Contribución al estudio del crecimiento y las posibilidades

CONTRIBUCIÓN AL ESTUDIO DEL CRECIMIENTO
Y LAS POSIBILIDADES DEL APROVECHAMIENTO
TERMOQUÍMICO DE LAS MICROALGAS
NANNOCHLOROPSIS GADITANA Y
NANNOCHLOROPSIS OCULATA
Lucía Catalá Esteve
UNIVERSIDAD DE ALICANTE
Escuela Politécnica Superior
Instituto Universitario de Ingeniería de Procesos Químicos
CONTRIBUCIÓN AL ESTUDIO DEL
CRECIMIENTO Y LAS POSIBILIDADES
DEL APROVECHAMIENTO
TERMOQUÍMICO DE LAS
MICROALGAS NANNOCHLOROPSIS
GADITANA Y NANNOCHLOROPSIS
OCULATA
Memoria para optar al Grado
de Doctor presentada por
Lucía Catalá Esteve
Alicante, 2013
D. ANTONIO MARCILLA GOMIS, Catedrático del Departamento de Ingeniería
Química de la Universidad de Alicante,
CERTIFICA:
Que Dña. LUCÍA CATALÁ ESTEVE, Ingeniera Química, ha realizado bajo mi
dirección, en el Instituto Universitario de Ingeniería de Procesos Químicos de la
Escuela Politécnica Superior de la Universidad de Alicante, el trabajo que con el
título
“CONTRIBUCIÓN
POSIBILIDADES
DEL
AL
ESTUDIO
DEL
APROVECHAMIENTO
CRECIMIENTO
Y
LAS
TERMOQUÍMICO
DE
LAS
MICROALGAS NANNOCHLOROPSIS GADITANA Y NANNOCHLOROPSIS
OCULATA” constituye su memoria para aspirar al Grado de Doctor, reuniendo a
mi juicio, las condiciones necesarias para ser presentada y defendida ante el
Tribunal correspondiente.
Y para que conste a los efectos oportunos, en cumplimiento de la legislación
vigente, firmo el presente certificado en Alicante, a 10 de Octubre de 2013.
Fdo. Antonio Marcilla Gomis
José Antonio Caballero Suárez
Director del I.U. de Ingeniería de Procesos Químicos
i
AGRADECIMIENTOS
En primer lugar quiero expresar mi agradecimiento a mi director de esta
memoria, D. Antonio Marcilla Gomis. Trabajar con él significa no dejar nunca de
aprender, sin sus consejos y su constante apoyo este trabajo no hubiera sido
posible.
También quiero manifestar mi más sincero agradecimiento a mi familia y
especialmente a Raúl, quien desde el primer momento me apoyó y animó a
seguir. Sin su ayuda este trabajo hubiera resultado mucho más duro.
A todos mis compañer@s de habitáculo que han hecho del trabajo en la
Universidad algo agradable y divertido y me han ayudado a seguir en los
momentos más difíciles.
A todas aquellas personas, que de un modo u otro, me han ayudado,
Juan Carlos, Estefanía, Ana, Pilar, los Manolos, José,...
También quiero agradecer a la Generalitat Valenciana que mediante el
Programa VALi+d para investigadores en formación ha permitido mi
contratación y a Repsol YPF que ha proporcionado soporte económico para
esta investigación a través del proyecto Ingenio-2010-CDTI-Sost-CO2-CEN2008-1027.
iii
Dedicado a mi familia, muy
especialmente a mis
padres, Mª Carmen y Paco,
a mi hermano, Juan Pedro,
a mis amigos y a Raúl.
v
Índice
1. RESUMEN ................................................................................................................ 1
2. INTRODUCCIÓN ...................................................................................................... 5
2.1. Las microalgas .................................................................................................... 7
2.1.1. Respuesta a las necesidades humanas ......................................................... 8
2.1.2. Excelente fuente alimenticia ........................................................................... 9
2.1.3. Múltiples aplicaciones en medicina................................................................. 9
2.1.4. Un amplio campo de usos ............................................................................ 10
2.2. Consideraciones generales de los cultivos de microalgas ................................. 12
2.3. Métodos de cultivo de microalgas ..................................................................... 16
2.3.1. Estanques abiertos ....................................................................................... 17
2.3.2. Fotobiorreactores ......................................................................................... 18
2.4. Medios de cultivo ............................................................................................... 21
2.5. Dinámica del crecimiento .................................................................................. 22
2.6. Tipos de cultivo ................................................................................................. 23
2.6.1. Cultivo estático ............................................................................................. 23
2.6.2. Cultivo continuo ............................................................................................ 25
2.6.3. Cultivo masivo .............................................................................................. 25
2.7. Aprovechamiento energético de las microalgas ................................................. 27
2.7.1. Biomasa ....................................................................................................... 27
2.7.1.1. Tipos de biomasa .................................................................................... 28
2.7.1.2. Ventajas .................................................................................................. 30
2.7.1.3. Inconvenientes ........................................................................................ 30
2.7.1.4. Procesos de conversión de la biomasa en energía ................................. 31
2.7.2. Pirólisis de biomasa ..................................................................................... 32
2.7.2.1. Análisis termogravimétrico ...................................................................... 33
2.7.2.1.1. Aplicaciones ....................................................................................... 34
2.7.3. Pirólisis de microalgas .................................................................................. 35
2.8. Análisis cinético ................................................................................................. 36
2.8.1. Aspectos generales sobre procedimientos de análisis cinético ................ 41
3. OBJETIVOS ........................................................................................................... 49
vii
4. MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................................. 53
4.1. Materiales empleados ....................................................................................... 55
4.1.1. Microalgas .................................................................................................... 55
4.1.2. Medio de cultivo y escalado de cepas .......................................................... 57
4.1.3. Reactores ..................................................................................................... 59
4.1.3.1. Fotobiorreactores situados en una sala blanca ....................................... 59
4.1.3.2. Reactores abiertos situados en el exterior............................................... 60
4.1.3.3. Fotobiorreactores de tipo de columna de burbujas situados en el exterior61
4.1.3.4. Fotobiorreactores de tipo airlift situados en el exterior............................. 62
4.2. Equipos y técnicas analíticas utilizadas ............................................................. 64
4.2.1. Determinación de la evolución del crecimiento celular .................................. 64
4.2.2. Control de la contaminación y conteo celular................................................ 65
4.2.3. Determinación de la distribución del tamaño de partícula ............................. 67
4.2.4. Determinación de nutrientes en el medio de cultivo ...................................... 68
4.2.4.1. Determinación de fósforo soluble ............................................................ 68
4.2.4.2. Determinación de nitratos ....................................................................... 70
4.2.5. Determinación de la composición bioquímica de la biomasa ........................ 70
4.2.5.1. Determinación de las proteínas ............................................................... 70
4.2.5.2. Determinación de los carbohidratos ........................................................ 71
4.2.5.3. Determinación de los lípidos transesterificables ...................................... 72
4.2.5.4. Determinación de los lípidos totales ........................................................ 74
4.2.6. Análisis termogravimétrico............................................................................ 76
4.2.7. Pyroprobe conectado a un cromatógrafo de gases con detector masas ....... 76
5. PUBLICACIONES .................................................................................................. 79
5.1. Kinetic model for microalgae concentration and size distribution: Application to
Nannochloropsis gaditana .......................................................................................... 89
5.2. Study of the evolution of the biochemical composition of outdoor cultures of the
microalgae Nannochloropsis oculata as a function of the initial nitrate concentration 119
5.3. Estimation of CO2 stripping/CO2 microalgae consumptions ratios in bubble
column photobioreactor using the analysis of the pH profiles. Application to
Nannochloropsis oculata microalgae culture ............................................................. 159
5.4. Thermogravimetry and Py-GC/MS techniques as fast qualitative methods for
comparing the biochemical composition of Nannochloropsis oculata samples obtained
under different culture conditions .............................................................................. 167
viii
5.5. Comments on “Thermogravimetric analysis of microalgae combustion under
different oxygen supply concentrations (Appl. Energy 88 (2011) 3189-3196)” .......... 177
5.6. Review of thermochemical conversion of microalgae ....................................... 183
6. CONCLUSIONES ................................................................................................. 195
7. BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................... 203
Índice de tablas ....................................................................................................... 219
Índice de figuras ..................................................................................................... 221
ix
x
RESUMEN
1
Resumen
Las microalgas son microorganismos biológicos versátiles que ofrecen
numerosas ventajas con respecto a la biomasa lignocelulósica terrestre para la
producción de biocombustibles renovables. Las microalgas tienen una eficiencia
fotosintética más alta requiriendo por tanto una menor extensión de tierra. También
pueden ser ricas en aceite (triglicéridos) y cosechadas con mayor frecuencia debido a
su rápida tasa de crecimiento. Por otra parte, las microalgas pueden cultivarse en
climas variables, con aguas tanto salobres como contaminadas, y los reactores
pueden situarse en tierras marginales no aptas para otros cultivos. Como resultado de
ello, los problemas ambientales relacionados con los cambios globales en los patrones
de uso del suelo son menores para el cultivo de algas. Las microalgas también pueden
eliminar el nitrógeno, fósforo y metales pesados de las aguas residuales. Por lo tanto,
el cultivo de algas se puede acoplar con la biorremediación de aguas residuales.
Además, las instalaciones de cultivo de microalgas se pueden integrar con las
centrales eléctricas que utilicen combustibles fósiles y, de este modo, aprovechar el
CO2 que se obtiene en los gases de combustión para la producción de biomasa algal a
través de la fotosíntesis.
Por todo lo comentado anteriormente, resulta de gran interés llevar a cabo
diferentes estudios, que engloben desde la mejora del sistema de cultivo, incluida la
etapa de concentración, a la caracterización de la biomasa generada para, de esta
manera, encontrar la mejor alternativa para su posterior utilización.
En el presente trabajo de investigación se ha incidido fundamentalmente en
dos de los aspectos más importantes a tener en cuenta para la obtencion de biomasa
(y/o energía) a partir de las microalgas:
a) Estudio de las condiciones necesarias para hacer posible el crecimiento de
dichos microorganismos.
b) Caracterización de la biomasa generada.
