M-CIRB-AADC-02 Rev. 02. Manual de Técnicas Especiales en
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Código: M-CIRB-AADC-02 Revisión: 02 Fecha de emisión: 1-Octubre-2012 Página: 1 de 39 Manual de Técnicas Especiales en Hematología 1.- OBJETIVO Realizar de manera correcta las técnicas de hematología para ayudar a obtener un buen apoyo al diagnóstico sobre los diversos tipos de padecimientos hematológicos. 2.- ALCANCE Aplica a todos los pacientes y/o muestras que sean recepcionadas en el AADC y soliciten alguna de estas pruebas. 3.- POLITICAS 3.1.- El horario para la toma y/o recepción de las muestras será de 7:00 a 9:00 de la mañana de lunes a viernes. 3.2.- Para hacer efectiva la toma de la muestra el usuario debe cumplir con las condiciones descritas en el instructivo “Requisitos para toma de muestra”. 3.3.-Para las pruebas especiales que no se terminan el mismo día y/o que para su procedimiento se requieren 3 días se le indicara al paciente cuando vendrá a su toma de muestra. 4.-CONTENIDO a) b) c) d) e) f) g) h) Perfil de Hierro Billirrubinas Hemoglobina libre en suero , plasma y orina Prueba de hemólisis acida HAM, Inulina y Sucrosa para el diagnóstico de hemoglobinuria paroxistica nocturna. Fragilidad osmotica de los Eritrocitos Autohemólisis Investigacion de Hemoglobinas Inestables Inducción de Drepanocitos Código: M-CIRB-AADC-02 Revisión: 02 Fecha de emisión: 1-Octubre-2012 Página: 2 de 39 Manual de Técnicas Especiales en Hematología i) j) k) l) m) n) o) Inducción de cuerpos de Heinz Grupos sanguineos Prueba de Coombs Directo Prueba de la reducción de Metahemoglobina para la detección de la deficiencia de glucosa 6-fosfato deshidrogenasa Hemoglobina Fetal Electroforesis de Hemoglobina Velocidad de sedimentación globular PERFIL DE HIERRO Principio de la determinación de Hierro Sérico. Debido a que, en el plasma, el hierro (TF-Fe+³) se halla unido en su totalidad a la Transferrina (TF), puede ser cuantificado fácilmente a partir de un extracto desproteinizado del mismo. La adición de una substancia precipitante y reductora produce la liberación del hierro a partir de la TF y su reducción a Fe²+, al cual se une posteriormente el derivado de la fenantrolina (sulfato de batofenantronila) o compuesto cromógeno, produciéndose con ello un cambio de color. TF- (Fe³+)2 2 Fe²+ + TF Fe+² + Agente cromógeno Complejo coloreado rosado. La densidad óptica (D.O) o absorbancia del compuesto coloreado es finalmente analizada mediante un espectrofotómetro a 530 nanómetros (nm.). Capacidad total de fijación (CTF) La Transferrina libre del suero se satura con una solución de hierro quedando un exceso de hierro en el suero. Este hierro libre es absorbido con carbonato de magnesio, quedando así en el sobrenadante exclusivamente hierro unido a transferrina cuya concentración nos indica la capacidad total de fijación de hierro del suero. La CTF corresponde a la cantidad de transferrina presente en el plasma que puede ser sustituido por el hierro. Debido a ello la CTF constituye una medida indirecta de la concentración de TF. Debido a que prácticamente todo el hierro circulante se halla unido a la transferrina, la CTF se determina añadiendo un exceso de hierro (capaz de saturar completamente la transferrina) al suero problema y midiendo a continuación el valor de la sideremia, una vez eliminado todo el hierro excedente o libre mediante un quelante o fijador de hierro, que casi siempre es el carbonato de magnesio. Código: M-CIRB-AADC-02 Revisión: 02 Fecha de emisión: 1-Octubre-2012 Página: 3 de 39 Manual de Técnicas Especiales en Hematología Reactivos 1. Solución de hierro a concentraciones de 6, 3 y 1.5 µg/ml. (La concentración de 6 µg/ml es para saturar el Fe, el de 3 es para el standar de CTF y 1.5 µg/ml para stándar de Fe). 2. Carbonato de Magnesio en polvo (200mg) 3. Ácido Ascórbico en polvo 4. Solución Salina 5. Solución de batofenantrolina sulfonatada 0.6% 6. Buffer concentrado de glicina HCL (pH 1.9). el buffer de trabajo debe ser preparado el día de a prueba, para ello a cada volumen de buffer concentrado agregar 2 volúmenes de solución de ácido ascórbico al 0.5% en suero fisiológico Preparación de reactivos a) Buffer concentrado Pesar 3.75gr de glicina, agregar solución salina (150ml aprox.), mezclar bien y ajustar el pH a 1.9 ±0.02 con HCl 0.1 N, aforar a 250ml y guardar en refrigeración. b) Batofenantrolina Disolver 160 mg de batofenantrolina sulfonatada en solución salina aforar a 25ml. c) Solución de Hierro Disolver 175.5 mg de sulfato ferroso amónico hexahidratado en unos 50ml de solución salina, agregar 1.25ml de HCl concentrado, calentar ligeramente y agregar gota a gota una solución muy diluida de permanganato de potasio hasta que la solución adquiera un ligero tinte violeta, aforar a 250ml con solución salina, esta solución es estable indefinidamente y contiene 100µ de hierro por ml. d) Standars A partir de la solución madre preparar un Standar de hierro de 6µ/ml diluyendo 6 ml de dicha solución hasta 100 ml con solución salina, utilizando un matraz aforado. En forma similar preparar la de 3 µg y 1.5 µg. e) Ac. Ascórbico Pesar 0.5 gr y aforar con solución salina c.b.p 100 ml Código: M-CIRB-AADC-02 Revisión: 02 Fecha de emisión: 1-Octubre-2012 Página: 4 de 39 Manual de Técnicas Especiales en Hematología Material biológico 5 ml aprox. de sangre sin anticoagulante. Técnica 1.-Preparación de standars Tubo Blanco.- 0.5 ml de Buffer de Hierro, agregar 1 ml de Ácido ascórbico, añadir 0.5 ml de solución salina. Tubo Estándar de 3.- 0.5 ml de Buffer de Hierro, agregar 1 ml de Ácido ascórbico, añadir 0.5 ml de estándar 3. Tubo Estándar 1.5.- 0.5ml de Buffer de Hierro, agregar 1 ml de Ácido ascórbico, añadir 0.5 ml de estándar 1.5. Agitar y esperar 20 minutos. Leer a 530 nm. (la 1era lectura) Añadir 30 µl de Batofenantrolina. Agitar y esperar 1 hora para realizar la 2da. Lectura. 2.- Determinación de Hierro Sérico Tubo Blanco.- 0.5 ml de Buffer de Hierro, agregar 1 ml de Ácido ascórbico, añadir 0.5 ml de solución salina. Tubo Paciente.- 0.5 ml de Buffer de Hierro, agregar 1 ml de Ácido ascórbico, añadir 0.5 ml de suero paciente. Mezclar vigorosamente e incubar 20 minutos a temperatura ambiente. Leer a 530nm y anotar. Después de la primera lectura añadir 30 µl de batofenantrolina Agitar y luego hacer 2da lectura. Código: M-CIRB-AADC-02 Revisión: 02 Fecha de emisión: 1-Octubre-2012 Página: 5 de 39 Manual de Técnicas Especiales en Hematología 3.