EVALUACION DE BACTERINAS

INFORME AFINAL DE PROYECTO
PROYECTO No.: 375/05
INFORMACIÓN GENERAL
Título:
EVALUACION
DE
BACTERINAS
PARA
LA
PREVENCION
DE
LEPTOSPIROSIS EN BOVINOS EN EL ESTADO DE GUANAJUATO
Responsable (s): MVZ MC, VICTOR MANUEL BANDA RUIZ
Institución (es): Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Microbiología Animal
/ Campo Experimental Bajío INIFAP
Periodo que cubre el informe: Junio 2006 Julio 2007
Cantidad autorizada:
Cantidad ejercida:
Avance período 95%
Avance global del proyecto 60 %
Objetivos y Metas Propuestas
. Elaborar bacterina de leptospira empleando células completas de la bacteria
. Elaborar Bacterina de leptospira utilizando células fraccionadas
. Evaluar la respuesta de las diferentes bacterinas en condiciones controladas utilizando
el modelo conejo
Analizar los resultados del experimento con métodos biológicos y estadísticos
1
Extrapolar los resultados obtenidos con el mejor tratamiento a becerros de diferentes
hatos en Guanajuato
. Analizar resultados con métodos biológicos y estadísticos
Aplicar la bacterina en población abierta y evaluar resultados
Actividades Desarrolladas
En esta fase del proyecto se consiguieron 60 becerras con edades entre 3 y 9 meses de
nacidas cuadro 1, pertenecientes a 10 productores (tabla 1), todos ellos localizados en
los municipios de Celaya y Juventino Rosas. Para este período se aplicaron tres
tratamientos, estos fueron bacterina experimental con células completas (Tx1);
bacterina experimental con células fraccionadas (Tx2) y un lote control elaborado con
medio de cultivo de leptospira sin bacterias. Es esta etapa del experimento no se utilizó
la bacterina comercial porque cuando se probó en conejos, esta no fue capaz de
desarrollar una respuesta inmune adecuada. (Ver detalles en informe anual 2005-2006).
Las bacterinas se elaboraron con un concentración de 1X10 9 células de leptospiras por
mililitro. Se aplicó a las becerras 2 ml vía intramuscular con un esquema de vacunación
a los 0, 30, 90, y 180 días. Del mismo modo se tomaron muestras de sangre para
obtener suero cada 15 días hasta el día 270 posteriores a la primera vacunación. Todos
los sueros fueron analizados por la prueba de aglutinación microscópica para observar
en cada animal la capacidad de inmunidad provocada por la bacterina.
Tabla 1 No. De productores cooperante para la evaluación de las bacterinas
Productor
Dirección
No. De animales
López
Productores 15 de Mayo. J
10
Rosas
Leopoldo Ariza
Ex hacienda Franco
9
Francisco Abortes Guerrero
Granja Guadalupe
6
J. Rosas
Francisco Arreguín León
Celaya
6
Francisco Arreguín Ramírez
Celaya
4
Javier Arreguín León
Celaya
2
Samuel Arreguín León
Celaya
7
Miguel Arreguín León
Celaya
6
Leopoldo Contreras
Celaya
10
2
La prueba de aglutinación microscópica se realizó utilizando una batería de antígenos
(Tabla 2) vivos y frescos, para los cuales se realizaron resiembras cada 15 días o
menos en caso de agotarse.
Tabla 2. Cepas de leptospira usadas en la prueba de aglutinación microscópica y en la
elaboración de bacterinas
Serovariedad
Cepa
de
referencia
Serogrupo
Genogrupo
icterohaemorrhagiae*
RGA
Icterohaemorrhagiae Interrogans
hebdomadis*
Hebdomadis
Hendomadis
Interrogans
bratislava
Jez-Bratislava
Australis
Interrogans
pyrogenes
Salinem
Pyrogenes
Interrogans
grippotyphosa*
Moskva V
Grippotyphosa
Kirshneri
canicola*
Hond Utrecht IV Canicola
Interrogans
pomona*
Pomona
Pomona
Interrogans
panama
CZ 214 K
Panama
Noguchii
Wolffi*
3705
Sejroe
Interrogans
hardjo*
Hardjoprajitno
Sejroe
Interrogans
Hardjo
H89
Sejroe
Interrogans
icterohaemorrhagiae
Palo Alto
Icterohaemorrhagiae Interrogans
portaln vere
Sinaloa
Canicola
Interrogans
tarassovi*
Perepelitsin
Tarassovi
Borgpeterseni
Los sueros fueron diluidos inicialmente 1:20 para observar la mínima, reacción antígeno
anticuerpo hasta alcanzar un título final para lo cual se realizaron diluciones dobles de
los sueros.