Para ello, el trabajo se ha dividido en las siguientes etapas:
1. Estudio del uso de la distribución de tamaño de partícula de la microalga
Nannochloropsis gaditana para obtener información sobre el crecimiento
del cultivo. Modelado cinético de la concentración celular y la distribución
de tamaño de partícula.
3
Resumen
2. Estudio de la evolución de la composición bioquímica de los cultivos de la
microalga Nannochloropsis oculata al aire libre en función de la
concentración inicial de nitratos en el medio y de la etapa de crecimiento.
3. Cálculo de la relación de CO2 consumido por la microalga Nannochloropsis
oculata y el CO2 perdido por arrastre en un fotobiorreactor de tipo columna
de burbujas utilizando el análisis de los perfiles de pH.
4. Estudio del empleo de técnicas de termogravimetría y Py-GC/MS como
métodos cualitativos rápidos para la comparación de la composición
bioquímica de muestras de Nannochloropsis oculata obtenida bajo
diferentes condiciones de cultivo.
5. Revisión del estado del arte de la conversión termoquímica de microalgas.
4
INTRODUCCIÓN
2. INTRODUCCIÓN
2.1. Las microalgas
2.1.1. Respuesta a las necesidades humanas
2.1.2. Excelente fuente alimenticia
2.1.3. Múltiples aplicaciones en medicina
2.1.4. Un amplio campo de usos
2.2. Consideraciones generales de los cultivos de microalgas
2.3. Métodos de cultivo de microalgas
2.3.1. Estanques abiertos
2.3.2. Fotobiorreactores
2.4. Medios de cultivo
2.5. Dinámica del crecimiento
2.6. Tipos de cultivo
2.6.1. Cultivo estático
2.6.2. Cultivo continuo
2.6.3. Cultivo masivo
2.7. Aprovechamiento energético de las microalgas
2.7.1. Biomasa
2.7.1.1. Tipos de biomasa
2.7.1.2. Ventajas
2.7.1.3. Inconvenientes
2.7.1.4. Procesos de conversión de la biomasa en energía
2.7.2. Pirólisis de biomasa
2.7.2.1. Análisis termogravimétrico
2.7.2.1.1. Aplicaciones
2.7.3. Pirólisis de microalgas
2.8. Análisis cinético
2.8.1. Aspectos generales sobre procedimientos de análisis cinético
2
Introducción
2.1. LAS MICROALGAS
Las microalgas son individuos unicelulares o pluricelulares, cuyas células
funcionan independientemente, realizando todas las funciones vitales. La alimentación,
en general, es fotosintética y por tanto, son capaces de transformar la luz solar en
energía química mediante la fotosíntesis oxigénica y, además, asimilar carbono en
forma de dióxido de carbono.
Como estos organismos contienen clorofila y otros pigmentos, tienen una gran
eficiencia fotosintética, entre 2 y 5 veces superior a las plantas superiores (Thomas y
col., 1984). Por este proceso, que regula el contenido de oxígeno y dióxido de carbono
en la atmósfera, las microalgas contribuyen a aliviar el efecto invernadero y
proporcionan el material orgánico presente en los ecosistemas acuáticos (Barsanti y
Gualtieri, 2006).
Estos organismos unicelulares que habitan diversos ambientes acuáticos,
desde el trópico a las regiones polares, son reconocidos como fuente de bioproductos
de gran importancia económica. Constituyen una fuente directa de alimento,
medicamentos, forraje, fertilizantes y combustible y son indicadores de contaminación
(Spolare y col., 2006).
Se evalúa que son más de 10.000 las especies de microalgas existentes, por lo
que representan un recurso prácticamente inexplorado, ya que solamente unas 100
especies se han estudiado con detalle desde el punto de vista fisiológico y bioquímico
(Olaizola, 2003).
La biotecnología de microalgas ha avanzado en aspectos tan diversos como la
alimentación humana y animal, las industrias farmacéutica y cosmética, la producción
de fertilizantes, el acondicionamiento de suelos para la agricultura y la depuración de
aguas residuales (Pinto y col., 2003; Hirooka y col., 2003).
Los cultivos de microalgas poseen numerosas ventajas: a gran escala son
simples en su implementación y según para qué procesos pueden resultar
interesantes desde el punto de vista económico. Muchas microalgas crecen en
ambientes salinos e hipersalinos, por lo que no compiten con la agricultura tradicional
por los limitados recursos de tierra arable y agua dulce.
Conforme se desarrolla la tecnología para su cultivo, los costes de producción
se abaratan de manera sorprendente, lo que significa un estímulo para los países
7
Introducción
emergentes, ya que pueden resolver el problema de falta de alimento por un lado, y
por otro, generar recursos.
2.1.1.
RESPUESTA A LAS NECESIDADES HUMANAS
Las microalgas han sido aprovechadas a lo largo de la historia de la humanidad
pero en el siglo XX se han investigado formas de uso industrial.
Las diferentes líneas de investigación han estado influidas por los factores
socioeconómicos de cada época. Así, a partir de la escasez de alimento en el mundo,
entre los años 1935 y 1940, surge el interés de desarrollar sistemas algales tendentes
a encontrar nuevas fuentes de proteínas. Fue la primera aplicación desarrollada a nivel
industrial (Venkataraman y col., 1985).
La Biotecnología Algal se inicia cuando científicos alemanes comienzan a
cultivar microalgas masivamente para obtener lípidos y proteínas, reemplazando a la
proteína animal y vegetal convencional para consumo directo del ganado y del
hombre, acortando la ineficiente cadena alimenticia proteica que existía en aquel
entonces.
Entre los años 1965 y 1980 la motivación del cultivo de microalgas es la calidad
del medio ambiente. Se comprueba que las microalgas pueden jugar un papel
importante en la transformación de la materia orgánica de las aguas residuales en
biomasa y agua tratada que puede utilizarse para riego (Shelef y col, 1978).
Durante el periodo 1955-1970 se realizaron avances en la tecnología del cultivo
de algas y se ampliaron los objetivos de su utilización.
Entre los años 1975 y 1982, la crisis del petróleo hizo dirigir la investigación
hacia fuentes alternativas como la aplicación biológica de la energía solar. Dado que
constituyen un eficiente sistema de utilización de la energía solar, existe un interés
continuo en la tecnología de la producción microalgal (Benemann y col, 1977, 1998).
En los últimos años se ha sumado el interés por la obtención de biomoléculas
de alto valor añadido y se estima que el 60 % de los recursos algales requeridos para
la obtención de los ingredientes de base en la industria química extractiva o alimenticia
proviene de cultivos de microalgas (Harun y col., 2010).
8
Introducción
2.1.2.
EXCELENTE FUENTE ALIMENTICIA
Cuando los científicos descubrieron la rapidez con que crecen estos
microorganismos, con un rendimiento por unidad de superficie 20 veces mayor que la
soja, la describieron como el alimento del futuro.
Poseen concentraciones de nutrientes poco comunes, superior a la observada
en cualquier especie vegetal. Un gramo diario de microalga, constituye una alternativa
para complementar la deficiente dieta actual debido a su alto contenido en vitaminas,
proteínas y polisacáridos (Carballo-Cárdenas y col., 2003).
Su contenido en proteína es, por término medio, del 65 %, superior al de otros
alimentos naturales. Pero aún es mayor su elevada concentración de vitaminas,
minerales y otros nutrientes. La ingestión de 1 a 3 gramos al día de los productos que
contienen algas aporta cantidades apreciables de beta-caroteno (provitamina A),
vitaminas E y complejo B, hierro y oligoelementos.
El alga es muy energizante, más que el ginseng y el polen de abeja. La
combinación de las propiedades energizantes y supresoras del apetito hacen del alga
un complemento muy valioso en los tratamientos de ayuno. Además limpia las toxinas
del organismo a través del sistema linfático y es idónea para el entrenamiento de alta
intensidad (Herikson, 1994).
También contiene ácido gammalinoleico, estimulante de las prostaglandinas,
importantes sustancias corporales que regulan la actividad de todas las células del
organismo, incluidas las del corazón, la piel, el sistema circulatorio y la musculatura.
2.1.3.
MÚLTIPLES APLICACIONES EN MEDICINA
En el campo de la medicina humana y veterinaria es considerable su potencial
debido a que algunas especies producen compuestos bioactivos (García-Casal y col.,
2009). Algunas especies contienen luteína, que puede reducir el riesgo de diversos
tipos de cáncer, enfermedades cardiacas y oftalmológicas. Otros compuestos de
microalgas presentan también acción anticarcinogénica, antimutagénica, estimuladora
del sistema inmune, reductora de hipertensión, desintoxicante y reductora de
colesterol.
9
Introducción
Se han obtenido también substancias bactericidas y anticoagulantes de la
sangre, terapéuticas y preventivas de colitis ulcerativas, gastritis o anemia entre otras
múltiples aplicaciones.
Un derivado de la clorofila microalgal se emplea para la confección de una
crema dental enriquecida que elimina la bacteria causante de las caries dentales.
También se han desarrollado cremas que las incluyen por sus propiedades
antioxidantes y protectoras de los rayos ultravioletas (Spolaore y col., 2006).
En Japón se han realizado experimentos de administración de ficocianina (FC),
un pigmento azul presente en algunas especies, a ratones con cáncer de hígado con
buenos resultados (Dainippon Ink and Chemicals, 1983). En Estados Unidos, se ha
patentado un método para el tratamiento de la ateroesclerosis (forma más común de
arteriosclerosis) y del cáncer mediante FC inyectada (Henry y Morcos, 1989).
Recientemente se han realizado estudios de la utilización de extracto de FC
donde se plantea que se inhibe la replicación del VIH (Chamorro y col., 2002).
Otro pigmento de las microalgas es el beta-caroteno, antioxidante y eficiente
captador de radicales. Disminuye el riesgo de cataratas y de enfermedades
degenerativas de la retina relacionadas con el envejecimiento (Liang y col., 2004).
Por otra parte las microalgas representan una importante reserva de ácidos
grasos omega-3, cuyos derivados son efectivos en la prevención y el tratamiento de
ciertas patologías, incluyendo enfermedades coronarias, agregación plaquetaria,
niveles anómalos de colesterol, y algunos tipos de cáncer, siendo además altamente
prometedores para el tratamiento de ciertas formas de enfermedad mental (Olaizola,
2003).
