkveld y Kruger, 1996). Un efecto negativo de esta tinción es que puede ocurrir una tinción excesiva de la célula y del fondo o background, lo cual se puede contrarrestar lavando primero la muestra de semen antes de realizar el frotis (Menkveld y Kruger, 1996). La tinción de Diff-Quik se realiza de la siguiente manera: Se realiza un frotis en un portaobjetos de la muestra fresca para evaluación de la ME. Luego, se deja secar bien a temperatura ambiente y se tiñe con la tinción HEMA3 o Diff-Quick, que consiste en 1 fijador con alcohol metilo, y 2 colorantes, uno con eosina Y y otro con azul de metileno. En el fijador, la lámina se mantiene por 1 minuto; en el colorante rojo se deja por 2 minutos, y finalmente se mantiene en el colorante violeta por 2 minutos más. La observación se realiza al microscopio óptico, con un aumento de 100x, bajo aceite de inmersión. Figura 4.4 Soluciones de la tinción de Diff-Quik. De izquierda a derecha: fijador, solución 1 con eosina Y, y solución 2 con azul de metileno. 68 El kit comercial Testsimplets® (Figura 4.5) fue introducido por Schirren et al. en 1977 (Henkel et al., 2008), y consiste en un portaobjetos cubierto por una capa coloreada, constituida por dos colorantes: 2,1 µg/cm2 de acetato de violeta de cresilo y 1 µg/cm2 nuevo azul de metileno. Cabe resaltar que esta tinción no necesita de un frotis para teñir la muestra. Se coloca una gota de semen sobre la capa coloreada, y luego se cubre con un cubreobjetos, para ser observado posteriormente al microscopio. La intensidad del color y la proporción de mezclado de los colorantes en el recubrimiento de los portaobjetos son constantes y están estandarizados). Figura 4.5 Kit de Testsimplets® de la empresa Waldeck. Se puede observar la lámina donde se colocará la muestra seminal, la caja contenedora de las láminas, y la caja contenedora de los cubreobjetos. La OMS recomienda la tinción de Papanicolaou, ya que ofrece una buena tinción de los espermatozoides y de otras células. Permite la tinción de la región acrosomal y posacrosomal de la cabeza, las gotas citoplasmáticas, la pieza media, y del flagelo (OMS, 1999). Algunos laboratorios utilizan tinciones rápidas como la Diff-Quik; sin embargo, algunos frotis teñidos con tinciones rápidas pueden presentar un fondo coloreado y no siempre ofrecen la misma calidad que el Papanicolaou (OMS, 1999). Además, el tamaño de la cabeza espermática teñida con Diff- 69 Quik es más grande que las teñidas con Papanicolaou o con Shorr; incluso, las cabezas espermáticas teñidas son un poco más pequeñas que las cabezas de los espermatozoides vivos en el semen original, aunque su forma no cambia (OMS, 1999). En el presente trabajo, se utilizan las tinciones de Diff-Quik y de Testsimplets®. No siempre se evalúa la morfología espermática siguiendo un proceso de tinción de las células y posterior observación al microscopio. De hecho, se han buscado nuevas formas de análisis que disminuyan la valoración subjetiva al catalogar a un espermatozoide morfológicamente normal o anormal, y que aporten parámetros métricos y objetivos que reflejen mejor la realidad de la muestra seminal (Soler et al., 2005). Varias de estas formas nuevas de análisis y evaluación son los analizadores computarizados, aquellos basados en la birrefringencia espermática, y la selección por microscopía de alto aumento para IMSI. 4.7.2 Analizadores computarizados Algunos estudios han sugerido que la evaluación de la ME con analizadores computarizados puede proveer información clínica útil. Algunas compañías CASA ofrecen paquetes para examinar la ME pero pocos están automatizados completamente y existen problemas con la preparación de las muestras a analizar y con la discriminación entre espermatozoide y detritus (OMS, 1999). Además, se ha observado diferencias significativas entre instrumentos (Davis y Gravance, 1994). Se necesita alcanzar un mayor desarrollo de estos sistemas antes que el análisis espermático asistido por computadora pueda ser recomendado para el estudio rutinario de la ME (OMS, 1999). Soler et al. (2005) destacaron la existencia de una correlación positiva entre la ME y la capacidad fecundante in Vitro. Debido a esta correlación, resaltan la importancia de trabajar en la búsqueda de un método estandarizado y reproducible que ayude a mejorar el análisis de la ME. En este contexto, los primeros analizadores computarizados de ME (CASMA) aparecieron hace 20 años aproximadamente. Uno de estos analizadores fue el Sperm Class Analyzer (SCA®), que se centraba en el estudio de la cabeza y la pieza media. Los sistemas ASMA analizan una serie de parámetros morfométricos objetivos que pueden ayudar a definir cuál espermatozoide es normal. 70 Las ventajas de todos estos métodos es que aportan parámetros métricos y objetivos, se fijan en detalles que difícilmente los embriólogos podrían observar y así determinan mejor la ME normal que otros métodos. Sin embargo, son muy caros, y aunque otorgan mayor precisión e información, no hay estándares adecuados (Soler et al., 2005; El-Ghobashy y West, 2003). En base a esto, Soler et al. (2005) desarrollaron un nuevo sistema computarizado de morfometría espermática (ISAS por sus siglas en inglés, un SCA® evolucionado), y valoraron su utilidad como pronosticador de la tasa de fecundación obtenida con muestras seminales de pacientes que seguían los procedimientos de IIU, FIV e ICSI. También se compararon los resultados obtenidos con ISAS con aquellos obtenidos del análisis morfológico estándar. Analizaron parámetros espermáticos tales como el área, perímetro, longitud y ancho de la cabeza, porcentaje de la cabeza ocupada por el acrosoma y área, ancho, ángulo y distancia entre los ejes de la cabeza y la pieza media. Observaron diferencias significativas entre los valores de algunos parámetros morfológicos entre las muestras frescas y aquellas sometidas a swim-up. Para casos