el tinidazol induce roturas de simple cadena en leucocitos de ratón

Anuario Toxicología 2001;1(1):57-64
Centro de Investigaciones Biomédicas. ICBP “Victoria de Girón”
EL TINIDAZOL INDUCE ROTURAS DE SIMPLE CADENA
EN LEUCOCITOS DE RATÓN
Lic. Gisell Rodríguez Ferreiro,1 Lic. Lourdes Cancino Badías,2 Dr. Elio A. Prieto González2
y Dr. Javier Espinosa Aguirre2
RESUMEN: Se estudió la capacidad del tinidazol de inducir roturas de simple cadena y sitios
sensibles al álcali en leucocitos de rratón,
atón, por el ensa
aciones de 1100,
00, 250
ensayyo cometa. In vitr
vitroo concentr
concentraciones
g/mLL incrementan el porcentaje de células dañadas, describiendo una relación dosis
y 500 µ g/m
respuesta. Para observar este efecto no es necesaria la reducción del grupo nitro. A los 30 min
de reparación el daño en los leucocitos se mantiene, mientras que a los 60 min sólo es
reparado el daño producido por la mayor concentración. In vivo se pudo observar que una
dosis de 100 mg/kg de peso es capaz de inducir daño en el ADN de los leucocitos de ratón.
Este efecto es observado 24 y 48 h después del tratamiento con una dosis 3 veces superior a
la dosis terapéutica. El tinidazol al igual que otros nitroimidazoles es capaz de inducir alteraciones cromosómicas.
AZOL; TEST
S DE MUT
AD/métodos; ENS
AY O COMET
A/métodos; REP
ADeCS: TINID
TINIDAZOL;
TESTS
MUTA
GENICIDAD/métodos;
ENSA
COMETA/métodos;
REPA
A GENICID
CION DEL ADN; LEUCOCIT
OS; RA
TONES.
RACION
LEUCOCITOS;
RAT
RA
La infección con bacterias es común en
poblaciones humanas, fundamentalmente en
los países del tercer mundo. Puede causar
desnutrición y a más largo plazo cáncer. De
los agentes antimicrobianos desarrollados y
empleados en el tratamiento de estas afecciones se encuentran los nitroimidazoles.1,2
Entre ellos se destacan el metronidazol, el
ornidazol y el tinidazol, con estructura similar
y equivalentes en su actividad terapéutica y
espectro antimicrobiano.3
El tinidazol (1-[2-(etil sulfonil) etil]-2metil-5 nitroimidazol) se aplica en infeccio-
nes causadas por Trichomona vaginalis,
Entamoeba histolítica y Giardia lamblia4 y
en la profilaxis de infecciones perioperatorias
de cirugías digestivas y ginecológicas.2 también se utiliza en infecciones causadas por
Helicobacter pilori5 Éste antiinfeccioso
después de ser metabolizado,6,7 interacciona
con el ADN de la célula bacteriana y produce
muerte celular.8 Su acción antiparasitaria
radica en su rápida captación por el parásito,
en la luz intestinal y en los tejidos, que
conduce a la lisis de la estructura celular
parasitaria.9
1
Departamento de Biología Molecular y Celular. Centro de Investigaciones Biomédicas. Instituto Superior
de Ciencias Médicas de La Habana.
2
Departamento de Genética y Toxicología Ambiental. Instituto de Investigaciones Biomédicas. Universidad Autónoma de México.
57
En Cuba se utiliza el tinidazol en pacientes de todas las edades y en ocasiones se realiza su uso indiscriminado. Diferentes estudios han demostrado que
este fármaco actúa como un mutágeno
de sustitución de pares de bases 6,7 y a
concentraciones elevadas induce corrimiento del marco de lectura.7 También,
Leal-Garza y cols., en 1984 10 encontraron una inducción de micronúcleos en
eritrocitos de ratones tratados con esta
droga. Sin embargo, no existen muchos
trabajos dirigidos al esclarecimiento de
los mecanismos involucrados en estos
efectos. Se ha investigado fundamentalmente el metronidazol como patrón de los
nitroimidazoles.1,11
El ensayo Cometa consiste en el análisis de células individuales que son lisadas
y se someten a una electroforesis, para así
lograr que los fragmentos de cromosomas
corran hacia el ánodo y se revelen como la
cola de un cometa.12 Esta prueba se utiliza
para la evaluación genotóxica de diferentes
sustancias extrañas al organismo,
monitoreo genético, animales centinelas y
para determinar la capacidad de reparación
del ADN ante el daño provocado por un
xenobiótico.