-Determinación de la Capacitad total de fijación Tubo paciente. Agregar 0.5 ml de Fe 6µg Añadir 0.5 ml de suero paciente Mezclar y reposar 15 minutos, después añadir carbonato de magnesio (MgCO3) y agitar cada 5 minutos durante 30 minutos, Centrifugar por 20 minutos. Al sobrenadante que se obtiene determinar Hierro Sérico. *Todas las lecturas se hacen a 530 nm. *Se usa solución salina como blanco adicional. Cálculos Fe= 150/St de Hierro x la Absorbancia del paciente = µg/dl CTF= 600/St x la Absorbancia del paciente = µg/dl IS= Hierro Sérico / CTF Valores de referencia Hierro sérico= 60 a 180 µg/dl Capacidad total de fijación=250-380 µg/dl IST= 20-50% Código: M-CIRB-AADC-02 Revisión: 02 Fecha de emisión: 1-Octubre-2012 Página: 6 de 39 Manual de Técnicas Especiales en Hematología BILIRRUBINAS Introducción: La bilirrubina se origina por degradación del grupo Hem de la hemoglobina (Hb), que a su vez aparece en el plasma como consecuencia de la destrucción de los glóbulos rojos (GR) en el Sistema reticuloendotelial . La Hb, una vez liberada en el interior del eritrocito, se combina con las haptoglobinas, proteínas plasmáticas específicas para su transporte. En una primera etapa y tras su libración de la haptoglobina, se forma, por acción de una oxigenasa, un grupo formilo, con lo que se rompe el anillo tetrapirrólico del Hem, formándose el compuesto denominado biliverdina, que en una etapa posterior y por acción de una reductasa se transforma en bilirrubina. Fundamento: Se trata una solución de ácido sulfanílico en HCl diluido con solución de nitrito de sodio, formándose ácido nitroso con el HCl. El ácido nitroso transforma el ácido sulfanílico en solución diazoica inestable de gran capacidad reactiva. El diglucurónido de bilirrubina hidrosoluble (bilirrubina conjugada) se une al ácido sulfanílico diazoico, formándose azobilirrubina de color púrpura con una absorbancia proporcional a la cantidad de bilirrubina conjugada. Tratando la solución con alcohol metílico, la bilirrubina unida a la albúmina (bilirrubina libre) puede reaccionar con el ácido sulfanílico diazoico y la absorbancia del color final es proporcional a la cantidad total de bilirrubina, la diferencia entre los dos valores representa la cantidad de bilirrubina unida a la albúmina. El ácido sulfanílico diazotado reacciona con la bilirrubina, formando diazobilirrubina color rosa proporcional a la bilirrubina. El alcohol se usa para bajar las proteínas y dejar libre la bilirrubina libre. La bilirrubina conjugada, muy polar, reacciona en medio acuoso con el reactivo de diazotación, por lo que se le llamó directa, pues al poner en contacto el suero y el reactivo apareció directamente el color. Sin embargo la bilirrubina libre, poco polar, no da directamente la reacción y es preciso añadir un tercer reactivo que es metanol para que produzca la reacción de diazotación con la consiguiente aparición del color, por este motivo se le llama bilirrubina indirecta. Código: M-CIRB-AADC-02 Revisión: 02 Fecha de emisión: 1-Octubre-2012 Página: 7 de 39 Manual de Técnicas Especiales en Hematología Preparación de Soluciones Stock. 1. Diazo blanco HCl QP 15 mL H2O desionizada cbp 1000 mL Mezclar y aforar. 2. Diazo A III B Ácido sulfanílico 1 g HCl QP 15 mL H2O destilada cbp 1000 mL Disolver el ácido sulfanílico, añadir HCl y aforar. 3. Diazo B III C Nitrito de sodio 500 g. H2O destilada cbp 1000 mL. Disolver y aforar. 4. Diazo reactivo de Erlich 0.1 mL Diazo B + 10 mL H2O destilada. *De la solución anterior tomar 38 µL y añadirle 1.25 ml del Diazo A III B. Técnica (Método de Malloy-Evelyn): 1. Diluir el suero 1:10 con H2O 2. Pipetear en cuatro tubos: Bilirrubina directa Tubo 1: 1.25mL H2O + 0.250mL Diazo blanco + 1mL dilución de suero Tubo 2: 1.25mL H2O + 0.250mL Diazo Erlich* + dilución de suero Código: M-CIRB-AADC-02 Revisión: 02 Fecha de emisión: 1-Octubre-2012 Página: 8 de 39 Manual de Técnicas Especiales en Hematología Bilirrubina total Tubo 3: 1.25mL metanol + 0.250mL Diazo blanco + 1mL dilución de suero Tubo 4: 1.25mL metanol + 0.250mL Diazo Erlich* + 1mL dilución de suero 3. Mezclar e Incubar a temperatura ambiente 20 min protegido de la luz. 4. Leer a 535 nm ajustando a 100% de transmitancia con los tubos 1 y 3. Valores normales: Bilirrubina directa: 0.1 a 0.4 mg/dL Bilirrubina indirecta: 0.2 a 0.8 mg/dL Bilirrubina total: 0.2 a 1.2 mg/dL HEMOGLOBINA LIBRE EN SUERO, PLASMA Y ORINA. INTRODUCCIÓN.- La interpretación correcta de una orina obscura es importante para el diagnóstico de enfermedad hemolítica. Lo primero es excluir la presencia de eritrocitos en la orina por examen microscópico. La presencia de hemoglobina, en ausencia de eritrocitos en orina, es un indicador de hemoglobina libre en la orina. La investigación de hemoglobina libre en suero, plasma y/u orina, es de utilidad para el diagnóstico de hemólisis intravascular. FUNDAMENTO.-La prueba se basa en la actividad tipo peroxidasa de las hemoproteínas tales como la hemoglobina. Esta puede ser detectada por medio de una reacción en la que toman parte el peróxido de hidrógeno y un indicador como la bencidina. MATERIAL BIOLÓGICO. 1 ml de suero, plasma u orina. Código: M-CIRB-AADC-02 Revisión: 02 Fecha de emisión: 1-Octubre-2012 Página: 9 de 39 Manual de Técnicas Especiales en Hematología REACTIVOS. 1. Bencidina al 1% (guardar en frasco ambar) Bencidina ………..1g Ac. Acético Glacial… 90 ml Agua destilada c.b.p…100 ml 2. Agua oxigenada al 1% Agua oxigenada al 30%……… 1 ml Agua destilada cbp…………… 29 ml 3. Solución diluyente Ácido acético Glacial………. 10 ml Agua destilada cbp…………. 100 ml TÉCNICA. Usar 5 ml de sangre (con o sin anticoagulante). Centrifugar a 3,000 rpm durante 10 minutos. Separar el plasma o suero. Usar como suero control el de una persona normal. Código: M-CIRB-AADC-02 Revisión: 02 Fecha de emisión: 1-Octubre-2012 Página: 10 de 39 Manual de Técnicas Especiales en Hematología Proceder de acuerdo al siguiente esquema: Tubo Suero Testigo Bencidina H2O2 al 1% Paciente 10 µL ____ 500 µL 500 µL Testigo ____ 10 µL 500 µL 500 µL Blanco ____ ____ 500 µL 500 µL Mezclar los tubos después de añadir la bencidina. Mezclar nuevamente los tubos después de añadir el Peróxido de Hidrógeno. Incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos. Agregar a cada tubo 5 ml de solución diluyente, mezclar por inversión y Incubar 10 minutos a temperatura ambiente. Leer en el espectrofotómetro a 515 nm, frente al blanco. CÁLCULOS. Hemoglobina libre en mg/dL = [(Abs. del problema)/ (Abs. del estándar)] x (concentración del estándar en mg /dL) Nota: si se realiza alguna dilución tomarla en cuenta para los cálculos. VALORES DE REFERENCIA. Suero o plasma: hasta 5 mg/dL Orina: 0 mg/dL Código: M-CIRB-AADC-02 Revisión: 02 Fecha de emisión: 1-Octubre-2012 Página: 11 de 39 Manual de Técnicas Especiales en Hematología PRUEBA DE HEMÒLISIS CON SUCROSA PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA HEMOGLOBINURIA PAROXÍSTICA NOCTURNA. FUNDAMENTO.