2.1.4.
UN AMPLIO CAMPO DE USOS
Además de su uso forrajero, las microalgas se utilizan en la acuicultura en
todos los estadíos de crecimiento de los bivalvos, para estados larvales de algunas
especies de crustáceos y para estadíos tempranos de algunas especies de peces por
su alto contenido proteico. También se utilizan en acuicultura para incrementar con sus
pigmentos el color de salmónidos y crustáceos (Baeza-Rojano y col., 2013).
El incremento en el uso comercial de pigmentos naturales de origen microalgal
durante los últimos años se debe a las regulaciones cada vez más restrictivas sobre el
10
Introducción
uso de aditivos sintéticos en la industria alimentaria (Olaizola, 2003; Liang y col.,
2004).
Se usan como colorantes en la industria alimenticia en margarinas, mayonesas,
jugos de naranja, helados, quesos y productos de panificación (Olaizola, 2003; Liang y
col., 2004).
Algunos pigmentos algales se utilizan como aditivos en forrajes para
incrementar la pigmentación de la carne de pollo y de las yemas de huevos, así como
para aumentar la fertilidad del ganado (Elwinger y col., 1997).
Las microalgas se utilizan también como biofertilizadoras y acondicionadoras
del suelo. Recubren rápidamente los suelos removidos o quemados y reducen el
peligro de erosión (Trejo y col., 2012).
Hay especies de microalgas que favorecen la fijación de nitrógeno, y han hecho
posible, por ejemplo, el cultivo de arroz en terrenos anegados durante siglos sin
adición de fertilizantes (Whitton y Roger, 1989). Otras se emplean para reemplazar a
la cal en los abonos compuestos.
Otras especies han sido utilizadas para la purificación de biogás ya que ellas
consumen el dióxido de carbono como fuente de carbono inorgánico y además
controlan el pH del medio (Mann y col., 2009).
También son empleadas como eliminadoras de metales pesados tales como
cobre, cadmio y plomo, así como los hidrocarburos clorados (De-Bashan y Bahsan,
2010).
La utilización de microalgas constituye un método muy conocido para tratar
aguas residuales, sin muchas inversiones adicionales, aportando el oxígeno que
resulta tan necesario a las bacterias aeróbicas en su papel degradador de la materia
orgánica (www.oilgae.com).
Hoy es indiscutible la importancia económica de las microalgas como
organismos de los cuales se pueden extraer productos beneficiosos.
Sus múltiples aplicaciones promueven la necesidad de generar, a través de
actividades informativas y científicas, estrategias de trabajo a corto o medio plazo que
permitan la conservación del medio ambiente y la generación de ingresos a partir de
su producción industrial.
11
Introducción
2.2. CONSIDERACIONES
GENERALES
DE
LOS
CULTIVOS DE MICROALGAS
Muchos factores contribuyen al desarrollo óptimo de los cultivos de microalgas,
algunos de éstos afectan a las características del crecimiento
(Torrentera y Tacon,
1989).
Los parámetros más importantes que regulan el crecimiento de las microalgas
son: la cantidad de nutrientes, la luz, el pH, la agitación, la salinidad y la temperatura.
Los parámetros óptimos, así como los rangos tolerados dependen de cada especie.
Además, los diversos factores pueden ser interdependientes y un parámetro que es
óptimo para un conjunto de condiciones puede no serlo necesariamente para otro
(Coutteau, 1996).
Los recipientes de cultivo más comúnmente usados se construyen con
materiales no tóxicos como las placas Petri, matraces Erlenmeyer, matraces
Ferenback, etc… adecuados para cultivos de laboratorio. Para cultivos a gran escala
los recipientes de plástico, madera y hormigón son los más recomendables,
incluyendo los estanques rústicos en áreas rurales que son los sistemas más
económicos
(Torrentera y Tacon, 1989).
En cultivos masivos la agitación por aireación es un factor muy importante
(Fábregas y col., 1995). Es necesaria para la homogenización de los nutrientes,
asegurarse de que todas las células están expuestas a la luz de la misma manera,
evitar la estratificación térmica y la sedimentación de las microalgas y, sobre todo
mejorar el intercambio de gases entre el medio de cultivo y el aire. Este último es de
primordial importancia ya que el aire contiene la fuente de carbono para la fotosíntesis
en forma de dióxido de carbono. Dependiendo de la escala del sistema de cultivo, la
mezcla se logra moviendo todos los días con la mano (tubos de ensayo, erlenmeyers),
aireación (bolsas, tanques), o el uso de ruedas de paletas y bombas de chorro
(estanques). Sin embargo, debe tenerse en cuenta que no todas las especies de algas
puede tolerar una mezcla vigorosa (Coutteau, 1996).
Además, la adición de CO2 amortigua el agua contra los cambios de pH, como
resultado del balance CO2/HCO3-, hecho muy importante puesto que el intervalo de pH
para las especies de algas más cultivadas está entre 7 y 9. El colapso completo del
cultivo, debido a la interrupción de muchos procesos celulares, puede ser
consecuencia de la incapacidad de mantener un pH aceptable. En el caso de alta
12
Introducción
densidad de cultivo de algas, el CO2 procedente del aire (que contiene 0,03% de CO2)
burbujeado a través del cultivo limita el crecimiento de las algas y la adición de dióxido
de carbono permite corregir el pH creciente, que puede alcanzar valores límite de
hasta un pH de 10 durante el crecimiento de algas (Coutteau, 1996).
Otro factor importante es la penetración de la luz en el cultivo. Al igual que con
todas las plantas, las microalgas realizan la fotosíntesis, es decir, asimilan carbono
inorgánico para su conversión en materia orgánica. La luz es la fuente de energía que
impulsa esta reacción y en este sentido la intensidad, la calidad espectral y el
fotoperíodo deben ser considerados (Coutteau, 1996).
La intensidad de la luz juega un papel importante, pero los requisitos varían
mucho con la profundidad del cultivo y la densidad del cultivo de las algas: a mayores
profundidades y concentraciones de células, la intensidad de la luz debe ser
incrementada para penetrar a través del cultivo (por ejemplo, una intensidad de 1.000
lux puede ser adecuada para Erlenmeyers, para grandes volúmenes pueden ser
necesarios 5,000-10,000 lux). La luz puede ser natural o suministrada por tubos
fluorescentes. Una intensidad de la luz demasiado alta (por ejemplo, la luz directa del
sol, un recipiente pequeño cerca de la luz artificial) puede causar fotoinhibición.
Además, se debe evitar el sobrecalentamiento debido tanto a la iluminación natural y
artificial. Los tubos fluorescentes que emiten ya sea en el azul o el espectro de luz roja
son más adecuados, ya que son las partes más activas del espectro de luz para la
fotosíntesis (Coutteau, 1996).
El fotoperíodo es un factor que regula la división celular; en algunas especies
la reproducción asexual (división) ocurre durante el período de luz y éste es acelerado
bajo iluminación continua. En contraste, las especies formadoras de auxosporas
(esporas sexuales) dan lugar a células del mismo tamaño y esto ocurre en el período
de oscuridad. Por lo tanto, el período de iluminación puede ajustarse de acuerdo a los
objetivos del cultivo: el fotoperíodo continuo (horas de iluminación prolongada)
produce crecimientos rápidos, un fotoperíodo con horas de luz y oscuridad semejante
al fotoperíodo solar mantiene un crecimiento normal y saludable (Torrentera y Tacon,
1989).
La temperatura óptima para los cultivos está generalmente entre 20 y 24 °C,
aunque esto puede variar con la composición del medio de cultivo y las especies
cultivadas. Las especies más comúnmente cultivadas de microalgas toleran
temperaturas de entre 16 y 27 °C (Coutteau, 1996). Por ejemplo, para muchas
13
Introducción
especies de diatomeas, como la Phaeodactylum Tricornutum, la temperatura óptima
oscila entre los 15 y 22 °C, pocas especies de esta familia crecen a más de 28 °C. Las
clorofíceas pueden soportar altas temperaturas; un ejemplo es el cultivo masivo a la
intemperie de Chlorella saccharophila, cuyas temperaturas oscilan entre 12,5 – 30 °C
(Hirata y col., 1974, 1975, 1977; Torrentera, 1983). Una temperatura inferior a 16 °C
ralentizará el crecimiento, mientras que si es superior a 35 °C será letal para un
número importante de especies. Si es necesario, los cultivos de algas pueden ser
enfriados por un flujo de agua fría sobre la superficie del recipiente de cultivo o
mediante aire refrigerado por unidades de acondicionamiento.
En la Tabla 2.1 se muestran las características de algunas de las especies de
microalgas unicelulares utilizadas en acuicultura para la nutrición de moluscos y
crustáceos.
Tabla 2.1. Características de algunas de las especies de algas unicelulares utilizadas en
acuicultura (Coll Morales, 1983).
Género
Tiempo de
división (h)
Temperatura
óptima (ºC)
Diámetro
medio ()
Phaeodactylum (diatomea)
10
25
10.4
Skeletonema (diatomea)
13.1
18
>20
Dunaliella (clorofícea)
24
16
17.8
Chlorella (clorofícea)
7.7
25
5
Tetraselmis (clorofícea)
18
18
18.4
Monochrysis (crisofícea)
15.3
20-25
10
Isochrysis (crisofícea)
30.2
20
10.2
Estas especies se han utilizado en acuicultura marina dados su valor nutritivo y
de digestibilidad, además de su capacidad para crecer en cultivos masivos. La
duración del ciclo celular y los requerimientos de temperatura son susceptibles de
variación mediante selección de especies (Torrentera y Tacon, 1989).
En cada caso habrá que estudiar los requerimientos particulares de la especie
y de la variedad que se vaya a cultivar en las condiciones concretas de cultivo que se
van a utilizar, por lo que estos datos son sólo orientativos (Kinne, 1977).
14
Introducción
Además del control de los parámetros antes mencionados, es necesario
considerar que para el establecimiento de un sistema de producción de microalgas es
importante el dominio de las técnicas de aislamiento, purificación y mantenimiento de
cepas, así como el conocimiento de la fisiología, ciclo de vida, bioquímica, etc… de las
especies para determinar la viabilidad de su cultivo (Torrentera y Tacon, 1989).
