universidad autónoma metropolitana – iztapalapa métodos

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA – IZTAPALAPA
MÉTODOS INSTRUMENTALES
PRACTICA 1.
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS (LA APLICACIÓN DE LA CURVA
PATRÓN)
En las ciencias biológicas es muy importante saber identificar varias de las macromoléculas
de interés. El campo de estudio de las PROTEÍNAS es muy amplio, por lo que saber
determinarlas es esencial.
Existen varios métodos para determinar la concentración de proteínas de una muestra, tales
como la determinación de la absorbancia a 280 nm, o mediante la formación de derivados
coloreados de las proteínas, base de los métodos de BIURET o de LOWRY. En estos casos
se forma un complejo coloreado de cobre con el enlace peptídico; en el método de Lowry,
además del complejo anterior también se forma un derivado de las tirosinas que contribuye
a la absorbancia total.
El método que vamos a utilizar se en el empleo de un colorante hidrofóbico cuyas
disoluciones acuosas en presencia de ácido fosfórico tienen un color pardo y que, al
encontrarse en el entorno hidrofóbico del interior de una proteína, origina un color azul
intenso que se puede medir fácilmente. Este método depende, pues de la interacción
relativamente inespecífica entre un colorante hidrofóbico y las proteínas, por lo que es
relativamente sensible a la presencia de contaminantes tales como restos de detergente y
líquidos orgánicos como el metanol. Su principal ventaja es que resulta más rápido y fácil
de emplear que otros métodos alternativos, y más sensible que la medida de absorbancia a
280 nm.
Para determinar la concentración de proteína total presente en una muestra se requiere la
preparación de una curva de calibrado empleando una proteína patrón, que generalmente
suele ser la seroalbúmina bovina.
OBJETIVO
Determinar la concentración de proteínas de leche de vaca desnatada.
MATERIAL, EQUIPO Y RECTIVOS:
Reactivos
Reactivo de Bradford
NOTA: Si no se cuenta con él, prepararlo con los siguientes componentes
Azul de coomasie G-250 (5 mg)
Etanol (2.5 ml)
Ácido Fosfórico (5 ml)
Agua desionizada hasta 50 ml
Albúmina (10 mg)
Por el alumno
Leche o yakult (una fuente líquida con proteínas)
Material y/o equipo
1 Espectrofotómetro
2 Cubetas de 1 cm
1 matraz aforado de 50 ml
1 pizeta con agua destilada
10 tubos de ensaye de 13x100 mm u otra medida
1 gradilla para tubos de ensaye
1 micropipeta de 1000 ul
puntas para micropipeta
2 pipetas graduadas de 5 ml
2 pipetas graduadas de 10 ml
Papel milimétrico
Reactivo de Bradford, puede ser el comercial; si no se cuenta con él, se prepara de la
siguiente manera:
Mezclar en el orden indicado, disolver con agitación y a continuación filtrar.
Azul de coomasie G-250
…….
5 mg
Etanol
…….
2.5 ml
Ácido fosfórico
…….
5 ml
Agua
…….
Hasta 50 ml
Mezclar en el orden indicado, disolver con agitación y a continuación filtrar.
Patrón de albúmina. Disolver 10 mg de albúmina (del tipo con el que se cuente) en 10 ml
de agua destilada, con lo que tenemos una disolución madre con una concentración de 1
mg/ml.
METODOLOGÍA
1. Preparar la curva patrón de albúmina bovina en un rango desde 0 hasta 60 µg; de tal
manera que el volumen final en cada tubo sea de 1 ml. Mezclar para ello el volumen
adecuado de la disolución madre de albúmina bovina de un 1 mg/ml y el
correspondiente volumen necesario de agua, de acuerdo con la siguiente tabla.
METODO
1-Preparar la curva patrón de albúmina bovina en un rango desde 0 hasta
60 µg; de tal manera que el volumen final en cada tubo sea de 300 µl.
Realizar los
cálculos
llenando
tabla:
Mezclar
para
ello elcorrespondientes,
volumen adecuado
de lalasiguiente
disolución
madre de albúmina
bovina de un 1 mg/ml y el correspondiente volumen necesario de agua, de
µg
acuerdo
con 0la siguiente
20 tabla. 20
30
40
50
60
(proteína)
µl
µg (prot) 0 0
(albúmina)
0
µlµl (alb)
300
(agua)
µl (agua) 300
µlµl
totales
total 300300
10
10
290
300
300
20
20
280
300
300
30
30
270
300
300
40
40
260
300
300
50
60
50
60
250
240
300
300
300 300
2-Preparación de tres diluciones de la muestra problema:
2. Preparación de tres diluciones de la muestra problema:
Hacer una dilución 1:20 de la leche comercial; a continuación realizar las
Hacer unadiluciones
dilución 1:20
de la leche
a continuación
realizar las diferentes
diferentes
de acuerdo
concomercial;
la siguiente
tabla.
diluciones de acuerdo con la siguiente tabla.
Leche diluida
V. leche (µl)
V. agua (µl)
V. total
A
20
280
300
B
25
275
300
C
30
270
300
Finalmente añadir 3 ml del reactivo de Bradford a todos los tubos; tanto a las diluciones
que contienen la albúmina como a las que contienen la leche diluida. Agitar los tubos y a
continuación proceder a la lectura de la absorbancia a 595 nm en el espectrofotómetro.
RESULTADOS
1.
Elaboración de la curva patrón. Para ello representar en el papel milimetrado
adjunto la absorbancia de cada uno de los tubos que contenían albúmina frente a la cantidad
de proteínas correspondiente. Si se dispone de una calculadora con capacidad para hacer
rectas de regresión, compruebe el coeficiente de correlación de la recta obtenida. En
cualquier caso determine la pendiente de la recta. Sino, hacerlo directamente en hoja de
cálculo (Excel).
2.
Para las tres diluciones del problema, interpolar la absorbancia obtenidas sobre la
recta representada para saber la cantidad de proteínas presentes en cada una de ellas.
Alternativamente, haga el cálculo mediante la pendiente de la recta.
3.
Teniendo en cuenta los volúmenes de muestra usados en cada caso y teniendo en
cuenta la dilución realizada, calcúlese la concentración de proteínas en la muestra
analizada. Dar el resultado en gramos de proteínas por 100 ml de leche o yogurt o según sea
el caso.
4.
Anotar conclusiones.