de ICSI e IIU, observaron que el porcentaje de ovocitos fecundados aumentaba a medida que disminuía tanto el área y perímetro de la cabeza, principalmente (Figura 4.6). Las cabezas grandes pueden resultar de la condensación inadecuada de la cromatina o del mal intercambio de histonas por protaminas durante la espermatogénesis, lo que podría interferir con los primeros estadios del desarrollo embrionario (Soler et al., 2005). Esto explica el resultado de que a mayor perímetro y área de la cabeza, menores tasas de embarazo, observado en las muestras de IIU. 71 Figura 4.6 Regresiones lineales significativas (P < 0.05) entre la tasa de fecundación y los parámetros morfométricos de la cabeza de espermatozoides seleccionados por swim-up, para pacientes tratados mediante ICSI (a y b); y entre el establecimiento del embarazo y los parámetros morfométricos de espermatozoides seleccionado por swim-up, para pacientes que siguen la IIU (c y d) (a, área: r = -0.661; b, perímetro; r = -0.573; c, área de la cabeza: r = -0.619; d, perímetro de la cabeza: r = -0.595). Tomado de Soler et al. (2005). En el estudio realizado por El-Ghobashy y West (2003), que se basó en examinar el valor predictivo de la forma de la cabeza espermática y otros, analizados mediante CASA, sobre el resultado de FIV, se obtuvo una correlación positiva entre la forma normal de la cabeza, y la tasa de fecundación (Figura 4.7). También se observó lo mismo para características tales como el índice acrosomal normal y la presencia de vacuolas en el acrosoma, pero con una correlación positiva menor. 72 Figura 4.7 Gráfica de la tasa de fecundación (eje de ordenadas) dependiendo del porcentaje medio de espermatozoides con cabezas con forma normal (oval) en eje de abcisas (r = 0.696. P < .001). Modificado de El-Ghobashy y West (2003). 4.7.3 Análisis basado en la birrefringencia espermática Recientemente se ha propuesto un nuevo método para analizar la ME el cual, utilizando la microscopía de luz polarizada, permite evaluar las características de birrefringencia del espermatozoide debido a las propiedades anisotrópicas de las organelas celulares (Gianaroli et al., 2008a). El principio de la birrefringencia se basa en que, en una onda mecánica transversal, la vibración es perpendicular a la dirección de propagación de la onda. Si la vibración se mantiene paralela a una recta fija en el espacio, se dice que la onda está polarizada linealmente. Si permanece paralela a un plano se dice que está polarizada respecto a ese plano. Se puede tomar como ejemplo las ondas mecánicas en una cuerda. Si la cuerda estirada desde ambos extremos se mueve de lado a lado horizontalmente se observarán ondas en la misma dirección del movimiento. Si la cuerda se mueve describiendo círculos, las ondas formadas describen una hélice o elipse. Esta onda se dice que está polarizada elípticamente. Ocurre igualmente con ondas electromagnéticas, como la luz. Existen cuatro fenómenos que producen ondas electromagnéticas polarizadas a partir de ondas no polarizadas: absorción, reflexión, dispersión o “scattering” y birrefringencia. La 73 birrefringencia, o doble refracción, es un fenómeno complicado que se presenta en algunos materiales inorgánicos y orgánicos. En la mayoría de los materiales, la velocidad de la luz es la misma en todas direcciones. Estos materiales son isótropos. Debido a su estructura atómica, los materiales birrefringentes son anisótropos, en los cuales la velocidad de la luz depende del plano de la polarización y de su dirección de propagación a través del material (Tipler y Mosca, 2005), y resulta en la obtención de distintos índices de refracción en cualquier dirección en el mismo material (Murphy et al., 2009). Cuando un rayo de luz incide sobre los materiales birrefringentes, puede separarse en dos rayos denominados rayo ordinario y rayo extraordinario, cuya diferencia se conoce como retardancia (Figura 4.8). Estos rayos están polarizados en direcciones mutuamente perpendiculares y se propagan con diferentes velocidades. Dependiendo de la orientación relativa del material y de la luz incidente, los rayos pueden propagarse también en direcciones diferentes (Tipler y Mosca, 2005). Debido a que la presencia de birrefringencia en los materiales es la expresión de una alta organización y compactación molecular, un espermatozoide que presente este fenómeno en el núcleo, el acrosoma y en la cola, puede ser considerado como normal (Gianaroli et al., 2008a). Así, el uso de la microscopía polarizada para la selección de espermatozoides para ICSI se basa en las propiedades de birrefringencia natural del espermatozoide humano. Por ejemplo, en los núcleos de células maduras, hay una fuerte birrefringencia intrínseca asociada a los filamentos de nucleoproteína, los cuales están ordenados en barras y orientados longitudinalmente. La presencia de filamentos de proteínas subacrosomales orientados longitudinalmente le da al complejo acrosomal maduro un tipo similar de birrefringencia. Esto es igual para porciones largas de cola, donde la organización microtubular del axonema y de las mitocondrias en la pieza media son birrefringentes. 