MP Bacteriología y Micología - Facultad de Medicina Veterinaria y

Manual de Prácticas de Laboratorio
Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia
Subdirección Académica
Área de Docencia de Salud Pública
MANUAL DE PRÁCTICAS DE
LABORATORIO DE
BACTERIOLOGÍA Y MICOLOGÍA
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CONTENIDO
Página
I. INTRODUCCIÓN
3
II. BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO
4
III. PRÁCTICAS
1. Procedimientos de rutina para identificar bacterias y hongos
7
2. Métodos de inoculación y siembra de bacterias en medios de cultivo
13
3. Toma, conservación y envió de muestras para análisis bacteriológico y micológico
21
4. Aislamiento e identificación de enterobacterias
26
5. Aislamiento e identificación de bacterias no entéricas (bacterias que afectan el tracto respiratorio:
Pasteurella, Mannheimia, Bordetella)
30
6. Aislamiento e identificación de bacterias Gram positivas (cocos piógenos)
33
7. Aislamiento e identificación de agentes micóticos
37
8. Determinación de la susceptibilidad in vitro a los antimicrobianos
42
9. Procesamiento de muestras enviadas al laboratorio de bacteriología y micología
47
IV. BIBLIOGRAFÍA
51
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I.
INTRODUCCIÓN
La microbiología tiene numerosas áreas o ramas con fundamentos técnicos comunes, pero cada
rama tiene sus características particulares, dado que hay diversos tipos de microorganismos
hallados en diferentes hábitats. Una de estas divisiones es la bacteriología y micología médica que
estudia aquellas bacterias, levaduras y hongos que afectan la salud del hombre y de los animales,
especialmente por su capacidad patógena. De tal manera que la bacteriología y micología son
ramas de la microbiología que estudian a las bacterias, levaduras y hongos.
La importancia de los microorganismos en la vida de los humanos y animales, así como la relación
con el medio ambiente no fue reconoció inmediatamente, pero en 1893 Theobald Smith dijo: “En el
estudio de las formas microscópicas conocidas como bacterias, tenemos lo que puede llamarse
justamente el punto focal de varias ramas de la ciencia biológica”. El desarrollo de la bacteriología
y micología médica en los años subsecuentes ha probado esta veracidad. Lo que ha permitido la
interacción de las bacterias y hongos en la historia natural de la enfermedad, puesto que el
concepto de enfermedad infecciosa, su prevención y tratamiento se mantienen actualizados hasta
la fecha.
El desarrollo de la microbiología se ha debido a la curiosidad científica y al interés de
investigadores y científicos, auxiliados muchas veces por su firmeza en sostener lo que sabían que
era cierto, en contra de las refutaciones aparentes y el desdeño de sus compañeros. La historia de
la bacteriología y micología médica, es la evolución del conocimiento de las causas del proceso
salud-enfermedad.
Este manual de prácticas de bacteriología y micología, abarca aquellas especies bacterianas y
micóticas de importancia en salud animal, para lo cual se considera sus características
morfológicas, fisiológicas y patogénicas. Se realiza una descripción básica de los agentes
patógenos que afectan tanto al hombre como a los animales. La íntima relación existente entre el
hombre y los animales y el consumo de productos de origen animal exigen que toda la gente
involucrada en la microbiología médica veterinaria se familiarice con los agentes infecciosos de los
animales si desean comprender las enfermedades que producen.
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II.
BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO
La mayoría de los accidentes que ocurren en un laboratorio de prácticas, son ocasionados
principalmente por dos razones: la falta de conocimiento acerca de los procedimientos que se
realiza en el laboratorio y la negligencia para seguir las reglas de seguridad. Es transcendental
tener en cuenta que las normas de seguridad, no son la única base en que los laboratorios
efectúan las actividades de docencia, extensión, diagnóstico e investigación, pero es muy
importante que esas medidas sean aplicadas al ingresar al laboratorio de prácticas.
Al realizar cualquier procedimiento en un laboratorio, involucra el exponerse a diferentes agentes
bacterianos o micoticos infecciosos de manera directa al momento de manipular la muestra o
material contaminado, para disminuir este riesgo se debe aplicar la bioseguridad.
La bioseguridad involucra en lograr actitudes y conductas que disminuyan el riesgo del usuario en
el laboratorio, de tal manera que salvaguarde su salud o integridad. El conocimiento previo de
normas y la aplicación adecuada de buenas prácticas de trabajo en el laboratorio es un deber de
cada discente. Estas normas son la base de un buen control de calidad del trabajo que se esté
llevando en la realización de cada práctica para cubrir los objetivos planteados.
Recomendaciones generales para aplicar las buenas prácticas en el laboratorio:
1. Ingresar al laboratorio con bata blanca limpia.
2. Antes de realizar cualquier procedimiento retirarse anillos, pulseras, o cualquier otro accesorio
que pueda entrar en contacto con las muestras o medios que se utilizan en el laboratorio;
colocar sus pertenencias en un lugar apropiado retirado del sitio de trabajo.
3. Evitar pipetear con la boca.
4. Manejo de cualquier muestra con equipo de protección personal (bata, guantes, mascarilla,
careta facial y goggles).
5. Restringir el uso a alumnos sin previa capacitación de agujas, jeringas, y otros objetos
punzocortantes a fin de evitar el riesgo de inoculación.
6. Limpiar y desinfectar con alcohol al 70 % o benzal al 5 % las superficies de trabajo antes, y
después de realizar cualquier procedimiento. Se sugiere realizar una segunda desinfección con
hipoclorito de sodio al 0.5 %
7. Lavado de manos antes y después de cada sesión de trabajo con jabón y agua, esto incluye
también el colocarse los guantes.
8. Manejo, tratamiento y disposición adecuada de los Residuos Peligrosos Biológicos Infecciosos
(RPBI), con base a la Norma Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Protección
ambiental- Salud ambiental- Residuos Peligrosos Biológicos Infecciosos- Clasificación y
especificaciones de manejo.
9. Todos los químicos deberán manejarse con equipo de protección y dentro de una campana de
extracción.
10. En caso de un derrame de muestras biológicas deberá agregarse hipoclorito de sodio al 1.0 %
y dejar actuar por 30 min y posteriormente limpiar.
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Normas disciplinarias:
1. Leer el reglamento interno del laboratorio de prácticas
2. No se permitirá el ingreso al laboratorio, después de 15 minutos del horario estipulado de
inicio de la práctica.
3. El acceso al laboratorio es exclusivamente con bata blanca y limpia, por lo que no se permitirá
la permanencia en la sesión práctica de los discentes que no porten su bata.
4. Se prohíbe fumar, comer, beber o realizar cualquier otra actividad que no esté relacionada con
la práctica correspondiente.
5. Se prohíbe el uso de celulares y otros medios electrónicos de comunicación durante la
realización de las prácticas y uso de los laboratorios.
6. Ningún discente podrá salir o entrar sin previa autorización del docente.
7. Las comunicaciones verbales serán de manera ordenada, en voz baja y solo con la mesa que
integra el equipo.
8. Evitar lo más posible el estar circulando entre mesas del laboratorio durante la sesión práctica
9. En caso de accidentes (quemadura, salpicadura y heridas) avisar inmediatamente al docente
encargado de la práctica.
10. Colocar los desechos en el contenedor correspondiente.
11. No verter sustancias en la superficie de la mesa, suelo o tarjas.
Manejo adecuado de residuos peligrosos biológico infecciosos:
Sangre y material orgánico: Coágulos, aplicadores de madera e hisopos, se sumergirán en una
solución de hipoclorito de sodio al 1.0%, posteriormente serán colocados en bolsas de plástico
rojas (sangre) y amarillas (desechos patológicos) para su eliminación e incineración.
Materia fecal: Al término de la práctica se colocará en una solución de hipoclorito de sodio al
1.0%, posteriormente serán colocados en bolsas de plástico amarillas (desechos patológicos) para
su eliminación e incineración.
Material de vidrio: tubos, portaobjetos, cubreobjetos, varillas de vidrio, cajas de Petri, matraces y
frascos de diferentes capacidades, serán depositados en contenedores con agua jabonosa
adicionada con hipoclorito al 1.0%, en esta solución permanecerán por tres horas antes de su
lavado y secado.
Nota: Material como papel, aplicadores de madera, algodón y similares que hayan estado en
contacto con material infeccioso, deberán ser rociados con hipoclorito al 1.0 %, y posteriormente
colocarlos en bolsas de plástico amarillas (desechos patológicos) para ser incinerados.
Desinfectantes
Es importante conocer las diferentes soluciones desinfectantes, como el cloro, que se utiliza para
mantener limpio y desinfectado el laboratorio, materiales, equipos, así como su preparación en las
concentraciones que se necesiten.
Al inicio y al final de cada práctica el discente debe lavarse las manos y colocarse alcohol al 70 %
o benzal al 5 %.
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Las superficies de trabajo deben ser limpiadas y suministrar con un paño una solución de
hipoclorito de sodio al 0.5 % esperar 3 minutos e iniciar a trabajar.
ADVERTENCIA: No usar fenol, debido a que es una solución cáustica, no se recomienda su
empleo sobre la piel, por su efecto irritativo y acumulativo en la piel.
Preparación de soluciones:
Solución de alcohol al 70 %
Alcohol al 96°…………………………………………………….. 73 mL
Agua bidestilada o desionizada………………………………… 27 mL
Hipoclorito de sodio al 0.5 % (áreas sin presencia de material orgánico)
Hipoclorito de sodio (5.0 % presentación comercial)…………………...…… 100 mL
Agua bidestilada o desionizada……………....………………………………… 900 mL
Hipoclorito de sodio al 1.0 % (áreas con presencia de material orgánico)
Hipoclorito de sodio (5.0 % presentación comercial)...……………………… 200 mL
Agua bidestilada o desionizada……………....………………………………… 800 mL
Cuestionario.
1. ¿Qué es la bioseguridad?
2. ¿Cuál es el objetivo de la bioseguridad?
3. ¿Cuáles son los tipos de riesgos que existen en un laboratorio?
4. ¿En que se basa la clasificación de los agentes biológicos?
5. ¿Menciona cuales son las vías de entrada de los agentes biológicos al cuerpo?
6. ¿Métodos para disminuir los riesgos biológicos?
7. ¿Menciona 5 recomendaciones para buenas prácticas de trabajo?
8. ¿Menciona 5 normas disciplinarias de un laboratorio?
9. ¿Qué desinfectantes se pueden usar en la piel?
10. ¿Qué causa el fenol en el organismo?
Glosario de términos:
Accidente: suceso eventual o acción de que involuntariamente resulta daño para las personas o
las cosas.
Desinfectante: sustancia que destruye los microorganismos presentes, a excepción de las
esporas bacterianas
Precaución: acción para evitar o prevenir los inconvenientes, dificultades o daños que pueden
temerse durante el procedimiento.
Investigación: actividad que tiene por fin ampliar el conocimiento, sin perseguir, en principio,
ninguna aplicación práctica.
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III.
PRÁCTICAS
1. Procedimientos de rutina para identificar bacterias y hongos
Unidad de Competencia 1: Conocer e identificar la morfología bacteriana y fungal, así como sus
principios metabólicos, genéticos y taxonómicos.
Introducción:
En el diagnóstico microbiológico, la visualización del agente patógeno o su efecto en el material
biológico remitido al laboratorio de diagnóstico constituye el primer paso hacia su identificación.
Esto puede realizarse mediante el examen directo de una preparación húmeda o bien de un frotis
fijo teñido con colorantes específicos.
La observación de microorganismos vivos con o sin motilidad utilizando preparaciones húmedas es
fácil de realizar y requieren de un mínimo de material.
En una preparación húmeda se pueden observar diferentes tipos de movimiento, como son:
 El movimiento browiniano de partículas pequeñas debido al bombardeo por moléculas del
medio líquido.

