CHAPTER 2

CAPÍTULO 2.2.4.
LEPTOSPIROSIS
RESUMEN
La leptospirosis es una enfermedad contagiosa de los animales y de los humanos causada por
cualquiera de los miembros patógenos del género Leptospira. El diagnóstico laboratorial de la
leptospirosis puede ser complejo e implica pruebas que se dividen en dos grupos. Uno de los
grupos de pruebas está diseñado para detectar los anticuerpos antileptospiras, el otro está
diseñado para detectar leptospiras, antígenos de leptospiras o ácidos nucleicos de leptospiras en
tejidos animales o en fluidos corporales. El conjunto de pruebas concretas seleccionadas depende
del objetivo de la prueba (por ejemplo, los estudios de rebaños o el diagnóstico en un animal
aislado) y de las pruebas o de la experiencia de la que se disponga en la zona.
Identificación del agente: El aislamiento y la detección de las leptospiras en:
a)
los órganos internos (como el hígado, el pulmón, el cerebro y el riñón) y en los fluidos
corporales (la sangre, la leche, los fluidos cerebroespinal, torácico y peritoneal) de los
animales infectados clínicamente proporciona un diagnóstico definitivo de la enfermedad
clínica aguda o, en el caso de un feto, de la infección crónica de la madre.
b)
el riñón, la orina o en el tracto genital de animales sin signos clínicos sólo es diagnóstico de
un estado de portador crónico.
El aislamiento de leptospiras a partir de material clínico y la identificación de los aislados
constituyen una pérdida de tiempo, y son cometidos de los laboratorios de referencia
especializados. El aislamiento seguido de la tipificación a partir de portadores renales es muy útil
en los estudios epidemiológicos para determinar qué serovariedades están presentes en un grupo
concreto de animales, en una especie animal o en una región geográfica.
La demostración de la presencia de leptospiras mediante pruebas inmunoquímicas
(inmunofluorescencia e inmunohistoquímica) se adapta más a la mayoría de las condiciones de
laboratorio. Sin embargo, la eficacia de estas pruebas depende del número de organismos que
estén presentes en el tejido y carecen de la sensibilidad de un cultivo. A menos que se utilicen
reactivos especialmente elaborados, las pruebas inmunoquímicas no identifican la serovariedad
infectante, y los resultados deben interpretarse junto con los resultados serológicos. Los reactivos
para inmunofluorescencia se elaboran mejor con sueros antileptospira con un título alto de IgG,
que no están disponibles comercialmente. El suero de conejo para la tipificación de leptospiras
puede utilizarse para las pruebas inmunohistoquímicas y está disponible en los laboratorios de
referencia de leptospiras.
La presencia de material genético de leptospiras en tejidos o en fluidos corporales se puede
demostrar empleando diversos ensayos basados en la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR). Los ensayos de PCR son sensibles, pero los procedimientos de control de calidad y el
procesamiento de las muestras para PCR son cruciales y deben adecuarse al tejido, al fluido y a la
especie que se esté analizando. Al igual que ocurre con las pruebas inmunoquímicas, con la
mayoría de los ensayos de PCR no se identifica la serovariedad infectante.
Pruebas serológicas: Las pruebas serológicas constituyen el medio más ampliamente utilizado
para el diagnóstico de la leptospirosis, y la prueba de aglutinación microscópica (MAT) es la
prueba serológica estándar. Los antígenos seleccionados para su utilización en la MAT deben
incluir las cepas representativas de los serogrupos que se sabe que existen en la región concreta,
además de aquéllos que se sabe que persisten en otra región en la especie hospedadora objeto de
estudio.
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Capítulo 2.2.4. — Leptospirosis
La MAT se utiliza principalmente como una prueba de rebaño. Para la obtención de información
útil, se deben examinar al menos diez animales o el 10% del rebaño, el que mayor sea, y
documentar el historial de vacunación de los animales. Como prueba en un animal aislado, la MAT
es muy útil para el diagnóstico de la infección aguda: un aumento de cuatro veces en los títulos de
anticuerpos en las muestras de pares de sueros agudos o convalecientes tiene valor diagnóstico.
La MAT tiene limitaciones en el diagnóstico de la infección crónica en animales aislados y en el
diagnóstico de las infecciones endémicas de rebaños. Los animales infectados pueden abortar o
ser portadores renales/genitales mostrando títulos de MAT por debajo del título mínimo significativo
ampliamente aceptado de 1/100 (dilución final).
