EFECTO PRODUCIDO SOBRE LA ACTIVIDAD ANTITUMORAL DEL

Rev Cubana Oncol 1999;15(1):30-5
Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología
EFECTO PRODUCIDO SOBRE LA ACTIVIDAD ANTITUMORAL DEL
CORALÁN POR EL TRATAMIENTO CON UNA ENZIMA PROTEOLÍTICA
Lic. Rita M. Pérez Gil,1 Lic. Ana D. Ávila Cabrera,2 Lic. José L. Bello Gárciga,3 Dr. Mario Cruz Nurque,4
Lic. Carlos F. Calderón Marín5 y Lic. Marta Montalvo Duquesne6
RESUMEN
Los biopolímeros obtenidos de fuentes naturales se han ganado un lugar entre
los inmunoestimulantes de interés oncológico, en particular, los polisacáridos
extraídos de algas y otros organismos marinos, pueden ser considerados como
posibles nuevos medicamentos antitumorales. En el Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología, a lo largo de varios años se han desarrollado investigaciones encaminadas a caracterizar la actividad antitumoral del Coralán,
biopolímero obtenido de un coral blando del mar Caribe. En el presente trabajo
se demuestra que el tratamiento de la molécula de Coralán con una enzima
proteolítica produce una reducción en el contenido de proteínas que conduce a
la disminución de su actividad antitumoral.
Descriptores DeCS: CARCINOMA DE EHRLICH; PEPTIDO HIDROLASAS/
farmacología; CNIDARIA/efecto de drogas; AGENTES ANTINEOPLASICOS.
En las últimas décadas, han sido evaluados numerosos productos capaces de
actuar sobre las células tumorales por medio de la estimulación de los mecanismos
de defensa del organismo.1,2
Dentro de este tipo de moléculas se
encuentra el coralán, biopolímero aislado
1
2
3
4
5
6
Lic. en Química. Investigadora Auxiliar.
Lic. en Química. Investigadora Agregada.
Lic. en Biología. Doctor en Ciencias.
Dr. en Medicina Veterinaria. Aspirante a Investigador.
Lic. en Física Nuclear. Investigador Agregado.
Lic. en Veterinaria. Aspirante a Investigadora.
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de un coral blando que se encuentra en las
aguas del Mar Caribe, con el cual se han
desarrollado investigaciones encaminadas
a caracterizar su utilidad como posible
medicamento para el tratamiento de los
pacientes con cáncer.
El coralán está constituido por
polisacáridos y proteínas. El componente
polisacarídico contiene arabinosa,
galactosa, fucosa y glucosa, además de un
ácido urónico no identificado; también
contiene hexosaminas y presenta grupos
sulfatos.3 Dado su alto peso molecular,
hasta el momento, no ha sido posible fraccionar este compuesto en cromatografía de
filtración en gel.
El coralán inhibe en un 50 %, el crecimiento tumoral de los tumores experimentales como el adenocarcinoma 755, el
carcinoma pulmonar de Lewis y el sarcoma 180, cuando se suministra a las 48 horas después de transplantados los tumores
en ratones BDF1.4
El coralán induce el rechazo del crecimiento del tumor ascítico de Ehrlich
cuando se administra, en una dosis única
de 50 mg/kg, 48 h antes del trasplante del
tumor a ratones IBF1, al encontrarse que
el 70 % de los animales inoculados no desarrolló el tumor después de 30 días de
observación.5
El coralán estimula la actividad
citostática de los macrófagos, la actividad
de las células NK e incrementa la respuesta mitogénica de la fitohemaglutinina
(PHA); también evita la metastización hepática y pulmonar producida por el
melanona B16F10 trasplantado en ratones
C57BL/6,6-9 donde pueda existir una relación entre su acción sobre los mecanismos
de defensa del organismo y la actividad
antitumoral, tal y como se reporta para
otros inmunoduladores. 10,11
Nuestro trabajo tuvo como objetivo
conocer el efecto que produce sobre la actividad antitumoral del coralán, el tratamiento con una enzima proteolítica, con
respecto al coralán sin tratar, al evaluar el
aumento de la resistencia al crecimiento
del tumor ascítico de Ehrlich en ratones
IBF1 y al usar un esquema de tratamiento
similar al utilizado por JL Bello y otros.5
MÉTODOS
El coralán utilizado para este estudio
fue obtenido en nuestro laboratorio a partir del coral Pseudoterogorgia americana,
se siguió el método propuesto por Ovodova
y otros en 1981 (certificado de autor
SU 1098551) seguido de filtraciones en filtros bacteriológicos de 0,45 µm y 0,2 µm.