El movimiento de microcorrientes debido frecuentemente al calor generado por el foco
microscópico.

Movimiento flagelar o real de las bacterias cuyas características pueden variar en los diversos
microorganismos.
Para los estudios bacteriológicos y micológicos además se han ensayado y propuesto gran
variedad de métodos de tinción, los que apoyan en proporcionar contraste entre el microorganismo
y el medio que la rodea, permitiendo llevar a cabo la diferenciación entre los distintos tipos
morfológicos; además permite el estudio de estructuras u organelos propios de la célula bacteriana
y micótica. Dentro de las tinciones importantes para bacterias y hongos son las siguientes:
Tinción de Gram:
En 1884 un médico Danés, Christian Gram, desarrolló un método de tinción de gran utilidad en el
laboratorio de bacteriología. Está tinción revela detalles referentes a la forma y agrupación
bacteriana y permite clasificar a las bacterias en dos grandes grupos: Gram positivas y Gram
negativas.
Durante el proceso de tinción, tanto las bacterias Gram positivas como las Gram negativas
retienen el colorante primario. Sin embargo al aplicar el agente decolorante, la pared de las
bacterias Gram positivas sufre una deshidratación que impide la salida de colorante. En el caso de
las bacterias Gram negativas, el agente decolorante destruye la integridad de la membrana
externa, incrementando así su permeabilidad, lo cual permite la salida del colorante primario.
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Al aplicar el colorante de contraste, este no puede penetrar fácilmente en las bacterias Gram
positivas debido a la deshidratación de su pared; además de que estas bacterias quedaron
previamente teñidas con el colorante primario. Por el contrario, las bacterias Gram negativas se
tiñen fácilmente con el colorante de contraste. El resultado final es que las bacterias Gram
positivas se tiñen de violeta o azul y las Gram negativas de rojo.
La tinción de Gram es aplicada en forma universal como primer paso en la identificación de las
bacterias. Desafortunadamente existen algunos grupos bacterianos en los cuales la tinción de
Gram no es de utilidad taxonómica; como son: espiroquetas, micoplasmas, micobacterias,
clamidias y rickettsias.
Tinción para Bacterias Acido-Alcohol Resistentes:
Este método de tinción la penetración del colorante primario se facilita debido a que éste se
encuentra disuelto en fenol y a que es aplicado en presencia de calor. El método para demostrar la
ácido-alcohol resistencia es la tinción de Ziehl-Neelsen.
Una vez que el colorante penetra a la célula bacteriana, este se combina con las mismas
estructuras con las que se combina en cualquier otra bacteria y además reacciona con ácidos
micólicos libres, lo cual hace que la pared celular se vuelva aún más hidrofóbica.
Con la tinción de Ziehl-Neelsen tanto las bacterias ácido-alcohol resistentes, como las bacterias no
ácido-alcohol resistente se tiñen con el colorante primario. Sin embargo, al aplicar el agente
decolorante, compuesto por una mezcla de alcohol-ácido, este no solubiliza los lípidos de la pared
de las bacterias ácido-alcohol resistentes, y por lo tanto no se decoloran. Las bacterias no ácidoalcohol resistentes se decoloran fácilmente, por lo que se vuelve a teñir al aplicar el colorante de
contraste.
El grupo de bacterias ácido-alcohol resistentes, está representado principalmente por el género
Mycobacterium.
Tinción para Endoesporas:
La endoespora bacteriana es una estructura altamente deshidratada y rígida, que es formada por
algunos bacilos Gram positivos. Los géneros bacterianos de interés en medicina veterinaria que
son capaces de formar endoesporas son Bacillus y Clostridium. Estos responden de manera
diferente a las condiciones ambientales que inducen la formación de la espora.
Las endoesporas son estructuras ovales o esféricas que pueden encontrarse tanto
intracelularmente, como fuera de la bacteria (célula vegetativa). Por su localización dentro de la
célula pueden ser centrales, subterminales o terminales, y presentan además variación en su
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tamaño. Estas características son de utilidad taxonómica para la identificación de algunas especies
de los géneros capaces de esporular.
Se preparan 2 frotis fijos a partir del cultivo, uno de los frotis será teñido con la tinción de Gram y el
otro con la tinción de Schaeffer y Fulton.
En la tinción de Gram las esporas se observan como cuerpos refringentes sin teñir, mientras que
con la tinción de Schaeffer y Fulton las esporas se observan de color verde y las formas
vegetativas rojas.
Tinción Lactofenol Azul de Algodón:
Este es un método utilizado rutinariamente para la realización de preparaciones microscópicas de
hongos filamentosos con el fin de determinar sus estructuras morfológicas y por lo consiguiente su
identificación. Cada uno de los constituyentes del colorante lactofenol azul de algodón cumple una
función determinada.
El fenol sirve como fungicida, la glicerina permite tener una preparación semipermanente, el azul
de algodón tiñe el exterior de la pared de los hongos y el ácido-alcohol láctico actúa como agente
aclarante.
Objetivo: El discente realizará las tinciones de rutina en el laboratorio de Bacteriología y Micología
para la identificación de estructuras bacterianas y micóticas, y comprender su utilidad.
Competencias:
1. Describir la diferencia entre una preparación húmeda y un frotis fijo, así como su utilidad
diagnóstica.
2. Aplicar los principios y procedimientos de las tinciones para la observación de bacterias y
hongos.
3. Emplear la tinción de Gram y lactofenol azul de algodón, para observar la morfología, tamaño,
agrupación y afinidad tintorial de bacterias y hongos.
Lugar de Realización:
Laboratorio de prácticas de la FMVZ-UAEM.
Tiempo Destinado a la Práctica:
2 Horas
Material de laboratorio:
Portaobjetos, cubreobjetos, lápiz graso, asas bacteriológicas graduadas, papel secante, aceite de
inmersión, mechero, tren de tinción de Gram, tinción de lactofenol azul de algodón, solución
desinfectante, KOH al 3%, Microscopio óptico binocular de campo claro (con objetivos de 4X, 10X,
40X, 100X), vaselina o plastilina
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Material biológico:
 Cultivo en agar de Escherichia coli
 Cultivo en agar de Staphylococcus spp.
 Cultivo en agar de una levadura
 Cultivo en agar de Aspergillus spp.
Metodología:
Preparaciones Húmedas:
1. Depositar una capa delgada de vaselina alrededor del borde del cubreobjetos o un pedazo
pequeño de plastilina en las 4 esquinas del cubreobjetos, SIN TOCAR las caras del cubreobjetos
con los dedos.
2. En el centro del cubreobjetos preparado con vaselina ó plastilina, coloque con el asa
microbiológica varias gotas del cultivo bacteriano (un cubreobjetos por muestra)
3. Tome una laminilla y colóquela sobre el cubreobjetos, presionando suavemente.
4. Invierta la preparación y obsérvala al microscopio con los objetivos de 40X y 100X si se utilizó
vaselina, o con el de 10X en el caso de haberse utilizado plastilina.
Preparación de Frotis Fijos para Tinciones:
a) Realizar un frotis fijo de cada uno de los cultivos proporcionados.
b) Utilizar laminillas limpias y marcadas para su identificación, con el lápiz graso marcar el área
donde se va a colocar la muestra.
c) La metodología para realizar el frotis bacteriano dependerá si el cultivo se encuentra en medio
sólido o líquido.
a) Cultivo en líquido: con un asa bacteriológica previamente flameada y fría, se introduce
en el cultivo bacteriano se coloca en el portaobjetos y se difunde en el área marcada y se
fija al calor.
b) Cultivo en medio sólido: se coloca una gota de agua destilada estéril en el
portaobjetos, se recolecta una colonia de medio solido y se mezcla, realizando un
extendido uniforme.
d) Se debe extender la gota sobre el portaobjetos de forma que el resultado sea una capa fina.
Debe evitarse preparar un frotis demasiado grueso.
e) Dejar secar las preparaciones (frotis) a temperatura ambiente.
f) Cuando se haya secado el frotis pasar el portaobjetos por la llama del mechero con la capa del
frotis hacia arriba, no aplicar calor en forma excesiva ya que estropearía la morfología normal y
la estructura de los microorganismos que se van a teñir.
Procedimiento para la tinción de Gram:
1. Preparar frotis fijos a partir de cada uno de los cultivos bacterianos
2. Agregar sobre la preparación cristal violeta durante 30 segundos.
3. Lavar con agua destilada
4. Añadir lugol durante 30 segundos.
5. Lavar con agua destilada
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6.
7.
8.
9.
Decolorar con alcohol-cetona por 5 a 10 segundos.
Lavar con agua destilada
Agregar safranina durante 30 segundos.
Lavar, secar y observar al microscopio con aceite de inmersión y con el objetivo de 100X
Procedimiento para la prueba de KOH al 3 %:
El objetivo de realizar la prueba de KOH al 3% es para ratificar los resultados de la tinción de
Gram. Esta prueba consiste en colocar sobre una laminilla una gota de KOH al 3 %, después con
el asa calibrada se recolecta muestra de las colonias bacterianas en estudio, se mezcla con la gota
de KOH, con movimientos giratorios durante 1 a 3 minutos.
Interpretación: Si al separar el asa de la mezcla se forma una hebra viscosa, la prueba es positiva
e indica que se trata de bacterias Gram negativas. Si al separar el asa no se forma hebra, la
prueba es negativa, e indica que las bacterias son Gram positivas
Procedimiento de Tinción de Lactofenol Azul de Algodón:
Este procedimiento se usa para identificar las formas fungales
1. Sobre un portaobjetos limpio se coloca una gota de lactofenol azul de algodón.
2. Con el asa en forma de “L” recolectar una pequeña cantidad de la colonia y se deposita sobre
la gota del colorante.
3. Se coloca un cubreobjetos sobre la preparación, la cual puede ser ligeramente calentada (esto
ayuda a extender el hongo en toda la preparación y a remover las burbujas)
4. La preparación se observa al microscopio con los objetivos 5X, 10X y 40 X.
Resultados:
El discente realizara dibujos o fotografías de las formas bacterianas y fúngicas, así como una
investigación bibliográfica para conocer de acuerdo a la morfología colonial macroscópica y
microscópica de las bacterias, así como las estructuras celulares de los hongos para identificarlos,
y realizar un reporte escrito de la práctica.
Evaluación:
El docente establecerá los criterios de evaluación para otorgar una calificación durante la práctica
y del reporte de prácticas, con la finalidad de medir el grado de adquisición de conocimientos,
habilidades, aptitudes/valores de las unidades de competencia que se relacionen con la práctica.
Cuestionario:
1. ¿De qué color se tiñen las bacterias Gram positivas y por qué?
2. ¿De qué color se tiñen las bacterias Gram negativas y por qué?
3. ¿Qué es un frotis?
4. ¿Con que finalidad se fija la muestra de microorganismos en el porta objetos?
5. ¿Cuál es la razón de teñir las muestras bacterianas?
6. ¿Por qué es necesario emplear aceite de inmersión para la observación de los
microorganismos?
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7. ¿Qué función tiene el yodo en la tinción de Gram?
8. Menciona tres bacterias que tiñen Gram positivas y escribe la enfermedad que causa cada una
de ellas
9. Menciona tres bacterias que tiñen Gram negativas y escribe la enfermedad que causa cada
una de ellas.
10. ¿Para qué sirve la tinción de Ziehl-Neelsen?
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2. Métodos de inoculación y siembra de bacterias en medios de cultivo
UNIDAD DE COMPETENCIA 1: Conocer e identificar la morfología bacteriana y fungal, así como
sus principios metabólicos, genéticos y taxonómicos.
Introducción:
Para realizar el estudio de las bacterias es necesario recuperarlas del hábitat natural donde se
encuentran y hacer que proliferen en medios artificiales, que les proporcionen sus requerimientos
nutricionales. Este procedimiento se le conoce como cultivo bacteriano in vitro.
Las bacterias para su metabolismo necesitan donadores y aceptores de hidrógeno, fuentes de
carbono, fuentes de nitrógeno y minerales. Además del uso de un medio nutritivo adecuado para el
cultivo bacteriano, es necesario considerar factores ambientales tales como la temperatura, pH,
humedad relativa y atmósfera de incubación.
Los métodos de siembra de bacterias en medios de cultivo están directamente relacionados con la
consistencia de los mismos. Estos pueden ser líquidos (pruebas bioquímicas y medios de
enriquecimiento), semisólidos (pruebas de motilidad de cepas), sólidos (pruebas bioquímicas,
conservación de cepas, pruebas de susceptibilidad a quimio-terapéuticos o realizar aislamientos
en cultivo puro).
Medios Sólidos para Conservación de Cepas: el medio es envasado en tubos y se permite su
solidificación de manera inclinada de tal manera que se logre una superficie (Fig. 1). El uso de
tubos con tapón de baquelita disminuye la deshidratación del medio.
Fig. 1. Medio de cultivo envasado
en tubo y salificado de manera
inclinada para realizar la siembra
del cultivo bacteriano a conservar.
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Medios Sólidos para Pruebas de Susceptibilidad a Quimioterapéuticos: el medio es envasado
en cajas de Petrí y la inoculación se hace por medio de estrías continuas en toda la superficie por
medio del asa o por medio de un hisopo (Fig. 2).
a
b
Fig. 2. (a). Medio de cultivo solido en caja Petrí, la superficie debe ser lisa y el nivel de llenado
debe estar parejo, (b). Inoculación de la cepa bacteriana para realizar la prueba de
sensibilidad.
Medios Sólidos para el Aislamiento en Cultivo Puro: el medio para cultivo bacteriano se envasa
en cajas de Petrí, con el objetivo es obtener un crecimiento uniforme de colonias bacterianas, es
decir, “colonias puras”, libres de otros gérmenes contaminantes, con el fin de estudiar e identificar
la especie bacteriana. La inoculación se realiza con el asa graduada (Fig. 3).
a
b
Fig. 3. (a) Distribución del medio de cultivo en cuadrantes envasado en caja Petrí para el
aislamiento bacteriológico (b) modo de sembrado con el asa bacteriológica y el sentido de la
dilución.
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El estudio de la morfología de las colonias es de gran importancia debido a que gracias a ésta
puede iniciarse una identificación preliminar de los microorganismos aislados. Las colonias
bacterianas presentan características morfológicas muy variadas, mismas que son constantes para