74 Figura 4.8 Birrefringencia. (A) En un material isótropo, un haz de luz se refracta en un rayo emergente. (B) En un material anisótropo, un haz de luz se refracta en dos rayos de luz de diferentes velocidades: Uno rápido y otro lento. La diferencia de los índices de refracción de estos rayos se denomina retardancia. Modificado de: Gianaroli et al. 2008b. La ventaja de esta técnica es que al introducir lentes polarizados y analizadores junto con un sistema de micromanipulación, existe la posibilidad de seleccionar células birrefringentes para ICSI sin afectar la vitalidad o movilidad (Gianaroli et al., 2008a). Gianaroli et al. (2008a) compararon las observaciones hechas sobre espermatozoides con morfología normal utilizando microscopía electrónica de transmisión y microscopía de luz polarizada, y concluyeron que un espermatozoide considerado normal con una de las técnicas, también podía ser considerado normal con la otra. Así que quisieron evaluar la proporción de espermatozoides birrefringentes en pacientes “infértiles” que iban a ser tratados con ICSI, para ver si existía alguna relación entre los parámetros morfológicos y sus estructuras protoplasmáticas, y aplicar la microscopía de luz polarizada al procedimiento de ICSI para evaluar a los espermatozoides de las muestras seminales de estos pacientes. Además, evaluaron el desarrollo del embrión y la tasa de implantación de los cigotos provenientes de estos espermatozoides, y compararon todo con un grupo control (pacientes tratados con ICSI convencional), para analizar las ventajas de seleccionar al espermatozoide fecundante en base a su birrefringencia. 75 Evaluaron muestras de pacientes normospérmicos, oligoastenoteratospérmicos (OAT) con movilidad progresiva, OAT sin movilidad progresiva, y tomadas directamente del testículo. Tomaron a los espermatozoides que presentaban birrefringencia en la cabeza y fueron inyectados en los ovocitos (Figura 4.9). La ME fue evaluada siguiendo el criterio estricto de Kruger. C Figura 4.9 Bajo luz polarizada, se puede diferenciar entre espermatozoides en los cuales la reacción acrosómica ocurrió (A) o no (B), o espermatozoides con un patrón de birrefringencia alterado (C). En B, es evidente la birrefringencia en la pieza media, así como en la cabeza, C acrosoma y núcleo. En C, la alteración de la birrefringencia se debe a la presencia de una vacuola en la cabeza y en la pieza media. Modificado de Gianaroli et al. (2008b). Observaron una mayor birrefringencia en las muestras de pacientes normospérmicos, así como mayores tasas de embarazo e implantación en el grupo de estudio (seleccionado por birrefringencia) que el grupo control (Figura 4.10). De acuerdo a varios estudios, la calidad seminal tiene un efecto en el resultado del ICSI y en la predisposición a anomalías cromosómicas, las cuales aumentan proporcionalmente a la severidad de la condición del factor masculino. Sin embargo, muchas de las técnicas para evaluar a los espermatozoides son altamente invasivas y no se pueden utilizar para seleccionar al espermatozoide que va a ser inyectado en el procedimiento de ICSI. La ventaja del estudio de la birrefringencia espermática es que puede reflejar la buena salud del espermatozoide sin ser altamente invasivo, permitiendo seleccionar directamente al espermatozoide fecundante. 76 Figura 4.10 Comparación de resultados entre el grupo control (barras negras) y grupo de estudio (barras grises). (A) Tasa de embarazo por transferencia de embrión en relación a la calidad de la muestra seminal. (B) Tasa de implantación en relación a la calidad de la muestra seminal. OAT=oligoastenoteratospérmicos (Tomado de: Gianaroli et al. (2008a)). Concluyeron que el uso de la birrefringencia es un método eficaz para seleccionar al espermatozoide fecundante, ya que perfecciona esta selección para los procedimientos de ICSI, debido a la posibilidad de evaluar la organización de los organelos en la cabeza y cola, sin afectar la viabilidad espermática (Gianaroli et al., 2008a). La birrefringencia también permite detectar vacuolas en la cabeza, la presencia de las cuales se ha relacionado con bajas tasas de embarazo y abortos tempranos (Berkovitz et al., 2006). 77 4.7.4 Selección por microscopía de alto aumento para IMSI Un nuevo método que ha dado buenos resultados es el de chequear las organelas espermáticas con un microscopio con alto poder de magnificación (Gianaroli et al., 2008). Fue desarrollada por Bartoov et al. (2002), y su ventaja radica en que no necesitaba de tinción o fijación celular para la selección, todo se realiza en tiempo real (Figura 4.11). Fue denominada evaluación de la morfología de los organelos de espermatozoides móviles con alta magnificación (MSOME por sus siglas en inglés), para IMSI (Intracytoplasmic Morphologically Selected Sperm Injection) que es un ICSI en la cual se selecciona con alta magnificación al espermatozoide a ser inyectado. Este examen necesita de un microscopio invertido con un equipo de contraste interferencial de Nomarski (aumenta la resolución), un objetivo de inmersión x100, una cámara y un monitor, para alcanzar un aumento de x6000. Si se equipa con un zoom, se puede llegar hasta x12000. Esto permite observar las partes de un espermatozoide: acrosoma, lámina posacrosomal, pieza media, mitocondrias, flagelo y núcleo (Junca et al., 2009). Figura 4.11 Un espermatozoide normal móvil a alto aumento (x6100), sin teñir y sin fijar. La base de la cabeza se señala con una flecha roja y una B. Tomado de Cassuto et al. (2009). Bartoov et al. (2002) basaron su estudio en observaciones realizadas sobre la poca relación que algunos estudios han establecido entre la ME y el resultado de FIV e ICSI. Sin embargo en el tracto reproductor femenino, los espermatozoides que llegan a la zona pelúcida usualmente tienen una ME normal, existiendo una exclusión en el recorrido de aquellos con ME anormal. Esto no ocurre en procedimientos de ICSI. Puede suceder además que el embriólogo 78 escogiese para el ICSI a un espermatozoide anormal, aunque la muestra de semen tuviese una población de espermatozoides que pudo haber arrojado resultados normales. Además, el embriólogo podría pasar por alto defectos sutiles en los organelos cuando analiza los espermatozoides a menos de x1000. Por esto, estos investigadores quisieron ver la relación entre el uso de IMSI e ICSI. Analizaron los organelos a un aumento de 6300x. Obtuvieron una correlación positiva entre el porcentaje de espermatozoides con morfología general y nuclear normales inyectados y la tasa de fecundación (Figura 4.12) mas no con la obtención de embarazo. Los resultados apoyan el