Los cultivos estériles de microalgas se pueden obtener a partir de las
colecciones de cultivos especializados. El aislamiento de especies de algas no es
sencillo debido al tamaño de las células y la asociación con otras especies. Existen
varias técnicas de laboratorio para aislar las células individuales, como la dilución en
serie, placas sucesivas en medios de agar y la separación con pipetas capilares. Las
bacterias pueden ser eliminadas del cultivo por lavado o con la presencia de
antibióticos (Coutteau, 1996).
La colección de cepas de algas debe ser cuidadosamente protegida contra la
contaminación durante la manipulación y la regulación deficiente de la temperatura.
Para reducir los riesgos, se suele mantener dos tipos de cultivo, uno para abastecer a
los cultivos iniciadores del sistema de producción y otro que sólo se somete a las
operaciones necesarias para su mantenimiento (Coutteau, 1996).
La contaminación con bacterias, protozoos u otras especies de algas es un
problema grave para los cultivos monoespecíficos de microalgas. Las fuentes más
comunes de contaminación son el medio de cultivo (agua de mar y los nutrientes), el
aire (a partir de la entrada de aire, así como el medio ambiente), el recipiente de
cultivo y el cultivo inicial (Coutteau, 1996).
El agua de mar utilizada para el cultivo de algas debe estar libre de organismos
que puedan competir con las algas unicelulares, como otras especies, zooplancton
fitófago, o bacterias. La esterilización del agua de mar puede realizarse por cualquiera
de los métodos físicos (filtración, tratamiento en autoclave, pasteurización, la
irradiación UV) o químicos (cloración, acidificación, ozonización). No se requiere
tratamiento del agua cuando se utiliza agua salada subterránea obtenida a través de
perforaciones, ya que suele estar libre de organismos vivos y pueden contener sales
minerales suficientes para llevar a cabo el cultivo de algas, sin enriquecimiento. En
algunos casos el agua de pozo contiene altos niveles de sales de amonio y hierro, este
último precipita después de la oxidación en el aire (Coutteau, 1996).
Una fuente común de contaminación es la condensación en las líneas de aire
que albergan ciliados. Por esta razón, las líneas de aire deben mantenerse secas, y
15
Introducción
tanto el aire como el dióxido de carbono deben ser filtrados a través de un filtro en
línea de 0,3 o 0,5 micras antes de entrar en el cultivo. Para grandes volúmenes de
aire, se pueden construir unidades de filtración usando algodón y carbón activo
(Coutteau, 1996).
Para concentrar las microalgas se puede emplear la floculación química o la
centrifugación. Los productos tales como sulfato de aluminio y cloruro férrico hacen
que las células coagulen y precipiten en el fondo o floten en la superficie. La
centrifugación de grandes volúmenes de cultivo de algas se realiza generalmente
mediante un separador, el caudal se ajusta de acuerdo con las especies de algas y la
tasa de centrifugación del separador. Las células se depositan en las paredes de la
cabeza de la centrífuga como una pasta espesa de algas, que luego se resuspenden
en un volumen limitado de agua. La suspensión resultante se puede almacenar
durante 1-2 semanas en el refrigerador o congelador. En este último caso, los agentes
crioprotectores (glucosa, dimetilsulfóxido) se añaden para mantener la integridad
celular durante la congelación. Sin embargo, la ruptura celular y la duración limitada
siguen siendo las principales desventajas de la conservación a largo plazo de la
biomasa de algas (Coutteau, 1996).
2.3. MÉTODOS DE CULTIVO DE MICROALGAS
Se han llevado a cabo un número creciente de estudios para explorar las
técnicas, procedimientos y procesos de producción de grandes cantidades de biomasa
algal (Huesemann y col., 2009; Spolaore y col., 2006). Los estanques abiertos y los
fotobiorreactores cerrados son las dos técnicas de cultivo más frecuentemente
empleadas. Los estanques abiertos son menos favorables a causa de la limitación
existente para controlar la contaminación por depredadores mientras que los
fotobiorreactores proporcionan un sistema fácil para controlar los nutrientes necesarios
para el crecimiento, temperatura, CO2 y O2 disuelto y pH, y para prevenir la
contaminación. Sin embargo, los fotobiorreactores tienen un alto coste inicial y en ellos
sólo se pueden cultivar determinadas especies de microalgas por el alto estrés
hidrodinámico al que éstas se ven sometidas. Por lo tanto, el tipo de cultivo elegido es
un factor importante que se debe tener en cuenta para conseguir una producción
óptima de una especie de microalgas específica (Tabla 2.2).
16
Introducción
Tabla 2.2. Selección de especies de microalgas y su método de cultivo (Harun y col.,
2010).
Especie/grupo
Método de cultivo
Spirulina, Arthrospira
Estanques abiertos, lagos
platensis/Cyanophyta
naturales
Chlorella
Estanques abiertos, tubos
Babel y col., 2002; Ramos
vulgaris/Chlorophyta
de vidrio, fotobiorreactores
de Ortega y col., 1986
Dunaliella salina/
Estanques abiertos,
Tafreshi y col., 2006; Zhu y
Chlorophyta
fotobiorreactores
col., 2008
Haematococcus pluvialis/
Estanques abiertos,
Olaizola, 2000; Vega-
Chlorophyta
fotobiorreactores
Estrada y col., 2005
Phorphyridium
cruentum/Rhodophyta
Fotobiorreactor tubular
Referencia
Grobbelaar, 2007
Muller-Feuga y col., 2003;
Sun y col., 2008
Muriellopsis sp./
Estanques abiertos,
Blanco y col., 2007; Del
Chlorophyta
fotobiorreactores
Campo y col., 2001
2.3.1.
ESTANQUES ABIERTOS
El empleo de estanques abiertos como método para cultivar microalgas es
bastante común. Los estanques abiertos existen de muchas formas, teniendo cada
una de ellas ciertas ventajas e inconvenientes. Los tipos de estanques que son más
comúnmente usados en investigación y en la industria son los de tipo “carrusel”, los
estanques grandes y poco profundos y los tanques circulares. La localización en la
que éstos se sitúan es un factor crítico en la determinación del tipo de estanque y la
especie de microalga elegidos.
Debido a la falta de control en los sistemas abiertos, el éxito del cultivo se
convierte en una función del clima local, contribuyendo de forma significativa la
localización (Masojidek y col., 2008). Los estanques abiertos están limitados por
parámetros de crecimiento clave, como la intensidad de luz, la temperatura, el pH o la
concentración de oxígeno disuelto. La contaminación por depredadores es otro
aspecto importante a tener en cuenta cuando se trabaja con estanques abiertos,
17
Introducción
pudiendo ésta limitar el cultivo a especies de microalgas que pueden crecer bajo
condiciones severas.
Muchos estudios han valorado la posibilidad del cultivo de microalgas en
sistemas abiertos. Lee (2001) afirmó que únicamente una limitada variedad de
especies de microalgas resistentes a ser cultivadas bajo condiciones severas pueden
crecer en estanques abiertos (Dunaliella-alta salinidad, Spirulina-alta alcalinidad y
Chlorella-alta nutrición). Dunaliella salina (DS) es una de las especies con las que se
han conseguido mejores resultados entre las que han sido empleadas para la
producción de carotenoides, los cuales la protegen de las condiciones climatológicas
intensas en los sistemas abiertos (Tafreshi y col., 2006). Hase y col. (2000) lograron
una eficiencia fotosintética estable para la Chlorella sp. y la Chlorophuta sp. en
sistemas carrusel. Además Blanco y col. (2007) emplearon Muriellopsis sp. para
producir células ricas en luteína en tanques abiertos agitados con una rueda de
paletas. Estas células pueden ser usadas como colorantes y aditivos para la comida,
en acuicultura y granjas avícolas. Asimismo, estos autores concluyeron que el
rendimiento era bastante similar al de los sistemas cerrados.
Además, el coste de cultivo de las microalgas es un elemento fundamental a la
hora de comparar los sistemas abiertos con los cerrados. Está ampliamente
demostrado que el coste de cultivo en los estanques es significativamente menor que
en los reactores cerrados. Los costes de construcción, operación y mantenimiento de
los estanques son menores que en los fotobiorreactores (http://www.oilgae.com), su
diseño es menos técnico y más escalable. Por todo ello, a pesar de que los estanques
tienen una concentración de biomasa menor, son una opción de cultivo competitiva.
2.3.2.
FOTOBIORREACTORES
Actualmente, la investigación en el diseño de fotobiorreactores para cultivar
microalgas está muy desarrollada. Los fotobiorreactores permiten un control mejor que
los sistemas abiertos en la mayoría de los parámetros de cultivo (Chisti, 2007). La
Tabla 2.3 representa la comparación de los métodos de cultivo de microalgas. El
ambiente controlado de los fotobiorreactores permite conseguir una productividad más
alta, siendo ésta el indicador más importante del éxito de la tecnología detrás del
reactor. Es difícil comparar la productividad de los reactores debido a las diferentes
especies y escalas empleadas.
18
Introducción
Los fotobiorreactores más utilizados son los tubulares y los planos. En
comparación con otros reactores, los tubulares se consideran más apropiados para el
cultivo exterior. La gran superficie de iluminación que se obtiene mediante tubos
translúcidos es la causa principal que los hace adecuados para el exterior. Los tubos
pueden
ser
colocados
con
distintas
configuraciones
dependiendo
de
las
especificaciones del sistema. Las más comunes son en línea recta y en espiral. La
geometría del reactor también es importante, por ejemplo, los tubulares pueden
ponerse de forma vertical, horizontal o inclinada. La principal diferencia entre estas
configuraciones es que la vertical permite una transferencia de materia mayor y una
disminución en la energía necesaria, mientras que los horizontales son más
escalables, pero requieren una superficie de terreno mayor (Ugwu y col., 2008).
Tabla 2.3. Comparación de los métodos de cultivo de microalgas (Harun y col., 2010).