Los enzimoinmunoensayos (ELISA) también pueden ser útiles para la detección de anticuerpos
contra las leptospiras. Se han elaborado numerosos ensayos que se utilizan principalmente para la
detección de infecciones recientes y para la selección de animales experimentales que se emplean
en los estudios de infección. Los animales que han sido vacunados frente a la serovariedad
pertinente pueden dar resultados positivos en muchos ELISA, dificultando de esta manera la
interpretación de los resultados.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: Las vacunas para uso veterinario
son suspensiones de una o más serovariedades de Leptospira spp. inactivadas de tal forma que la
actividad inmunógena se conserva. Aunque se ha probado una gama de vacunas experimentales
basadas en extractos celulares, las vacunas comerciales son, con pocas excepciones, productos
con células completas. Las leptospiras se cultivan en medios de cultivo adecuados que contienen a
menudo suero o proteínas del suero. En caso de utilizarse, el suero y las proteínas del suero
deben retirarse de los productos finales. Las vacunas pueden contener adyuvantes adecuados.
A. INTRODUCCIÓN
La leptospirosis es una enfermedad contagiosa de los animales y los humanos producida por la infección con la
espiroqueta Leptospira. Todas las leptospiras patógenas se clasificaron anteriormente como miembros de la
especie Leptospira interrogans; sin embargo, el género ha sido reorganizado recientemente y las leptospiras
patógenas ahora se clasifican en varias especies de Leptospira (11, 58, 85). Hay más de 200 serovariedades
diferentes de leptospira reconocidas que se clasifican en 23 serogrupos (46). En un manual recientemente
publicado (31) se revisa Leptospira y la leptospirosis.
El uso, la interpretación y el valor de los procedimientos de diagnóstico de laboratorio para la leptospirosis varían
según la historia clínica del animal o del rebaño, la duración de la infección y la serovariedad infectante. Debe
sospecharse de leptospirosis aguda en los siguientes casos: aparición repentina de agalactia (en el ganado
lechero adulto y ovino); ictericia y hemoglobinuria, especialmente en animales jóvenes; meningitis; y fallo renal
agudo o ictericia en perros. La leptospirosis crónica debe considerarse en los siguientes casos: aborto,
mortinatos, nacimiento de animales débiles (pueden ser prematuros); infertilidad; fallo renal crónico o hepatitis
crónica activa en perros; y casos de oftalmia periódica en caballos. La localización y la persistencia de
leptospiras en el riñón y en el tracto genital de machos y hembras son dos secuelas microbiológicas crónicas
importantes de la infección por leptospiras que presentan problemas de diagnóstico concretos. Los animales
infectados crónicamente pueden ser portadores durante toda la vida y servir de reservorios de la infección para
otros animales y para los humanos.
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
1.
Identificación del agente
La demostración de la presencia de leptospiras en la sangre y la leche de los animales que muestran signos
clínicos que sugieren leptospirosis aguda tiene valor diagnóstico. Sin embargo, el aislamiento a partir de la
sangre no es siempre satisfactorio, porque la bacteriemia es pasajera y no siempre se acompaña de signos
clínicos. Con frecuencia, los perros se tratan con antibióticos antes de tomar las muestras para analizar la
presencia de Leptospira, lo que después disminuye la probabilidad de identificar el agente en la sangre. También
tiene valor diagnóstico la detección de una infección generalizada por leptospira en una serie de órganos
tomados en la necropsia. Sin embargo, si el animal vive lo suficiente o se le ha tratado con antibióticos, puede
resultar difícil la detección sistémica de organismos intactos; en estos casos la inmunohistoquímica puede ser
particularmente útil en la identificación del antígeno residual de leptospiras. La demostración de la presencia de
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leptospiras en el tracto genital, los riñones o la orina sólo debe interpretarse considerando en conjunto los signos
clínicos y los resultados serológicos, ya que estos hallazgos puede que sólo indiquen que el animal era portador.
El fallo en la demostración de la presencia de leptospiras en la orina de un animal no descarta la posibilidad de
que éste sea portador renal crónico; sólo indica que el animal no excretaba cantidades detectables de leptospiras
en el momento del examen. La toma de orina después del tratamiento de los animales con un diurético
aumentará las posibilidades de detectar el organismo (53). En los casos importantes en los que estén implicados
animales aislados (por ejemplo, la autorización para que un caballo semental vuelva a la reproducción), las
pruebas negativas de muestras de orina de tres semanas consecutivas se considera una buena demostración de
que el animal no elimina leptospiras por la orina.
La demostración de las leptospiras en los fluidos corporales o en órganos internos (normalmente en el riñón, el
hígado, el pulmón, el cerebro o en la glándula adrenal) de fetos abortados o nacidos muertos tiene valor
diagnóstico de la leptospirosis crónica de la madre, y es una evidencia de la infección activa del feto.
El aislamiento de leptospiras es el método más sensible de la demostración de su presencia, siempre que no
haya residuos de antibióticos, que no haya autolisis avanzada del tejido, que los tejidos se manejen con rapidez
para realizar cultivos después de su recogida y, en el caso de la orina, que tenga un pH adecuado. Si los tejidos
o los fluidos no se pueden enviar al laboratorio inmediatamente para la realización de un cultivo de leptospiras, la
muestra se conservará a 4°C para impedir el crecimiento excesivo de otras bacterias y la autolisis de las
muestras de tejido. Como medios de transporte para el envío de las muestras deben emplearse medio de
cultivo líquido o solución al 1% de albúmina sérica bovina (BSA) con 5-fluorouracilo a una concentración de 100–
200µg/ml.