uso de alta magnificación como técnica para escoger el espermatozoide fecundante en ICSI, y analizar su morfología a nivel subcelular en tiempo real. Otro ejemplo de la utilización de microscopía de alto aumento en procedimientos de ICSI, es el trabajo de Antinori et al. (2007), en el cual utilizaron la técnica de IMSI (inyección intracitoplasmática de espermatozoides seleccionados morfológicamente) basándose en los resultados del examen bajo 6600x. Obtuvieron una mayor tasa de embarazo clínico y de implantación en procedimientos de IMSI que ICSI (Tabla 4.9). Concluyen que es importante enfatizar cómo una sola evaluación espermática es fiable sólo cuando se lleva a cabo en un espermatozoide móvil; ya que una imagen estática de un espermatozoide permite la evaluación de la parte visible, dejando algunas alteraciones morfológicas sin descubrir. Como se puede observar, utilizando la microscopía de alto aumento se pueden desarrollar técnicas que mejoran los resultados en ciclos de ICSI. Por otra parte Berkovitz et al. (2006), utilizando un aumento de 6600x para observar la forma del núcleo espermático y la presencia de vacuolas en la cabeza para determinar su efecto sobre la obtención de embarazo en FIV e ICSI, observaron que la presencia de vacuolas parecía reducir la tasa de embarazo y aumentaba la tasa de abortos por embarazo. 79 Figura 4.12 Correlación entre la tasa de fecundación en ICSI y dos parámetros de MSOME. (a) Espermatozoides morfológicamente normales. (b) Espermatozoides con núcleo morfológicamente normal. Tomado de Bartoov et al. (2002). Tabla 4.9 Comparación de las tasas de fecundación, embarazo, implantación y aborto obtenidos de grupos tratados mediante ICSI e IMSI (inyección intracitoplasmática de espermatozoides morfológicamente seleccionados). Modificado de Antinori et al. (2007). aP = 0.004; bP = 0.007. Grupo 1, ICSI (n = Grupo 2, IMSI (n = 227) 219) No. de ovocitos inyectados 2.92 ± 0.26 2.90 ± 0.29 No. de embriones transferidos por 2.37 ± 0.67 2.47 ± 0.68 paciente Tasa de embarazo clínico (%) 58/219 (26.5)a 89/227 (39.2)a Tasa de implantación (%) 59/521 (11.3)b 97/560 (17.3)b Tasa de abortos (%) 14/58 (24.1) 15/89 (16.9) La técnica de evaluación por tinciones es la más común actualmente para analizar la ME en los laboratorios de reproducción asistida. De esta técnica, Diff-Quik y Testsimplets® son algunas de las tinciones más utilizadas en la actualidad. Como objetivo de este trabajo se desea comparar dos tinciones, Diff-Quik y Testsimplets®, en el análisis de la ME en muestras seminales, para evaluar la factibilidad de hacer cambios y mejorar la eficiencia del laboratorio de Andrología, en cuanto al tiempo de entrega de resultados. 80 4.8 Materiales y Métodos Se analizó la ME de las muestras seminales de 30 pacientes de UNIFERTES, con DiffQuik (utilizado en UNIFERTES) y Testsimplets®. Estos pacientes presentaban una concentración espermática mayor a 20 millones/ml, y una movilidad espermática mayor a 50% de espermatozoides progresivos rápidos y moderados. Para realizar la tinción de Diff-Quik, se efectuó un frotis en un portaobjeto con 60 µl de la muestra seminal, y se dejó secar al aire. Luego se tiñó siguiendo los pasos descritos para esta tinción. Para realizar la tinción de Testsimplets®, se tomó 10 µl de la muestra seminal, y se colocó en la mitad del portaobjeto pre-teñido. Inmediatamente, se colocó sobre la muestra un cubreobjetos, también incluido en el kit, y se presionó suavemente. Se dejó transcurrir 15 minutos para que los espermatozoides perdieran movilidad y la tinción hiciera efecto. En ambos casos, se evaluaron 100 espermatozoides al microscopio óptico a un aumento de 1000x. Se contaron los espermatozoides normales y los anormales con un contador manual, siguiendo el criterio estricto de Kruger. Se clasificaron los espermatozoides anormales de acuerdo al defecto morfológico observado. Así, este grupo estaba constituido por todos aquellos espermatozoides que presentaran alguna de las siguientes deformidades: En cabeza: si era alargada, piriforme, si presentaba doble cabeza, si era redonda, si era grande (macrocéfala), si era pequeña (microcéfala), o si era amorfa y no entraba en ninguna categoría anterior. 81 En pieza media: Si en la unión pieza media-cabeza, la primera estaba doblada; si era gruesa, si era irregular, o si presentaba gotas citoplasmáticas. En flagelo: si se encontraba enrollado, si era doble, si era corto, si respecto a la unión con la cabeza era abaxial y si estaba doblado. Se compararon los resultados de cabezas piriformes y alargadas, entre ambas tinciones, ya que Henkel et al. (2008) y Schoenfeld et al. (1981), explican que los espermatozoides podrían permanecer de lado debido al soporte húmedo de la lámina de Testsimplets®, que no implica un proceso de fijación, llevando a confundir al observador inexperto con el defecto de cabeza alargada o el defecto de cabeza piriforme. Además, se deseó saber si Testsimplets® podía ser utilizado para evaluar el porcentaje de células redondas en semen, en vez de con el test de peroxidasa. Si en la observación inicial de movilidad y concentración se observaba un número de células redondas >1*106, se les realizaba el test de peroxidasa, contando porcentaje de células redondas de la línea blanca y porcentaje de células redondas de la línea espermática. Aquellos pacientes (n = 7, en total) a quienes se les debía realizar el Test de Peroxidasa, se les evaluaba también el porcentaje de células redondas de ambos tipos en la lámina de Testsimplets®. Posteriormente, utilizando el programa estadístico STATGRAPHICS Centurion XVI (StatPoint Technologies), se compararon los resultados obtenidos entre ambos tratamientos, tanto en la evaluación morfológica como en el conteo de células redondas, siguiendo una prueba-t apareada. 