Factor
Estanques abiertos
Fotobiorreactores
Espacio necesario
Alto
Bajo
Pérdida de agua
Muy alta
Baja
Pérdida de CO2
Alta
Baja
Concentración O2
Baja
Acumulación
Temperatura
Muy variable
Requiere enfriamiento
Estrés hidrodinámico
Bajo
Alto
Limpieza
Poca
Necesaria
Contaminación
Alta
Ninguna
Calidad de la biomasa
Variable
Reproducible
Coste de cosecha
Alto
Bajo
Se han llevado a cabo diversos estudios en los que se presenta la aplicación
de fotobiorreactores tubulares para el cultivo de microalgas, tanto de tipo vertical
(Babcock y col., 2002) como horizontal (Richmond y col., 1993) y helicoidal (Hall y col.,
2003). Por otro lado, los fotobiorreactores planos son utilizados por su pequeño
camino óptico, longitud a través de la cual la luz penetra en el cultivo, puesto que
ayuda a mantener densidades celulares superiores en más de un orden de magnitud
19
Introducción
comparado con los otros fotobiorreactores (Hu y col., 1996). Además, este tipo de
reactores son favorables debido a que el consumo de energía es menor, la capacidad
de transferencia de materia es mayor, se acumula menos el oxígeno, no se generan
volúmenes a los que no le llega la luz en comparación con otros reactores y tienen una
eficiencia fotosintética mayor (Gitelson y col., 1996). Se necesita un diseño del reactor
apropiado para obtener la máxima masa celular. Varios diseños de fotobiorreactores
planos se han construido: de vidrio (Qiang y col., 1998), de PVC transparente grueso
(Ramos de Ortega y col., 1986), en forma de V (Iqbal y col., 1993) e inclinados (Hu y
col., 1996). En las Figuras 2.1-2 se representan diagramas esquemáticos de
fotobiorreactores tubulares y de estanques tipo carrusel.
Figura 2.1. Configuraciones de reactores cerrados para el cultivo de microalgas. Reactor
tubular en espiral (Arriba) (Acién Fernández y col., 2001). Reactor tubular horizontal
(Abajo) (Harun y col., 2011).
20
Introducción
Figura 2.2. Configuración de reactor abierto para el cultivo de microalgas. Estanques tipo
carrusel (Harun y col., 2011).
2.4. MEDIOS DE CULTIVO
Se han desarrollado diferentes medios para el cultivo de microalgas que van
desde las fórmulas para enriquecer el agua de mar natural, hasta el uso de medios
artificiales que permitan resultados constantes en contraste con los resultados tan
variables que brinda el uso del agua de mar natural que, entre otros factores, depende
del lugar de donde se obtiene, y del tiempo de almacenamiento (Torrentera y Tacon,
1989).
Los medios artificiales se usan principalmente para fines experimentales, ya
que como se ha mencionado, proporcionan resultados constantes, aunque existen
algunas especies que no crecen en medios artificiales por factores desconocidos. Las
principales fórmulas utilizadas van desde el agua de Miguel, que data de 1910,
desarrollada por Allen-Nelson; el medio de End-Schereiber de 1934, hasta fórmulas
específicas para familias de algas como la fórmula del Laboratorio Haskins de Nueva
York para diatomeas, (Provasoli y col., 1975; Matthiesen y col., 1966; Guillard, 1973;
Droop, 1975, 1979; Schöne, 1982).
El fitoplancton se desarrolla y multiplica en función de las condiciones
fisicoquímicas del medio. En términos generales, los macronutrientes o factores
limitantes del crecimiento, carbono, nitrógeno, fósforo, silicio, magnesio, potasio y
21
Introducción
calcio, se requieren en cantidades relativamente grandes, mientras que los llamados
micronutrientes (hierro, manganeso, cobre, zinc, sodio, molibdeno, cloro y cobalto) se
necesitan en menores cantidades (Torrentera y Tacon, 1989).
Existen otros medios que incluyen en su composición sustancias orgánicas
(vitaminas, aminoácidos) necesarias para aquellas especies de microalgas autótrofas,
que no sintetizan por medio de la fotosíntesis este tipo de compuestos y resultan
factores que pueden limitar su crecimiento; tal es el caso de Platimonas, Chrysophytas
y algunas Bacillariophyceas (Torrentera y Tacon, 1989).
2.5. DINÁMICA DEL CRECIMIENTO
El crecimiento de un cultivo de microalgas se caracteriza por cinco fases
(Coutteau, 1996) (Figura 2.3):
Fase de retraso o inducción (1): En esta fase, sólo se produce un pequeño
aumento en la densidad celular. Los cultivos inoculados con algas que crecen
exponencialmente
tienen
fases
cortas
de
retraso,
lo
que
puede
reducir
considerablemente el tiempo necesario para su escalado. El retraso en el crecimiento
se atribuye a la adaptación fisiológica del metabolismo de las células para el
crecimiento, tales como el aumento de los niveles de enzimas y metabolitos implicados
en la división celular y la fijación de carbono.
Fase exponencial (2): Durante la segunda fase, la densidad celular aumenta
como una función del tiempo t de acuerdo con una función logarítmica: Ct = C0.et,
donde Ct y C0 son la concentración de células en el tiempo t y 0, respectivamente, y 
es la tasa de crecimiento específico. Esta tasa depende principalmente de la especie
de alga, la intensidad de la luz y la temperatura.
Fase de la tasa de disminución del crecimiento (3): La división celular se
ralentiza cuando nutrientes, luz, pH, dióxido de carbono u otros factores físicos y
químicos comienzan a limitar el crecimiento.
Fase estacionaria (4): En la cuarta etapa, el factor limitante y la tasa de
crecimiento están equilibrados, lo que da como resultado una densidad celular
relativamente constante.
La muerte o la fase de "accidente" (5): Durante la etapa final, se deteriora la
calidad del agua y los nutrientes se agotan a un nivel capaz de sostener el
22
Introducción
crecimiento. La densidad celular disminuye rápidamente y el cultivo colapsa
eventualmente.
Figura 2.3. Cinco fases de crecimiento de los cultivos de microalgas.
En la práctica, los accidentes de cultivo pueden ser causados por una variedad
de razones, incluyendo el agotamiento de un nutriente, la deficiencia de oxígeno,
recalentamiento, alteración del pH, o la contaminación. La clave para el éxito de la
producción de algas es mantener todos los cultivos en la fase exponencial de
crecimiento. Además, el valor nutritivo de las algas producidas es inferior una vez que
el cultivo está más allá de la fase 3 debido a la digestibilidad reducida, la composición
deficiente, y la posible producción de metabolitos tóxicos.
2.6. TIPOS DE CULTIVO
En general se distinguen tres tipos de cultivo (Coutteau, 1996):
2.6.1.
CULTIVO ESTÁTICO
El cultivo estático consiste en el desarrollo del cultivo hasta fase de crecimiento
exponencial y la utilización del volumen total del mismo. Generalmente estos cultivos
se usan con fines de bioensayo o bien para transferencia a volúmenes mayores (ver la
Figura 2.4, que ilustra la secuencia del cultivo). Normalmente cuando se alcanza una
23
Introducción
densidad óptima de células en un cultivo, se utiliza parte del mismo como inóculo de la
siguiente fase.
Fase I
Stock primario obtenido de
laboratorio (Cepario)
(Agitar
los
recipientes 2
ó 3 veces al
Fase II
Inoculación aséptica de
plancton en agua esterilizada,
día)
filtrada y enriquecida. El
plancton permanece en
contendores de stock.
Crecimiento sin aire
Fase III
Inoculación aséptica de un
stock de cultivo de agua marina
Cultivo
esterilizada en autoclave,
intermedio
filtrada y enriquecida.
Crecimiento de 4 días. Flujo
bajo de aire
Fase IV
Inoculación del cultivo en agua
Cultivo
marina filtrada, enriquecida e
masivo
irradiada. Crecimiento de 2
días. Flujo bajo de aire
Figura 2.4. Secuencia de cultivo en sistema estático.
24
Introducción
2.6.1.
CULTIVO CONTINUO
De acuerdo a Kubitschek (1970), un cultivo continuo es un sistema de flujo en
el cual las células individuales están suspendidas en un volumen constante en un
estado de equilibrio dinámico, establecido por una eliminación de cultivo y adición de
medio nutritivo por unidad de tiempo en aparatos llamados turbidostatos y
quimiostatos, donde la eliminación de cultivo y la adición del medio de cultivo fresco se
hace de forma continua y automática.
Cuando se requiere de grandes cantidades de células a intervalos frecuentes
para alimentar especies en cultivo (peces, crustáceos, moluscos), los cultivos
semicontinuos o continuos proporcionan un gran número con mayor consistencia en
forma uniforme y constante. En estos cultivos es importante determinar la
concentración óptima de los nutrientes por unidad de tiempo en relación a la tasa de
dilución o cosecha del cultivo. Cuando se alcanza el estado de equilibrio del sistema,
la producción es máxima. En la Figura 2.5 se muestra un ejemplo de cultivo
semicontinuo.
Figura 2.5. Esquema de un cultivo semicontinuo.
2.6.2.
CULTIVO MASIVO
Se considera cultivo masivo a aquellos cuya producción es a gran escala en
tanques u otros recipientes de gran volumen.
Existen muchas alternativas para la producción de microalgas en cultivo
masivo, desde la utilización de tanques de plástico, madera, hormigón hasta los
25
Introducción
estanques rústicos, así como la utilización de fertilizantes minerales de tipo agrícola o
la gran variedad de escretas de ganado que se emplean como fuentes de nutrientes.
En relación a la utilización de luz artificial o natural, ésta dependerá del tipo de
infraestructura con que se cuente.
El control de la temperatura será necesario en función del tipo de microalga en
cultivo y de la región climática donde se establezca el mismo. En las Figuras 2.6-7 se
presentan dos ejemplos de sistemas de cultivo masivo.
Figura 2.6. Cultivo masivo a la intemperie de algas unicelulares. Estanques de tipo
Raceway en Cyanotech (Hawaii) (izquierda). Reactores tubulares de la empresa Salata
GmbH (Ritschenhausen, Germany) (derecha).
26
Introducción
Figura 2.7. Esquema del invernadero de Wachapreague (USA). Cultivo masivo con
temperatura controlada en invernadero con ventilador.
2.7. APROVECHAMIENTO
ENERGÉTICO
DE
LAS
MICROALGAS
2.7.1.