-El diagnóstico de la HPN está basado en la demostración de la presencia de glóbulos rojos (GR) sensibles al complemento, evento que es característico de esta enfermedad. Cuando los eritrocitos normales son suspendidos en una solución isotónica de sucrosa no hay lisis osmótica, ya que la sucrosa no penetra en la membrana del eritrocito. Con la presencia de una cantidad de suero, como fuente de complemento, las células de pacientes con HPN se lisan en una solución de sucrosa. Esto se debe a que la baja fuerza iónica de la solución favorece la unión de los componentes del complemento a la membrana del GR, promoviendo la formación de la fracción citolítica del mismo (C5b-9), produciendo hemólisis in vitro. Está prueba se utiliza para el diagnóstico de Hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN). Se debe efectuar a cualquier persona con hemoglobinuria, aplasia medular o en cualquier caso de hemólisis no diagnosticada. MATERIAL BIOLÓGICO. 1. 3ml de sangre con anticoagulantes Citrato de Sodio al 3.8% del paciente. 2. 5ml de sangre sin anticoagulante del paciente para obtener suero. 3. 3ml sangre con anticoagulantes Citrato de Sodio al 3.8% del testigo. 4. 5 ml de sangre sin anticoagulante del testigo para obtener suero (compatible con el paciente). REACTIVOS. 1. Sucrosa al 10 % 2. Solución salina al 0.9%. TÉCNICA. Las muestras sanguíneas obtenidas, tanto del paciente como del testigo, son centrifugadas a 3,000 r.p.m. durante 10 minutos, para la obtención de plasma o suero, y paquete globular (separar el plasma y el suero). Código: M-CIRB-AADC-02 Revisión: 02 Fecha de emisión: 1-Octubre-2012 Página: 12 de 39 Manual de Técnicas Especiales en Hematología Realizar 3 lavados de los GR del paciente y del testigo (sangre con citrato de sodio), con solución salina isotónica y centrifugando 5 minutos a 3,000 rpm después del último lavado decantar y suspender los GR al 50 % en solución salina. 1. En un tubo de 12 x 75 mm. colocar 0.15 ml del suero del testigo compatible con el paciente. 2. Agregar 0.1 ml de la suspensión de glóbulos rojos al 50 % del paciente. 3. Añadir 0.55 ml de sucrosa al 10 %. 4. El 100% de hemólisis se produce añadiendo a la misma cantidad de glóbulos rojos, agua destilada en vez de suero y sucrosa (choque osmótico). 5. Se procede en igual forma con la muestra del testigo normal, utilizando su propio suero. 6. Mezclar y dejar a temperatura ambiente 30 minutos. En ese lapso, mezclar por inversión, las muestras, dos veces. 7. Centrifugar a 3,000 r.p.m. durante 5 minutos. 8. Separar el sobrenadante y hacer hemoglobina libre, tanto a los tubos del paciente como a los tubos del testigo normal. 9. Hacer hemoglobina libre del suero del paciente y del suero del testigo. CÁLCULOS. 1. Calcular la hemoglobina libre del sobrenadante de los tubos del paciente y de los tubos del testigo. 2. Restar la hemoglobina libre del suero del testigo a la prueba del paciente y a la prueba del testigo. 3. Calcular el % de hemólisis de la prueba del paciente y del testigo, tomando los valores de la hemólisis total del paciente y del testigo como el 100% de hemólisis (tubo con agua). VALORES DE REFERENCIA. 0.38 a 1.83 mg /dL de hemoglobina libre 0.3% a 1.75% de hemólisis. Código: M-CIRB-AADC-02 Revisión: 02 Fecha de emisión: 1-Octubre-2012 Página: 13 de 39 Manual de Técnicas Especiales en Hematología INTERPRETACIÓN.-Si hay lisis la prueba es positiva. La magnitud de la lisis dependerá del % de células HPN y del tipo de ellas que predominen HPN-II y HPN-III. Resultados falsos positivos: las células del paciente con anemia megaloblástica o con anemia hemolítica autoinmune pueden lisarse con esta prueba. Por esto, pequeñas cantidades de lisis deben interpretarse con precaución, ya que pueden no representar lisis de células HPN. Resultados falsos negativos: éstos se deben principalmente a la utilización de suero deficiente en completo (sometido a calentamiento). PRUEBA DE HEMÓLISIS CON INULINA PARA EL DIAGNÓSTICO DE HEMOGLOBINURIA PAROXÍSTICA NOCTURNA. FUNDAMENTO.-La inulina cristalina activa el complemento por la vía de C3 o vía alterna. Los GR de pacientes con HPN son sensibles a la acción del complemento, produciéndose hemólisis. MATERIAL BIOLÓGICO. 1. 5 ml de sangre sin anticoagulante del paciente 2. 10 ml de sangre sin anticoagulante del testigo (ABO compatible con el paciente). TÉCNICA. La sangre sin anticoagulante del paciente, así como la del testigo, se centrifugan a 3000 r.p.m. durante 10 minutos y posteriormente se separa el suero. Lavar los glóbulos rojos del paciente y del testigo tres veces con solución salina fisiológica, centrifugando a 3000 r.p.m. por 5 minutos en cada lavado. Después del último lavado, decantar todo el sobrenadante y con el paquete hacer una suspensión de glóbulos rojos al 50 % con solución salina fisiológica. Código: M-CIRB-AADC-02 Revisión: 02 Fecha de emisión: 1-Octubre-2012 Página: 14 de 39 Manual de Técnicas Especiales en Hematología Procedimiento: 1. En un tubo de 12 x 75mm depositar 0.5 ml de la suspensión de glóbulos rojos al 50 % del paciente. Añadir 0.5 ml del suero compatible. Luego añadir 0.1ml de inulina al 10%. 2. En un tubo de 12 x 75 mm depositar 0.5 ml de la suspensión de los glóbulos rojos del paciente, añadir 0.5 ml de agua desionizada para obtener el 100 % de hemólisis. Luego añadir 0.1 ml de inulina al 10%. 3. Hacer el mismo procedimiento con un testigo normal (utilizando su propio suero). 4. Mezclar todos los tubos. 5. Incubar a 37° C durante 45 minutos. 6. Centrifugar a 3000 r.p.m. durante 5 minutos. 7. Separar el sobrenadante y hacer hemoglobina libre por el método de la Bencidina a todos los tubos, tanto al suero del paciente como al suero compatible CÁLCULOS.-Calcular la hemoglobina libre del sobrenadante de los tubos del paciente y de los tubos del testigo. Restar la Hb libre del suero del testigo a la prueba del paciente y a la prueba del testigo. Calcular el % de hemólisis de la prueba del paciente y del testigo, tomando los valores de la hemólisis total del paciente y del testigo como el 100% de hemólisis (tubo con agua). VALORES DE REFERENCIA. De 0 a 2.0 mg/dL de hemoglobina libre. 0% a 2.16% de hemólisis. PRUEBA DE HEMÓLISIS ACIDA (PRUEBA DE HAM) PARA EL DIAGNÓSTICO DE HPN Código: M-CIRB-AADC-02 Revisión: 02 Fecha de emisión: 1-Octubre-2012 Página: 15 de 39 Manual de Técnicas Especiales en Hematología FUNDAMENTO.-En sus observaciones originales, Thomas Ham hizo notar que los eritrocitos del paciente con HPN, eran lisados por suero fresco normal -especialmente cuando el suero era acidificado- y que esta lisis dependía de la presencia de complemento, pero no de anticuerpos. Trabajos posteriores de Wendell Rosse y su grupo demostraron que la presencia del ion Mg favorece la activación del complemento y en pacientes con HPN activa aún más la vía alterna. Añadiendo Cloruro de Magnesio, en pequeñas cantidades, al suero acidificado, se hace mayor la sensibilidad de la prueba. MATERIAL BIOLÓGICO. 1. 5 ml de sangre obtenida con anticoagulante citrato de sodio 3.8 % del paciente y testigo. 2. 5 ml de sangre sin anticoagulante del paciente. 3. Dos tubos de 7 ml de sangre sin anticoagulante del testigo (ABO compatible con el paciente). REACTIVOS. 