82 4.9 Comparación y Resultados 4.9.1 Defectos morfológicos observados en las muestras A continuación se presentarán fotografías de las distintas características espermáticas observadas. Tabla 4.10 Fotografías de características morfológicas espermáticas observadas durante el estudio. 83 84 85 También se observaron células redondas de ambos tipos: de la línea blanca (leucocitos) y de la línea espermática. Se presentan en la tabla a continuación. Tabla 4.11 Fotografías de células redondas observadas en ambas tinciones. 86 4.9.2 Comparación de espermatozoides Testsimplets® y Diff-Quik normales entre tinciones Se comparó el porcentaje de espermatozoides normales contados en frotis teñidos con Diff-Quik con aquellos contados en láminas de Testsimplets®. Se observó que no existen diferencias entre datos (Figura 4.13), de los cuales se compararon sus medias. Con la hipótesis nula de que los datos son iguales entre sí según la técnica, se calcularon las comparaciones estadísticas, obteniéndose que no se puede rechazar la hipótesis nula, es decir, ambas técnicas producen los mismos datos. Gráfico Caja y Bigotes datospasanDQ.Normales datospasan.Normales 0 3 6 9 12 15 18 Figura 4.13 Gráfico de caja y bigotes de porcentaje de espermatozoides normales calculados en una lámina de Testsimplets® (abajo), y teñidos con Diff-Quik (arriba). La siguiente tabla presenta los estadísticos de resumen para el porcentaje de espermatozoides normales en ambas técnicas de tinción. Incluye medidas de tendencia central, medidas de variabilidad y medidas de forma. El sesgo estandarizado puede utilizarse para determinar si la muestra proviene de una distribución normal. Valores de estos estadísticos fuera del rango de -2 a +2 indican desviaciones significativas de la normalidad. En este caso, el valor del sesgo estandarizado se encuentra dentro del rango esperado para datos provenientes de una distribución normal. 87 Tabla 4.12 Resumen estadístico de los datos de espermatozoides normales contados de acuerdo a ambos tratamientos. Recuento Promedio Desviación Estándar Coeficiente de Variación Mínimo Máximo Rango Sesgo Estandarizado Diff-Quik 30 9,33333 3,51679 37.6799% 1 16 15 0,0194158 Testsimplets 30 9,3 3,84304 41.323% 2 18 16 0.306712 En la siguiente tabla se ejecuta una prueba-t apareada para comparar las medias de las dos muestras. También construye el intervalo de confianza para la diferencia entre las medias, el cual se extiende desde -1,87047 hasta 1,93714. Puesto que el intervalo contiene el valor de 0, no hay diferencia significativa entre las medias de las dos muestras de datos, con un nivel de confianza del 95,0%. Además, como el valor-P calculado no es menor que 0,05, no se puede rechazar la hipótesis nula. Tabla 4.13 Prueba-t para comparar las medias de los datos de espermatozoides normales para ambos tratamientos. Comparación de Medias Intervalos de confianza del 95,0% intervalo de confianza para la diferencia de medias suponiendo varianzas iguales: 0,033333 +/- 1,9038 [-1,87047, 1,93714] Prueba t para comparar medias Hipótesis nula: media1 = media2 Hipótesis Alt.: media1 ≠ media2 suponiendo varianzas iguales: t = 0,0350478 valor-P = 0,972162 No se rechaza la hipótesis nula para α = 0,05. 88 4.9.3 Comparación de espermatozoides piriformes y alargados entre tinciones Testsimplets® y Diff-Quik Se realizó una prueba-t para comparar los resultados obtenidos entre el número de espermatozoides con cabeza piriforme y con cabeza alargada, ya que el aumento de estas variables en Testsimplets® podría estar asociado al uso del mismo. Tabla 4.14 Comparación de cabezas alargadas y piriformes observadas con Testsimplets® y DiffQuik. Cabeza Alargada Intervalos de confianza del 95.0% intervalo de confianza para la diferencia de medias suponiendo varianzas iguales: 3.43333 +/- 4.60922 [-1.17589, 8.04256] Hipótesis nula: media1 = media2 Hipótesis Alt.: media1 ≠ media2 suponiendo varianzas iguales: t = 1.49105 valor-P = 0.141368 No se rechaza la hipótesis nula para alfa = 0.05. Piriforme Intervalos de confianza del 95.0% intervalo de confianza para la diferencia de medias suponiendo varianzas iguales: 6.96667 +/- 3.771 [3.19566, 10.7377] Hipótesis nula: media1 = media2 Hipótesis Alt.: media1 ≠ media2 suponiendo varianzas iguales: t = 3.69804 valor-P = 0.000484231 Se rechaza la hipótesis nula para alfa = 0.05. Se puede observar que, aunque no se rechaza la hipótesis nula al comparar cabezas alargadas, sí se rechaza en cabezas piriformes. De hecho, el número de cabezas piriformes es mayor en el análisis realizado con Diff-Quik que con Testsimplets® (Figura 4.14). 89 30.00 P = 0,141368 P = 0,000484231 25.00 20.00 15.00 Testsimplets Diff-Quik Quik 10.00 5.00 0.00 Piriformes Alargados Figura 4.14 Porcentaje promedio de espermatozoides con defectos de cabeza alargada y piriforme, según la tinción utilizada. Así, se tiene que se observó mayor porcentaje de cabezas piriformes en Diff-Quik (Figura 4.15). Gráfico Caja y Bigotes datospasanDQ.Piriformes datospasan.Piriformes 0 10 20 30 40 Figura 4.15 Gráfico de caja y bigotes de porcentaje de espermatozoides piriformes calculados en una lámina de Testsimplets® (abajo), y teñidos con Diff-Quik (arriba). 4.9.4 Defectos morfológicos Se evaluó si había algún defecto morfológico que presentara diferencias de acuerdo a la tinción utilizada. Se realizó nuevamente una prueba-t apareada, y se obtuvo que los siguientes defectos morfológicos diferían entre ambas tinciones: además del defecto morfológico de cabeza 90 piriforme, los defectos morfológicos de la pieza media doblada, irregular y presencia de gotas citoplasmáticas (Tabla 4.15). Tabla 4.15 Defectos morfológicos con diferencias estadísticas entre tinciones. Pieza Doblado Media Irregular Gotas citoplasmáticas Hipótesis nula: media1 = media2 Hipótesis Alt.: media1 ≠ media2 suponiendo varianzas iguales: t = -3,55577 valor-P = 0,000758059 Se rechaza la hipótesis nula para alfa = 0,05. Hipótesis nula: media1 = media2 Hipótesis Alt.: media1 ≠ media2 suponiendo varianzas iguales: t = -2,81391 valor-P = 0,006672 Se rechaza la hipótesis nula para alfa = 0,05. Hipótesis nula: media1 = media2 Hipótesis Alt.: media1 ≠ media2 suponiendo varianzas iguales: t = -3,61946 valor-P = 0,000620937 Se rechaza la hipótesis nula para alfa = 0,05. Se obtuvo, además, las diferencias de promedio existentes entre los defectos morfológicos de pieza media evaluados con Testsimplets® y con Diff-Quik (Figura 4.16). P = 0,006672 4.50 4.00 P = 0,000620937 3.50 3.00 P = 0,000758059 2.50 Testsimplets 2.00 Diff-Quik 1.50 1.00 0.50 0.00 Doblado Irregular Gotas Cit Figura 4.16 Promedios de defectos morfológicos observados que presentaban diferencias significativas entre tinciones. 