Objetivos y Metas Alcanzadas
Se tomaron 1140 muestras de sangre las cuales se analizaron por aglutinación
microscópica, los títulos de anticuerpos, se vieron incrementados en las becerras con
los tratamientos Tx2 y Tx3 mientras que los controles se observaron incrementos
probablemente debido a infecciones durante este período. Es importante mencionar que
a pesar que la bacterina solo contenía a la serovariedad hardjo, se encontraron
3
anticuerpos contra serovariedades de otros serogrupos lo cual indica que este biológico
es capaz de producir una respuesta inmune contra leptospiras de diferente serogrupo
sin la necesidad que esté presente en la bacterina.
Los resultados que se obtuvieron por grupo son los siguientes
Día 270
Día 255
Día 240
Día 225
Día 210
Día 195
Día 180 vacuna
Día 165
Día 150
Día 135
Día 120
Día 105
Día 90 vacuna
Día 75
Día 60
Día 45
Día 30 vacuna
Día 15
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
Día 0 vacuna
Promedio de
Anticuerpos
Cuadro 1. Promedio de anticuerpos por muestreo
en becerras del grupo 1
Dias
El cuadro 1 muestra las curvas de anticuerpos detectados a partir del día 0 al 270 para
los tres tratamientos. Línea azul (Tx1 placebo); La línea verde (Tx2 bacterina con
células completas de leptospira) y línea amarilla (Tx3 bacterina con células
fraccionadas). En los animales de los tratamientos 1 y 2 se observan incrementos de
anticuerpos los días posteriores a cada vacunación mientras que en el grupo control no
se observa un incremento considerable a excepción del día 195 en donde se observó
un aumento en la repuesta inmune probablemente debido a alguna infección de campo.
Como se mencionó anteriormente las bacterinas experimentales empleadas en este
estudio no solo fue capaz de promover una respuesta in une contra la propia
serovariedad sino también contra otras de diferente serogrupo. En los cuadros
siguientes se podrá observar la actividad inmune por cada serovariedad utilizada en la
prueba de aglutinación microscópica. En el cuadro 2 se puede demostrar que la
serovariedad icterohaemorrhagiae presentó cierta actividad, al día 90 pi en los tres
tratamientos, aunque cabe mencionar que el Tx1 la reacción fue muy leve, y no
4
significativo mientras que en el Tx2 y Tx3 el incremento en el título de anticuerpos fue
considerable.
Cuadro 2. Anticuerpos a la serovareidad
icterohaemorrhagiae
2.00
Tx1
1.50
Tx2
1.00
Tx3
Día 270
Día 240
Día 210
Día 180
Día 150
Día 120
Día 90
Día 30
0.00
Día 60
0.50
Día 0
Porcentaje de
anticuerpos
2.50
Días
El cuadro tres refleja la inducción de anticuerpos a la serovariedad bratislava, esta
pertenece a un serogrupo diferente a al de la bacterina, al igual que en la cepa anterior
el aumento se evidencio solo hasta le día 195 pi en los tres tratamientos, perdurando en
los tratamientos Tx2 y Tx3, mientras que en el Tx1 a partir del día 225 disminuyó su
actividad. Incrementos anteriores son fueron significativos en oos tres tratamientos.
Tx1
Tx2
Día 270
Día 255
Día 240
Día 225
Día 210
Día 195
Día 180 vacuna
Día 165
Día 150
Día 135
Día 120
Día 105
Día 90 vacuna
Día 75
Día 60
Día 45
Día 30 vacuna
Tx3
Día 15
2.5
2
1.5
1
0.5
0
Día 0 vacuna
Porcentaje
Cuadro 3. Anticuerpos a la serovareidad bratislava
Días
5
La serovariedad pyrogenes fue una de las serovariedades que menos reaccionaron, a
la bacterina, pero también se debe hacer mención, ya que tanto el Tx2 y Tx3 tuvieron
incrementos durante el estudio (cuadro 4).