cada especie de bacterias en idénticas condiciones de cultivo. Estas características pueden
modificarse cuando factores tales como la humedad relativa, medio de cultivo, temperatura,
atmósfera de incubación varían.
La descripción de las colonias bacterianas debe realizarse cuando éstas se encuentran separadas
unas de otras en el medio de cultivo, tomando en cuenta las siguientes características: tamaño,
color, superficie, borde, opacidad, elevación, estructura interna.
Las características de la superficie, borde, opacidad, elevación y estructura interna, están sujetas a
la interpretación del observador. Para describirlas es necesario el uso de un microscopio
estereoscópico, por lo que su valor descriptivo es menos relevante (ver Anexo 3). De acuerdo a
estos criterios, las colonias pueden clasificarse de la siguiente forma:
 Superficie: lisas, rugosas.
 Estructura interna: mucoide, granular, filamentosa.
 Opacidad: translúcidas, opacas, brillantes.
 Borde: enteras, onduladas, lobuladas, erizadas, filamentosas.
 Elevación: umbilicales, difusas, planas, convexas.
Otro dato útil en la identificación preliminar de colonias bacterianas es la producción de
hemolisinas. Estas se ponen de manifiesto en medios de cultivo adicionados con sangre, tales
como el agar sangre y el caldo sangre. En el agar sangre la producción de hemolisinas conduce a
la formación de un halo de lisis de eritrocitos alrededor de las colonias. Si dicho halo es
transparente se interpreta como hemólisis completa (hemolisis ) mientras que si el halo es de
color gris verdoso se trata entonces de hemólisis incompleta (hemolisis ).
Al hacer la identificación de las colonias bacterianas aisladas no siempre será necesario detallar
todas las características morfológicas mencionadas; generalmente se toman en cuenta aquellas
que son relevantes.
Objetivo: El alumno analizará las diferentes técnicas de siembra para el cultivo de bacterias y
hongos in vitro, utilizando medio de cultivo según su utilidad y describirá la morfología colonial.
Competencias:
1. Describir la importancia del cultivo de bacterias y hongos in vitro.
2. Identificar las condiciones necesarias para el cultivo in vitro de las bacterias y hongos.
3. Clasificar los medios de cultivo básico, de enriquecimiento, diferenciales, selectivos y de
transporte.
4. Realizar las técnicas de siembra en medios de cultivo líquidos semisólidos y sólidos.
5. Explicar las reacciones metabólicas de bacterias y hongos en algunos medios diferenciales.
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6. Analizar la utilidad diagnóstica de la morfología colonial bacteriana y fungal, y categorizar con
base en las siguientes características: tamaño, color de la colonia, pigmentación de medio,
estructura interna, borde y hemólisis.
Lugar de Realización:
Laboratorio de prácticas de la FMVZ-UAEM, bajo el apoyo del Departamento de Prácticas de la
Facultad
Tiempo Destinado a la Práctica:
4 Horas (dos sesiones)
Material:
General: Asas bacteriológicas graduadas, asas bacteriológicas rectas, papel secante, solución
desinfectante, marcador permanente, mechero, estufa bacteriológica a 37 ºC (temperatura
constante).
Sección:
 1 cultivo en agar de Escherichia coli
 1 cultivo en agar de Staphylococcus spp.
 1 cultivo en agar de una levadura
 1 cultivo en agar de Aspergillus spp.
 Medio Agar sangre
 Medio MacConkey
 Medio Verde Brillante
 Medio Agar Sal y manitol
 Medio Agar Sabouraud
 Medio TSI
 Medio SIM
 Caldo Rojo de Fenol
 Caldo nutritivo
Metodología:
Proceso de Inoculación y Siembra en Placa:
Primer Día (Sesión Uno)
1. Desinfectar la mesa de trabajo.
2. Seleccionar una colonia del medio que contiene un cultivo puro, sosteniendo la placa a una
distancia no mayor de 20 cm. del mechero.
3. Esterilizar el asa y dejarla enfriar en el agar.
4. Tomar únicamente la colonia seleccionada
5. Descargar el asa en uno de los extremos de la placa (ver Anexo 1).
6. Realizar la siembra con la misma asa.
7. Esterilizar el asa y dejarla enfriar,
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8. Cerrar la caja y rotularla con el número o nombre de muestra, número de equipo y fecha.
9. Incubar placas a 37 ºC por 24 horas.
Segundo Día (Sesión Dos)
1. Desinfectar la mesa de trabajo y encender el mechero.
2. Analizar cuidadosamente el crecimiento en las cajas de Petrí, sin abrirlas.
3. Observar las colonias obtenidas y describirlas teniendo en cuenta las siguientes
características: tamaño, color de la colonia, pigmentación de medio, estructura interna, borde y
hemólisis.
4. Interpretar las formas y características de las colonias (ver Anexo 3).
5. Guarda las cajas en el refrigerador, hasta la próxima clase (OPCIONAL).
Proceso de Inoculación y Siembra en Tubo (Medio Sólido):
Primer Día (Sesión Uno)
1. Destapar el tubo y flamear la parte superior.
2. Esterilizar el asa recta y enfriarla.
3. Tomar una colonia del medio que contiene el cultivo puro con el asa recta estéril.
4. Siembre en los tubos con agar inclinado de acuerdo al método que se utilice de siembra, a una
distancia aproximada de 20 cm. del mechero (ver Fig. 1).
5. Rotular los tubos de la misma manera que las placas.
6. Incubar placas a 37 ºC por 24 horas.
Segundo Día (Sesión Dos)
1. Analizar y observar cuidadosamente el crecimiento en los tubos, sin abrirlos, y anotar lo
interpretado.
2. Guarda las cajas en el refrigerador, hasta la próxima clase.
Proceso de Inoculación en Tubo (Medio Líquido):
Primer Día (Sesión Uno)
1. Seleccionar una colonia del medio a una distancia aproximada de 20 cm. del mechero
2. Esterilizar el asa recta y enfriarla
3. Destapar el tubo y flamear la parte superior.
4. Introducir el asa con el inoculó a sembrar, agitar el asa hasta que la muestra sea homogénea
(ver Anexo 2).
5. Esterilizar el asa y dejarla enfriar
6. Flamear el tubo y taparlo.
7. Rotular los tubos de la misma manera que las placas.
8. Desinfectar la mesa de trabajo
9. Incubar tubos a 37 ºC por 24 horas.
Segundo Día (Sesión Dos)
1. Analizar y observar cuidadosamente el crecimiento en los tubos, sin abrirlos, y anota lo
observado.
2. Guarda los tubos en el refrigerador, hasta la próxima clase (OPCIONAL).
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Resultados:
Con la información obtenida durante la práctica y la posterior investigación que tendrá que realizar
el alumno, entregará un reporte de práctica tal como lo solicite el docente.
Evaluación (Criterios):
Cada docente establecerá los criterios de evaluación para otorgar una calificación durante la
práctica y del reporte de prácticas, con la finalidad de medir el grado de adquisición de
conocimientos, habilidades, aptitudes/valores de las unidades de competencia que se relacionen
con la práctica.
CUESTIONARIO:
1. ¿Por qué se debe trabajar cerca del mechero?
2. ¿Qué es un cultivo puro?
3. ¿Qué estudios se realizan aislando un microorganismo?
4. ¿Qué sucede si se recolecta una colonia bacteriana con el asa caliente?
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Anexos:
Anexo 1. Técnicas de Siembra en Placa y Tubo
(b)
(a)
(c)
(d)
Anexo 1. (a) Inicio de la inoculación y distribución de la muestra con asa bacteriológica, (b) y (c)
distribución de los cuadrantes 2 y 3 se toca una o dos estrías del cuadrante anterior (d) el cuarto
cuadrante se toca una o dos estrías del tercer cuadrante y se hace la distribución con estrías
separadas con la finalidad de obtener colonias aisladas. Terminada la distribución en cada cuadrante
se flamea el asa. Nótese que el procedimiento es en sentido a las manecillas del reloj.
Anexo 2. Técnica de sembrado en tubo
(a)
(b)
(c)
(d)
Anexo 2. (a) Se flamea el asa bacteriológica. (b) Se enfría y se recolecta la muestra. (c) Se introduce
en el tubo con medio líquido y se gira el asa para que se desprenda la muestra. (d) Se cierra el tubo y
se flamea el asa. El proceso se realiza cerca de la flama del mechero.
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Anexo 3. Morfología de las colonias bacterianas
Anexo 3. Características morfología de las colonias bacterianas en cultivos primarios (Stanchi N. O., et
al 2007)
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3. Toma, conservación y envió de muestras para análisis bacteriológico y micólogico
UNIDAD DE COMPETENCIA III: Explicar la importancia del control de las bacterias y hongos en
las diversas áreas de la medicina veterinaria en las que se ven relacionados, así como la
colección, envío y procesamiento de muestras para diagnóstico
Introducción:
La bacteriología y micología diagnóstica es el estudio de las muestras tomadas a partir de
pacientes de los cuales se sospecha de una infección que involucre a estos agentes. El laboratorio
puede apoyar al clínico de la siguiente manera:
 Confirmando el diagnóstico presuntivo.
 Sugiriendo la quimioterapia de la enfermedad.
 Colaborando en el conocimiento epidemiológico de las enfermedades.
 Permitiendo la elaboración de autobacterinas.
Los resultados del examen bacteriológico y micológico, así con la rapidez con que éstos sean
obtenidos, no dependen sólo de los métodos de laboratorio empleados, sino también de la forma
en que sean colectadas y enviadas las muestras clínicas. Dichos resultados pueden verse
influenciados por la presencia de microorganismos que son parte de la microflora normal, por la
migración bacteriana pos-mortem o por la aplicación de antimicrobianos antes del envío de la
muestra. El clínico debe tener en mente estos factores para realizar la interpretación de los
resultados emitidos por el laboratorio.
1. Colección y Envió de Muestras:
A continuación se mencionan algunas normas generales:
 Tomar la muestra del sitio más representativo del problema, de preferencia en la etapa aguda
de la enfermedad.
 Las muestras obtenidas a partir de animales muertos deberán tomarse dentro de las primeras
3 horas de ocurrida la muerte o el sacrificio.
 Las muestras deben colectarse bajo estrictas condiciones de antisepsia. Tanto el material de
colección como el recipiente en el que la muestra sea transportada deberán ser estériles. Este
último preferentemente debe tener un tapón de rosca.
 Las muestras colectadas no deben entrar en contacto con desinfectantes.
 Las muestras deben identificarse con los siguientes datos: especie, raza, edad, sexo, arete o
nombre del animal, así como dirección teléfono y nombre del propietario del animal (etiqueta
de identificación).
 Una vez colectadas las muestras deben enviarse dentro de las siguientes 24 horas al
laboratorio en condiciones de refrigeración.
 Cuando sea necesario el uso de hisopos para la colección de las muestras hay peligro de
desecación, por ello deben enviarse en medios de transporte (Stuart, Carry-Blair, etc.) que
ayudan a la preservación de la bacteria pero no a la multiplicación.
 Debe anexarse una historia clínica pertinente que incluya la hora de la muerte del animal,
número de animales afectados, si el animal del que proviene la muestra fue tratado con
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
antimicrobianos, cuáles y durante cuánto tiempo; así como un diagnóstico presuntivo con base
en signos clínicos y epidemiológicos.
Es importante hacer notar que el manejo de las muestras clínicas deben realizarse con
precaución debido a que algunos agentes involucrados en las enfermedades infecciosas de
animales constituyen un riesgo de zoonosis para la salud del clínico y del bacteriólogo.
Los problemas más frecuentes para la identificación bacteriana y micológica en el laboratorio son:
 Envió de muestras no representativas de la lesión en cuestión.
 Toma de muestras sin antisepsia.
 Envió de muestras en condiciones inadecuadas.
 Falta de historia clínica completa y de un diagnóstico presuntivo.
Por lo anterior, es indispensable que el clínico tenga un conocimiento sobre la correcta obtención y
envío de muestras al laboratorio (ver Anexo 4).
Objetivo: El alumno utilizará los procedimientos generales para la colección, conservación y envío
de muestras clínicas al laboratorio para el diagnóstico bacteriológico y micológico.
Competencias:
 Describir el material necesario para colectar muestras o especímenes sospechosos de
microorganismos aerobios y anaerobios
 Identificar las condiciones ambientales adecuadas para tomar una muestra representativa de
un proceso infeccioso, así como de agua y alimento
 Describir como se conservan y se envían las muestras al laboratorio
 Indicar los datos importantes para realizar una historia clínica pertinente, orientada al
diagnóstico bacteriológico y micológico
 Demostrar a partir de una muestra clínica, los conocimientos de colección y envió de muestras
para laboratorio
Lugar de Realización:
Laboratorio de prácticas de la FMVZ-UAEM, bajo el apoyo del Departamento de Prácticas de la
Facultad, siempre y cuando se decida trabajar con animales de laboratorio.
OPCIONAL: Se puede optar por ir a una explotación animal y a nivel de campo realizar el ejercicio
de toma y envió de muestras
Tiempo Destinado a la Práctica:
2 Horas (una sesión)
Material:
Grupo:
 Una nevera con refrigerantes
 Torundas con alcohol al 70 %
 Torundas con yodo al 2 %
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Por Equipo:
 Material para sujeción del animal
 Medio de transporte Stuart
 Hisopos estériles
 Frascos tipo Gerber estériles
 Bolsa de plástico nuevas
 Estuche de disecciones
Por Discente:
 Equipo de protección personal (dependiendo si se decide realizar en laboratorio o explotación
pecuaria)
Metodología:
 Obtener muestras de exudado, leche, sangre, heces, orina, órgano y pelos de animales que
presenten problemas clínicos, así como de agua y alimento si amerita.
 Recopilar los datos más importantes para realizar la historia clínica
 Conservar y enviar las muestras al laboratorio de diagnóstico para su análisis bacteriológico o
micológico.
Resultados:
Con la información obtenida durante la práctica y la posterior investigación que tendrá que realizar
el alumno, entregara un reporte de práctica tal como lo solicite el docente.
Evaluación (Criterios):
Cada docente establecerá los criterios de evaluación para otorgar una calificación durante la
práctica y del reporte de prácticas, con la finalidad de medir el grado de adquisición de
conocimientos, habilidades, aptitudes/valores de las unidades de competencia que se relacionen
con la práctica.
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Anexos:
Anexo 4. Recomendaciones para la Toma y Envió de Muestras de Acuerdo a Condiciones
Patológicas Específicas.
Condición
Patológica
Tipo de Muestra y Cantidad
Recomendada