91 4.9.5 Comparación entre leucocitos/células redondas espermáticas También se deseó evaluar si el número de células redondas, sean leucocitos o células espermáticas inmaduras, que se observaron al realizar el contaje de la ME con el kit de Testsimplets®, correspondían al número de células redondas de ambos tipos que se contabilizaron al realizar el test de Peroxidasa, en una muestra de 7 pacientes con células redondas >1x106. Para esto, se realizó una comparación estadística de las medias. Tabla 4.16 Resumen estadístico del contaje de células redondas de la línea espermática (LE) y de la línea blanca (LB), tanto en el test de peroxidasa (per) como en el kit de Testsimplets® (ts). LEper Recuento Promedio Desviación Estándar Coeficiente de Variación LEts 7 72 29,6142 41,13% LBper 7 74,5714 22,3969 30,03% LBts 7 28 29,6142 105,77% 7 25,4286 22,3969 88,08% En la siguiente tabla se realizó una prueba-t apareada para comparar las medias de las muestras. Se puede observar que el valor-P calculado no es menor que 0,05, por lo tanto no se rechaza la hipótesis nula. Es decir, no hay diferencias significativas entre el contaje de células redondas entre el test de Peroxidasa y el kit de Testsimplets®. Tabla 4.17 Prueba-t para comparar las medias del número de células redondas de las líneas blanca y espermática, evaluadas tanto en el test de peroxidasa como con el kit de Testsimplets®. Comparación de Medias LB y LE Prueba t para comparar medias Hipótesis nula: media1 = media2 Hipótesis Alt.: media1 ≠ media2 suponiendo varianzas iguales: t = 0,183232 valor-P = 0,857675 No se rechaza la hipótesis nula para α= 0,05. 92 4.10 Discusión De acuerdo a los resultados obtenidos, no existen diferencias significativas en el porcentaje de espermatozoides normales según el criterio estricto de Kruger dependiendo del tipo de tinción utilizado (Testsimplets® o Diff-Quik). Tampoco existen diferencias significativas en el análisis de células redondas tanto de la línea blanca como de la línea espermática, entre el kit de Testsimplets® y el test de peroxidasa, aunque el n=7. Estos resultados en cuanto a ME concuerdan con los de algunos autores como Schirren et al. (1977), que compararon el estudio de la ME según la OMS con Testsimplets® con Papanicolaou, y no obtuvieron diferencias significativas entre ambos resultados. Además, volvieron a comparar el porcentaje de espermatozoides normales entre ambas tinciones 24 horas después, e indicaron que se obtienen mejores resultados, debido quizás a la “mejor penetración de la tinción”. Otro estudio realizado por Calamera y Vilar (1979), en el que compararon la evaluación de la ME según la OMS utilizando Testsimplets® con otras dos tinciones (Pappenheim y Couture), no observaron diferencias significativas entre las tinciones, y concluyeron que Testsimplets® es una tinción rápida y confiable, pero que no puede ser preservada. Con las otras dos tinciones, los frotis se mantenían permanentemente, mientras que con Testsimplets®, las láminas resultaban “inútiles” después de 24 horas. Schoenfeld et al. (1981), compararon el análisis de la ME según la OMS con Testsimplets® y con la tinción Hematoxilina-Eosina, y tampoco observaron diferencias significativas entre ambas tinciones. Resaltan que, aunque las instrucciones de Testsimplets® recomienda esperar 2 horas para que los espermatozoides se inmovilicen, ellos observaron que al cabo de 4 minutos ya todas las células se encontraban inmovilizadas y teñidas. 93 Mientras otros autores como Henkel et al. (2008), que compararon la ME según Kruger con diferentes tinciones en muestras de 94 pacientes escogidos al azar de una clínica de andrología, sí observaron diferencias significativas entre Testsimplets® y otras tinciones, como Papanicolaou y Shorr. En el estudio de Henkel et al. (2008), también describen la imposibilidad de guardar las muestras en las láminas de Testsimplets® para futuras re-observaciones. Para subsanar este problema, la empresa productora de Testsimplets® recomienda una técnica que permite preservar las láminas de Testsimplets® hasta por 4 meses. Esta técnica se realiza luego de colocar la muestra de semen sobre la lámina. Se deja secar al aire, se fija con formalina 10% por un minuto, y se cubre con un cubreobjetos. Schoenfeld et al. (1981) observaron que si se cubría la lámina de Testsimplets® con un cubreobjeto y luego se recubría con pintura de uñas, la muestra podía ser observada hasta 5 días después. Si además, luego de evaluar la muestra en Testsimplets®, se le removía el cubreobjetos y se dejaba secar la muestra al aire, la tinción podía durar hasta 3 meses. Si se removía el cubreobjetos, la muestra se dejaba secar al aire y se fijaba con formalina al 10%, la tinción podría demorar hasta 3 meses antes de desteñirse, de la misma manera como recomienda Testsimplets®. Durante la evaluación de la ME con el kit de Testsimplets®, se hicieron algunas observaciones. Una de ellas era que algunos de los espermatozoides observados parecían estar de lado debido a la forma que presentaba la cabeza, lo cual concuerda con las observaciones realizadas por Henkel et al. (2008), en su estudio realizado para