El cultivo debe realizarse en un medio semisólido (0,1–0,2% agar) con BSA o bien con Tween 80 (por ejemplo,
medio Tween 80/BSA o EMJH) (39) o con BSA y una combinación de Tween 80 y Tween 40 (25). La
contaminación se puede controlar añadiendo una serie de agentes selectivos, por ejemplo, 5-fluorouracilo (43),
ácido nalidíxico (44), fosfomicina (54), y una mezcla de rifamicina, polimixina, neomicina, 5-fluorouracilo,
bacitracina y actidiona (1). Sin embargo, el uso de agentes selectivos puede reducir las posibilidades de
aislamiento cuando sólo haya un número pequeño de leptospiras viables, y muchas cepas de leptospiras no
crecerán en medios selectivos que contengan múltiples antibióticos. La adición de suero de conejo al 0,4–1% a
un cultivo semisólido aumenta las posibilidades de aislar algunas serovariedades de leptospiras exigentes.
Los cultivos deben incubarse a una temperatura de 29 ± 1°C al menos durante 16 semanas y, preferentemente,
durante 26 semanas (25). El tiempo que se requiere para la detección de un cultivo positivo varía con la
serovariedad de leptospira y el número de organismos presentes en la muestra. Las serovariedades
menos exigentes (por ejemplo, Pomona y Grippotyphosa) pueden dar resultados positivos tan pronto como entre
7–10 días después de la inoculación; otras serovariedades (por ejemplo, Hardjo y Bratislava) pueden tardar
mucho más tiempo. Los cultivos deben examinarse con un microscopio de campo oscuro cada 1–2 semanas. Es
importante utilizar una fuente luminosa de 100 vatios y un microscopio de campo oscuro de buena calidad.
La presencia de leptospiras se puede demostrar también mediante una serie de técnicas de tinción
inmunoquímicas, por ejemplo, inmunofluorescencia (9, 26) y diversas técnicas inmunohistoquímicas (4, 28, 63,
65, 86). Estas técnicas son útiles para diagnosticar la infección en material patológico que es inadecuado para la
realización de cultivos o donde se requiere un diagnóstico rápido. Puesto que el éxito de estas técnicas depende
del número de organismos presentes, son menos apropiadas para diagnosticar el estado de portador crónico,
donde el número de organismos puede ser muy bajo o localizado. Las leptospiras no se tiñen bien con los
colorantes de anilina, y las técnicas de tinción argéntica carecen de sensibilidad y especificidad, aunque
constituyen un complemento útil para el diagnóstico histopatológico (6).
Los ensayos basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se emplean en la actualidad en algunos
laboratorios de diagnóstico y en la mayoría de los laboratorios de referencia para la detección de leptospiras en
tejidos y fluidos corporales. Se han descrito diferentes juegos de promotores o cebadores para la realización de
ensayos de PCR (3, 5, 32, 34, 39, 45, 51, 66, 75, 79, 83), con algunos cebadores específicos para el género
Leptospira y otros que son específicos de serovariedad. Los ensayos de PCR pueden ser bastante sensibles,
pero la carencia de especificidad (es decir, resultados positivos falsos) puede representar un problema. El control
de calidad de los ensayos de PCR utilizados para el diagnóstico de la leptospirosis requiere una atención
especial en lo que se refiere al diseño y al volumen de trabajo del laboratorio para prevenir la contaminación de
los materiales y al uso de muestras control apropiadas (24, 49). Además, el procesamiento de la muestra para
PCR es decisivo y debe ser adecuado para el tejido, el fluido y la especie que se esté analizando. Un
procedimiento para la preparación de las muestras de orina para PCR en el que se emplean perlas magnéticas
recubiertas de anticuerpos contra las leptospiras promete un aumento en la detección de leptospiras patógenas
en la orina (70).
La identificación de los aislados de leptospiras es un cometido de los laboratorios de referencia especializados.
Para realizar una identificación completa, debe utilizarse una combinación de procedimientos que determinen: 1)
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si el aislado es un patógeno o un saprofito; 2) la especie de Leptospira a la que pertenece el aislado y 3) el
serogrupo y la serovariedad del aislado. Un cultivo puro de leptospiras se identifica como perteneciente a una
especie patógena o saprofita mediante pruebas diferentes como la capacidad de infectar animales, la resistencia
relativa a la 8-azaguanina, la actividad lipasa, la tolerancia a la sal y a la temperatura (41, 42), la amplificación del
ADNr de 23S (82) y el contenido de G+C del ADN (41).