1. Ácido Clorhídrico 0.2 N HCl H2O c.b.p. 1.6 ml 100.0 ml 2. Cloruro de Magnesio 0.05 M Cloruro de Magnesio 1.01 g Agua desionizada c.b.p. 100 ml TÉCNICA. Centrifugar la sangre del paciente y testigo Separar el suero y plasma del paciente y testigo. Lavar los glóbulos rojos 3 veces con solución salina isotónica. Después del último lavado, decantar todo el sobrenadante y hacer una suspensión al 50% con solución salina isotónica. Código: M-CIRB-AADC-02 Revisión: 02 Fecha de emisión: 1-Octubre-2012 Página: 16 de 39 Manual de Técnicas Especiales en Hematología Descomplementar 1 ml de suero compatible (30 minutos a 56 ° C). Proceder de acuerdo al siguiente esquema con la muestra del PACIENTE Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Suero con C 0.5 ml _____ 0.5 ml 0.5 ml ______ Suero sin C _____ 0.5 ml _______ _____ ______ H2O desionizada _____ _____ _______ _____ ______ HCl 0.1 N 0.05 ml 0.05 ml 0.05 ml _____ 0.05 ml Cl2Mg2 0.05 ml 0.05 ml ______ ______ 0.05 ml GR citratados al 50% 0.05 ml 0.05 ml 0.05 ml 0.05 ml 0.05 ml Realizar el mismo procedimiento con el testigo control. Mezclar todos los tubos e incubar todos los tubos por 1 hora a 37 ° C. Posteriormente centrifugar a 3000 r.p.m. por 5 minutos. Observar si hay hemólisis en el sobrenadante Realizar una determinación de hemoglobina libre a todos los tubos del paciente y del testigo. CÁLCULOS Calcular la hemoglobina libre del sobrenadante de todos los tubos del paciente y del testigo. Restar la Hb libre del suero del testigo a los tubos del 1 al 4 del paciente y del testigo. Calcular el % de hemólisis de la prueba del paciente y del testigo, tomando los valores de la hemólisis total del paciente y del testigo como el 100% de hemólisis (tubo 5 con agua). VALORES DE REFERENCIA. Código: M-CIRB-AADC-02 Revisión: 02 Fecha de emisión: 1-Octubre-2012 Página: 17 de 39 Manual de Técnicas Especiales en Hematología De 0 a 1.78 mg/dL de hemoglobina libre. De 0% a 1.68% de hemólisis. INTERPRETACIÓN. Si hay hemólisis en los tubos 1 y 3 se hace diagnóstico de HPN. En el tubo 2 no deberá haber hemólisis. En el tubo 4 se observa hemólisis parcial si existe HPN. El tubo 5 representa el 100 % de hemólisis. FRAGILIDAD OSMÓTICA DE LOS ERITROCITOS FUNDAMENTO.- Cuando se incuban eritrocitos en un medio hipotónico se favorece un fenómeno de osmosis hacia el eritrocito. Este fenómeno va a depender de la capacidad de regulación de la membrana eritrocitaria. La disminución de esta función llevaría a un estado de hemolisis. La prueba de fragilidad osmótica es útil en el diagnóstico de Esferocitosis hereditaria. MATERIAL BIOLOGICO. 1.- 7ml de sangre desfibrinada estéril del paciente y 7ml de sangre desfibrinada estéril del testigo REACTIVOS. 1. SOLUCIÓN STOCK NaCl.......................................... 180g Fosfato de Sodio-dibásico......... 27.35g Fosfato de Sodio monobásico....4.86g Agua Destilada................c.b.p...2,000 ml Código: M-CIRB-AADC-02 Revisión: 02 Fecha de emisión: 1-Octubre-2012 Página: 18 de 39 Manual de Técnicas Especiales en Hematología 2. SOLUCIÓN DE TRABAJO Se hace a partir de la solución Stock, diluyendo 1:10 con agua desionizada. TECNICA. 1. En un matraz Erlenmeyer de 125 ml que contenga de 10 a 15 pequeñas perlas de vidrio se vierten en 7 ml de sangre del paciente 2. El matraz se agitara manualmente durante 10 minutos ( con movimientos circulares pegado a la mesa ) hasta que no se oiga el ruido de las perlas, 3. Decantar 2 ml de sangre desfibrinada a un tubo de 5 ml estéril. 4. Hacer lo mismos pasos con un testigo normal. 5. Incubar por 24 horas a 37 ° C. 6. Con la sangre restante hacer la prueba de fragilidad osmótica de 30 minutos usando tubos de 13 x 100 estériles de la siguiente manera: PACIENTE 1 2 3 4 5 6 7 8 9 TUBO 0.90 0.85 0.80 0.75 0.70 0.65 0.60 0.55 0.50 BUFFER 4.50ml 4.25ml 4.00ml 3.75ml 3.50ml 3.25ml 3.00ml 2.75ml 2.50ml H20 0.50ml 0.75ml 1.00ml 1.25ml 1.50ml 1.75ml 2.00ml 2.25ml 2.50ml SANGRE 0.05ml 0.05ml 0.05ml 0.05ml 0.05ml 0.05ml 0.05ml 0.05ml 0.05ml Código: M-CIRB-AADC-02 Revisión: 02 Fecha de emisión: 1-Octubre-2012 Página: 19 de 39 Manual de Técnicas Especiales en Hematología 10 11 12 13 14 15 16 0.45 0.40 0.35 0.30 0.20 0.10 0.00 2.25ml 2.00ml 1.75ml 1.50ml 1.00ml 0.50ml 0.00ml 2.75ml 3.00ml 3.25ml 3.50ml 4.00ml 4.50ml 5.00ml 0.05ml 0.05ml 0.05ml 0.05ml 0.05ml 0.05ml 0.05ml Hacer lo mismo con un testigo normal. 7. Mezclar bien las soluciones antes de agregar la sangre desfibrinada y al agregar esta, mezclar por inversión. 8. Incubar 30 minutos a temperatura ambiente. 9. Centrifugar 5 minutos a 3,000 r.p.m. 10. Leer la absorbancia del sobrenadante a 540 nm frente a blanco de agua. 11. Para la fragilidad osmótica de 24 horas se procede de igual manera. 12. Correr un testigo normal simultáneamente al problema. 13. Graficar en papel milimétrico: Abscisas Concentración de Cloruro de Sodio y Ordenadas el % de hemólisis. CÁLCULOS % de Hemólisis = D.O de cada tubo (del 1 al 15)/ D.O del tubo 16 X 100 VALORES DE REFERENCIA. En condiciones normales el 50 % de hemólisis se produce con una concentración de Cloruro de Sodio de 0.445 a 0.40 % a los 30´ y a una concentración de 0.465 a 0.59 % a las 24 horas, si se obtiene el 50 % de hemólisis o más a concentraciones elevadas se considera que hay fragilidad aumentada. Situación contraria puede suscitarse en talasemias y hepatopatías. Código: M-CIRB-AADC-02 Revisión: 02 Fecha de emisión: 1-Octubre-2012 Página: 20 de 39 Manual de Técnicas Especiales en Hematología INTERPRETACIÓN. El aumento de la fragilidad osmótica se observa en la esferocitosis hereditaria haciéndose más evidente el fenómeno después de la incubación. También se observa aumento en la fragilidad osmótica en la enfermedad hemolítica autoinmune. El aumento de la resistencia osmótica es característico de las talasemias, en el déficit de hierro y en cualquier situación en la que se encuentra un aumento en la superficie de los eritrocitos como sucede en las enfermedades hepáticas. INVESTIGACION DE HEMOGLOBINAS INESTABLES POR METODO DE TINCIÓN. FUNDAMENTO.-La incubación de la sangre completa con azul de cresil brillante causa desnaturalización y precipitación de las hemoglobinas inestables, resultando un punteado difuso en los eritrocitos. Estos cuerpos de inclusión consisten en globina degradada, con o sin el Hem unido, como la nucleoproteína del reticulocito. La globina degradada es demostrable en tinciones vitales acuosas, pero no se puede teñir con colorantes que usan alcohol para su fijación. La finalidad de esta prueba es detectar la presencia de Hemoglobina H (β-4) y otras hemoglobinas inestables. Cuando la Hemoglobina H está presente su concentración es, en ocasiones, tan baja que es difícil reconocerla por electroforesis. Sin embargo, como otras hemoglobinas inestables, su presencia se puede demostrar después de precipitarla con un colorante reductor como el azul de cresil brillante. MATERIAL BIOLOGICO. 1. 2ml de sangre con anticoagulante (EDTA) del paciente. 2. 