Tx1
Tx2
Día 270
Día 255
Día 240
Día 225
Día 210
Día 195
Día 180 vacuna
Día 165
Día 150
Día 135
Día 120
Día 105
Día 90 vacuna
Día 75
Día 60
Día 45
Día 30 vacuna
Tx3
Día 15
2.5
2
1.5
1
0.5
0
Día 0 vacuna
Porcentaje
Cuadro 4. Anticuerpos a la serovariedad pyrogenes
Días
El cuadro 5 muestra los anticuerpos detectados para la serovariedad canicola la cual se
comporto durante todo el experimento de forma muy similar, los tres tratamientos
tuvieron títulos muy similares existiendo una leve diferencia a partir del día 210 en
donde el Tx2 y Tx3 mostraron un título mayor que Tx1.
Tx1
Tx2
Día 270
Día 255
Día 240
Día 225
Día 210
Día 195
Día 180 vacuna
Día 165
Día 150
Día 135
Día 120
Día 105
Día 90 vacuna
Día 75
Día 60
Día 45
Día 30 vacuna
Tx3
Día 15
2.5
2
1.5
1
0.5
0
Día 0 vacuna
Porcentaje
Cuadro 5. Anticuerpos a la serovareidad canicola
Días
Las serovariedades wolffi, hardjo y H89 (cepa de aislamiento Nacional) todas ellas
pertenecen al serogrupo Sejroe. Los anticuerpos detectados en los becerros vacunados
6
hacia la serovariedad wolffi se mostraron muy superiores en los tratamientos 2 y 3,
mientras que el Tx1 no se determino anticuerpos o solo fueron en mínima expresión
(cuadro 6).
Cuadro 6. Anticuerpos a la serovareidad wolffi
porcentaje
2.5
2
Tx1
1.5
Tx2
1
Tx3
0.5
Días
Día 270
Día 240
Día 210
Día 180 vacuna
Día 150
Día 120
Día 90 vacuna
Día 60
Día 30 vacuna
Día 0 vacuna
0
El cuadro 7 muestra los anticuerpos detectados en becerras de los tres tratamientos a
la serovariedad hardjo, en este se muestra que al igual que en el otro los tratamientos 2
y 3 mostraron una actividad muy similar reaccionando e incrementando los títulos de
anticuerpos en los días posteriores a la vacunación.
Cuadro 7. anticuerpos a la serovareiadad hardjo
2
Tx1
1.5
Tx2
1
Tx3
0.5
Día 270
Día 240
Día 210
Día 180 vacuna
Día 150
Día 120
Día 90 vacuna
Día 60
Día 30 vacuna
0
Día 0 vacuna
Porcentaje
2.5
Días
7
Del mismo modo los anticuerpos determinados a la cepa H89 (aislamiento nacional), se
comportaron de la misma forma como se demuestra en los cuadros 6 y 7, siendo
ligeramente superiores a las serovariedades wolffi y hardjo, (cuadro 8)
2.5
2
1.5
1
0.5
0
Tx1
Tx2
Día 270
Día 255
Día 240
Día 225
Día 210
Día 195
Día 180 vacuna
Día 165
Día 150
Día 135
Día 120
Día 105
Día 90 vacuna
Día 75
Día 60
Día 45
Día 30 vacuna
Día 15
Tx3
Día 0 vacuna
Porcentaje
Cuadro 8. Anticuerpos a la serovareidad H89 (hardjo
aislamiento Nacional)
Días
Con excepción de la serovariedad icterohaemorrhagiae, en todos los casos los
anticuerpos a partir del día 180 en que se aplicó la bacterina los anticuerpos tubieron una
mayor duración lo que puede suponer que la inmunidad de hato es adecuada, por lo tanto
este esquema resulta propicio para hatos en donde nunca se habían tomado medidas
preventivas contra la leptospirosis.
Estos resultados solo demuestran la actividad inmunogénica de la bacterina en estos
animales, a pesar de ser adecuada, y puede ser aplicada como preventivo en los hatos
lecheros del estado de Guanajuato, también se evaluó la actividad reproductiva de las
becerras. Esta fue en base al manejo de cada explotación. En este manejo se encontró que
entre los mismos productores hay diferencias, ya que tiene diferentes parámetros para
iniciar la vida reproductiva de los animales, esto esta basado principalmente en la edad y
peso de los animales, en todos los casos la persona encargada de inseminar a los animales
es el dueño, encargado de del hato ó vaquero.