Se han identificado nuevas especies de leptospiras basándose en el análisis de hibridación de ADN–ADN (11,
58, 85). En estos análisis se utilizó, en la mayoría de los casos, la cepa tipo para cada serovariedad; para unas
cuantas serovariedades se han examinado también los aislados clínicos para determinar las designaciones de
nuevas genoespecies. Los diferentes aislados pertenecientes a una única serovariedad normalmente pertenecen
a la misma especie, pero éste no siempre es el caso. La identificación de especies a partir de aislados de campo
todavía es engorrosa, pero puede hacerse mediante análisis de secuencias del ADNr de 16S o mediante análisis
genético de los genes de ARN ribosómico de 16S o 23S (14, 47, 55, 57, 80, 81).
Las cepas pertenecientes a Leptospira pueden diferenciarse a nivel de serogrupo mediante reacciones de
aglutinación cruzada (23). La diferenciación posterior a nivel de serovariedad se hace tradicionalmente mediante
absorción por aglutinación cruzada, aunque para la mayor parte de los aislados esto se hace ahora utilizando
métodos que requieren menos tiempo como son: el análisis del factor (23), los anticuerpos monoclonales (MAbs)
(71, 72), el análisis con las endonucleasas de restricción (38, 48, 73, 74) y diversas estrategias con PCR (14, 18,
22, 33, 56, 57, 59, 62, 87, 88). Sin embargo, las pruebas basadas en la genética puede que no den siempre los
mismos resultados que la prueba de la absorción por aglutinación cruzada.
2.
Pruebas serológicas
Las pruebas serológicas constituyen el procedimiento de laboratorio utilizado con más frecuencia para confirmar
el diagnóstico clínico, para determinar la prevalencia en el rebaño y para realizar los estudios epidemiológicos.
Los anticuerpos de las leptospiras aparecen a los pocos días del comienzo de la enfermedad y persisten durante
semanas o meses y, en algunos casos, años. Desafortunadamente, los títulos de anticuerpos puede que caigan
hasta niveles indetectables mientras los animales permanecen infectados crónicamente. Para superar este
problema, se necesitan métodos sensibles que detecten el organismo en la orina o en el tracto genital de
portadores crónicos.
Se ha descrito una amplia variedad de pruebas serológicas que muestran grados variables de especificidad de
serogrupo y de serovariedad. La prueba de la aglutinación microscópica (MAT) y el enzimoinmunoensayo
(ELISA) contribuyen al diagnóstico veterinario.
a)
Prueba de aglutinación microscópica
La prueba MAT en la que se emplean antígenos vivos es la prueba serológica más ampliamente utilizada.
Constituye la prueba de referencia frente a la que se evalúan todas las otras pruebas serológicas y se utiliza
en las comprobaciones para la importación/exportación. Para obtener una sensibilidad óptima deben
emplearse antígenos representativos de todos los serogrupos conocidos que existen en la región en la que
se han encontrado los animales y, preferiblemente, cepas que representen a todos los serogrupos
conocidos. La presencia de un serogrupo normalmente viene indicada por la reacción frecuente en la
selección serológica o en el aislamiento de una serovariedad procedente de animales afectados
clínicamente. Se puede mejorar la sensibilidad de la prueba utilizando aislamientos locales en vez de cepas
de referencia, pero las cepas de referencia ayudan en la interpretación de los resultados entre los
laboratorios. La especificidad de la MAT es buena; normalmente los anticuerpos frente a otras bacterias no
dan reacción cruzada con Leptospira de manera significativa. Sin embargo, existe reacción cruzada
serológica significativa entre las serovariedades de Leptospira y es probable que un animal infectado con
una serovariedad tenga anticuerpos frente a la serovariedad infectante que dé reacción cruzada con otras
serovariedades (normalmente a un nivel más bajo) en la MAT. Además, los animales que han sido
vacunados contra la leptospirosis pueden tener anticuerpos frente a las serovariedades presentes en la
vacuna utilizada. Por tanto, es especialmente importante considerar el historial de vacunación de los
animales objeto de estudio. Los dos métodos para la realización de la prueba se han descrito
detalladamente (37, 52).
Las estirpes seleccionadas deben cultivarse en Tween 80 BSA o en un medio comercial adecuado a 29 ±
1°C y el cultivo debe tener al menos 4 días, pero no más de 8. La transmitancia del antígeno debe ser del
60–70% utilizando un espectrofotómetro con un filtro de 400 nm o tener un valor de 25 en una lectura en un
nefelómetro. El número de antígenos que se utilizan es determinado, y se puede realizar una selección con
una dilución del suero de 1/50 (o una dilución de inicio diferente basada en el objetivo de la prueba). A cada
pocillo se añade un volumen de cada antígeno, igual al volumen del suero diluido, para hacer una dilución
final del suero de 1/100 en la prueba de selección. Las placas de microtitulación se incuban a 29 ± 1°C
durante 2-4 horas, y se examinan mediante microscopía de campo oscuro. El grado de reacción se
interpreta mediante la estimación del porcentaje de leptospiras que se aglutinan. Si se aglutinan el 100% de
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Capítulo 2.2.4. — Leptospirosis
las leptospiras, la reacción es 4+; 3+ equivale aproximadamente al 75% de aglutinación; 2+ equivale al
50%; y 1+ equivale a menos del 50%. Si se realiza una prueba de selección, cualquier suero que dé una
reacción 2+ a una dilución 1/100 se titula a punto final, empleando diluciones al doble del suero empezando
en una dilución final de 1/100 hasta 1/12.800 o mayor. El título de punto final es la inversa de la dilución
más alta con una reacción 2+ o mayor.