2ml de sangre con anticoagulante (EDTA) del testigo. REACTIVOS. 1. Citrato salino. Citrato de Sodio 0.4g. Solución salina isotónica 100 ml. 2. Azul de cresil brillante al 1 %. Código: M-CIRB-AADC-02 Revisión: 02 Fecha de emisión: 1-Octubre-2012 Página: 21 de 39 Manual de Técnicas Especiales en Hematología Azul de cresil brillante 1g. Citrato Salino c.b.p. 100 ml. TECNICA. 1. Colocar 2 gotas de azul de cresil brillante al 1%. en un tubo de ensayo 2. Añadir 2 gotas de la sangre problema. 3. Incubar a 37 ° C. 4. A los diez minutos de incubación hacer un frotis, contar el % de células positivas. 5. A la hora de incubación hacer un frotis y contar el % de células positivas 6. A las 24 horas hacer un nuevo frotis y contar el % de células positivas. 7. Realizar simultáneamente un testigo normal. CÁLCULOS. Se cuentan de 500 a 1000 células y se calcula el % de células positivas, estas tienen la apariencia de una pelota de golf. INTERPRETACIÓN. Los frotis positivos indican la presencia de hemoglobinas inestables. Cuando el frotis de una hora es positivo, la presencia de hemoglobina H debe ser fuertemente sospechada, ya que las otras hemoglobinas inestables necesitan más tiempo de incubación para ser desnaturalizadas y precipitadas. En el carácter de alfa talasemia, ocasionalmente pueden encontrarse células que contienen cuerpos de inclusión que no corresponden a hemoglobina H. En la enfermedad por hemoglobina H el 50% o más de las células son positivas. Código: M-CIRB-AADC-02 Revisión: 02 Fecha de emisión: 1-Octubre-2012 Página: 22 de 39 Manual de Técnicas Especiales en Hematología INDUCCIÓN DE DREPANOCITOS. FUNDAMENTO.-Los Drepanocitos son hematíes falciformes debido a un proceso de polimeración de la hemoglobina, los eritrocitos adquieren una forma de hoz o media luna. Su aparición es propia de estado homocigoto, aumenta si la sangre se expone a condiciones anaeróbicas y agentes reductores como el metabisulfito. La Hb S es resultante por la sustitución de un aminoácido Ácido glutámico por Valina a nivel del sexto residuo de la cadena beta. MATERIAL BIOLOGICO. 1. 3 ml de sangre con anticoagulante EDTA, del paciente. 2. 3 ml de sangre con anticoagulante EDTA, del testigo. REACTIVOS. 1. Metabisulfito de Sodio al 2% (preparar al momento de usar). TECNICA. En un tubo de ensayo depositar una gota de sangre problema y 3 gotas de metabisulfito de sodio al 2%. Mezclar bien y colocar una gota de esta mezcla en un portaobjetos y colocar un cubreobjetos. Sellar los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas. Hacer lo mismo con la muestra del testigo control Examinar al microscopio a la 1, a las 2 y 24 horas para investigar la presencia de drepanocitos. Informar la prueba negativa o positiva. Código: M-CIRB-AADC-02 Revisión: 02 Fecha de emisión: 1-Octubre-2012 Página: 23 de 39 Manual de Técnicas Especiales en Hematología INDUCCIÓN DE CUERPOS DE HEINZ. FUNDAMENTO.-Los cuerpos de Heinz toman un color púrpura cuando se exponen a colorantes básicos. Los cuerpos de Heinz son precipitado de hemoglobina desnaturalizada que se encuentran pegados a la membrana celular. REACTIVOS. Violeta de metilo al 0.5%, (preparar con solución salina). La solución debe filtrarse antes de su uso. MATERIAL BIOLOGICO. 1. 3 ml de sangre con anticoagulante EDTA del paciente. 2. 3 ml de sangre con anticoagulante EDTA del testigo. TECNICA. Se mezcla usando pipeta Pasteur en un tubo de ensayo 1 gota de sangre y 4 gotas de solución salina de violeta de metilo previamente filtrado, incubar 10 minutos a temperatura ambiente. Se hacen frotis con la mezcla y se observa la suspensión celular entre portaobjetos y cubreobjetos. Los cuerpos de Heinz se tiñen de color púrpura intenso y su tamaño varía desde 1 a 2 micras. Habitualmente se encuentran cerca de la órbita de los eritrocitos y pueden encontrarse varios cuerpos en cada uno. Informar el % de eritrocitos que contienen cuerpos de Heinz contando 1000 glóbulos rojos por lo menos, de acuerdo con el cálculo siguiente: % de eritrocitos que contienen cuerpos de Heinz= No. de eritrocitos con cuerpos de Heinz/1000 X100 DETERMINACIÓN DE GRUPOS SANGUÍNEOS Fundamento.- La determinación de los grupos sanguíneos ha constituido un requisito imprescindible para efectuar una transfusión sanguínea, ya que la incompatibilidad entre donante y receptor puede ocasionar una brusca destrucción de los hematíes transfundidos, con riesgo para la vida del paciente. El conocimiento de los grupos sanguíneos ha sido de gran importancia no solo en el campo de la terapéutica transfusional, sino también en el conocimiento de la genética humana y de la fisiopatología de Código: M-CIRB-AADC-02 Revisión: 02 Fecha de emisión: 1-Octubre-2012 Página: 24 de 39 Manual de Técnicas Especiales en Hematología determinadas anemias hemolíticas producidas por anticuerpos dirigidos contra ciertos antígenos eritrocitarios. De enorme importancia ha sido el conocimiento de la sensibilización fetomaterna para la profilaxis de la anemia hemolítica del recién nacido o eritoblastosis fetal. Debido a la presencia en el plasma de individuos normales de anticuerpos contra grupos sanguíneos (aglutininas naturales) y de antígeno de grupo en los hematíes, es posible determinar el grupo de los mismos ya directamente a partir de hematíes (método directo) o indirectamente a través de las aglutininas plasmáticas (método inverso). Material biológico Sangre sin anticoagulante 3ml (también puede usarse sangre con EDTA) Reactivos Suero anti-A Suero anti-B Suero anti-AB Suero anti-Rh Solución salina fisiológica (NaCl 0.9%) Técnica 1. Centrifugar la sangre 10 minutos a 3000 rpm 2. Separar el suero 3. Tomar unas gotas del paquete de Glóbulos rojos y hacer 3 lavados con solución salina fisiológica. 4. Al término de los lavados preparar una suspensión final al 5%. 5. Luego proceder como sigue: (técnica en tubo) Grupo A.- Una gota del anti-A añadirle una gota de la suspensión de GR al 5% Grupo B.- Una gota del anti-B añadirle una gota de la suspensión de GR al 5% Grupo AB.- Una gota del anti AB, añadirle una gota de la suspensión de GR al 5% Código: M-CIRB-AADC-02 Revisión: 02 Fecha de emisión: 1-Octubre-2012 Página: 25 de 39 Manual de Técnicas Especiales en Hematología Rh.- Una gota del Anti-D, añadirle una gota de la suspensión de GR al 5%. Tubo control.- Añadirle una gota de suero problema y agregarle una gota de la suspensión al 5-% de los GR. Mezclar y centrifugar 30 segundos entre 3200 a 3500 rpm Observar la presencia o ausencia de aglutinacion. El tubo de autocontrol no debe presentar aglutinación Si el Rh presenta aglutinación indica que es positivo, si no se observa aglutinación indica que es un Rh negativo y se realiza Du. Procedimiento para el Du El tubo donde se hizo el Rh se incuba 15 minutos a 37°C Luego se lava 3 veces con solución salina Después de terminar los lavados; se le pone 2 gotas del reactivo de Coombs, se centrifuga 30 segundos y se observa la aglutinación si no hay aglutinación el Rh es negativo Du negativo. Interpretación Un Rh positivo tiene muchos sitios antigénicos y el Rh negativo no tiene estos sitios es Rh -. Un Du+ que tiene pocos sitios que da positivo ese es realmente sangre Rh + PRUEBA DE COOMBS COOMBS DIRECTO FUNDAMENTO.