Es objetivo de este trabajo conocer la
capacidad del tinidazol de inducir rupturas
de simple cadena en leucocitos de ratón,
utilizando el ensayo cometa. Además, se
estudiará la capacidad reparativa de estas
células in vitro y después de un tratamiento con una dosis 3 veces superior a la dosis
terapéutica.
(BDH); ciclofosfamida (Pras-Farma, S.A);
agarosa de punto de fusión normal (APFN),
agarosa de bajo punto de fusión (ABPF),
NaOH, lauril sarcosinato de Na, DMSO,
bromuro de etidio, tripan azul (Sigma); NaCl
(Fluka); liquemine (Roche).
Métodos
Una dosis de 100 mg de tinidazol/kg de
peso se inoculó por vía intraperitoneal, utilizando a cada animal como su propio control. La ciclofosfamida a una dosis de
100 mg/kg de peso fue el control positivo del
experimento. La muestra de sangre se tomó
a las 24 y 48 h después de la inoculación.
Animales
Ratones machos de la línea Balb/c con
un peso corporal de 27 ± 3 g fueron utilizados en ambos experimentos. Se mantuvieron en condiciones controladas: ciclos de
luz y oscuridad (12 x 12 h), agua y comida
ad libitum.
Esquema experimental
IN VITRO
80 µ L de sangre del plexo orbital se ensayan con 3 concentraciones de tinidazol
(100, 250 y 500 µ g/mL). Las muestras se incubaron durante 30 min, a 37 °C y posteriormente se centrifugaron a 15 000 rpm, durante 10 seg. Las células reconstituidas con
80 mL de PBS se utilizaron en el ensayo.
Para medir la reparación, la suspensión
celular fue incubada a 37 °C, durante 30 y
60 min. Se utilizó el peróxido de hidrógeno
(350 mM) como control positivo.
IN VIVO
Reactivos
PBS (libre de Ca2+ y Mg2+), EDTA,
Tris, Tritón X-100, peróxido de hidrógeno
58
Ensayo cometa
Procesamiento estadístico
10 µ L de la suspensión celular y
75 mL de ABPF (0,5 %) se extendieron
en láminas portaobjetos, previamente
preparadas con 150 µ L de APFN (0,5 %).12
Se añadió la tercera capa de ABPF (75 µ L)
y las láminas fueron sumergidas durante 1 h a 4 °C, en solución de lisis
(2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM tris,
lauril sarcosinato de Na al 1 %, pH 10;
tritón X 100 al 1 %, DMSO al 10 %). El
desenrollamiento se realizó a 4 °C, durante 20 min (300 mM de NaOH, 1 mM
EDTA, pH 12,6) y se corrió la electroforesis a 25 V y 250 mA, durante 30 min.
Se realizaron 3 lavados con amortiguador de neutralización (0,4 M Tris, pH
7,5) y los núcleos se tiñeron con
bromuro de etidio (20 ug/mL). Se utilizó un microscopio de fluorescencia
(zeiss) con objetivo 40 x /0,65 seco,
filtro de excitación 515-560 nm y filtro
barrera 590 nm. Se analizaron 200 células por tratamiento y se expresó el
daño al ADN como los porcentajes de
células dañadas y en cada nivel de
daño. Se consideraron células no dañadas aquellas que no tenían cola y
para los niveles de daño se consideraron 5 categorías arbitrarias: nivel 0, no
migración del material genómico; nivel 1, migración corta; nivel 2, migración media; nivel 3, migración larga y
como nivel 4, al núcleo no definido.
Ambos parámetros se expresaron como
el número de células con colas entre el
total de células analizadas multiplicado por 100. La viabilidad celular se
midió utilizando la técnica de exclusión
con tripan azul, considerando como un
efecto citotóxico marcado cuando se
afecta la viabilidad celular por encima
de un 10 %.
Los grupos fueron comparados entre
sí por la prueba t de Student, para un 95 y
un 99 % de significación, utilizando el
paquete estadístico MICROSTAT.
Resultados y discusión
Ensayo Cometa in vitro
Los nitrocompuestos junto a los hidrocarburos policíclicos aromáticos y aminas aromáticas son reconocidos como importantes
carcinógenos del medio ambiente y las alteraciones estructurales del ADN se relacionan
con los eventos de iniciación del cáncer.13
El tinidazol indujo la formación de roturas de cadenas a las concentraciones ensayadas, se encontró un aumento significativo del daño relacionado con la dosis, que
se observa con el incremento del porcentaje
de células dañadas (fig. 1.) Akintowa y cols.
en 1988,14 reportaron que la concentración
de 500 mg/mL es tóxica, sin embargo estos
resultados no están relacionados con efectos citotóxicos del compuesto, como se demostró en el ensayo con tripan azul.