BIOMASA
Biomasa es toda sustancia orgánica renovable de origen tanto animal como
vegetal, por tanto, las microalgas entrarían en esta definición. La energía de la
biomasa proviene de la energía que almacenan los seres vivos. En primer lugar, los
vegetales al realizar la fotosíntesis, utilizan la energía del sol para formar sustancias
orgánicas. Después los animales incorporan y transforman esa energía al alimentarse
de las plantas. Los productos de dicha transformación, que se consideran residuos,
pueden ser utilizados como recurso energético.
Desde principios de la historia de la humanidad, la biomasa ha sido una fuente
energética esencial para el hombre. Con la llegada de los combustibles fósiles, este
recurso energético perdió importancia en el mundo industrial y en la actualidad los
principales usos que tiene son domésticos.
En Europa, Francia es el país que mayor cantidad de biomasa consume (más
de 9 millones de toneladas equivalentes de petróleo (tep)) seguido de Suecia. España
ocupa el sexto lugar dentro de esta lista con 3,6 millones de tep (http://www.eurobserver.org/).
27
Introducción
Los factores que condicionan el consumo de biomasa en Europa son:
 Factores geográficos: las condiciones climáticas de la región indicarán las
necesidades de calor que requiera cada zona y con qué biomasa podrán ser cubiertas.
 Factores energéticos: por la rentabilidad o no de la biomasa como recurso
energético. Esto dependerá de los precios y del mercado energético en cada
momento.
 Disponibilidad del recurso: éste es el factor que hay que estudiar en primer
lugar para determinar el acceso y la temporalidad del recurso.
Dentro del Plan de Energías Renovables en España 2011-2020 se establece
como objetivo conseguir una cuota mínima del 20% de energía procedente de fuentes
renovables en el consumo final bruto de energía de la Unión Europea, el mismo
objetivo establecido para España, y una cuota mínima del 10% de energía procedente
de fuentes renovables en el consumo de energía en el sector del transporte en cada
Estado miembro para el año 2020. Sin embargo, teniendo en cuenta las conclusiones
adoptadas por los Jefes de Estado y de Gobierno de la Unión Europea, podría
materializarse un aumento en el objetivo de reducción de GEI hasta alcanzar el 30%
en 2020. En ese caso habrá que modificar los objetivos nacionales de reducción de
estos gases y las políticas para conseguirlos, lo que podría suponer la revisión de los
objetivos del PER.
2.7.1.1. Tipos de biomasa
Existen diferentes tipos de biomasa que pueden ser utilizados como recurso
energético. Aunque se pueden hacer multitud de clasificaciones, se ha escogido la
clasificación más aceptada, la cual divide la biomasa en cuatro tipos diferentes:
biomasa natural, residual seca y húmeda y los cultivos energéticos.
1. BIOMASA NATURAL
Es la que se produce en la naturaleza sin ninguna intervención humana. El
problema que presenta este tipo de biomasa es la necesaria gestión de la
adquisición y transporte del recurso al lugar de utilización. Esto puede provocar
que la explotación de esta biomasa sea inviable económicamente.
2. BIOMASA RESIDUAL (SECA y HÚMEDA)
Son los residuos que se generan en las actividades de agricultura (leñosos y
herbáceos) y ganadería, en las forestales y en la industria maderera y
28
Introducción
agroalimentaria, entre otras, pudiendo ser todavía utilizados y considerados
subproductos. Como ejemplo podemos considerar el serrín, la cáscara de
almendra, el orujillo, las podas de frutales, etc… Se denomina biomasa residual
húmeda a los vertidos llamados biodegradables, es decir, las aguas residuales
urbanas e industriales y los residuos ganaderos (principalmente purines).
3. CULTIVOS ENERGÉTICOS
Estos cultivos son implantados y explotados con el único objetivo de la
obtención de biomasa.
Los cultivos energéticos se pueden clasificar de muchas formas, por el tipo
de suelo donde crecen, por el tipo de producto que se cosecha, etc. Según su
aprovechamiento final, los cultivos se pueden clasificar en:
•
Cultivos oleaginosos para la producción de aceites transformables en
biodiésel.
•
Cultivos alcoholígenos para la producción de bioetanol a partir de
procesos de fermentación de azúcares.
•
Cultivos lignocelulósicos, para la generación de biomasa sólida
susceptible de su uso para distintas aplicaciones:
–
Térmicas, como climatización de edificios, agua caliente sanitaria, y
aplicaciones industriales (preparación de cualquier fluido de proceso).
–
Fabricación de combustibles más elaborados, con un valor añadido a la
biomasa bruta, como astillas o pelets.
–
Cogeneración generalmente asociada a una actividad industrial, o
generación eléctrica simple.
– Obtención de biocarburantes de segunda generación.
El cultivo de cereales para el aprovechamiento energético es bastante
discutido. En primer lugar porque la rentabilidad de estos cultivos no es muy grande. Y
en segundo lugar, por la posible competencia que podrían ejercer sobre los cultivos
tradicionales.
Una posible solución a este problema sería la utilización de cultivos acuáticos
como el jacinto de agua (Nimphaea sp.), que posee una de las productividades de
biomasa más elevadas (un centenar de toneladas de materia seca por hectárea y por
29
Introducción
año). Otra posibilidad podría ser la utilización de ciertas algas microscópicas
(micrófitos), que tendrían la ventaja de permitir un cultivo continuo y productividades
anuales de hasta 150 toneladas por hectárea (Sialve y col. 2009).
2.7.1.2. Ventajas
La utilización de la biomasa con fines energéticos tiene las siguientes ventajas
medioambientales:
 Disminución de las emisiones de CO2. Aunque para el aprovechamiento
energético de esta fuente renovable tengamos que proceder a una combustión, y el
resultado de la misma sea agua y CO2, la cantidad de este gas causante del efecto
invernadero, se puede considerar que es la misma cantidad que fue captada por las
plantas durante su crecimiento. Es decir, que no supone un incremento de este gas en
la atmósfera (Prins y col., 2007).
 No emite apenas contaminantes sulfurados ni nitrogenados, ni partículas
sólidas (Hughes, 2000).
 Si se utilizan residuos de otras actividades como, por ejemplo, la cáscara de
almendra o el hueso de aceituna, esto se traduce en un reciclaje y disminución de
residuos. Por tanto, canaliza los excedentes agrícolas alimentarios, permitiendo el
aprovechamiento de las tierras de retirada.
 Puede provocar mayor actividad económica en el medio rural.
 Disminuye la dependencia externa del abastecimiento de combustibles.
En la actualidad la tecnología aplicada a la biomasa está sufriendo un gran
desarrollo. La investigación se está centrando en los siguientes puntos:
1. Aumentar el rendimiento energético de este recurso.
2. Minimizar los efectos negativos ambientales de los residuos aprovechados y de las
propias aplicaciones.
3. Aumentar la competitividad en el mercado de los productos.
4. Posibilitar nuevas aplicaciones de gran interés como los biocombustibles.
2.7.1.3. Inconvenientes
 Tiene un mayor coste de producción frente a la energía que proviene de los
combustibles fósiles.
30
Introducción
 Menor rendimiento energético en comparación con los combustibles fósiles.
 Producción estacional.
 La materia prima es de baja densidad energética lo que quiere decir que ocupa
mucho volumen y por lo tanto, puede tener problemas de transporte y
almacenamiento.
 Necesidad de acondicionamiento o transformación para su utilización.
2.7.1.4. Procesos de conversión de la biomasa en energía
Existen diferentes métodos que transforman la biomasa en energía
aprovechable. Los dos métodos más utilizados en este momento, son los
termoquímicos y los biológicos.
- Métodos termoquímicos
Estos métodos se basan en la utilización del calor como fuente de
transformación de la biomasa. Están muy desarrollados para la biomasa seca, sobre
todo para la paja y la madera.
Se utilizan los procesos de:
Combustión
La combustión es la conversión de la biomasa por el oxígeno del aire, en esta
reacción se libera agua y gas carbónico, y puede ser utilizada para la calefacción
doméstica y para la producción de calor industrial. Por tanto, mediante este proceso se
pueden obtener varias formas de energía útil (Sanchez-Silva y col., 2013).
Pirólisis
La pirólisis es una degradación térmica en ausencia de un agente oxidante, de
este modo, los compuestos volátiles de la materia prima sólida carbonosa se
vaporizan en reacciones primarias por la acción del calor, dejando un residuo
carbonoso y cenizas. La pirólisis siempre produce gas, vapor que puede condensar y
recuperarse como líquido y un residuo sólido (Bridgwater y col., 2002).
Gasificación
La gasificación es la conversión de materia prima carbonosa en un gas con un
valor energético mayor, mediante su oxidación parcial a temperatura elevada
(Bridgwater y col., 2002).
31
Introducción
El gas producido en el proceso de gasificación tiene ventajas con respecto a la
biomasa original:

Es más versátil y se puede usar para los mismos propósitos que el gas natural.

Puede quemarse para producir calor y vapor y puede alimentar motores de
combustión interna y turbinas de gas para generar electricidad.

Es un combustible relativamente libre de impurezas y causa menores problemas
de contaminación al quemarse.
- Métodos biológicos
La hidrólisis y posterior fermentación de biomasa con alto contenido de
azúcares, almidones o celulosa, puede utilizarse para la producción de alcohol etílico
(etanol), igual al que resulta de la destilación del petróleo (Moragues y Rapallini, 2003).
La fermentación o digestión metánica es la descomposición bacteriana de
materia orgánica en la ausencia de aire, produciendo una mezcla gaseosa,
denominada biogás, con un 50 a 70 % de metano, un 30 a 45 % de dióxido de
carbono, de 0,5 a 3 % de nitrógeno, 1 % de hidrógeno, 1 % de oxígeno y vestigios de
anhídrido sulfuroso y de otros gases (Moragues y Rapallini, 2003).
2.7.2.
PIRÓLISIS DE BIOMASA
La pirólisis consiste en la descomposición físico-química de la materia orgánica
bajo la acción del calor y en ausencia de un medio oxidante. Los productos obtenidos
se pueden clasificar en tres grandes grupos: gases compuestos por hidrógeno, óxidos
de carbono e hidrocarburos; líquidos hidrocarbonados y residuos sólidos carbonosos,
cuyas cantidades relativas dependen de las propiedades de la biomasa a tratar y de
los parámetros de operación del equipo (Hossain y Davies, 2013).