-La presencia de IgG o C3d sobre la superficie eritrocitaria puede ponerse de manifiesto mediante una antiglobulina polivalente obtenida por inmunización de conejos frente a las proteínas del suero humano, o mezclando anticuerpos monoclonales de ratón y contienen anticuerpos Anti-IgG y antiC3d. Esta antiglobulina preparada comercialmente para uso industrial se conoce como Código: M-CIRB-AADC-02 Revisión: 02 Fecha de emisión: 1-Octubre-2012 Página: 26 de 39 Manual de Técnicas Especiales en Hematología “suero de Coombs” y puede tener también antiglobulinas especificas contra determinadas inmunoglobulinas (IgG, IgA, IgM) o fracciones del complemento (C3d). A diferencia de los anticuerpos producidos por el organismo la antiglobulina de coombs es un anticuerpo completo y debido a ello produce una aglutinación de los eritrocitos cuando se hayan recubiertos por anticuerpos incompletos o por el complemento. Por tanto la prueba de Coombs pone de manifiesto la presencia de anticuerpos fijados a la membrana eritrocitaria y que son la causa de la hemólisis in vivo. MATERIAL BIOLÓGICO 5 ml. de sangre coagulada del paciente Eritrocitos grupo O Rh Positivo (D+) REACTIVOS Suero de Coombs (antiglobulina humana) Solución salina fisiológica MÉTODO Centrifugar la sangre del paciente a 3000 r.p.m. Separar el suero del paquete globular. Lavar tres veces el paquete globular del paciente y los eritrocitos O Rh+ con sol. salina fisiológica. En cada lavado centrifugar 5 minutos y decantar. Después de lavados, resuspender al 5% los eritrocitos del paciente y los O Rh+ en sol. salina fisiológica. Proceder de la siguiente manera: Suspensión de GR al 5% Pte. Suspensión de GR O Rh + Suero Paciente Suero Coombs Tubo 1 1 gota Tubo 2 1 gota 2 gotas 2 gotas Tubo 3 1 gota Tubo 4 Tubo 5 1 gota 2 gotas 2 gotas El tubo 3 CENTRIFUGAR 30 seg. a 3200 rpm o 1000 rpm por 1 min. 1 gota 2 gotas Código: M-CIRB-AADC-02 Revisión: 02 Fecha de emisión: 1-Octubre-2012 Página: 27 de 39 Manual de Técnicas Especiales en Hematología Incubar 20 min. 37°C 4°C 37°C 4°C 37°C CENTRIFUGAR 30 seg. a 3200 rpm o 1000 rpm por 1 min. Observar aglutinación y reportar en cruces INTERPRETACION Aglutinación en el tubo 3: Se interpreta POSITIVO y nos indica que hubo sensibilización in vivo de los eritrocitos (COOMBS DIRECTO). TÍTULOS: Realizar diluciones seriadas (1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64) del reactivo de coombs con sol salina y añadir una gota de los eritrocitos del paciente, centrifugar y observar si hay aglutinación y hasta que dilución se presenta. Tubo 1.- Es autocontrol a 37° Tubo 2.- Es autocontrol a 4° Tubo 3.- Coombs directo Tubo 4.- Anticuerpos circulantes a 37° Tubo 5.- anticuerpos circulantes a 4° PRUEBA DE LA REDUCCCIÓN DE METAHEMOGLOBINA (PARA LA DETECCIÓN DE LA DEFICIENCIA DE GLUCOSA –6FOSFATO DESHIDROGENASA). FUNDAMENTO. La deficiencia de glucosa –6-fosfato deshidrogenasa se determina por la inhabilidad de los eritrocitos a acelerar la reducción de metahemoglobina a hemoglobina cuando se incuba con glucosa, nitrito de sodio y azul de metileno. Código: M-CIRB-AADC-02 Revisión: 02 Fecha de emisión: 1-Octubre-2012 Página: 28 de 39 Manual de Técnicas Especiales en Hematología La hemoglobina se oxida a metahemoglobina por el nitrito de sodio. La subsecuente reducción a hemoglobina se logra en presencia de azul de metileno. Esto es a través de la vía de las pentosas o fosfato de pentosa y actuación de la reductasa de meta hemoglobina TPHN REACTIVOS. Cloruro de sodio 0.145 M (salina normal) Glucosa al 5% Tubos con anticoagulante ACD Preparación de nitrito de sodio Nitrito de sodio ----------- 1.250 g H2O desionizada cbp 100 mL (conservarla en botella obscura hacerla mensualmente). Solución de cloruro de azul de metileno 0.0004 M Preparación del cloruro de azul de metileno. Cloruro de azul de metileno trihidratado H2O desionizada cbp 100 mL. Calentar a 37°C para disolución completa. Hacer una dilución 1:10 149.5 mg La dilución 1:10 se logra tomando 10 ml de esta solución en un matraz volumétrico y aforar con solución salina normal. Esta solución 1:10 es al que se usa y deberá hacerse mensualmente. Buffer de fosfato 0.02 M,pH 6.6 (KH2PO4NaOH 0.02 M) Preparación del buffer de fosfatos 0.05 M pH 6.6 : KH2PO4-----3.4 g H2O desionizada cbp 125 ml (mezclarlos bien) NaOH 0.19 M 44.2 mL Código: M-CIRB-AADC-02 Revisión: 02 Fecha de emisión: 1-Octubre-2012 Página: 29 de 39 Manual de Técnicas Especiales en Hematología H2O desionizada cbp 500 ml (mezclarlos bien) Para obtener un buffer de fosfatos 0.02 M a pH 6.6 de la mezcla anterior se toman 400 mL agregarle H2O desionizada cbp 1000 ml . Solución de cianuro de sodio 0.4 M Cianuro de sodio 1 g H2O desionizada cbp 50 ml Guardar en refrigeración 4-8 °C y en recipiente protegido de la luz, debe hacerse cada mes. Ferrocianuro de potasio 0.6 M Preparación de ferrocianuro de potasio 0.6 M Ferrocianuro de potasio 10 g H2O desionizada cbp 50 ml. Guardar la solución en refrigeración a 4-8 ° C en frasco protegido de la luz es estable por varios meses. Buffer de fosfato 0.05 M pH 6.6 ver descripción anterior. METODO. 1. Procedimiento general para prueba de reducción metahemoglobina. Toma de muestra y preparación La sangre venosa puede mezclarse con heparina (0.2 mg por ml) o ACD (0.15 ml de ACD/ml de sangre, la prueba debe hacerse en la siguientes 8 horas de que se obtuvo la sangre y si no se inicia en los siguientes 30 minutos después de haber obtenida la muestra, ésta debe conservarse a 4-8 °C hasta su uso. Oxidación de la hemoglobina a metahemoglobina por nitrito de sodio y la conversión enzimática subsecuente a hemoglobina en presencia de azul de metileno. El ensayo puede hacerse en 3 tubos. Código: M-CIRB-AADC-02 Revisión: 02 Fecha de emisión: 1-Octubre-2012 Página: 30 de 39 Manual de Técnicas Especiales en Hematología P= problema 2mL de sangre N= normal 2mL de sangre tubo Glucosa 5% NaNO2 0.18 M Azul metileno Paciente Control 0.2 ml 0.2 ml 0.1ml 0.1 ml de 0.1 ml 0.1 m Las muestras anteriores se mezclan por inversión 12 veces. Posteriormente se incuba a 37 °C por 180 minutos a los 60 y 120 minutos debe de airarse gentilmente, soplando a través de una pipeta previamente colocada. Debe evitarse la formación de burbujas. **La glucosa se añade porque la reducción de metahemoglobina es dependiente de una adecuada suplementación de azúcar, esto es importante sobre todo si al muestra se tomó con heparina y podría omitirse si se tomó con ACD. También podría agregarse a la sangre 0.1 mL de glucosa al 5 % por mL de muestra inmediatamente después de la toma, si esta se hizo con heparina. I.