La identidad de los antígenos es un factor crucial al realizar la MAT. Los antígenos deben evaluarse con
respecto a su identidad utilizando sueros hiperinmunes de conejo, MAbs, o un método molecular que
confirme los pases a lo largo del tiempo, preferiblemente cada vez que se realiza la prueba, pero al menos
dos veces al año. El suero de conejo hiperinmune para este fin puede prepararse utilizando un protocolo
como el ofrecido por la Subcomisión de Taxonomía de Leptospira (40). Brevemente, se seleccionan conejos
sanos con un peso entre 2–4 kg que no tengan anticuerpos antileptospiras detectables. A cada conejo se le
administra una inyección intravenosa de un cultivo vivo que haya crecido bien o de un cultivo clonado y
tratado con formalina con una densidad aproximada de 2 × 108 leptospiras/ml en una vena marginal de la
oreja. El cultivo debe hacerse en medio Tween 80 BSA o en otro medio apropiado. Se administran cinco
inyecciones de 1, 2, 4, y 6, ml a intervalos de 7 días. Una semana después de la última inyección, se
determina el título del anticuerpo homólogo mediante la MAT. Si el título es ≥1/12.800, se anestesia el
conejo y se sangra mediante punción cardiaca 7 días más tarde (es decir, 14 días después de la inyección
final). Si el título es <1/12.800, se administra otra inyección de 6 ml de cultivo; 7 días después de ésta se
determina de nuevo el título homólogo. El procedimiento debe repetirse con otro conejo a no ser que el
título sea ≥1/12.800. Para la preparación de cada antisuero se utilizan dos conejos. Si los títulos son
satisfactorios en ambos conejos, los sueros se pueden mezclar. Para mantener la potencia es preferible
liofilizar el antisuero en volúmenes de 2 ml y conservarlo a 4°C. Alternativamente, el suero se puede
conservar en volúmenes de 2 ml a –20°C.
Debe comprobarse de forma regular la pureza de los antígenos utilizados en la MAT mediante el cultivo en
agar sangre y en caldo de tioglicolato. Los cultivos base de antígenos se pueden almacenar a –70°C o en
nitrógeno líquido. Puede que después de la liofilización haya una tasa de supervivencia baja de leptospiras.
El pase repetido de antígenos en medio de cultivo da lugar a una pérdida de antigenicidad. En este caso, se
debe hacer un nuevo cultivo líquido a partir del cultivo base.
En algunas situaciones, los cultivos formalinizados o liofilizados se pueden emplear en la MAT. Las
principales ventajas del uso de organismos muertos son que los antígenos pueden estandarizarse y se
puede evitar el gasto, la dificultad y el riesgo de mantenimiento de cultivos vivos de Leptospira. Los títulos
que se determinan empleando antígenos vivos y muertos no pueden compararse directamente, y muchas
de las personas que realizan diagnósticos tienen la sensación de que la máxima sensibilidad de la MAT se
obtiene empleando antígenos vivos.
Como una prueba en un animal aislado, la MAT es muy útil en el diagnóstico de la infección aguda; tiene
valor diagnóstico la demostración de un aumento de cuatro veces en los títulos de anticuerpos en muestras
de pares de sueros procedentes de animales enfermos agudos y convalecientes. La prueba tiene
limitaciones en el diagnóstico de la infección crónica en animales aislados tanto en el diagnóstico de
abortos (27) como en la identificación de portadores renales o genitales (25). Esto es particularmente cierto
en las infecciones por leptospiras adaptadas al hospedador, por ejemplo, la infección por la serovariedad
Hardjo en el ganado vacuno. Cuando se toma como significativo un título de 1/100 o superior, la
sensibilidad de la prueba sólo es del 41%, e incluso cuando el título significativo mínimo se reduce a 1/10, la
sensibilidad de la prueba sólo es del 67% (25). Sirve de diagnóstico la demostración de anticuerpos en la
sangre fetal.
Puesto que la leptospirosis es un problema de rebaño, la MAT tiene un uso mucho mayor como una prueba
de rebaño. Para obtener información útil, Cole et al. (17) sugirieron que se tomaran muestras de al menos
diez animales o del 10% del rebaño, la que mayor sea. En un estudio de la infección por Hardjo en el
ganado vacuno, Hathaway et al. (37) encontraron que normalmente una muestra de diez vacas indicaba la
presencia o ausencia de infección en un rebaño. El incremento en el tamaño de la muestra mejoraba
notablemente la información epidemiológica, las investigaciones de la enfermedad clínica y los rastreos
retrospectivos de salud pública.