Porcentaje células dañadas
120
90
60
30
0
0
100
250
Tinidazol (ug/ml)
500
30 min
FIG. 1. Efecto genotóxico del tinidazol en
leucocitos a los 30 min de exposición (media
de 2 experimentos, p < 0,05).
59
Al igual que para el metronidazol,3 la
formación de un metabolito hidroxilado por
la acción de nitrorreductasas de bacterias y
mamíferos, potencia la actividad mutagénica
de la molécula parental.6,7 Sin embargo, el
tinidazol a altas concentraciones induce
sustituciones de pares de bases en ausencia de activación metabólica, en el ensayo
de Ames.7 Estos resultados demuestran que
este fármaco no necesita de activación
metabólica para generar rupturas de simple
cadena en leucocitos de ratón, porque aunque en los linfocitos se expresan algunas
enzimas que participan en el metabolismo
de xenobióticos, ellos sólo representan del
20 al 30 % de la población total. Igualmente
el metronidazol y el dimetridazol, 2 medicamentos que pertenecen a la misma familia y
con estructura similar al tinidazol, inducen
roturas de simple cadena, en linfocitos humanos en ausencia de la fracción S9, en condiciones aerobias.1 La toxicidad obtenida
en estas condiciones parece estar relacionada con la reducción de un electrón de la
molécula parental y la producción de un
radical nitro, que en presencia de oxígeno
es reoxidado y genera especies reactivas,1
como ya fue demostrado para el 1-metil-2-nitroimidazol.15
El porcentaje de células en cada nivel
de daño es un método semicuantitativo indicativo de la cantidad de ADN migrado y
por consiguiente de la extensión del daño.
Este es el parámetro más descriptivo, sólo
superado por los procedimientos basados
en el procesamiento digital de la imagen,12
100 y 250 µ g/mL de tinidazol muestran un
incremento significativo del porcentaje de
células con migración media, con respecto
al control (fig. 2). La mayor concentración
indujo un aumento significativo de células
con migración corta, los que se corresponden con una disminución significativa de células sin migración del ADN para todas las
concentraciones estudiadas, confirmando los
resultados obtenidos para el porcentaje de
células dañadas. En las concentraciones
no se observó un incremento significativo
del porcentaje de células con migración larga y migración completa, lo que representa un
mayor daño al ADN. Sin embargo, en el
ensayo alcalino la cola del cometa es creada por lazos relajados del ADN, el número
de lazos en la cola indica el número de roturas, con el incremento del daño la intensidad de la cola se incrementa, por lo que
existen agentes con alta actividad
genotóxica que producen colas cortas y
densas.12 La longitud de la cola está directamente relacionada con el tamaño de los
fragmentos y se pudiera suponer que es
proporcional a la extensión del daño en el
ADN, pero no representa exactamente el
número de rupturas en el ADN, sino depende del desenrollamiento de la hebra.16
Reparación
Se puede definir la reparación como un
conjunto de respuestas celulares asociadas
con la restauración del ADN. Daños en
algunos genes que participan en la repa-
Porcentaje de células
90
60
30
0
0
Control
1
2
3
Niveles de daño
T 100
T 250
4
T 500
FIG. 2. Porcentaje de células en cada nivel de
daño a los 30 min de exposición (media de 2
experimentos, p < 0,05).
60
100
Porcentaje de células
80
60
40
20
0
0
1
2
3
Niveles de daño
T 100
T 250
Control
4
T 500
FIG. 3. Ensayo cometa in vitro. Porcentaje reparación ( T: concentraciones de tinidazol
en µg/mL).
80
60
Porcentaje de células
ración han sido asociados a ciertas enfermedades. 17 Durante la reparación
por escisión de bases y nucleótidos se
generan rupturas, que pueden ser también causa de la migración del ADN en el
ensayo cometa.12
Después de 30 min no ha sido reparado el daño generado por el tinidazol, para
las concentraciones del ensayo (fig. 3). Se
observaron incrementos significativos del
porcentaje de células dañadas, este aumento
de la cantidad de células en el nivel 1
(migración corta) se corresponde con una disminución significativa en el nivel 0. A los 60
min, no existen diferencias significativas con
respecto al control para el porcentaje de células no dañadas y en los diferentes niveles
de daño solo para 500 µ g/mL (fig. 4). En las
concentraciones de 100 y 250 µ g/mL la cantidad de células sin cola es men o r
significativamente del control (P =
7,14 . 10-4 y P = 0,034, respectivamente) y se
observó un aumento significativo de células en el nivel 1 (P = 6,44 × 10 4 y P =
0,0456, respectivamente. Sólo a 250 µ g/
mL se encuentran diferencias significativas con respecto al control por un incremento de células en el nivel 2 (P =
0,0468).