Abortos




Feto Completo o Contenido
Abomasal (1 mL)
Pulmón, Bazo, Hígado, Riñón
Fetal (6 cm por lado)
Placenta y Placentomas.
Secreción Vaginal (1 mL)
Leche (15 mL)
Alimento (100 g.)



Exudado Purulento (1 mL)
Absceso Completo
Biopsia
Artritis


Líquido Sinovial (1 mL)
Articulación Completa
Clostridiasis
Invasivas (Miositis
Necróticas,
Hepatitis
Necrótica)
Enterotoxemia


Músculo Necrótico (6 cm. por
lado)
Tejido Subcutáneo Edematoso (6
cm. por lado)
Hígado (6 cm. por lado)

Intestino y Órganos Afectados
Dermatomicosis

Pelos y Escamas
Diarreas



Intestino
Heces (1 g.)
Nodulos Linfaticos Mesentericos,
Vesícula Biliar.
Alimento (100 g.)
Agua (100 mL)

Abscesos,
Granulomás
Exudados
y



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Forma de
Colección y
Envío
Frascos,
Bolsas
de
Plástico,
Hisopos,
Jeringas.
Jeringa,
Hisopo,
Frasco, Bolsa
de Plástico.
Jeringa,
Hisopo, Bolsa
de Plástico.
Frasco, Bolsa
de Plástico
Segmento
Ligado
de
Intestino
en
Frasco.
Frascos,
Sobres
de
Papel Nuevos,
Portaobjetos
Segmento
Ligado
del
Intestino
en
Frasco.
Guantes
de
Palpación.
Frascos,
Bolsas,
Observaciones
El feto y los órganos
pueden
enviarse
en
congelación, cuando se
sospecha de candidiasis
enviar hígado en medio de
transporte
especial.
Alimento en caso de
aflatoxicosis.
En caso de granulomas
sospechosos
de
tuberculosis
deben
extremarse precauciones.
Desinfectarse piel antes de
la artrocentesis.
Enviar
rápidamente
al
laboratorio en atmósfera
anaerobia, en este caso no
es
recomendable
refrigeración.
Enviar en refrigeración.
No es necesario que los
recipientes estén estériles.
Las
muestras
deben
tomarse de la periferia de la
lesión.
En grandes especies tomar
las heces directamente del
recto y en pequeñas
especies con hisopos. En
caso
sospechoso
de
paratuberculosis
enviar
raspado
y
mucosa
intestinal.
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Infecciones
Genitales



Exudados (1 mL)
Lavados Prepuciales o Vaginales
(10 mL)
Órganos: Testículos, Epididimo,
Útero. (Completos o 6 cm. por
lado)
Hisopos.
Hisopos,
Jeringas,
Frascos
Bolsas
Plástico.
Infecciones
Urinarias


Orina (6 mL)
Riñón (6 cm. por lado)
Mastitis


Leche (15 mL)
Glándula Mamaria (6 cm. por
lado)
Neumonías



Lavado Traqueobronquial (5 mL)
Pulmón (6 cm. por lado)
Nódulos Linfaticos Mediastinicos
Jeringas,
Frascos,
Bolsas
Plástico
Otitis Media Aguda
o Crónica

Exudado (1 mL)
Hisopos,
Jeringas
Problemas
Nerviosos

Encéfalo (Completo o 6 cm. por
lado)
Exudados (1 mL)
Líquidos Cefalorraquideo (2 mL)
Septicemias