-Estimación cualitativa de metahemoglobina De la mezcla anterior obtener 0.1 mL y agregar 10 mL 0.02 M buffer de fosfatos Incubar a temperatura ambiente 2.5 o 5 minutos y valorar el color tomando como referencia el standar (T) .Es muy importante el tiempo. Interpretación de la estimación cualitativa de metahemoglobina Individuos normales: El color de la muestra es roja, similar a N* Individuos heterocigotos: el color varía de acuerdo en proporción a la expresión: va de grisáseo a café. Código: M-CIRB-AADC-02 Revisión: 02 Fecha de emisión: 1-Octubre-2012 Página: 31 de 39 Manual de Técnicas Especiales en Hematología Individuos homocigotos: el color es grisáceo a café similar a T. II.- Determinación porcentual y cuantitativa de metahemoglobina La determinación de la metahemoglobina es dependiente del cambio de la densidad óptica a 640 nm de longitud de onda, cuando se añade cianuro de sodio a la solución que contiene metahemoglobina Para el cálculo porcentual es necesario conocer toda la hemoglobina presente (o sea metahemoglobina más hemoglobina) esto se logra determinando la densidad óptica de la solución a 540 nm de longitud de onda después de convertir todo el pigmento a cianometaheglobina con ferrocianuro de potasio y cianuro de sodio. Procedimiento. De la muestra que se incubó por 180 minutos tomar 100 µl y agregar 10 ml de Buffer 0.02 M, mezclar y realizar la primera lectura en un espectrofotómetro 640 nm de longitud de onda. Después de la primera lectura añadir una gota de cianuro de sodio 0.4 M, en el tubo de la muestra y en el blanco, mezclarlo bien y después de 3 min determinar la densidad óptica a 640 nm (lectura 2). Para la tercera lectura se toman 2 mL de las soluciones anteriores y añadirles 8 mL de buffer de fosfatos 0.5 M y añadir una gota de cianuro de sodio 0.4 M y una 1 gota de ferrocianuro de potasio 0.6 M, mezclar bien y leerlo a los 3 minutos a 540nm. CALCULOS. (Lectura 1 – Lectura 2) factor = g/dL de metahemoglobina. Lectura 1 – Lectura 2 x 100 = % de metahemoglobina residual. Lectura 3 Código: M-CIRB-AADC-02 Revisión: 02 Fecha de emisión: 1-Octubre-2012 Página: 32 de 39 Manual de Técnicas Especiales en Hematología INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS. Normales: 5 % o menos Heterocigotos: 5 a 80 % Homocigotos: 80 a 95%. HEMOGLOBINA FETAL (HF: α2, γ2) Fundamento.- La hemoglobina fetal no se desnaturaliza por la incubación durante un minuto con NaOH 0.1 N. La hemoglobina desnaturalizada puede ser extraída de la solución por filtración después de la adición de sulfato de amonio ácido. La densidad óptica a 540 nm de la solución sobrenadante da la medida de la cantidad de hemoglobina fetal presente. En personas normales se encuentra menos del 2% de HbF después de 2 años de edad. En la sangre umbilical los niveles de HbF se encuentran inferiores al 10% de la cantidad total de hemoglobina. Se han encontrado niveles elevado de HbF entre de 2 al 5% en casos de esferocitosis hereditaria, en anemia aplasica, leucemia aguda, anemia mieloblástica, anemia perniciosa no tratada, carcinoma con metástasis en médula ósea. Los niños con anemia aplasica pueden presentar niveles superiores al 10 % de hemoglobina fetal. Aproximadamente el 50% de los pacientes afectados con betatalasemia presentan cantidades de hemoglobina fetal entre el 2 y el 5%. Material Biológico 3 ml de sangre con EDTA paciente y testigo Reactivos Código: M-CIRB-AADC-02 Revisión: 02 Fecha de emisión: 1-Octubre-2012 Página: 33 de 39 Manual de Técnicas Especiales en Hematología NaOH 0.1N Solución de sulfato de amonio ácido Tetracloruro de carbono Reactivo de Drabkin Técnica para obtener el hemolizado 1.-Realizar 3 lavados con solución salina al paquete globular 2.-Medir el volumen de paquete globular que quedo después de haberlo lavado 3.-De esta medida añadir la mitad en agua desionizada al paquete globular lavado. Taparlo perfectamente bien. 4.-Mezclar por Vortex 10 minutos 5.-Agregar la 4ta parte del volumen total de tetracloruro de carbono 6.-Tapar bien y mezclar por vortex 10 minutos. 7.-Centrifugar 20 minutos Proceso de desnaturalización 1.-En un tubo de 10 ml añadir 20 µL del hemolizado del paciente y agregarle 3.2 ml de NaOH 0.1N tapar con papel parafilm y mezclar por 1 minuto. 2.- Añadir 6.8 ml de sulfato de amonio, mezclar y filtrar con papel watman. 3.-Marcar 3 tubos, uno para el paciente, uno para el blanco y el otro para el 100% de hemolisis. 4.- En el tubo paciente añadir 4ml del filtrado y añadirle 1 ml del reactivo de drabkin. 5.-Al tubo para el 100% de hemolisis ponerle 4 ml de agua desionizada y añadirle 20 µL del hemolizado, y agregarle 1 ml del drabkin. 6.-Al tubo para el blanco ponerle 3.2 de NaOH 0.1N, y añadirle 6.8 de NH2SO4 después agregarle 1 ml del reactivo de drabkin.. 7.-Mezclar bien y leer a 540 nm. Para obtener el resultado se usa la siguiente formula: Código: M-CIRB-AADC-02 Revisión: 02 Fecha de emisión: 1-Octubre-2012 Página: 34 de 39 Manual de Técnicas Especiales en Hematología % de Hemoglobina fetal= (D.O paciente o testigo/ D.O del100% de hemolisis) x 25. PRUEBA DE AUTOHEMÓLISIS Fundamento.-La prueba de Autohemólisis a 37°C tiene como finalidad poner de manifiesto la capacidad de los hematíes para mantener su integridad in vitro después de un cierto tiempo (24 hrs) de incubación a 37°C frente a su propio plasma. Esta incubación se realiza tanto en presencia como en ausencia de cantidades suficientes de glucosa con el fin de valorar las necesidades metabólicas de la célula en dichas condiciones. Cuando se incuban eritrocitos en su propio suero se hemolizan gradualmente. Aunque el mecanismo exacto de la lisis es complejo. Se ha visto que la incapacidad de mantener el gradiente de cationes tiene un papel muy importante en la Esferocitosis Hereditaria (EH). En la EH la autohemólisis de la sangre oscila entre 10 al 50% y en condiciones normales, esta excede del 1 al 4%. La adición de glucosa, indispensable para mantener el equilibrio electrolítico de membrana reduce la hemolisis; en la esferocitosis hereditaria la adición de glucosa no corrige la hemolisis. Reactivos 1.-Solución salina Isotónica. 2.-Glucosa (Dextrosa) al 10% estéril Técnica: 1.-En un matraz Erlenmeyer de aprox. 125 ml que contenga de 8 a 10 perlas de vidrio se le vierten de 4 a 6 ml de la sangre del paciente o testigo. 2.-Agitar suavemente hasta dejar de escuchar el sonido de las perlas de vidrio contenidos en el matraz. 3.-Decantar la sangre desfibrinada. 4.-En un tubo estéril de aprox 5 ml colocar 2 ml de la sangre desfibrinada del paciente y añadirle 0.1 ml de glucosa al 10% y a otro tubo solo colocar los 2ml de sangre desfibrinada. Código: M-CIRB-AADC-02 Revisión: 02 Fecha de emisión: 1-Octubre-2012 Página: 35 de 39 Manual de Técnicas Especiales en Hematología 5.- En un tubo estéril de aprox 5 ml colocar 2 ml de la sangre desfibrinada del testigo y añadirle 0.1 ml de glucosa al 10% y a otro tubo solo colocar los 2ml de sangre desfibrinada. (En caso de que no haya suficiente sangre utilizar la mitad.) El resto de la sangre se centrifuga y separar el suero y congelarlo. 