Al hacer un diagnóstico serológico de la leptospirosis, deben tenerse muy en cuenta la serovariedad
infectante y el estado clínico implicado. En el caso del aborto inducido por la serovariedad Pomona en el
ganado vacuno, normalmente se encuentra un título alto en el momento del aborto, debido a que el
incidente clínico tiene lugar durante la fase aguda de la infección. El aborto en el ganado vacuno debido a la
serovariedad Hardjo es un hecho crónico; en este caso, la respuesta serológica en el momento del aborto
es más variable, apareciendo algunos animales seronegativos y otros que muestran títulos altos. El ganado
vacuno puede experimentar una caída en la producción de leche durante la fase aguda de la infección por
Hardjo, y este síntoma clínico está asociado con títulos altos. También debe tenerse en cuenta el historial
de vacunación al interpretar los resultados de la MAT, pues la vacunación extendida contribuye de forma
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importante al número de animales seropositivos y puede enmascarar la presencia de infecciones crónicas
en el rebaño, en particular por la serovariedad Hardjo.
b)
Enzimoinmunoensayo
Los ELISA para la detección de anticuerpos antileptospira se han elaborado empleando una serie de
preparaciones antigénicas diferentes, protocolos de ensayo y programas de ensayo que incluyen pruebas
en placa y pruebas con tiras reactivas. En general, los ELISA son bastante sensibles, pero no tienen la
especificidad de serovariedad de la MAT. En Europa se ha desarrollado y evaluado un ELISA que cuantifica
la IgG y la IgM caninas frente a varias serovariedades de leptospira (35, 36). En este ensayo se detecta IgM
antileptospira tan sólo 1 semana después de la infección, antes de que estén presentes los anticuerpos
aglutinantes. Los anticuerpos IgG se detectan en perros infectados, comenzando 2 semanas después de la
infección, y persisten durante largos periodos de tiempo. Por tanto, los perros con leptospirosis aguda
tienen títulos de IgM altos y títulos de IgG relativamente bajos; los perros que están vacunados o han tenido
una infección previa por leptospiras tienen títulos altos de IgG, pero bajos de IgM. Se han elaborado
también ensayos similares para la detección de anticuerpos bovinos, porcinos y ovinos antileptospira (2, 16,
21, 50, 60, 67–69, 76, 84). El papel más importante asociado a ELISA en el ganado es la utilización de un
ELISA de la IgM para la identificación de infecciones recientes (21) y para la selección de rebaños en
regiones donde no se practica la vacunación para la leptospirosis. Un ELISA de Ig total es útil en la
identificación de animales muy susceptibles que es conveniente para el trabajo de infección experimental
(29). Se han desarrollado también ensayos ELISA para la detección de anticuerpos de la serovariedad
Hardjo en la leche de vacas aisladas o en un tanque de almacenamiento de leche. Estas pruebas han sido
útiles en la identificación de rebaños infectados por Hardjo. Sin embargo, los rebaños que están vacunados
frente a la serovariedad Hardjo también darán resultados positivos en estos diferentes ELISA disminuyendo
su utilidad en las regiones donde la vacunación es una práctica rutinaria.
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO
Las vacunas contra la leptospirosis para uso veterinario son suspensiones de una o más cepas patógenas de
Leptospira inactivadas de tal manera que la actividad inmunógena se conserva. Aunque se han probado vacunas
experimentales basadas en extractos celulares (8), las vacunas comerciales son, con pocas excepciones,
productos que contienen células completas. Las leptospiras se cultivan en medios de cultivo apropiados que
pueden contener suero o proteínas del suero. En caso de utilizarse, el suero y las proteínas del suero deben
eliminarse del producto final. Las vacunas pueden contener adyuvantes adecuados.
Las directrices para la producción de vacunas veterinarias se dan en el Capítulo I.1.7. Principios de producción
de vacunas veterinarias. Las directrices dadas aquí y en el Capítulo I.1.7 tienen un carácter general y pueden
complementarse mediante requisitos nacionales o regionales.
1.
Control del inóculo
a)
Características del inóculo
Para la producción de vacunas es de suma importancia la selección adecuada de las cepas. La inmunidad
inducida mediante la vacunación es en gran medida específica de serovariedad (15). Una vacuna debe
formularse para su uso en una especie concreta de animal de una región geográfica concreta. Sólo debe
contener aquellas serovariedades - y preferentemente aquellos genotipos - que causen problemas en la
especie animal, o que se transmitan de una especie animal a otra en la región. Las cepas seleccionadas
para utilizarlas de cultivo de inóculo original deben clonarse en medio sólido para asegurar la ausencia de
contaminantes saprofitos de Leptospira y la uniformidad del cultivo.