Bolsas
Plástico,
Frascos,
Jeringa,
Hisopos.
Jeringas,
Frascos,
Bolsas
Plástico




Sangre (10 mL)
Bazo, Hígado, Pulmón, Nodulos
Linfaticos
Riñones, Cerebro (6 cm. por lado)
Médula Ósea (Una Costilla)
25/52
o
de
Cateter,
Jeringa,
Frasco, Bolsa
de Plástico.
Frascos,
Bolsas
de
Plástico
de
de
de
Si
se
sospecha
de
Campylobacter, Leptospira
o
mycoplasma,
las
muestras deben enviarse
dentro de las siguientes 3
horas de su colección en
refrigeración.
Las
muestras
deben
enviarse dentro de las
siguientes 2 horas de su
colección.
Lavar y desinfectar el
pezón previo a la obtención
de la muestra, cuidar de no
tocar la piel con el frasco,
sólo el chorro de leche
tendrá contacto con el
frasco.
Si
se
sospeche
de
micoplasmosis
o
clamidiasis, las muestras
deben enviarse dentro de
las siguientes 4 horas a su
colección.
Limpiar el canal externo
con un antiséptico y tomar
la muestra en el oído
medio.
El liquido cefalorraquídeo
debe ser procesado de
inmediatos
Si el animal tiene más de 3
horas de muerto debe
enviarse médula ósea.
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4. Aislamiento e identificación de enterobacterias
UNIDAD DE COMPETENCIA IV: Identificar los principales agentes bacterianos Gram negativos de
importancia veterinaria.
Introducción:
Dentro de la familia Enterobacteriaceae, muchos géneros de este grupo son habitantes naturales
del tracto gastrointestinal. Antes del advenimiento de los antibióticos, quimioterapéuticos e
inmunodepresores, estos géneros bacterianos estaban limitados a causar enfermedades del tracto
gastrointestinal y urinario. Hoy las enterobacterias (como lo es la E. coli) se pueden aislar en
infecciones septicémicas y en otros órganos diferentes al sistema digestivo y urinario.
Las enterobacterias tienen como vía de salida las heces y contaminan el medio ambiente, donde
pueden permanecer viables por mucho tiempo en condiciones favorables, por lo cual estos
agentes bacterianos son indicadores del grado de contaminación fecal de los alimentos y agua.
Algunos microorganismos intestinales como E. coli son parte de la flora normal, producen
enfermedades de manera accidental; en tanto otros géneros como Salmonella cuentan con
serovares que son patógenos para el hombre (tiphymurium) y en los animales domésticos
(chorelaisuis, dublin, entre otros).
Todas las enterobacterias son bacilos Gram negativos, sin agrupación definida. Ninguna
enterobacteria forma esporas. Son aerobias o anaerobias facultativas. Este grupo es amplio y
frecuentemente de publican cambios en su clasificación taxonómica.
E. coli causa diarrea y enteritis en distintas especies animales, además puede actuar como un
patógeno oportunista de procesos misceláneos como mastitis, onfalitis, infecciones de vías
urinarias y respiratorias. Además existen serotipos enteropatógenos que se asocian a la
producción de diarreas en cerdos, bovinos, caprinos y equinos; y serotipos asociados a septicemia
en bovinos y aves.
Citrobacter freundii es un patógeno oportunista que se asocia a infecciones misceláneas como las
descritas para E. coli. Se puede aislar de mamíferos, aves, reptiles y anfibios.
Salmonella enteritidis causa diarreas, septicemia y aborto en distintas especies animales.
Salmonella cholerasuis causa septicemia y neumonía en cerdos. Salmonella gallinarum causa la
tifoidea aviar.
Proteus mirabilis y Proteus vulgaris son patógenos oportunistas ampliamente distribuidos en la
naturaleza.
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Enterobacter aerogenes se asocia a mastitis bovina, se comporta como patógenos oportunista.
Serratia marcescens causa mastitis en bovinos. Klebsiella pneumoniae actúa como oportunista en
vías respiratorias y en tracto genital principalmente; es causa común de mastitis aguda en bovinos
y metritis, cervicitis y abortos en yeguas.
Objetivo:
El alumno describirá las características de cultivo, morfológicas y bioquímicas más relevantes de
las enterobacterias de mayor importancia en Medicina Veterinaria.
Competencias:
1. Realizar la tinción de Gram en las diferentes cepas de trabajo para conocer su morfología
microscópica, afinidad tintorial y agrupación.
2. Utilizar los medios de cultivo in vitro para el aislamiento de enterobacterias, así como sus
requerimientos atmosféricos.
3. Identificar las principales especies de cada género bacteriano perteneciente a las
enterobacterias.
4. Realizar las pruebas bioquímicas mínimas necesarias para la identificación de las
enterobacterias.
5. Utilizar las tablas de identificación para confirmar el género y la especie de cada
microorganismo.
6. Describir los principales procesos patológicos en los que se presentan las enterobacterias.
Lugar de Realización:
Laboratorio de prácticas de la FMVZ-UAEM, bajo el apoyo del Departamento de Prácticas de la
Facultad
Tiempo Destinado a la Práctica:
4 Horas (dos sesiones)
Material:
GENERAL: Asas bacteriológicas graduadas, asas bacteriológicas rectas, portaobjetos, papel
secante, solución desinfectante, marcador permanente, Mechero, Estufa Bacteriológica a 37 ºC
(temperatura constante). Microscopio óptico binocular de campo claro (con objetivos de 4X, 10X,
40X, 100X), tiras de papel filtro.
Sección:
 1 cultivo en agar de Escherichia coli
 1 cultivo en agar de Salmonella tiphymurium
 1 cultivo en agar de Enterobacter cloacae
 1 cultivo en agar de Citrobacter freundii
 1 cultivo en agar de Proteus vulgaris o Proteus mirabilis
 1 cultivo en agar de Pseudomona aeroginosa
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Por Equipo:
 Agar Sangre
 Agares selectivos diferenciales: MacConkey, Verde Brillante, XLD, Salmonella-Shigella,
Bismuto sulfito.
 Agar de Triple Hierro y Azúcar (TSI)
 Medio SIM
 Citrato de Simmons
 Urea
 Lisina Descarboxilasa
 Agar de Fenilalanina
 Base de rojo de Fenol con Lactosa, glucosa, manitol y maltosa.
 Medio MIO.
 Reactivo de Cloruro ferrico al 10 %.
 Reactivo de Oxidasa
 Reactivo de Indol
 Tren de tinción de Gram
 Reactivo de KOH al 3 %
Metodología:
Primer Día (Sesión Uno)
1. Limpie y desinfecte la mesa de trabajo.
2. Inocule y siembre en cada medio de cultivo asignado, la cepa bacteriana establecida a cada
equipo.
3. Realice la tinción de Gram y compruebe con la prueba de KOH al 3 %
4. Realice la prueba de Oxidasa, utilizando el papel filtro
5. Siembre las pruebas bioquímicas con la cepa bacteriana establecida a cada equipo
6. Incube los medios de cultivo y las pruebas bioquímicas a 37 ºC por 24 horas
7. Limpie y desinfecte la mesa de trabajo.
8. Anote las observaciones obtenidos de las pruebas realizadas.
Segundo Día (Sesión Dos)
1. Limpie y desinfecte la mesa de trabajo.
2. Realice la tinción de Gram, prueba de KOH al 3% y prueba de Oxidasa.
3. Realice la interpretación de las pruebas bioquímicas.
4. Observe la morfología colonial y las reacciones que se observan en cada medio de cultivo.
5. Concluya la identificación del microorganismo con base a los resultados de las pruebas
bioquímicas.
6. Limpie y desinfecte la mesa de trabajo.
Resultados:
Con la información obtenida durante la práctica y la posterior investigación que tendrá que realizar
el alumno, entregara un reporte de práctica tal como lo solicite el docente.
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Área de Docencia de Salud Pública
Evaluación (Criterios):
Cada docente establecerá los criterios de evaluación para otorgar una calificación durante la
práctica y del reporte de prácticas, con la finalidad de medir el grado de adquisición de
conocimientos, habilidades, aptitudes/valores de las unidades de competencia que se relacionen
con la práctica.
CUESTIONARIO:
1. ¿Menciona las principales enterobacterias de importancia en Medicina Veterinaria?
2. ¿Cuáles son las enfermedades que producen y que especies afectan las enterobacterias que
mencionaste anteriormente?
3. ¿Qué medios de cultivo y pruebas complementarias necesitarías para confirmar el género y
especie de las enterobacterias antes mencionadas?
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5. Aislamiento e identificación de bacterias no entéricas
(Bacterias que afectan el tracto respiratorio: Pasteurella, Mannheimia, Bordetella)
UNIDAD DE COMPETENCIA IV: Identificar los principales agentes bacterianos Gram negativos de
importancia veterinaria.
Introducción:
Las pasteurelas son bacterias facultativas, inmóviles y poseen cápsula. No forman esporas. Son
oxidasa positiva. Habitantes normales de las mucosas de las vías respiratorias altas y del tracto
digestivo de animales y hombre. Generalmente se presentan como invasores secundarios
produciendo infecciones del tracto respiratorio, mastitis y ocasionalmente septicémicas.
Pasteurella multocida y Mannheimia haemolytica se asocian al proceso multietiológico denominado
“fiebre de embarque de los bovinos”. Pasteurella multocida se asocia a procesos neumónicos en
bovinos y cerdos. Es uno de los agentes etiológicos de la rinitis atrófica del cerdo (junto con B.
bronchiseptica) y el agente etiológico del cólera aviar.
Mannheimia haemolytica se asocia a procesos neumónicos en ovinos y caprinos, a septicemias en
corderos y a problemas de mastitis en ovinos.
Pasteurella pneumotropica es causa de neumonías y abscesos en cuyos, ratas y hámsters.
Pasteurella gallinarum es parte de la microflora normal de la cavidad nasal de pollos y pavos y se
comporta como oportunista en problemas respiratorios.
Bordetella bronchiseptica son microorganismos aerobios estrictos, pueden presentar motilidad y
generalmente producen cápsulas. No forman esporas. Es una bacteria del epitelio ciliado del tracto
respiratorio de diferentes especies animales. Ocasiona la rinitis atrófica del cerdo en asociación
con P. multocida. También se ha aislado a partir de neumonías en roedores, gatos, equinos y
perros.
Objetivo: El alumno describirá las características de cultivo, morfológicas y bioquímicas más
relevantes de los géneros Pasteurella, Mannheimia y Bordetella de mayor importancia en Medicina
Veterinaria.
Competencias:
 Aplicar la tinción de Gram en las diferentes cepas de trabajo para conocer su morfología
microscópica, afinidad tintorial y agrupación.
 Utilizar los medios de cultivo in vitro para el aislamiento de los géneros Pasteurella,
Mannheimia y Bordetella, así como sus requerimientos atmosféricos.
 Identificar las principales especies de los géneros Pasteurella, Mannhemia y Bordetella.
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 Realizar las pruebas bioquímicas mínimas necesarias para la identificación del género y
especie de las bacterias estudiadas.
 Utilizar las tablas de identificación para confirmar el género y la especie de cada
microorganismo.
 Describir los principales procesos patológicos en los que se presentan los géneros Pasteurella,
Mannheimia y Bordetella.
Lugar de Realización:
Laboratorio de prácticas de la FMVZ-UAEM, bajo el apoyo del Departamento de Prácticas de la
Facultad
Tiempo Destinado a la Práctica:
4 Horas (dos sesiones)
Material:
General: Asas bacteriológicas graduadas, asas bacteriológicas rectas, portaobjetos, papel
secante, solución desinfectante, marcador permanente, Mechero, Estufa Bacteriológica a 37 ºC
(temperatura constante). Microscopio óptico binocular de campo claro (con objetivos de 4X, 10X,
40X, 100X), tiras de papel filtro.
Sección:
 1 cultivo en agar de Pasteurella multocida
 1 cultivo en agar de Mannheimia haemolytica