Los resultados sugieren la necesidad
de un tiempo mayor para que el daño inducido por este principio activo sea completamente reparado, aunque otros mecanismos median para que a la mayor concentración se haya reparado el daño completamente a los 60 min. Dependiendo de la concentración del xenobiótico y la magnitud
del daño, funcionan uno o más mecanismos de reparación, algunos de los cuales
se expresan constitutivamente, mientras
otros son inducidos.17 Cuando se compromete la vida de la célula, se dispara el mecanismo de reparación SOS y los fragmentos son reparados aunque se pierda
la fidelidad de la secuencia original. El
tinidazol induce diferentes tipos de daños
relacionados con la dosis, 6,7,10 por lo que
la inducción de diferentes mecanismos de
reparación, dependiendo de la concentración, puede explicar estos resultados.
40
20
0
0
1
2
3
4
Niveles de daño
Control
T 100
T 250
T 500
FIG. 4 Ensayo cometa in vitro. Porcentaje de
células en cada nivel de daño a los 60 min de
reparación. (T: concentraciones de tinidazol
en µg7mL).
61
Ensayo cometa in vivo
tras que antes del tratamiento el mayor
porcentaje de células se encontró en la
categoría de no migración. A diferencia
del estudio in vitro, el tinidazol in vivo
indujo la formación de colas largas
(nivel 3). La formación de un metabolito
hidroxilado que potencia la actividad
mutagénica del tinidazol, 6 , 7 puede
también ser la causa de un daño mayor
en los leucocitos de ratones tratados
con el fármaco. A las 48 h después del
tratamiento se observaron diferencias
solamente para los niveles 0 y 1, con
respecto a los datos obtenidos antes
del tratamiento. Se puede pensar que
hay una recuperación del daño, aunque
no completamente.
Una aplicación muy útil que tiene este
ensayo es en el área de la genética
toxicológica para evaluar los efectos
genotóxicos in vitro o in vivo de sustancias
químicas.12 Se observaron incrementos
significativos después del tratamiento
con tinidazol a los diferentes tiempos de
muestreo (tablas 1 y 2). Se observaron
diferencias significativas con respecto al
control para los niveles 0, 1, 2 y 3, 24 h,
después del tratamiento (tabla 1). La mayor cantidad de células se encuentra con
migración corta, media y larga, mien-
TABLA 1. Porcentajes de células no dañadas y dañadas para el tratamiento con tinidazol
(100 mg/kg). Ensayo Cometa in vivo
Muestreo
Animales
no dañadas
0 horas
dañadas
1
2
3
4
5
X ± ES
43 ,37
73,07
61,54
69,31
58,33
62,13 ± 4,3
51,63
26,92
38,46
30,69
41,67
37,88 ± 4,3
24 horas
no dañadas
dañadas
25,03
7,92
22
17,31
38,32
22,12 ± 4,9** 77,88
48 horas
no dañadas
dañadas
74,96
92,07
78
82,69
61,68
± 3,4 ** 39,15
43,53
45,07
44,44
27
35,71
± 3,4 * 60,85
56,46
54,92
55,56
73
64,29
± 3,4 *
p = 0,05*; p = 0,01**
(X ± ES): media ± error estándar de la media.
TABLA 2. Tinidazol (100 mg/kg): porcentaje de células en cada nivel de daño a los diferentes
tiempos de muestreo, ensayo Cometa in vivo
Muestreo
Animales
0 horas
1
2
3
4
5
X ± ES
1
2
3
4
5
X ± ES
1
2
3
4
5
X ± ES
24 horas
48 horas
Nivel 0
Nivel 1
48,37
43,32
73,07
26,92
61,54
15,38
69,31
14,96
58,33
29317
62,13 ± 4,3
25,95 ± 5,2
25,03
51,66
7,92
55,1
22
38
17,31
62,69
38,32
50,36
22,12 ± 4,9** 51,57 ± 4,0**
43,53
44,39
45,07
48,92
44,44
51,85
27
64,33
35,71
51,9
*
39,15 ± 3,5
52,28 ± 2,3**
p = 0,05*; p = 0,01**
(X ± ES): media ± error estándar de la media.