comparar tres métodos de tinción para la evaluación de la morfología espermática humana: Papanicolaou, Shorr y Testsimplets®. Henkel et al. (2008) y Schoenfeld et al. (1981), explican que los espermatozoides podrían permanecer de lado debido al soporte húmedo de la lámina de Testsimplets®, que no implica un proceso de fijación, llevando a confundir al observador inexperto con el defecto de cabeza alargada o el defecto de cabeza piriforme; sin embargo, en este trabajo no se obtuvieron diferencias entre el defecto de cabeza alargada entre tinciones, pero sí se obtuvo un mayor porcentaje de espermatozoides con cabezas piriformes en la evaluación con Diff-Quik que con Testsimplets® (Figura 4.14). También explican que, por este mismo soporte húmedo, los espermatozoides podrían hincharse, modificando también las observaciones realizadas. Henkel et al. (2008) no recomiendan el uso de Testsimplest®, aunque lo hayan encontraron correlacionado con Papanicolaou. 94 Una ventaja de Testsimplest es que no necesita tener un extractor o campana de extracción cercanos (Henkel et al., 2008). De entre todos los defectos morfológicos evaluados (de cabeza, pieza media y cola), sólo cuatro presentaban, al comparar las medias de cada tinción, diferencias estadísticas. Son los defectos de cabeza piriforme, de pieza media doblada, con borde irregular y con presencia de gotas citoplasmáticas. Según lo observado por Henkel et al. (2008), cabe resaltar el hecho que se esperaba mayor porcentaje de cabezas piriformes en la evaluación por Testsimplets® que en la evaluación por Diff-Quik. Brinsden (1999) comenta que una cabeza piriforme, en la cual la base de la cabeza no es redondeada sino puntiaguda, indica una debilidad de la región entre cabeza y pieza media. Respecto a las cabezas piriformes, Rousso et al. (2002) realizaron un estudio para investigar la frecuencia de espermatozoides con cabeza piriforme, el porcentaje de ocurrencia de este defecto morfológico, y para evaluar la posible correlación de este defecto con otros parámetros seminales. Los espermatozoides con cabeza piriforme fueron observados en 98.2% de las muestras seminales; en hombres subfértiles, el defecto se presentaba en 22% del total de espermatozoides contabilizados; y observaron una correlación positiva entre este defecto y otros, como la pieza media doblada, la presencia de gotas citoplasmáticas y el flagelo enrollado. Los autores afirman que “a mayor número de espermatozoides con la cabeza piriforme, mayor el porcentaje de formas espermáticas anormales y mayor el número de anormalidades morfológicas por espermatozoide” (Rousso et al., 2002). Las imágenes de las células de la muestra seminal se ven en tres dimensiones (3D), debido posiblemente al soporte húmedo de la lámina. En el frotis y tinción con Diff-Quik, las imágenes se observan en dos dimensiones (2D), es decir, el enfoque de la imagen de la célula se encuentra en un solo plano al observarla a través del microscopio, mientras que en el kit Testsimplets® se debe mover el micrómetro del microscopio para observar en varios planos todas las partes de la célula analizada; quizás este hecho podría permitir en Testsimplets® observar mejor las anomalías de flagelo y pieza media, y podría explicar las diferencias obtenidas al evaluar los defectos de pieza media (Figura 4.16). 95 Mortimer y Menkveld (2001), comentaron que Testsimplets® puede dar preparaciones de baja calidad, y que su análisis puede ser más difícil y lento que la tinción de Papanicolaou. Incluso, Diff-Quik tampoco puede proveer de todos los detalles y penetración que Papanicolaou puede ofrecer. Aunque se analizaron pocos casos, no se observaron diferencias estadísticamente significativas en el análisis de células redondas entre el test de Peroxidasa con el kit Testsimplets®, se podría concluir que es confiable utilizar Testsimplets® para el análisis de células redondas en la muestra seminal, en concordancia con el estudio de Henkel et al. (2008). En otro estudio realizado por Riedel (1980), en el cual compararon el uso de Testsimplets® con la tinción de Papanicolaou para determinar la presencia de células redondas de la línea blanca, se concluyó también que es posible utilizar Testsimplets®. Schoenfeld et al. (1981) sugieren que Testsimplets® permite una diferenciación fácil entre células redondas, ya que las células de la línea blanca exhiben claramente sus gránulos individuales. Angelopoulos et al. (1997), también analizaron células redondas con Testsimplets® y confirmaron el tipo celular mediante FISH, y sugirieron que se puede utilizar Testsimplets® para seleccionar células redondas de la línea espermática para uso investigativo o clínico. El test de peroxidasa, como se explicó anteriormente, consiste en mezclar 10 µl de bencidina o de o-toluidina con 10 µl peróxido de hidrógeno y 10 µl de la muestra seminal. La bencidina es un potente carcinogénico; en humanos puede ser mutagénico cuando se inhala, y se ha asociado a un aumento de contraer cáncer en riñones, uretra y vejiga (Fichas de Seguridad). El o-toluidina también se ha asociado a un riesgo de contraer cáncer (o-o’Tolidine). Una de las ventajas del Testsimplets® es que no contiene bencidina ni o-toluidina, aunque las cantidades de estos compuestos a las que se expone el operador durante la realización del test de peroxidasa son mínimas. La realización de la tinción con Testsimplets® es mucho más rápida que las otras tinciones, ya que Testsimplets® es una tinción del tipo pancromático, es decir, todos los colorantes neutros actúan juntos en un solo paso, mientras la tinción de Diff-Quik es del tipo 96 panóptica, la cual es una coloración combinada realizada sucesivamente por colorantes neutros (Márquez, 2004). Ambas tinciones, a su vez, son del tipo Romanovsky, que consiste en aplicar varios colorantes que tienen afinidad por diferentes constituyentes celulares (Stevens