8
El diagnóstico de gestación en la mayoría de las ocasiones si es realizado por un Médico
Veterinario y este es requerido siempre y cuando el animal no repita el estro a los 21 días
posteriores a la inseminación.
En esta parte del experimento se obtuvieron los siguientes datos. El cuadro 8 se presentan
los parámetros reproductivos de las becerras en el grupo control tratados con el placebo
con un total de 19 animales, de los cuales 11 aun no tiene actividad reproductiva, 5 ya se
encuentran inseminadas. De estos animales 2 de ellos han necesitado dos servicios para
estar gestantes. Es importante mencionar que los problemas que presentaron estas
vaquillas fue en una de ellas un quiste folicular y fue tratada con hormonas, mientras que
la otra que requirió un segundo servicio ya que presento un calor sucio posterior a la
inseminación, siendo tratada con antibiótico. Hasta este momento en este grupo la
gestación sigue en curso.
El grupo vacunado con cepas inactivadas de leptospiras completas (Tx2), se cuanta con
18 animales de los cuales 9 de ellos aun no entran en una etapa reproductiva, 8 de ellos ya
se encuentran inseminadas y solo una ha necesitado un segundo servicio. En este grupo la
vaquilla que requirió el segundo servicio no presento algún síntoma de enfermedad,
posiblemente fue debido a la edad del animal al primer servicio ya que fue entre los 13 y
14 meses de edad.
9
Las becerras que recibieron el tratamiento 3, es en donde menos animales gestante hay, ya
que de 19 animales 13 animales no han sido inseminadas, 5 se encuentran gestantes y una
sola de ellas tuvo la necesidad de ser inseminada 2 veces para quedar gestante. Este
animal al igual que la vaquilla del tratamiento 2, fue inseminada por primera vez antes de
los 15 meses de edad. (Cuadro 9)
Cuadro 9. Número de animales y su situación reproductiva por
tratamiento
No. de animales
20
Primer servicio
15
Segundo servicio
10
Sin actividad reproductiva
5
No. De animales
0
Tx1
Tx2
Tx3
Tratamientos
El cuadro 9 presenta los porcentajes de fertilidad de cada grupo, en el grupo 1 se tiene un
26.32% de vaquillas de primer servicio; 10.53% requirieron dos servicios y 63.16
animales aun no presentan actividad reproductiva. El grupo con el Tx2 se cuenta con
42.11% de animales inseminados con un solo servicio, de estos el 5.56% requirió dos
servicios por concepción y el 50% aun no ha sido inseminado. Por último en el grupo del
Tx3 26.33% ya se encuentra inseminada y el 5.26% se aplicaron 2 dosis de semen para
lograr la gestación.
Cuadro 10. Porcentaje de índices reproductivos en las becerras
vacunadas
Porcentaje
80.00
60.00
Primer servicio
40.00
Segundo servicio
Sin actividad reproductiva
20.00
0.00
Tx1
Tx2
Tx3
Tratamientos
10
Objetivos y Metas por Alcanzar
En esta fase se lograron los objetivos esperados ya que demostró que la bacterina
produce anticuerpos en los animales vacunados, que estos animales, al menos en los
que ya están inseminados y con diagnóstico de gestación, se han necesitado menos
dosis por concepción que los animales no vacunados. Por lo que hay una disminución
en los costos de producción.
Otra meta por alcanzar pero que está en proceso es que todos los animales en este
estudio tengan al menos una inseminación y diagnóstico de gestación.
Desglose del Ejercicio Financiero
En el periodo 2006 -2007 se ejercieron $148,505.00 (Ciento cuarenta y ocho mil pesos
quinientos cinco pesos 00/100 M. N.) de los cuales en servicios personales se dispuso
de $60.000.00 los cuales fueron para el pago de un técnico de laboratorio y un técnico
de campo. En materiales y suministros se gastaron $57,785.00 para la compra de
reactivos de laboratorio, material de laboratorio y gasolina. $17,220.00 para el pago de
viáticos, hospedaje, alimentación, y peaje. Así mismo se emplearon $13,500.00 para
gastos indirectos.