62
Nivel 2
Nivel 3
Nivel 4
7,7
0
0
0
0
0
15,38
0
7,69
9,17
0
7,45
12,50
0
0
8,95 ± 2,6
0
3,03± 1,85
12,45
10,85
0
29,23
7,69
0
22
18
0
19,23
5,77
0
7,48
3,85
0
**
18,08 ± 3,8 9,23 ± 2,5
0
3,45
1,72
6,9
6
0
0
3,7
0
0
8,66
0
0
10,53
0
1,85
6,47 ± 1,4 0,34 ± 0,3 1,75 ± 1,3
En estos resultados se observa que el
tinidazol es capaz de dañar el ADN a nivel
de los cromosomas, a dosis 3 veces mayor
que la dosis terapéutica (2 g x día), aunque
ya a dosis de 50 mg/kg de peso se induce la
formación de micronúcleos en ratones.10 Sin
embargo, no se puede concluir que este
efecto sería similar en humanos, ya que para
el metronidazol un medicamento similar a
éste, existen resultados aún contradictorios. Se ha demostrado que este fármaco
produce anafases anormales en células
CHO, alteraciones cromosómicas en
linfocitos e induce la formación de
micronúcleos.18 También, Re y cols., en
19971, demostraron su capacidad de inducir
rupturas de cadenas in vitro y la inducción
de carcinogénesis en roedores,19 pero Fahrig
y Engelke, en 199811 no encontraron inducción de alteraciones cromosómicas en pacientes tratados con la droga. Estudios de la actividad genotóxica del dimetridazol, revelan
que este compuesto químico produce sustituciones de pares de bases en Salmonella
typhimurium 3 y rupturas de cadenas en
linfocitos humanos,1 pero estos hallazgos
no han sido comprobados in vivo.
que incluyen: reparación por escisión de
bases y nucleótidos, roturas producidas por
el ataque de un compuesto químico o radiaciones, escisión seguida de la unión de
agentes intercalantes, aductos del ADN,
acción de las endonucleasas o topoisomerasas y la acción de hidrolasas.20
El ensayo cometa reveló que el tinidazol
induce roturas de simple cadena en
leucocitos de ratón, in vitro e in vivo, pero
no se ha estudiado cuál de estos mecanismos puede ser el responsable del efecto
clastogénico de esta droga . Otros estudios
deben ser objetivo de investigaciones
futuras, en las que se esclarezcan la contribución del metabolito hidroxilado en esta
actividad, la relevancia de enzimas
antioxidantes, la contribución de las roturas inducidas por los mecanismos de reparación y cómo se comporta este efecto en
células humanas.
Agradecimientos
Al Centro de Inmunología Molecular,
por permitirnos el uso de equipamiento indispensable para realizar el estudio y a la
Lic. Aida Leiva González por sus valiosos
comentarios.
Conclusiones
Las rupturas de simple cadena son el
resultado de diferentes tipos de reacciones
SUMMARY: The capacity of tinidazole to induce single strand breaks and sites sensitive
to alk
ali in mouse leucoc
ytes w
as studied bbyy using the comet assa
ations
alkali
leucocytes
was
assayy. In vitr
vitroo concentr
concentrations
of 100, 250 and 500 mg/m
mg/mLL increase the percentage of damaged cells, describing a doseresponse rrelationship.
elationship. TToo observ
eduction of the nitr
oobservee this effect, it is not necessary the rreduction
nitrogr
oup. 30 minutes after the rrepair
epair
oc
ytes is still pr
esent, wher
eas at 60
group.
epair,, the damage of the leuk
leukoc
ocytes
present,
whereas
min, only the damage produced by the highest concentration is repaired. It was possible to
observe in vivo that a dose of 100 mg/kg of weight may induce damage in the DNA of the
mouse leucocytes. This effect is observed 24 and 48 h after the treatment with a dose three
times that of the therapeutic dose. Tinidazole as other nitroimidazoles is able to induce
chromosomal alterations.
AGENICITY TEST
S/methods; COMET ASS
AY/methods; DNA
Subject headings: TINID
TINIDAZOLE;
MUTA
TESTS/methods;
ASSA
AZOLE; MUT
AIR; LEUK
OC
YTES; MICE.
REPAIR;
LEUKOC
OCYTES;
REP
63
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Recibido: 29 de mayo del 2001. Aprobado: 30 de
junio del 2001.
Lic. Gisell Rodríguez Ferreiro. Centro de Investigaciones Biomédicas ISCM-H. Ave. 146 esquina a
31, Playa, Ciudad de La Habana, Cuba.
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