 1 cultivo en agar de Bordetella Bronchiseptica
Por Equipo:
 Agar sangre
 Agar MacConkey.
 Agar de Triple Hierro y Azúcar (TSI)
 Medio SIM
 Urea
 Base de rojo de Fenol con Lactosa, glucosa, manitol y maltosa.
 Medio MIO.
 Reactivo de Oxidasa
 Reactivo de Indol
 Tren de tinción de Gram
 Reactivo de KOH al 3 %
Metodología:
Primer Día (Sesión Uno)
1. Limpie y desinfecte la mesa de trabajo.
2. Inocule y siembre en cada medio de cultivo asignado, la cepa bacteriana establecida a cada
equipo.
31/52
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4.
5.
6.
7.
8.
9.
Realice la tinción de Gram y compruebe con la prueba de KOH al 3 %
Realice la prueba de Oxidasa, utilizando el papel filtro
Siembre las pruebas bioquímicas con la cepa bacteriana establecida a cada equipo
Incube los medios de cultivo a 37 °C por 24 h en microaerobiosis
Incube las pruebas bioquímicas a 37 ºC por 24 h
Limpie y desinfecte la mesa de trabajo.
Anote las observaciones obtenidos de las pruebas realizadas.
Segundo Día (Sesión Dos)
1. Limpie y desinfecte la mesa de trabajo.
2. Realice la tinción de Gram, prueba de KOH al 3% y prueba de Oxidasa.
3. Realice la interpretación de las pruebas bioquímicas.
4. Observe la morfología colonial y las reacciones que se observan en cada medio de cultivo.
5. Concluya la identificación del microorganismo con base a los resultados de las pruebas
bioquímicas.
6. Limpie y desinfecte la mesa de trabajo.
Resultados:
Con la información obtenida durante la práctica y la posterior investigación que tendrá que realizar
el alumno, entregará un reporte de práctica tal como lo solicite el docente.
Evaluación (Criterios):
Cada docente establecerá los criterios de evaluación para otorgar una calificación durante la
práctica y del reporte de prácticas, con la finalidad de medir el grado de adquisición de
conocimientos, habilidades, aptitudes/valores de las unidades de competencia que se relacionen
con la práctica.
Cuestionario:
1. ¿Menciona las principales diferencias morfológicas de entre las enterobacterias y bacterias
Gram negativas que afectan el tracto respiratorio?
2. ¿Qué medios de cultivo y pruebas complementarias necesitarías para confirmar el género y
especie de los agentes bacterianos antes mencionados?
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6. Aislamiento e identificación de bacterias Gram positivas
(Cocos piógenos)
UNIDAD DE COMPETENCIA V: Identificar los principales agentes bacterianos Gram positivos de
importancia veterinaria.
Introducción:
Los estafilococos son microorganismos facultativos, inmóviles, generalmente no poseen cápsula y
no forman esporas. Algunas cepas producen pigmento cuando se cultivan a 37°C en medios
enriquecidos. Son catalasa positiva. Los estafilococos son microorganismos ubicuos que con
frecuencia pueden ser comensales de la piel y mucosas de los animales. Son organismos
esféricos que se agrupan en racimos, aunque algunas células pueden encontrarse solas, en pares
o en cadenas muy cortas. Son fuertemente Gram positivos.
Staphylococcus aureus produce una gran variedad de infecciones supurativas en heridas,
endometritis, cistitis, piodermas en corderos, perros, gatos y en aves se produce también en
abscesos. Staphylococcus hycus, se asocia a la entidad clínica específica del cerdo conocido
como epidermitis exudativa. Staphylococcus intermedius se asocia
a piodermas, otitis,
conjuntivitis, osteomielitis y rara vez mastitis en perros. Staphylococccus saprophyticus es un
patógeno oportunista.
Los estreptococos son microorganismos facultativos, generalmente inmóviles, algunas especies
poseen cápsula y no forman esporas. Con excepción de algunas especies de los grupos B y D, no
producen pigmento. Son catalasa negativo. Los estreptococos son parásitos de las mucosas de los
animales y el hombre. Dadas las condiciones apropiadas, pueden convertirse en gérmenes
oportunistas, asociándose a una gran variedad de procesos piógenos.
Las colonias de los estreptococos a las 24 h de incubación a 37 °C en aerobiosis son de 1 a 2 mm
de diámetro, circulares convexas, grisáceas o translucidas en forma de gotas de rocío. La mayoría
de las cepas patógenas producen hemólisis  o , lo cual se ve incrementado cuando se cultivan
en atmósfera con 10% de CO2. Son organismos esféricos u ovoides que se agrupan en cadenas
cuando son cultivados en medios líquidos.
Streptococcus zooepidemicus y Str. equisimilis producen cervicitis, metritis, abortos, poliartritis y
mastitis en equinos; también producen procesos piógenos en bovinos y cerdos. Streptococcus
zooepidemicus y Str. equi producen la gurma o papera de los potros. Streptococcus
zooepidemicus, Str. faecalis y Str. faecium se involucran en diferentes procesos patológicos de las
aves. Streptococcus agalactiae, Str. disgalactiae y Str. uberis son importantes agentes etiológicos
de mastitis bovina. Streptococcus canis es agente etiológico de diferentes procesos purulentos en
perros. Streptococcus suis es el agente etiológico de la linfadenitis estreptococcica del cerdo.
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Objetivo: El alumno describirá las características de cultivo, morfológicas y bioquímicas más
relevantes de las especies de Staphylococcus spp y Streptococcus spp de mayor importancia en
Medicina Veterinaria.
Competencias:
 Realizar la tinción de Gram en las diferentes cepas de trabajo para conocer su morfología
microscópica, afinidad tintorial y agrupación.
 Utilizar los medios de cultivo in vitro para el aislamiento de los géneros Staphylococcus spp y
Streptococcus spp, así como sus requerimientos atmosféricos.
 Identificar las principales especies de los géneros Staphylococcus spp y Streptococcus spp.
 Realizar las pruebas bioquímicas mínimas necesarias para la identificación del género y
especie de las bacterias estudiadas.
 Utilizar las tablas de identificación para confirmar el género y la especie de cada
microorganismo.
 Describir los principales procesos patológicos en los que se presentan los géneros
Staphylococcus spp y Streptococcus spp.
Lugar de Realización:
Laboratorio de prácticas de la FMVZ-UAEM, bajo el apoyo del Departamento de Prácticas de la
Facultad
Tiempo Destinado a la Práctica:
4 Horas (dos sesiones)
Material:
General: Asas bacteriológicas graduadas, asas bacteriológicas rectas, portaobjetos, papel
secante, solución desinfectante, marcador permanente, Mechero, Estufa Bacteriológica a 37 ºC
(temperatura constante). Microscopio óptico binocular de campo claro (con objetivos de 4X, 10X,
40X, 100X).
Sección:
 1 cultivo en agar de Staphylococcus aureus
 1 cultivo en agar de Staphylococcus epidermidis
 1 cultivo en agar de Streptococcus agalactiae
 1 cultivo en agar de Streptococcus disgalactiae
 1 cultivo en agar de Steptococcus hemolítico
 1 cultivo en agar de Enterococcus faecalis
Por Equipo:
1. Plasma de Conejo.
2. Agar sangre.
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3. Medio selectivo (Staphylococcus): Agar sal y manitol, Agar staphylococcus 110 ó Agar
Chapman stone.
4. Agar sangre con azida de sodio
5. Agar MacConkey
6. Agua Oxigenada (reactivo de catalasa).
7. Agar de Triple Hierro y Azúcar (TSI)
8. Urea
9. Base de rojo de fenol con lactosa, glucosa, manitol, trehalosa, sorbitol y maltosa.
10. Medio MR-VP.
11. Tren de tinción de Gram
12. Reactivo de KOH al 3 %
Metodología:
Primer Día (Sesión Uno)
1. Limpie y desinfecte la mesa de trabajo.
2. Inocule y siembre en cada medio de cultivo asignado, la cepa bacteriana establecida a cada
equipo.
3. Realice la tinción de Gram y compruebe con la prueba de KOH al 3 %
4. Realice la prueba de catalasa, y efectué la prueba de coagulasa en portaobjetos
5. Siembre las pruebas bioquímicas con la cepa bacteriana establecida a cada equipo
6. Incube los medios de cultivo y pruebas bioquímicas a 37 °C por 24 h
7. Limpie y desinfecte la mesa de trabajo.
8. Anote las observaciones obtenidos de las pruebas realizadas.
Segundo Día (Sesión Dos)
1. Limpie y desinfecte la mesa de trabajo.
2. Realice la tinción de Gram, prueba de KOH al 3% y prueba de catalasa.
3. Realice la interpretación de las pruebas bioquímicas.
4. Observe la morfología colonial y las reacciones que se observan en cada medio de cultivo.
5. Concluya la identificación del microorganismo con base a los resultados de las pruebas
bioquímicas.
6. Limpie y desinfecte la mesa de trabajo.
Resultados:
Con la información obtenida durante la práctica y la posterior investigación que tendrá que realizar
el alumno, entregara un reporte de práctica tal como lo solicite el docente.
Evaluación (Criterios):
Cada docente establecerá los criterios de evaluación para otorgar una calificación durante la
práctica y del reporte de prácticas, con la finalidad de medir el grado de adquisición de
conocimientos, habilidades, aptitudes/valores de las unidades de competencia que se relacionen
con la práctica.
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Cuestionario:
1. ¿Menciona las principales diferencias morfológicas de entre las bacterias Gram positivas y
bacterias Gram negativas?
2. ¿Cuáles son las diferencias entre Staphylococcus y Streptococcus?
3. ¿Qué medios de cultivo y pruebas complementarias necesitarías para confirmar el género y
especie de los agentes bacterianos antes mencionados?
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7. Aislamiento e identificación de agentes micóticos
UNIDAD DE COMPETENCIA VII: Identificar los principales agentes micóticos de importancia
veterinaria.
Introducción:
Los dermatofitos forman un grupo de hongos relacionados taxonómicamente, que muestran
afinidad por tejidos queratinizados tales como piel, pelo, plumas, uñas, y cuernos. Dentro de este
grupo de hongos se incluyen tres géneros: Epidermophyton, Microsporum y Trichophyton, de los
cuales únicamente los dos últimos tienen importancia en Medicina Veterinaria.
La mayoría de los dermatofitos son habitantes del suelo. Algunas especies que se han adaptado al
huésped son parásitos de los animales. Las infecciones por dermatofitos se conocen como
dermatofitosis y se caracterizan por producir lesiones superficiales. En los animales domésticos no
existe diferencia clínica notoria en cuanto a tipo y forma de las lesiones. Estas son generalmente
circulares, con descamación, alopecia y prurito, con o sin formación de costras.
Objetivo: El alumno describirá las características de cultivo y morfológicas más relevantes de las
micosis más importantes del grupo de los dermatofitos de mayor importancia en Medicina
Veterinaria.
Competencias:
 Realizar la tinción de lactofenol azul de Algodón en las diferentes muestras de trabajo para
conocer su morfología microscópica.
 Utilizar los medios de cultivo in vitro para el aislamiento de dermatofitos, así como sus
requerimientos atmosféricos.
 Identificar las principales especies de cada género micótico de importancia Medicina
Veterinaria.
 Utilizar las tablas de identificación para confirmar el género y la especie de cada
microorganismo.
 Describir los principales procesos patológicos en los que se presentan los géneros
pertenecientes al grupo de los dermatofitos.
Lugar de Realización:
Laboratorio de prácticas de la FMVZ-UAEM, bajo el apoyo del Departamento de Prácticas de la
Facultad
Tiempo Destinado a la Práctica:
4 Horas (dos sesiones, separadas por una semana una de otra)
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Material:
General: Asas bacteriológicas graduadas, asas bacteriológicas rectas, portaobjetos, cubreobjetos,
papel secante, solución desinfectante, marcador permanente, Mechero, Estufa Bacteriológica entre
24 y 28 ºC (temperatura constante). Microscopio óptico binocular de campo claro (con objetivos de
4X, 10X, 40X, 100X), Hojas y mangos de Bisturí, pinzas sin dientes de uso clínico.
Por Equipo:
 Agar sangre.
 Medio selectivo: Agar Sabouraud, agar para selección de hongos (agar micobiótico) o agar
tripticasa de soya.
 Agar MacConkey
 Base de rojo de fenol con lactosa, glucosa, manitol, trehalosa, sorbitol y maltosa.
 Tren de tinción lactofenol azul de algodón
Metodología:
Primer Día (Sesión Uno)
Preparación y Acondicionamiento de la Muestra:
La muestra ha utilizar para el aislamiento e identificación micológica debe ser característica, y
debe ser tomada bajo las debidas medidas de bioseguridad exigidas para este género y del
tamaño adecuado, y procesarse inmediatamente.
Procedimiento:
1. Con un hisopo estéril se toma la muestra y se siembra en una caja de agar Sabouraud o agar
micobiótico, agar sangre y agar Mc Conkey, e inocular bajo el procedimiento de aislamiento en
cultivo puro incubando a 30 °C por 24 a 72 h.
2. Sembrado en el microcultivo:
a. Dentro de una caja petrí estéril agregar entre 2 a 4 mL de agua bidestilada estéril.
b. Colocar un soporte y poner un portaobjetos con un cuadro de Agar Sabouraud o
Agar para hongos de aproximadamente 1 cm2.
c. Con el asa tomar la muestra y sembrar por picadura en cada lado del agar,
posteriormente colocar el cubreobjetos, tapar la caja e incubar de 24 a 28 °C de
entre 24 a 120 h aprox.
d. Una vez observado crecimiento se procede a la realización del frotis, previa
inactivación del cultivo.
3. Preparación del frotis.
a. Introduce un algodón impregnado con formol al 10 % en la caja y déjalo actuar
durante 30 minutos con el fin de inactivar al hongo.
b. En un portaobjetos coloca dos gotas separadas de lactofenol azul de algodón. Con
las pinzas toma cada uno de los cubreobjetos y colócalos sobre cada una de las
gotas del colorante.
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c. Obsérvese las preparaciones en el microscopio de campo claro con los objetivos 10
X y 40 X
d. Observa las estructuras fungales y sus características morfológicas.
Segundo Día (Sesión Dos)
Interpretación de Resultados:
La identificación se lleva a cabo mediante la observación de las colonias fungales y la preparación
de frotis húmedos a partir de estas o a partir de microcultivos con el fin de determinar la morfología
microscópica (ver Anexo 5).
1. Identificación en medio de cultivo: las cajas de estos medios deben ser revisadas
periódicamente hasta por 190-200 h a 24 a 28 °C y observar la textura, tamaño y pigmento de la
superficie y base de las colonias desarrolladas. La mayoría de los dermatofitos producen colonias
con micelio de aspecto algodonoso o polvoso.
2. Tinción de Azul de Algódon: los dermatofitos producen dos tipos de aleuriosporas; las
macroaleuriosporas (multicelulares, septadas) y las microaleuriosporas (unicelulares, no septadas)
la morfología característica de dichas estructuras permite la identificación de cada una de las
especies.
Epidermophyton produce abundantes macroaleuriosporas de pared gruesa y lisas, en forma de
raqueta y no produce microaleuriosporas.
Trichophyton produce pocas macroaleuriosporas con forma alargada (forma de “basto”), de pared
lisa y delgada, y produce abundantes microaleuriosporas.
Microsporum produce abundantes macroaleuriosporas en forma de huso, con pared gruesa y
áspera (a menudo descritas como “ornamentadas”) y produce pocas microaleuriosporas. Otras
estructuras microscópicas que ocasionalmente son útiles para la identificación de los dermatofitos
son la presencia de hifas espirales o en forma de “peine” (hifas pectinadas); la presencia de
clamidosporas terminales; de artrosporas.
Resultados:
Con la información obtenida durante la práctica y la posterior investigación que tendrá que realizar
el alumno, entregara un reporte de práctica tal como lo solicite el docente.
Evaluación (Criterios):
Cada docente establecerá los criterios de evaluación para otorgar una calificación durante la
práctica y del reporte de prácticas, con la finalidad de medir el grado de adquisición de
conocimientos, habilidades, aptitudes/valores de las unidades de competencia que se relacionen
con la práctica.
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Cuestionario:
1. ¿Menciona las principales diferencias morfológicas entre las bacterias y los hongos
microscópicos?
2. ¿Qué diferencia hay entre la tinción de Gram y la tinción Lactofenol azul de algodón?
3. ¿Qué medidas de bioseguridad utilizarías para manipular y procesar muestras de
enfermedades micóticas?
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ANEXOS:
Anexo 5: Principales agentes micoticos de importancia en medicina veterinaria (Hungerford, et al.,
1998)
a)
c)
Microsporum canis
Conidiobolus coronatus
e)
g)
b)
d)
Aspergillus flavus
f)
Malassezia pachydermatis
h)
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Microsporum gypseum
Sporothrix schenckii
Blastomyces dermatitidis
Trichophyton mentagrophytes
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8. Determinación de la susceptibilidad in vitro a los antimicrobianos
UNIDAD DE COMPETENCIA VIII: Identificar los mecanismos de acción y resistencia de los
antimicrobianos utilizados en medicina veterinaria
Introducción:
En la actualidad se encuentra una gran cantidad de antibióticos en el mercado, algunos solamente
son específicos para determinadas bacterias, otros únicamente las inhiben y otros actúan solo
sobre las Gram positivas.
Debido al abuso de los antibióticos, las bacterias han adquirido resistencia a ellos, de ahí que
cuando se presenta un paciente en el que no surten efectos los antibióticos, se debe considerar
que el microorganismo que lo está infectando se ha hecho resistente.
En la selección del antibiótico más adecuado para el tratamiento de una infección bacteriana se
deben tomar en cuenta diversos factores que dependen tanto del tipo de antibiótico elegido y de su
efecto sobre el agente causal que se aíslo del proceso infeccioso.
Se han propuesto diversos métodos para medir in vitro la susceptibilidad bacteriana a los
antibióticos, de los cuales el más popular es el método de difusión en agar, prueba cualitativa en la
que se utilizan discos de papel filtro impregnado con concentraciones conocidas de los diferentes
antibióticos. Estos discos se colocan sobre la superficie del agar Muller-Hinton previamente
inoculado con la cepa problema (ver Anexo 6).
Después de la incubación se observan halos de inhibición de desarrollo bacteriano alrededor de
los discos con antibióticos a los cuales el microorganismo es susceptible. Por el contrario, si la
bacteria es resistente hay crecimiento alrededor del disco (ver Anexo 6).
Objetivo: El alumno determinará la susceptibilidad a los antimicrobianos empleados para Gram
positivos y Gram negativos mediante el método de difusión en agar.
Competencias:
 Realizar el método de difusión en agar como prueba de susceptibilidad in vitro a los
antimicrobianos.
 Identificar los principales antimicrobianos empleados para agentes bacterianos Gram positivos
y Gram negativos.
 Analizar los resultados de la prueba de susceptibilidad in vitro para clasificara los agentes
bacterianos en susceptibles, susceptibilidad intermedia y resistentes a los antimicrobianos a los
que fueron desafiados.
 Describir los principales mecanismos de acción de los antimicrobianos en los principales
géneros bacterianos de importancia Medicina Veterinaria.
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Lugar de Realización:
Laboratorio de prácticas de la FMVZ-UAEM, bajo el apoyo del Departamento de Prácticas de la
Facultad
Tiempo Destinado A La Práctica:
4 Horas (dos sesiones)
Material:
General: Asas bacteriológicas graduadas, pinzas de disección sin dientes de uso clínico, Compás
de calibración, Vernier, regla o platilla diseñada para este propósito, hisopos estériles, papel
secante, solución desinfectante, marcador permanente, Mechero, Estufa Bacteriológica a 37 ºC
(temperatura constante).
Sección:
 1 cultivo en agar de E. coli
 1 cultivo en agar de Staphylococcus spp
 Medio Agar Muller-Hinton
 Caldo Muller-Hinton
 Multidiscos de 12 antibióticos para bacterias Gram positivos (Sanofi Diagnostics Pasteur, S. A.)
 Multidiscos de 12 antibióticos para bacterias Gram negativos (Sanofi Diagnostic Pasteur, S. A.)
Metodología:
Primer Día (Sesión Uno)
Preparación y Acondicionamiento de la Muestra:
Preparar el medio de agar Mueller-Hinton de acuerdo a las instrucciones del fabricante, el pH final
a temperatura ambiente deberá estar entre 7.2 y 7.4, este medio favorece el crecimiento de casi
todos los microorganismos para los que son más importantes las pruebas de susceptibilidad.
Tomar con una asa bacteriológica de 4 a 5 colonias aisladas del mismo tipo morfológico e inocular
en 4 mL de caldo Mueller-Hinton, se incuba a 35 °C hasta que aparece una turbidez ligera
(generalmente 2 a 5 horas), la turbidez se ajusta con solución salina estéril o caldo estéril hasta
tener una densidad de 0.5 de MacFarland, comparable con un estándar de sulfato de bario [El
estándar se prepara mezclando 0.5 mL de BaCl2 0.048 M (1.175 % peso/volumen de BaCl2H20)
con 99.5 mL de H2SO4 al 1% v/v (0.36N)].
La suspensión ajustada del inoculo no debe permanecer más de 15 a 20 minutos antes de
proceder a inocular en la caja de Petrí.
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Procedimiento:
1. Para inocular el agar se utiliza un hisopo estéril de algodón, el cual se humedece con la
suspensión, se quita el exceso de caldo presionado y girando el hisopo sobre la pared interna
del tubo, por arriba del nivel del caldo, se estría el medio en tres direcciones sobre la totalidad
de la superficie de agar, para obtener un inóculo uniforme, se efectúa un último barrido del
hisopo sobre el reborde de la caja de Petrí y el agar. Cuando el inóculo se haya secado (de 3 a
5 minutos) se procede a colocar los discos.
2. Los discos se toman con pinza estéril y se colocan en el medio en un tiempo menor de 15
minutos después de haber inoculado la placa, los discos deberán presionarse ligeramente para
asegurar un contacto con la superficie, deberá prevenirse una sobreposición de las zonas de
inhibición con la distribución adecuada de los discos y con un límite no menor de 15 mm de los
bordes de la placa.
3. Después de 15 minutos de haber colocado los discos, invertir la caja de Petrí e incubar a 35
°C. El tiempo de incubación es de 18 a 24 horas.
Interpretación:
Segundo Día (Sesión Dos)
La medición de los halos de inhibición se hace con compás de calibración, Vernier, regla o platilla
diseñada para este propósito, por el fondo de la caja la cual se ilumina con luz reflejada. El punto
final de todos los sistemas de lectura será hasta la completa inhibición del crecimiento determinada
visualmente, ignorando colonias tenues o muy pequeñas que pueden ser observadas con
minuciosidad (ver Anexos 6 y 7).
Resultados:
Con la información obtenida durante la práctica y la posterior investigación que tendrá que realizar
el alumno, entregara un reporte de práctica tal como lo solicite el docente.
Evaluación (Criterios):