Comentarios Generales
Hasta este momento se tienen las siguientes conclusiones:
1. Las bacterinas elaboradas con una sola cepa de leptospira, provoca una respuesta
inmune adecuada contra la misma serovariedad y serovariedades homologas, en
este caso la bacterina fue elaborada con la cepa H89 la cual es una cepa de
aislamiento nacional, altamente antigénica y este trabajo demostró ser también
inmunogénica.
2. Con esta cepa se logró producir una respuesta inmune humoral hacia las
serovariedades wolffi y hardjo, ambas pertenecen al serogrupo Sejroe, por lo cual
esta reacción era esperada.
3. La reacción que se encontró hacia las serovariedades icterohaemorrhagiae,
pyrogenes, canicola y bratislava, pudiera pensar en alguna infección de campo,
pero en todos los casos el aumento de anticuerpos sobre todo en los tratamientos 2
11
y 3 responden a las fechas de refuerzo de la bacterina, por lo que esta puede ser
debida a cierta reacción cruzada.
4. Los títulos de anticuerpos en el tratamiento 1 en la mayoría de los casos, no rebaso,
la dilución 1:20 mientras que la respuesta inmune en los animales vacunados con la
bacterina 1 y 2 alcanzaron títulos de 1:640.
5. Hasta el momento no se cuenta con el 100% de animales inseminados pero en el
grupo control se han presentado más repeticiones de servicio que en los grupos
vacunados. Y los animales que han repetido calor ha sido por la edad de
inseminación, y no por algún proceso patológico como ocurrió en el grupo control.
6. El calendario de vacunación que se propuso ha resultado adecuado en animales en
donde nunca se ha aplicado ningún tratamiento preventivo contra la leptospirosis.
7. Se observó también que el papel nutricional y de manejo es un factor importante
para adquirir una buena inmunidad de hato ya que se han encontrado diferencias
entre los diferentes productores, y entre estos parámetros son muy diferentes, lo
cual si marca ciertas diferencias. (datos no presentados ya que no se tiene el total
de los animales inseminados)
Aspectos generales de las explotaciones lecheras.
Como se mencionó con anterioridad en casi todas las explotaciones los productores son
los encargados de desarrollar todas o casi todas las actividades dentro de la explotación, o
son parte de las actividades familiares, solo en ocasiones con asesorados por un médico
veterinario zootecnista y en casi todas ellas los programas de control no se llevan a cabo y
mucha de las veces por carecer de información adecuada.
12
Algunos productores también han comentado, que se han acercado a ellos laboratorios
comerciales para venderles sobre todo vacunas, las cuales solo tiene el beneficio para los
propios laboratorios, ya que estos mismos aplican la vacuna y no les recomiendan ningún
método ni calendario de vacunación, por lo tanto sin una asesoría técnica.
Solo uno de los productores cuenta con el apoyo de técnicos de GGAVATT del estado de
Guanajuato, es importante mencionar que la mayoría de ellos solo lleva sus registros
reproductivos en una libreta con un control mínimo de sus animales.
Por otro lado en ninguna explotación se cuenta con un programa de vacunación
establecido ya que solo aplican algún biológico cuando tiene problemas , pero dejan de
aplicarlo cuando éstos desaparecen.
Solo en algunas ocasiones, aplican alguna vitamina y en ocasiones desparasitan a los
animales de vez en cuando.
13
La alimentación del ganado es según la oferta que se encuentre en la región, y la época de
cosecha el algunos casos se ofrecía planta de brócoli, zanahoria, casi todos los
productores muelen su alimento como lo es la caña del maíz, y concentrado.
Los corrales en general en época de lluvias estaban anegados de agua y excretas de los
animales propiciando con esto la diseminación de enfermedades entre ellas leptospira, se
observaron en algunos casos problemas de podo dermatitis lo que implica una lesión en
piel con heridas abiertas lo que también favorece la infección del animal.
14
En época de secas los establos no se observó humedad en los corrales. La limpieza en
general es regular ya que el estiércol se queda en los corrales y este se limpia muy
esporádicamente.
15
La presencia de animales de compañía es común en todos los establos, así como también,
la de fauna nociva como lo son los roedores, principalmente en zonas donde hay alimento.
Una práctica de estos animales, cuando una vaca aborta o tiene su parto es comerse las
excretas, y si estas están contaminadas con algún patógeno, esta puede infectar al animal
que consuma estos tejidos.
16