5.-Tapar con papel parafilm y mezclar por inversión, luego incubar 48 hrs a 37°C. 6.-Agitar ligeramente de 5 a 6 veces los tubos durante este periodo de incubación; esto es importante porque si no se produce una hemolisis y ya no se puede seguir la prueba 7.-Al término de este tiempo sacar los tubos del Baño María mezclar por Inversión y determinar el Hematocrito de cada uno. 8.-Realizar dilución 1:250 de la sangre Total. (Nota: las diluciones se hacen con solución salina). 9.-La sangre total que queda centrifugar 10 minutos y al sobrenadante hacerle una dilución 1:25 10.-Al suero congelado realizarle una dilución 1:10 11.-El procedimiento anterior se realiza tanto al paciente como al testigo. 12.-Leer a 540 nm las absorbancias a las diluciones hechas. CÁLCULOS 1.-Multiplicar la Absorbancia de cada tubo por el factor de dilución. Sangre Total con glucosa: Absorbancia x 250 Sangre total sin glucosa: Absorbancia x 250 Suero con glucosa: Absorbancia x 25 Suero sin glucosa: Absorbancia x 25 Suero Congelado: Absorbancia x 10 2.-Calcular el % de Hemolisis para los tubos con glucosa utilizando la siguiente formula. Absorbancia 2- Absorbancia 3 (100-Hto/Absorbancia 1)= % de hemólisis. 3.-Calcular el % de hemolisis para los tubos sin glucosa utilizando la misma formula Código: M-CIRB-AADC-02 Revisión: 02 Fecha de emisión: 1-Octubre-2012 Página: 36 de 39 Manual de Técnicas Especiales en Hematología 4.-Proceder de igual forma con los valores del testigo. ELECTROFORESIS DE HEMOGLOBINA Principio.- Cuando se deja pasar una corriente eléctrica continua a través de una solución que posea diferentes componentes cargados eléctricamente estos podrán ser separados. La Hb por ser una molécula de naturaleza proteica, está constituida por aminoácidos que poseen radicales ácidos COO- y básicos NH3+, la carga eléctrica de estos grupos dependerá del pH del medio en que estén disueltos. Las diferentes Hb normales (HbA, HbA2 y HbF), al igual que otras proteínas, cuando se colocan en un medio a un determinado pH, presentan diferente carga eléctrica, por lo que pueden ser separadas, debido a su diferente movilidad. Existe Hb que posee una carga similar, estas migran prácticamente al mismo nivel. Un ejemplo de ellos lo constituyen las Hb A2. HbC, y HbE, las Hb S . Reactivos Buffer TEB pH 8.6 TRIS (Hidroximetilamino metano) = 2.55g EDTA = 0.15g Ácido bórico = 0.8 g H2O destilada c.b.p = 250 ml Técnica 1. Preparación de la muestra Código: M-CIRB-AADC-02 Revisión: 02 Fecha de emisión: 1-Octubre-2012 Página: 37 de 39 Manual de Técnicas Especiales en Hematología A una gota de sangre con EDTA añadirle 4 gotas del hemolizante o agua desionizada, mezclar bien. Incubar a temperatura ambiente 20 minutos 2. Preparación de la membrana En un vaso de precipitado de 100 ml añadir buffer TEB pH 8.6 y sumergir la membrana de acetato de celulosa lentamente para que se moje en forma uniforme (no forme burbujas), dejarla saturar 20 minutos, el resto del buffer vaciarlo a la cámara de electroforesis. 3. Colocar las muestras en los canales del portamuestras con una micropipeta 4. Sacar la membrana del buffer y quitar el exceso de buffer. Dejar que se seque. 5. Tomar las muestras con el peine y colocarlas en el soporte para transferirlas a la membrana 6. colocar la membrana sobre las tiras de papel filtro de tal manera que entre en contacto con el buffer 7. Cerrar la cámara y correr la electroforesis 350 V durante 20 minutos. 8. Terminado el tiempo de la electroforesis, sacar la membrana y colocarlo en un recipiente con colorante PONCEAU por 5 minutos para teñir la membrana. 9. Pasar la membrana a un recipiente con ácido acético al 5% (2 veces) 10. Identificar las bandas obtenidas. E).-VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN GLOBULAR (V.S.G) Introducción.- Cuando se dispone de un tubo de sangre con anticoagulante y se deja en reposo, se observa que después de un cierto tiempo las células sedimentan formándose 3 zonas: la inferior, constituida por los hematíes. Una media, de poco espesor constituida por los leucocitos, otra superior que es el plasma. A Este proceso se denomina velocidad de sedimentación globular y el interés de su estudio reside en el hecho de que la velocidad a que se realiza o velocidad de sedimentación globular (V.S.G) puede variar en diversas situaciones patológicas. En la práctica, la existencia de hematíes de pequeño tamaño (VCM ↓) o un numero muy escaso (anemia intensa) y el marcado aumento de la concentración plasmática de ciertas proteínas, como el fibrinógeno o las globulinas (haptoglobulinas, ß-glicoproteína acida, α1 anti-tripsina, proteína c-reactiva e inmunoglobulinas), son las principales causas de un aumento de la V.S.G. Código: M-CIRB-AADC-02 Revisión: 02 Fecha de emisión: 1-Octubre-2012 Página: 38 de 39 Manual de Técnicas Especiales en Hematología Técnica 1. 2. 3. 4. Se mezcla bien la sangre. Se llena un tubo de Wintrobe con la sangre del paciente hasta la marca 10. Se pone en una superficie plana y totalmente vertical y se deja reposar 1 hora. Al término de la hora se lee la fila opuesta donde se lee el hematocrito o sea la fila de la izquierda. Valor de referencia: 6.- Hombres: hasta 15 mm/h. Mujeres: hasta 20 mm/h. Niños: hasta 10 mm/h. Recién nacidos: 0-2 mm/h. DOCUMENTOS DE REFERENCIA Código (cuando aplique) N/A N/A N/A L-CIRB-AADC-01 Nombre del documento Lugar de almacenamiento Beutler E, Marschall L. Williams Hematology. 5ta. Edición. 1995. Vives J, Aguilar J. Manual de técnicas laboratorio en Hematología. 1ed. Ed. Elsevier. Barcelona España. Laboratorio AADC Laboratorio AADC Sans Sabrafen. Hematología Clínica Laboratorio de AADC Lineamiento para el manejo de Residuos Peligrosos Biológicos infecciosos (RPBI). Laboratorio de AADC Código: M-CIRB-AADC-02 Revisión: 02 Fecha de emisión: 1-Octubre-2012 Página: 39 de 39 Manual de Técnicas Especiales en Hematología 7.- CONTROL DE REVISIONES NIVEL DE REVISIÓN 01 02 SECCIÓN Y/O PÁGINA Todo el documento Todo el documento DESCRIPCIÓN DE LA MODIFICACIÓN Y MEJORA Se eliminó el código de CIPLADE que no correspondía a este manual. FECHA DE MODIFICACIÓN 18- Enero- 2013 Se mejoró la redacción del contenido, se eliminó el índice, introducción, documentos de referencia y el glosario. 18 de Agosto del 2015 Nota: La sección 10 será utilizada a partir de la primera modificación a este documento. La revisión 00, se mantendrá en blanco. Elaboró Revisó Aprobó M en C. Irma Quintal Ortiz Técnico Académico QFB. Gabriela Alonzo Salomón Responsable del AADC Dr. Jorge Zavala Castro Director del CIR Las firmas avalan la responsabilidad de las personas que: elaboran el documento, revisan su adecuación y aprueban para su implementación dentro del Sistema de Gestión de la Calidad de la Universidad Autónoma de Yucatán.