Posteriormente, deben seleccionarse las cepas adecuadas por su capacidad para crecer con alto
rendimiento en las condiciones de cultivo de lotes.
b)
Métodos de cultivo
Cada cepa componente que se incluye en la vacuna final debe cultivarse por separado en medio líquido,
preferiblemente en medio libre de proteínas (7, 64) o bajo en proteínas (7).
El volumen de cada cultivo de inóculo original debe amplificarse mediante el crecimiento durante 2–10 días
a 29 ± 1°C en una serie de subcultivos hasta que se alcance un volumen suficiente para su uso como un
cultivo de inóculo de producción. Los cultivos deben airearse y agitarse cuando sea necesario.
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Capítulo 2.2.4. — Leptospirosis
Cada subcultivo del cultivo de inóculo original debe comprobarse con respecto a su pureza y crecimiento
adecuado. La pureza puede comprobarse mediante la inoculación del contenido de un asa del cultivo en
placas de agar sangre o en caldo de tioglicolato para su incubación a 37°C durante 2–5 días, y mediante el
examen de una extensión de precipitado del cultivo teñida con Gram. El crecimiento se puede examinar con
el microscopio de campo oscuro. Para garantizar la pureza y la homología, cada cultivo de inóculo
producción debe también comprobarse frente a su antisuero de conejo homólogo (23). Los MAb también se
pueden utilizar para este fin.
c)
Validación como vacuna
Hay una gran cantidad de información sobre la eficacia de las vacunas contra la leptospirosis. En la mayoría
de los casos, las vacunas proporcionan una protección importante frente a la enfermedad producida por una
infección homóloga en las condiciones de campo.
Las vacunas son menos eficaces en la prevención de la infección en animales, y un porcentaje de animales
vacunados se infectarán con la serovariedad pertinente, y pueden eliminar el organismo en la orina a pesar
de no presentar signos clínicos de la enfermedad.
Los ensayos de eficacia y la validación de vacunas deben llevarse a cabo en la especie diana de la vacuna.
La vacuna debe administrarse como se indica en la etiqueta, y la inmunidad debe comprobarse mediante la
infección con cepas de campo virulentas de cada serovariedad por vías naturales de infección, es decir,
mediante la infección conjuntival y/o vaginal. Los estudios de validación se han llevado a cabo con
frecuencia provocando la inmunidad mediante inyecciones intravenosas o intramusculares de leptospiras.
Las vacunas validadas de esta forma no siempre han ofrecido protección frente a la infección de campo que
tiene lugar por la exposición de las membranas mucosas del ojo, la boca y el tracto genital a las leptospiras.
Especialmente las vacunas comerciales contra la leptospirosis que contienen la serovariedad Hardjo no
siempre protegen al ganado de la infección conjuntival o de campo con la serovariedad Hardjo (10). Se ha
elaborado un borrador monográfico para la comprobación de la eficacia que especifica el uso de vías de
infección más naturales (30).
2.
Método de producción
La producción se lleva a cabo mediante el cultivo de lotes en fermentadores de tamaño apropiado. Éstos deben
estar equipados con tomas para la adición estéril del cultivo de inóculo, aire y medio de cultivo. Deben contar
también con tomas para el muestreo de forma que puedan supervisarse la pureza y el crecimiento del cultivo de
producción.
Para la producción se emplean preferentemente los medios bajos o libres de proteínas. Sin embargo, algunas
cepas requieren la presencia de proteína animal para alcanzar rendimientos adecuados; esta se suministra
normalmente como BSA. Todos los componentes de los medios que no se degraden por el calor deben
esterilizarse por calor. Esto reduce el riesgo de contaminación por las leptospiras saprofitas que lleva el agua,
que no son eliminadas mediante la esterilización por filtración.
Después de la adición del cultivo de inóculo, se puede supervisar el crecimiento del cultivo de producción a
intervalos frecuentes con relación al comienzo de la fase logarítmica del crecimiento. Una vez observado esto,
entonces se agita y se airea el recipiente. El rendimiento final puede mejorarse con frecuencia mediante la
adición de más Tween 80 al cultivo cuando se observe por primera vez la ralentización en el crecimiento
logarítmico. Un crecimiento adecuado puede requerir hasta 10 días de incubación a 29 ± 1°C.
La inactivación se hace normalmente mediante la adición de formalina, pero también se ha utilizado el fenol, el
mertiolato y la inactivación por calor.
Después de un periodo adecuado de inactivación, el cultivo puede concentrarse y el material proteico superfluo
puede eliminarse por ultrafiltración. Después se pueden mezclar volúmenes iguales de las diferentes cepas que
se van a incluir en la vacuna final y añadir el adyuvante y el conservante, si se considera oportuno.
3.