Cada docente establecerá los criterios de evaluación para otorgar una calificación durante la
práctica y del reporte de prácticas, con la finalidad de medir el grado de adquisición de
conocimientos, habilidades, aptitudes/valores de las unidades de competencia que se relacionen
con la práctica.
Cuestionario:
1. ¿Que otros medios de cultivo se pueden utilizar para preparar el inoculo?
2. ¿Cómo sabremos que el tubo con el inoculo ya está listo para ser inoculado?
3. ¿Que otros medios de cultivo se pueden utilizar en lugar del agar Mueller-Hinton?
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Anexos:
Anexo 6: Visualización de los diferentes resultados obtenidos en la prueba de susceptibilidad in
vitro, por el método de difusión en Agar (Kirby-Bauer).
Anexo 7: Clasificación de la susceptibilidad antimicrobiana con base al diámetro de los halos de
inhibición en bacterias Gram positivas y Gram negativas.
ANTIBIÓTICO
CONCENTRACIÓN
(MICROGRAMOS/mL)
AMIKACINA
AMPICILINA
Enterobacteriaceae
Staphylococcus spp.
Enterococcus spp.
Estreptococcus spp.
CARBENICILINA
Enterobacteriaceae
Pseudomona aeruginosa
CEFALOTINA
CEFOTAXIMA
CEFTAZIDIMA
CETRIAXONA
CEFUROXIMA
CLORANFENICOL
DICLOXACILINA
Estafilococcus spp.
ENOXACIMA
Enterobacteriaceae
ERITROMICINA
Enterococcus spp.
GENTAMICINA
30
10
DIÁMETRO DEL HALO DE INHIBICIÓN
EN mm (***)
Resistente
Intermedio Susceptible
(≤)
(≥)
14
15-16
17
11
28
16
21
12-13
22-29
14
29
17
30
17
13
14
14
14
13
14
12
18-22
14-16
15-17
15-22
15-17
14-20
15-17
13-17
23
17
18
23
18
21
18
18
10
11-12
13
14
15-17
18
13
14-17
18
100
30
30
30
30
30
30
1
10
15
10
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Enterobacteriaceae
12
NETILMICINA
30
12
NITROFURANTOINA
300
14
PEFLOXACINA
5
14
PENICILINA
10 UI
Etaphylococcus spp
28
N. gonorrhoeae
19
Enterococcus spp.
14
Estreptococcus spp.
19
TETRACICLINA
30
Enterobacteriaceae
14
TRIMETROPRIMSULFAMETOXAZOL
25
10
(***): Instructivo de multidiscos Gram positivos, Gram negativos BIO-RAD
46/52
13-14
13-14
15-16
15-22
15
15
17
23
29
20
20
15-18
19
11-15
16
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9. Procesamiento de muestras enviadas al laboratorio de bacteriología y micología
UNIDADES DE COMPETENCIA QUE SE RELACIONAN CON LA PRÁCTICA:
UNIDAD DE COMPETENCIA I, III, IV, V, VI, VIII
Introducción:
Un adecuado diagnóstico y tratamiento de las diversas enfermedades producidas por bacterias y
hongos, generalmente requiere de la detección e identificación del agente etiológico. Esto se logra
en el laboratorio a través del examen microscópico, aislamiento e identificación del agente y la
prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos.
Una vez que la muestra ha sido debidamente registrada e identificada, lo ideal es que sean
trabajadas de inmediato, pero cuando esto no sea posible será necesario mantenerlas en
refrigeración (4 a 8 °C) hasta que puedan ser procesadas. Sin embargo, es conveniente considerar
que existen muestras que deben ser trabajadas de inmediato ya que el proceso de refrigeración no
puede lograr que se conservan sin presentar alteraciones y multiplicaciones bacterianas, aunque
sea a un ritmo más lento, por ejemplo: orina, semen, alimento, agua, material fecal y leche.
Objetivo: El alumno aplicará los conocimientos para la realización del diagnóstico bacteriológico y
micológico de muestras clínicas como son: observación directa, aislamiento e identificación de los
microorganismos aislados en leche, heces y procesos piógenos.
Competencias:
 Valorar conforme a los lineamientos de conservación y envío de muestras al laboratorio, la
aceptación o el rechazo de una muestra para diagnóstico.
 Discutir los datos importantes de una historia clínica para orientar el diagnóstico bacteriológico
y micológico (establecer un diagnóstico presuntivo al proceso de laboratorio).
 Utilizar los procedimientos técnicos para el aislamiento de agentes bacterianos o micóticos.
 Realizar la identificación de los microorganismos aislados a partir de las muestras clínicas.
 Emitir el resultado final del diagnóstico bacteriológico o micológico.
 Realizar la prueba de susceptibilidad in vitro a los antimicrobianos de los microorganismos de
importancia aislados
Lugar de Realización:
Laboratorio de prácticas de la FMVZ-UAEM, bajo el apoyo del Departamento de Prácticas de la
Facultad
Tiempo Destinado a la Práctica:
4 Horas (dos sesiones)
47/52
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Subdirección Académica
Área de Docencia de Salud Pública
Material:
General: Asas bacteriológicas graduadas, asas bacteriológicas rectas, portaobjetos, papel
secante, solución desinfectante, marcador permanente, mechero, estufa bacteriológica a 37 ºC
(temperatura constante). Microscopio óptico binocular de campo claro (con objetivos de 4X, 10X,
40X, 100X), tiras de papel filtro.
Por Equipo:
 agar Sangre
 agares selectivos: MacConkey, Sal y manitol, Agar dextrosa y papa
 agar de Triple Hierro y Azúcar (TSI)
 Medio SIM
 Citrato de Simmons
 Urea
 Lisina descarboxilasa
 agar de Fenilalanina
 Base de rojo de fenol con lactosa, glucosa, manitol y maltosa.
 Medio MIO.
 Reactivo de cloruro férrico.
 Reactivo de Oxidasa
 Reactivo de Indol
 Tren de tinción de Gram
 Reactivo de KOH al 3%
Metodología:
Leche:
La siguiente metodología es la sugerida por el “Consejo Nacional de la Mastitis” de los Estados
Unidos de América, en su publicación “procedimientos de diagnóstico de la mastitis bovina”
Primer Día (Sesión Uno)
a) Las muestras refrigeradas deben ser calentadas a 25 °C durante 15 minutos con el fin de
liberar los microorganismos atrapados en la grasa de la leche.
b) La muestra debe agitarse vigorosamente para homogeneizarla.
c) Inmediatamente proceda a realizar dos frotis fijos, teñir con Gram, obsérvalos y anotar los
resultados.
d) Inocula 3 asadas de la muestra (son necesarias por los menos 0.025 mL) en la caja de agar
sangre, agar MacConkey, agar Sal y manitol y a partir de este inóculo realiza la primera estría
y completa la técnica para aislamiento en cultivo puro. Incuba 24 horas a 37 °C, en algunos
casos será necesario incubar hasta 48 h.
Segundo Día (Sesión Dos)
a) De las colonias aisladas describe números relativos y morfología macroscópica.
b) Realiza un frotis a partir de las colonias representativas del aislamiento y describe forma,
agrupación y reacción al Gram.
c) Realiza las pruebas de identificación necesarias para determinar género y especie.
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d) Realizar un antibiograma y determinar la susceptibilidad antimicrobiana de los
microorganismos aislados.
e) Emite un resultado definitivo y de acuerdo a este señalar los comentarios y/o recomendaciones
útiles para el clínico.
Heces:
Primer Día (Sesión Uno)
a) Realiza un frotis fijo a partir de la muestra y teñir con Gram, observar y anotar los resultados.
NOTA: Debido a que las heces contiene una microflora normal abundante el valor diagnóstico del
frotis tiene un valor relativo salvo algunas excepciones importantes.
b) Inocular una asada de la muestra en la caja de agar sangre, agar MacConkey, agar Sal y
manitol y realizar la técnica para aislamiento en cultivo puro. Incuba a 37 °C durante 24 horas.
c) Inocular aproximadamente 0.500g de la muestra en el tubo con caldo selenito. Incuba a 37 °C
durante 6-18 h y subcultivar en el medio de verde brillante con la técnica para aislamiento en
cultivo puro. Incuba a 37 °C durante 24 h.
Segundo Día (Sesión Dos)
a) Observar el desarrollo bacteriano en los medios de cultivo inoculados, describir números
relativos y morfología de las colonias aisladas.
b) Realizar un frotis fijo a partir de las colonias representativas del aislamiento, teñir con Gram y
describir agrupación y reacción tintorial.
c) Realizar las pruebas bioquímicas necesarias para determinar el género y especie del
microorganismo aislado.
d) Realizar un antibiograma y determinar la susceptibilidad antimicrobiana de los
microorganismos aislados.
e) Emitir un resultado definitivo y de acuerdo con este, señalar los comentarios y/o
recomendaciones útiles para el clínico.
Orina, Agua, Semen y Procesos Piógenos:
Primer Día (Sesión Uno)
a) Con uno de los hisopos de la muestra se inocula en el 1er. cuadrante de la caja de agar
sangre, agar MacConkey, agar sal y manitol, así como realizar un frotis directo a partir de la
muestra. Teñir con Gram, obsérvar y anotar la forma, agrupación, reacción tintorial y números
relativos.
b) Con el asa, se estria el resto de las cajas inoculadas bajo el proceso de siembra para
aislamiento en cultivo puro.
c) Incubar los medios a 37 °C durante 24 h.
Segundo Día (Sesión Dos)
a) Observar el desarrollo bacteriano en los medios de cultivo inoculados, describir números
relativos y morfología de las colonias aisladas.
b) Realizar las pruebas de identificación bioquímica necesarias para determinar género y especie
del microorganismo aislado.
c) Realizar un antibiograma y determinar la susceptibilidad antimicrobiana de los
microorganismos aislados.
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d) Emitir un resultado definitivo y de acuerdo a este, señalar los comentarios y/o
recomendaciones útiles para el clínico.
Alimento:
Primer Día (Sesión Uno)
a) Inocular aproximadamente 0.500g en 9.5 mL de caldo selenito y caldo lactosado, e incubar por
4 h a 37 °C.
b) A partir del caldo selenito, inocular en las cajas de agar MacConkey y agar verde brillante; y a
partir del caldo lactosado inocular en las cajas de agar sangre y agar Sal y manitol.
c) Realizar la técnica para aislamiento en cultivo puro.
d) Incubar a 37 °C durante 24 horas.
Segundo Día (Sesión Dos)
a) Observar el desarrollo bacteriano en los medios de cultivo inoculados, describir números
relativos y morfología de las colonias aisladas.
b) Realizar un frotis fijo a partir de las colonias representativas del aislamiento, teñir con Gram y
describir agrupación y reacción tintorial.
c) Realizar las pruebas bioquímicas necesarias para determinar el género y especie del
microorganismo aislado.
d) Realizar un antibiograma y determinar la susceptibilidad antimicrobiana de los
microorganismos aislados.
e) Emitir un resultado definitivo y de acuerdo con este, señalar los comentarios y/o
recomendaciones útiles para el clínico.
Resultados:
Con la información obtenida durante la práctica y la posterior investigación que tendrá que realizar
el alumno, entregara un reporte de práctica tal como lo solicite el docente.
Evaluación (Criterios):
Cada docente establecerá los criterios de evaluación para otorgar una calificación durante la
práctica y del reporte de prácticas, con la finalidad de medir el grado de adquisición de
conocimientos, habilidades, aptitudes/valores de las unidades de competencia que se relacionen
con la práctica.
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IV. BIBLIOGRAFÍA
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V. ACTUALIZACIÓN
Manual de Prácticas de Laboratorio de Bacteriología y Micología. Facultad de Medicina Veterinaria
y Zootecnia de la Universidad Autónoma del Estado de México. Toluca, México; 08 de Julio de
2013.
Primera Edición
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
Director:
Dr. en C. José Mauro Victoria Mora
Elaboró:
MVZ. Salvador Lagunas Bernabé
M. en C. Luis Fernando Vega Castillo
Revisó:
M. en C. Pomposo Fernández Rosas
QFB. Roberto Díaz Guadarrama
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