La pirólisis de los residuos sólidos orientada a la obtención de productos
líquidos y sólidos, es una buena alternativa para los subproductos agrícolas y
forestales y los residuos sólidos urbanos.
Para obtener combustibles líquidos y carbón se requiere una alimentación
seca. Con objeto de mejorar los rendimientos en combustibles líquidos se están
estudiando los procesos llamados de "licuefacción", que son variantes de la pirólisis
con adición de biomasa húmeda a temperaturas entre 300 y 500 °C y alta presión.
32
Introducción
En definitiva, la pirólisis parece ser un buen método para la obtención de
energía a partir de biomasa seca y, quizás, el mejor para convertir los residuos sólidos
urbanos en compuestos de interés económico. Aún queda un largo camino por
recorrer, pero las investigaciones en marcha permiten contemplar un futuro
prometedor en la aplicación de la pirólisis como procedimiento para convertir la
biomasa en energía útil.
2.7.2.1.
Análisis termogravimétrico
El análisis termogravimétrico (TGA) es el método más empleado para el
estudio cinético de la pirólisis de materiales. La definición generalmente aceptada de
análisis térmico abarca al grupo de técnicas en las que se mide una propiedad física
de un sistema, sustancia o un material, en función de la temperatura mientras se le
somete a un programa de temperatura controlado (Wendlandt, 1986). Se pueden
distinguir más de una docena de métodos térmicos que difieren en las propiedades
medidas y en los programas de temperatura. Estos métodos encuentran una amplia
aplicación tanto en el control de calidad como en investigación de productos
farmacéuticos, arcillas, minerales, metales, aleaciones, polímeros y plásticos.
En un análisis termogravimétrico se registra, de manera continua, la masa de
una muestra en una atmósfera controlada, o bien en función de la temperatura, o bien
en función del tiempo. En el primer caso (experimento dinámico) la temperatura de la
muestra va aumentando de manera controlada (normalmente de forma lineal con el
tiempo), y en el segundo (experimento isotermo), la temperatura se mantiene
constante durante todo el experimento. La representación de la masa o del porcentaje
de masa en función del tiempo o de la temperatura se denomina termograma o curva
de descomposición térmica. Existen otros tipos de análisis denominados de
termogravimetría diferencial (DTG) donde se registra la variación de masa, derivada,
con respecto a la temperatura o respecto al tiempo, dependiendo de que el
experimento sea dinámico o isotermo respectivamente. En la Figura 2.8 se
representan estos dos tipos de termograma: a) convencional; b) diferencial.
33
Introducción
Figura 2.8. Termogramas diferencial (curva superior, eje derecho) y convencional (curva
inferior, eje izquierdo) (Skoog y col., 2002).
2.7.2.1.1. APLICACIONES
El análisis termogravimétrico se emplea en todo tipo de aplicaciones,
proporcionando información acerca de la composición de la muestra: estabilidad
térmica, estabilidad oxidativa, efecto de distintas atmósferas, contenido de humedad y
volátiles, y a veces la composición de sistemas multicomponentes. Las curvas TG y
DTG permiten obtener información cualitativa y cuantitativa de la muestra.
En la bibliografía existente se emplea el análisis termogravimétrico para
investigar la biomasa y su comportamiento durante el calentamiento en atmósfera
inerte u oxidante (por ejemplo, Ghetti y col., 1996), para determinar biomasa en carbón
activo (por ejemplo, Craik y col., 1991) y principalmente para el modelado cinético de
la descomposición térmica de la biomasa (Por ejemplo: Saddawi y col., 2010; Melgar y
col., 2008; Cai y col., 2008; Miller y col., 1997; Fisher y col., 2002; Stenseng y col.,
2001; Jones y col., 2000; Shuping y col., 2010; Min y col., 2007).
34
Introducción
2.7.1. PIRÓLISIS DE MICROALGAS
Las microalgas se incluyen dentro de los recursos provenientes de la biomasa,
que es el recurso energético disponible más versátil.
La capacidad de la aplicación del análisis termogravimétrico para el estudio de
especies de microalgas, ha sido probada por varios autores. Por ejemplo, el empleo
del TGA en atmósfera de aire para estudiar los efectos de la temperatura en un alga
marina (Pane, 2001), artículo en el que se indica la existencia de claras diferencias
entre las distintas fases del crecimiento debido a la presencia de las diferentes
moléculas producidas durante el crecimiento y la diferencia en las propiedades
térmicas de estas moléculas intracelulares. Estos autores distinguen tres etapas en las
curvas de pérdida de masa obtenidas en el TGA. La primera etapa se produce en el
intervalo de 40-180 ºC y se debe a la pérdida de agua. En este proceso, la estructura
celular es progresivamente destruida, y tienen lugar fenómenos como la alteración de
la estructura de los lípidos. La segunda etapa ocurre en el intervalo de 180-400 ºC, e
implica la descomposición de proteínas y carbohidratos. Esta etapa produce la
principal pérdida de masa. Finalmente, la tercera etapa se da en el intervalo 400-760
ºC y se corresponde con la oxidación completa de la materia orgánica. Peng y col.
(2001), pirolizaron dos tipos de microalgas autotróficas en TGA para investigar sus
características pirolíticas. Esos autores también identificaron tres etapas de
descomposición, es decir, deshidratación, volatilización y descomposición del sólido, y
llevan a cabo un estudio cinético para caracterizar cada especie. El TGA además fue
empleado por Zhang y col. (2000) para estudiar una mezcla polietileno-Chlorella y por
Marcilla y col. (2009) para la caracterización mediante TG-FTIR de la Nannochloropsis
sp.
Por otro lado, la pirólisis analítica se ha utilizado ampliamente en la bibliografía
para obtener información acerca de la composición de diferentes materiales orgánicos.
Por ejemplo, Fabbri y col. (2005) utilizan el pyroprobe conectado a un cromatógrafo de
gases con detector masas (Py-GC/MS) como una técnica analítica rápida para
determinar el origen de la materia orgánica en los sedimentos marinos, Nguyen y col.
(2003) estudiaron los cambios bioquímicos producidos en B. braunii durante la
descomposición mediante procesos aeróbicos, Çoban-Yildiz y col. (2000) estudiaron la
composición química de la materia orgánica particulada suspendida en el mar negro,
Cejka y col. (1997) utilizaron el Py-GC/MS para analizar la materia orgánica a partir de
sedimentos, que consisten en diferentes tipos de algas, Derrene y col. (1991) utilizaron
35
Introducción
la pirólisis flash con GC/MS para caracterizar moléculas orgánicas insolubles en las
algas. Kruge y col. (1998) utilizaron el Py-GC/MS para estudiar la materia orgánica
acuática en muestras de sedimentos de aguas abiertas y se identificaron compuestos
nitrogenados como pirroles, índoles y piridinas. Estos compuestos son productos de
pirólisis característicos de proteínas y materia proteínica degradada (en este caso en
gran medida a partir de algas marinas y bacterias). Ishida y col. (1998) aplicaron la PyGC reactiva para determinar el contenido de lípidos y la composición de ácidos grasos
de cada individuo (Daphnia galeata) cultivado en diferente concentración de algas.
En relación con las microalgas, Thangalazhy-Gopakumar y col. (2012)
utilizaron la pirólisis analítica de C. vulgaris en un Py/GC-MS para identificar los
principales compuestos presentes en el bio-aceite con y sin catalizador (H + ZSM-5).
El diagrama de flujo de gas reactivo y el gas portador del GC durante la pirólisis
(adoptado de la pyroprobe manual de CDS 5200) se muestra en la Figura 2.9.
Gas portador
Cámara de horno
Al cromatógrafo
Gas reactivo
Venteo
Horno
Trampa
Muestra
Sonda
Figura 2.9. Diagrama de flujo del equipo CDS Pyroprobe 5200 (adaptada del manual).
2.8. ANÁLISIS CINÉTICO
Aunque existen distintos motivos por los que es de interés la obtención de
velocidades de reacción, se pueden destacar dos de ellos:
36
Introducción
1. Obtener información acerca del mecanismo de la reacción de descomposición, lo
cual puede ser útil para entender los procesos que están teniendo lugar.
2. Obtener parámetros cinéticos, que pueden permitir conocer la velocidad del
proceso de descomposición en otras condiciones mediante interpolación o
extrapolación y posibilitan el diseño del reactor.
Sin embargo, ambos están íntimamente relacionados, ya que por ejemplo, la
obtención de parámetros cinéticos es solamente posible si se conocen los
mecanismos de reacción.
Las reacciones de descomposición de la biomasa tienen lugar en fase
heterogénea, siendo la situación más frecuente aquella en la que un sólido se
descompone para dar una fracción sólida, una fracción líquida y una fracción gaseosa.
Ahora bien, a las temperaturas a las que los procesos de descomposición suelen tener
lugar estas dos últimas están en fase gas, por lo que el mecanismo de
descomposición más sencillo que cabe esperar es:
A  s S  (1 s)V
Proceso que suele seguirse estudiando la evolución de cualquier biomasa (A),
Sólido (S) o Volátil (V).
La formulación matemática del proceso de descomposición suele desarrollarse
mediante una expresión de tipo Arrhenius.
Velocidad de reacción  k f A, S, V   k o e
Ea
RT
f A, S, V 
Donde k0 es el factor de frecuencia o preexponencial, Ea la energía de
activación, R, la constante de los gases y f(A, S, V) una función que en un principio
podría ser tanto de la concentración de los reactivos como de los productos. Las
expresiones más comunes para esta función suelen ser escritas en función del grado
de conversión de la reacción , definido en términos de la masa inicial mo y la masa
instantánea m.
De este modo la velocidad de la reacción podría calcularse con una expresión
del tipo:
Velocidad de reacción  k f    k o e
Ea
RT
f  
37
Introducción
En la bibliografía existente aparecen distintos tipo de funciones del grado de
conversión, como las que se muestran en la Tabla 2.4, que dependen
fundamentalmente del modelo de reacción que supuestamente tiene lugar.
Tabla 2.4. Mecanismos de procesos en estado sólido más frecuentes (Shuping y col.,
2010).