y Lowe, 2006). Siendo ambas tinciones, Diff-Quik y Testsimplets®, tinciones tipo Romanovsky (Stevens y Lowe, 2006), los porcentajes de espermatozoides morfológicamente normales y anormales podrían ser parecidos entre ambos. Henkel et al. (2008) reportan, además, los altos costos del kit Testsimplets®. Una investigación realizada por las páginas web de algunas distribuidoras médicas señala que ofrecen este kit a €90 aproximadamente para 100 muestras, mientras que el kit para la tinción Diff-Quik está por el orden de los €112 o los $226, para más de 1000 muestras (Diff-Quik – Theinfertilityshop.com; Testsimplets – Quirumed.com; PROTOCOL Hema3 Manual Staining System – Fishersci.com). Es muy importante realizar una buena historia clínica, ya que algunos factores que causan anomalías morfológicas pueden ser disminuidos con cambios en el estilo de vida del paciente. Para aquellos casos de teratozoospermia irreversibles, p.e. causados por enfermedades genéticas, existen varias opciones que podrían ayudar a seleccionar a los espermatozoides con morfología normal para TRA. ICSI es una de ellas, ya que French et al. (2009), demostraron que una selección microscópica adecuada del espermatozoide para ICSI, es suficiente para tener buenos resultados en pacientes con teratozoospermia. Más recientemente, la utilización del IMSI, que es una técnica basada en la selección, a un aumento de 6000x, del espermatozoide que será inyectado en casos de ICSI, permite realizar una mejor selección de espermatozoides morfológicamente normales. Otra opción es con FIV-PICSI, que es un sistema fisiológico de selección de espermatozoides que consiste en utilizar placas de Petri especiales con gotas de ácido hialurónico, al cual se unirán aquellos espermatozoides morfológicamente normales con menos fragmentación del ADN y menos anomalías cromosómicas. Como demuestran algunos estudios, como el de Jakab et al. (2005) y Roudebusch et al. (2004), al comparar la frecuencia de estos 97 parámetros antes y después de realizar PICSI, han demostrado que disminuyen los porcentajes de aneuploidías cromosómicas, aumenta el porcentaje de espermatozoides morfológicamente normales y disminuye la fragmentación del ADN en las muestras espermáticas después de realizar PICSI. Este trabajo comparó la evaluación de la ME siguiendo el criterio estricto de Kruger, mediante las tinciones Diff-Quik y Testsimplets®. Es importante resaltar que ninguno de los trabajos anteriores comparó Testsimplets® con Diff-Quik siguiendo el criterio estricto de Kruger, bien sea porque estos trabajos compararon Testsimplets® con otra tinción, o lo compararon con Diff-Quik pero siguiendo un criterio distinto al de Kruger. Los resultados de este trabajo muestran que se puede utilizar Testsimplets® para el análisis de la ME, que el kit de Testsimplets® permite ahorrar tiempo y mejorar la eficiencia del laboratorio de Andrología en cuanto al tiempo de entrega de resultados, lo cual es importante en la evaluación clínica; pero es mucho más costoso que Diff-Quik. Si la rapidez en la entrega de resultados en la evaluación clínica es importante, se puede usar Testsimplets® mencionándolo en el reporte, ya que los resultados no son diferentes significativamente en este estudio. El método considerado el estándar de oro para la evaluación morfológica por la mayoría de los autores es el Criterio Estricto de Kruger con la tinción de Papanicolaou y DiffQuik. Si mantener los altos estándares en el laboratorio es lo importante, este es el método que se debe utilizar, al menos para tomar decisiones en pacientes que tienen resultados morfológicos dudosos o muy cercanos a lo normal (borderline). Como se comentó anteriormente, no hay un trabajo anterior a éste que compare DiffQuik y Testsimplets®, según el Criterio Estricto de Kruger. Son necesarios más trabajos para poder establecer el uso de Testsimplets® como una técnica confiable para la evaluación de la ME. Si los métodos producen diferentes perfiles de ME, quizás sea necesario establecer un valor normal para cada método (Diff-Quik y Testsimplets®) que se relacionen con los resultados de FIV. 98 Conclusiones y recomendaciones 5 Conclusiones y recomendaciones Anteriormente, ningún trabajo había comparado la evaluación de la ME siguiendo el criterio estricto de Kruger, mediante las tinciones Diff-Quik y Testsimplets®. Entre los métodos de tinción de la ME conocidos, no existen diferencias significativas entre las medias de los porcentajes de espermatozoides morfológicamente normales, siguiendo el criterio estricto de Kruger. Esto sugiere que ambas tinciones pueden ser utilizadas para evaluar la ME. Se encontraron diferencias entre defectos morfológicos, entre ambas tinciones. Estos defectos fueron (además de cabeza piriforme): pieza media doblada, irregular y con presencia de gotas citoplasmáticas. Se observó mayor porcentaje de estos tres defectos de pieza media en Testsimplets®, debido quizás a que el soporte líquido de esta tinción permita observar mejor los defectos de pieza media y/o flagelo. Se puede utilizar cualquiera de las dos tinciones, Diff-Quik y Testsimplets®, en el análisis de la ME según Kruger y en el análisis de células redondas en muestras seminales. El kit de Testsimplets® permite ahorrar tiempo, lo cual es importante en la evaluación clínica; pero es mucho más costoso que Diff-Quik. Usar Testsimplets® permitirá mejorar la eficiencia del laboratorio de Andrología en cuanto al tiempo de entrega de resultados. 99 Referencias 6 Referencias 1. ABITBOL, J. Estudio del hombre con problemas de fertilidad. En: URBINA, M.T. y J. LERNER BIBER. 2008. Fertilidad y Reproducción Asistida. Editorial Médica Panamericana C.A. Venezuela. 2. AGUIRRE, T. 2008 El diagnóstico genético preimplantacional. En: URBINA, M.T. y J. LERNER BIBER. 2008. Fertilidad y Reproducción Asistida. 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