Control del proceso
Durante la producción, deben tomarse submuestras de forma diaria o dos veces al día y supervisar el
crecimiento de las leptospiras y la ausencia de contaminantes. El crecimiento se supervisa contando leptospiras
en una cámara de conteo en el microscopio de campo oscuro o mediante un nefelómetro. La ausencia de
contaminación se puede establecer mediante el examen microscópico de preparaciones teñidas con Gram de un
cultivo centrifugado.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
349
Capítulo 2.2.4. — Leptospirosis
Inmediatamente antes de la inactivación, debe tomarse una muestra para su comprobación frente a su
anticuerpo homólogo con una MAT. Debe comprobarse que el cultivo inactivado esté libre de leptospiras viables.
Esto se hace inoculando alícuotas de cultivo inactivado en un medio de crecimiento apropiado como el medio de
Jonson & Harris (42), incubándolo a 29 ± 1°C durante al menos 4 semanas y examinándolo semanalmente
mediante microscopía de campo oscuro para detectar la presencia de leptospiras viables.
Después de realizar la mezcla, los niveles de agentes inactivantes libres, de minerales presentes en los
adyuvantes (como el aluminio) y conservantes (como el tiomersal) deben estar dentro de los límites prescritos.
4.
Control de lotes
a)
Esterilidad
Las muestras seleccionadas de la vacuna completa deben probarse para detectar la ausencia de bacterias
viables y de hongos (13, 19, 20, 77). En el Capítulo I.1.5 pueden encontrarse las pruebas para comprobar la
esterilidad y la ausencia de contaminación de materiales biológicos.
b)
Inocuidad
Debe comprobarse la inocuidad de muestras procedentes del producto acabado. Los métodos para realizar
esto se han descrito en otro sitio (12, 19, 78). La prueba debe llevarse a cabo para cada vía de inoculación
indicada en la etiqueta y en dos animales sanos de cada categoría (por ejemplo, animales preñados,
ganado joven) a los que va dirigida la vacuna. Los animales deben ser susceptibles a las serovariedades
empleadas en la vacuna y sus sueros deben estar libres de anticuerpos aglutinantes para esas
serovariedades. A cada animal se le administra una inyección de la vacuna a través de la vía recomendada
con el doble de la dosis recomendada, como se indica en la etiqueta. Los animales se observan durante 14
días y no deben mostrar efectos adversos locales o sistémicos atribuibles a la vacuna.
c)
Potencia
Deben examinarse muestras de la vacuna completa en cuanto a su potencia en hámsters o cobayas. La
potencia se mide normalmente por la capacidad de la vacuna para impedir la muerte del animal cuando se
infecta con 10--10.000 LD50 (dosis letal 50%). Con algunas serovariedades que no son letales para el
hámster o el cobaya, como la serovariedad Hardjo, la potencia se mide frente a la resistencia a la infección
renal cuando los animales se infectan con 10--10.000 ID50 (dosis infecciosa 50%) o mediante la inducción
de un título de anticuerpos adecuado en conejos.
Un protocolo de ejemplo consiste en inyectar un 1/40 de la dosis de perro de la vacuna a diez hámsters
sanos de no más de 3 meses. Después de 15–30 días, cada hámster vacunado y diez sin vacunar de la
misma edad se inyectan intraperitonealmente con una cantidad adecuada de un cultivo virulento de
leptospiras de la serovariedad utilizada para elaborar la vacuna (o una suspensión de tejido de hígado o
riñón tomado de un animal infectado experimentalmente). En el caso de las vacunas bivalentes, cada
serovariedad se examina por separado. Para que la vacuna pase la prueba, al menos 8/10 animales
vacunados deben permanecer con buena salud durante 14 días después de la muerte de los controles.
Otros protocolos pueden referirse a vacunas para ganado vacuno y porcino que contienen cinco o seis
componentes.
Las pruebas in-vitro de potencia para las vacunas contra la leptospirosis se están elaborando basándose en
la cuantificación del antígeno protector de la vacuna utilizando MAbs en un ELISA de captura (61). Estos
ensayos se están estandarizando empleando vacunas de referencia y la correlación con ensayos de
potencia existentes en hámsters o basados en anticuerpos y los datos de la eficacia diana–hospedador.
d)
Duración de la inmunidad
La duración de la inmunidad debe comprobarse en la especie animal a la que la vacuna está dirigida,
empleando las vías naturales de infección (10). La inmunidad vacunal debe persistir al menos durante 6
meses o más, dependiendo de la indicación de la etiqueta.
e)
Estabilidad
Cuando las vacunas se almacenan en las condiciones prescritas, se espera que éstas retengan su potencia
durante 1–2 años. La estabilidad debe evaluarse mediante la determinación de la potencia después del
almacenamiento a 4°C, a temperatura ambiente y a 37°C.
350
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.2.4. — Leptospirosis
5.
Pruebas sobre el producto final
a)
Inocuidad
Véase la Sección C.4.b.
b)
Potencia
Véase la Sección C.4.c.
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NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Leptospirosis (véase Cuadro en la Parte 3 de este
Manual de animales terrestres o consúltese la página Web de la OIE para conseguir la relación más actualizada:
www.oie.int).
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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