DETERMINACIÓN DE LOS CONTENIDOS
DE CARBOHIDRATOS Y PROTEÍNAS
El contenido de carbohidratos y proteínas se determinó por los métodos de
Dubois12 y Lowry13, respectivamente.
FRACCIONAMIENTO CROMATOGRÁFICO
DEL CORALÁN EN UNA MATRIZ
DE INTERCAMBIO IÓNICO
A una muestra que contenía 12 mg de
coralán disuelta en tampón Tris-HC1 0,01
M pH 6,0 a una concentración de 2 mg/L,
se aplicó en una columna, con una matriz
DEAE-Sephacel, de volumen de 2 mL. Se
utilizó como tampón inicial Tris-HC1
0,01 M pH 6,0. Las sustancias retenidas
en la matriz se despegaron utilizando un
gradiente salino desde 0,01M hasta 3M de
NaCl. La velocidad de flujo utilizada fue
de 5 mL/h y se colectaron fracciones con
un volumen de 0,5 mL.
Se obtuvo el perfil cromatográfico de
proteínas al medir la intensidad óptica en
cada fracción cromatográfica (280 nm) y
se realizó la determinación del contenido
de carbohidratos en cada fracción por el
31
método de Dubois midiendo la densidad
óptica a la longitud de onda 495 nm.
TRATAMIENTO DEL CORALÁN
CON UNA ENZIMA PROTEOLÍTICA (PRONASA)
El tratamiento con pronasa se realizó
disolviendo 250 mg de coralán en 50 mL
de tampón Tris-HC1 50 mM, CaCL 2
10 mM pH 7,9 y se añaden 50 mg de
la enzima. El tiempo de incubación fue
de 48 horas a una temperatura de 37°C.
Después se hirvió la mezcla durante 5 minutos y se separó por diálisis contra agua
destilada. El producto dializado se llevó a
sequedad por liofilización.
COMPARACIÓN DEL FRACCIONAMIENTO
CROMATOGRÁFICO DEL CORALÁN TRATADO
CON PRONASA Y SIN TRATAR
Dos muestras que contenían 60 mg de
coralán tratado y sin tratar se disolvieron
en el tampón inicial hasta una concentración de 1 mg/mL. Se aplicaron en una
columna de matriz de DEAE-Sephacel de
volumen de 75 mL. El tampón inicial fue
Tris-HC1 0,01M pH 6,0 y se despegaron,
las sustancias retenidas en la matriz, con
un gradiente salino, utilizado desde 0,01M
hasta 3M de NaCl. La velocidad de flujo
fue 10 mL/h y se colectó un volumen de 5 mL
por cada fracción.
Se obtuvo el perfil cromatográfico de
proteínas midiendo la densidad óptica
(250 nm) en cada una de las fracciones
colectadas.
EVALUACIÓN BIOLÓGICA
Dos grupos de ratones IBDF1 (IOR/
Hav x C57BL/6Ha) fueron tratados con
coralán tratado con pronasa y sin tratar, en
32
dosis de 20 mg/kg, durante 5 días. Transcurridas 48 horas después de finalizado el
tratamiento, se realizó el trasplante del tumor ascítico de Ehrlich, a razón de 2 x 106
células por animal. El grupo control consistió en ratones trasplantados con el tumor tratados con solución salina fisiológica.
Los animales se observaron diariamente y a los 30 días de inoculado el tumor, y se
determinó el porcentaje de animales positivos, aquellos donde el tumor prendió y el
porcentaje de animales negativos, donde no
hubo prendimiento del tumor de Ehrlich.
RESULTADOS
El coralán obtenido presentó un 15 %
de proteínas y un 55 % de carbohidratos,
determinados por los métodos de Lowry y
Dubois, respectivamente.
Al fraccionar el coralán en la matriz
de DEAE-Sephacel y obtener los perfiles
cromatográficos de proteínas y carbohidratos se observa (fig. 1), que el coralán
está compuesto principalmente por carbohidratos y proteínas que eluyen con el tampón de aplicación, aunque también están
presentes carbohidratos que eluyen a diferente molaridad de NaCl, al aplicar el
gradiente salino. Este resultado confirma
la presencia de polisacáridos cargados en
la molécula de este biopolímero, dado por
la presencia de grupos sulfatos y ácidos
urónicos.3
El tratamiento del coralán con la enzima proteolítica, produce una disminución en
el máximo correspondiente al perfil de proteínas (D.O. 280 nm) con respecto al del
coralán sin tratar (fig. 2). Este resultado
coincide con la determinación del contenido
de proteínas por el método de Lowry donde
se observa una disminución, de 0,15 mg/mL,
en el coralán sin tratar, a un 0,12 mg/mL para
el tratado con la enzima, lo que representa una reducción del 20 %.
D . O.
N aCl(M)
C arboh idratos (4 95nm )
Pro teínas (28 0nm )
3,0
3,00
2,5
2,0
2,00
1,5
1,0
1,00
0,5
Fig.1. Perfil cromatográfico del
Coralán obtenido de una columna de matriz de DEAE-Sephacel.
0,0
0
5
10
15
20
D . O. ( 28 0m )
0,00
25
30
N o. de fra cciones
N aCl ( M )
1,4
3,00
1,2
1,0
0,8
2,00
0,6
1,00
0,4
C on pro nasa
0,2
Fig.2. Perfil cromatográfico del
Coralán antes y después del tratamiento con pronasa obtenido de una
matriz de DEAE-Sephacel.
0,0
0
5
10
15
20
Sin pro nasa
0,00
25
30
N o. de fra ccio nes
33
En los ensayos de evaluación de la
actividad antitumoral (tabla) se observa que
en el grupo de animales que recibieron el
coralán tratado con pronasa, disminuye el
porcentaje de los que rechazan el tumor
(50 %), con respecto a los que recibieron
el coralán nativo (sin tratamiento con la
enzima) donde el porcentaje de los animales en que rechazó el tumor fue 87,5 %.
Tabla. Efecto sobre el prendimiento del tumor ascítico de Erhlich
en ratones IBF1 después del tratamiento con Carolán natural y
Coralán tratado con pronasa
Grupo Producto
1
2
3
Dosis
(mg/kg)
Tratado con
20
pronasa
No tratado
20
Control
NaCL 15 mM
Positivos
(%)
Negativos
(%)
50
50
12,5
90
87,5
10
DISCUSIÓN
De los resultados obtenidos, podemos señalar que en las condiciones en
que se realizó el tratamiento con pronasa
se produce la pérdida del contenido de
proteínas presentes en la molécula de
coralán (20 %), esto puede ser atribuido
a la complejidad estructural de la molécula lo cual no permite una total interacción
con la enzima.
Aunque aparentemente pequeña la
cantidad de proteína afectada por el
tratamiento con pronasa, el daño es suficiente para disminuir la actividad
antitumoral del coralán lo que permite inferir que la parte protéica de esta
molécula tiene un papel importante
para que manifieste su actividad biológica.
SUMMARY
The biopolymers obtained from natural sources have occupied an important place among the immunostimulants
of oncological interest, particularly, the polysaccharides extracted from sea plants and other marine organisms
that may be considered as possible new antitumor drugs. At the Institute of Oncology and Radiobiology, research
has been carried out for many years in order to characterize the antitumor activity of Coralán, a biopolymer
obtained from a soft coral from the Caribbean Sea. In the present paper it is shown that the treatment using the
molecule of Coralán with a protolytic enzime produces a reduction in the content of proteins that leads to the
decrease of its antitumor activity.
Subject headings: CARCINOMA, EHRLICH TUMOR; PEPTIDE HYDROLASES/pharmacology; CNIDARIA/
drug effects; ANTINEOPLASTIC AGENTS.
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Recibido: 15 de octubre de 1998. Aprobado: 6 de noviembre de 1998.
Dra. Rita M. Pérez Gil. Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología. Calle 29 esquina a E, El Vedado,
Ciudad de La Habana, Cuba.
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