Mecanismo
f()
Orden de reacción
Primer orden
1-
Segundo orden
(1-)2
Tercer orden
(1-)3
Difusión
Trasporte en una dirección
0.5
Trasporte en dos direcciones
[-ln(1-)]-1
Trasporte en tres direcciones
1.5(1)2/3[1-(1-)1/3]-1
Ecuación Ginstling- Brounshtein
1.5[(1-)1/3-1]-1
Limitación de la reacción en la superficie entre dos fases
Una dimensión
1
Dos dimensiones
2(1-)1/2
Tres dimensiones
3(1-)2/3
Nucleación al azar y crecimiento del núcleo
Bidimensional
2(1-)[-ln(1-)]1/2
Tridimensional
3(1-)[-ln(1-)]2/3
Nucleación y núcleo creciente
38
Ley de la potencia, n=1/2
21/2
Ley de la potencia, n=1/3
32/3
Ley de la potencia, n=1/4
43/4
Introducción
Sin embargo, las reacciones de descomposición suelen tener lugar siguiendo
mecanismos más complejos involucrando distintas reacciones que podrían estar
solapadas, dando como resultado aparente un único proceso. En este caso habría que
hablar de pseudoparámetros cinéticos. Si por el contrario existiera una clara evidencia
de la existencia de distintos procesos, cabría la posibilidad de la consideración de
distintas etapas, cada una de las cuales con su correspondiente triplete cinético (f(),
ko y Ea). Aunque en un principio esto parece una clara división, a la hora de analizar
resultados experimentales reales, a simple vista no suele ser posible aseverar si existe
o no un único proceso (aparente o real). En este sentido hay que recordar que los
parámetros cinéticos ko y Ea son constantes y si alguno de los procedimientos como
los que se describirán en las siguientes secciones mostraran que existe una
dependencia de alguno de ellos con el grado de conversión, ello nos estaría indicando
que el mecanismo de reacción es realmente más complejo, y deberían considerarse
otras etapas adicionales (Conesa y col. 2001; Maciejewski, 1999).
A pesar que esto último parece algo realmente obvio, existe en la bibliografía
una práctica relativamente común consistente en concluir el análisis cinético
mostrando gráficas que muestran la dependencia de la energía de activación con el
grado de conversión, cosa que en lugar de ser el final, en realidad debería ser el
comienzo de una etapa posterior de mejora del modelo propuesto.
Esta contradicción entre lo que cabría esperar (parámetros cinéticos que sean
constantes) y lo que es posible encontrar en la bibliografía (parámetros cinéticos que
no lo son) es un reflejo del estado y la evolución del análisis cinético.
La bibliografía existente sobre análisis cinético es extremadamente amplia,
debido fundamentalmente a que existe un gran abanico de posibles métodos de
análisis cinético, gran parte de los cuales fueron establecidos a principios de los años
60. Durante este medio siglo los distintos métodos han sido aplicados a la
determinación de parámetros cinéticos correspondientes a numerosos procesos como
por ejemplo reacciones de cristalización y descomposición de distintos tipos de
materiales (Saddawi y col., 2010; Melgar y col., 2008; Cai y col., 2008; Miller y col.,
1997; Fisher y col., 2002; Stenseng y col., 2001; Jones y col., 2000; Shuping y col.,
2010; Min y col., 2007, entre otros).
Hay que indicar que como se ha comentado, algunos de los métodos para
análisis cinético datan de principios de los años 60. A pesar de la gran evolución que
han experimentado los ordenadores durante este medio siglo de andadura, y de la
39
Introducción
gran ayuda que supone al cálculo numérico, es también relativamente común el
empleo de algunos de dichos procedimientos que se basan en aproximaciones,
justificables cuando el uso de ordenadores no estaba tan extendido.
La evolución del análisis cinético ha seguido un camino que podría definirse
como divergente, en la medida que durante todo este tiempo, los métodos más
antiguos se han consolidado al mismo tiempo que han ido surgiendo otros más
recientes, como por ejemplo el método NPK (Serra y col., 1998) o el IKP (Liu y col.,
2002). Prueba de esta divergencia en metodología y criterios fue puesta de manifiesto
con el “ICTAC kinetic Project”, que surgió a raíz del 11th International Congress on
Thermal Analysis and Calorimetry (ICTAC) en Filadelfia (USA) y que dio lugar a una
serie de 5 artículos escritos por investigadores con dilatada experiencia en análisis
cinético y que muestran parte de la problemática de dicho análisis (Brown y col., 2000;
Burnham, 2000; Maciejewski, 1999; Roduit, 2000; Vyazovkin, 1999).
De la serie de 5 trabajos, se podría destacar el escrito por M. Macijiewski que
destaca algunos aspectos a considerar:
1. Hablando en términos de experimentos obtenidos en condiciones no
isotermas, el análisis cinético tiene que ser llevado a cabo empleando datos obtenidos
a distintas velocidades de calefacción, lo cual facilita la discriminación de modelos. Tal
y como demuestra él mismo y Vyazovkin (1999), el ajuste de curvas obtenidas a una
única velocidad de calefacción es posible mediante el empleo de modelos y
parámetros cinéticos distintos, los cuales arrojan extrapolaciones muy dispares a otras
velocidades de calefacción. Sin embargo, el empleo de datos obtenidos a distintas
velocidades de calefacción no es una garantía total de que el modelo escogido sea el
real, cuando cabe la posibilidad que existan procesos solapados, tal y como se
demostró posteriormente (Marcilla y col., 2007).
2. El análisis cinético debe concluir con la determinación del triplete cinético por
completo, y no con la determinación de un único parámetro, como suele ocurrir con la
energía de activación.
A estos puntos, habría que añadir otro fundamental, y es que de alguna forma
los datos calculados deberían de ser capaces de poder calcular grados de conversión,
concentraciones, etc… que puedan ser comparados con los datos experimentales, y
de ese modo evitar el facilitar parámetros cinéticos que en ningún momento sean
capaces de reproducir los datos experimentales de partida, tal y como ocurre, por
ejemplo, con Shuping y col. (2010).
40
Introducción
2.8.1.
ASPECTOS GENERALES SOBRE PROCEDIMIENTOS DE
ANÁLISIS CINÉTICO
En la bibliografía es posible encontrar un gran número de procedimientos para
la obtención de los distintos parámetros cinéticos, aunque una de las tendencias
generales consiste en agruparlos en métodos diferenciales o métodos integrales,
dependiendo de la ecuación en que se apoyen. Los primeros de ellos emplean la
ecuación diferencial:
Velocidad de reacción 
Ea
d
d
RT f  

 ko e
dt
dT
Donde  es la velocidad de calefacción a la que se realiza el experimento.
Sin embargo los segundos emplean como punto de partida una modificación de
dicha ecuación consistente en su reordenación e integración:
Ea
k
d
RT dT 
 o e
f   

0
d
 g   
f  
T
To
ko

Ea
e
RT dT
Ahora bien, uno de los problemas consiste en la determinación de
T

To
e
Ea
RT
dT . La realización de dicha integral puede facilitarse si se hace un cambio
de variable: x 
T
To
Ea
e
RT
 Ea
RT dT
E
 a
R
e
0
x
x
2
dx 
Ea
k E
p( x )  g    o a p( x )
R
R
El valor de p(x) está tabulado, además que existen ecuaciones polinómicas
muy aproximadas (Doyle, 1962), cuyo empleo en la actualidad no son justificables tal y
como ha indicado Flynn en un artículo titulado “The Temperature Integral: its use and
abuse” (Flynn, 1997). Con todo ello, en bibliografía reciente (relacionada con
descomposición de microalgas) dichas aproximaciones son empleadas a pesar del
gran error que pueden conllevar (Shuping y col., 2010).
Aunque la distinción entre métodos diferenciales e integrales está muy
difundida, Vyazovkin y Lesnikovich criticaron esta clasificación (Vyazovkin y col., 1990)
y sugirieron la clasificación entre métodos discriminatorios, que requieren la
identificación de un determinado modelo cinético, y aquellos que no lo requieren, más
41
Introducción
conocidos como no discriminatorios o “sin modelo” (traducción literal del término
anglosajón “model free methods”).
Independientemente de la clasificación a emplear, a continuación se
describirán algunos de los métodos de análisis cinético más empleados.
Método de Kissinger (Kissinger, 1957)
Este método describe la descomposición de un sólido en otro sólido y un gas
mediante la ecuación:
Ea

d
 k o (1   )n e RT
dt
En el método se supone que n permanece constante durante el transcurso de
la reacción y obtienen, al derivar la ecuación e igualarla a cero, una expresión que se
cumple a la temperatura en la que la velocidad de reacción es máxima (T m), que
supone que es la temperatura a la que aparece el pico en la derivada del grado de
conversión.
Ea 
RTm2

E
 a
RTm
n 1
k o n(1   ) m e
Esta suposición también implica un grado de conversión constante a esa
temperatura máxima, mientras que en muchos casos el grado de conversión a la
temperatura del pico varía con la velocidad de calefacción y por lo tanto no puede
clasificarse como método isoconversional.
Integrando la ecuación original, operando y empleando la expresión de la
temperatura de pico se obtiene una ecuación que permite el cálculo de la energía de
activación a partir de la pendiente de la representación del ln(1/Tm2) vs (1/T).
d ln

E
Tm2
 a
1
R
d
T
La confusión que surge con su clasificación puede deberse al hecho de que la
ecuación que se obtiene es similar a la del método de Flynn–Wall- Ozawa (Vyazkovin
y col., 2006).
42
Introducción
Método de Friedman (Friedman, 1964)
Este método ha sido uno de los métodos más conocidos de los denominados
isoconversionales, puesto que se basa en la utilización de datos correspondientes a un
grado de conversión constante, pero obtenidos bajo distintas velocidades de
calefacción.
Este método consiste fundamentalmente en reorganizar la ecuación cinética de
la siguiente forma:
E
 d 
ln
  ln( k o )  ln(f  ) - a
RT
 dt 
Entonces, tomando datos correspondientes a determinados valores de grados
 d 
frente

 dt   cte
de conversión a distintas velocidades de calefacción se representa ln
a 1/T, pudiendo calcular Ea y ko a partir de las ordenadas en el origen y la pendiente
de cada conjunto de valores tomados a un grado de conversión fijo. Puesto que cabe
hacer muchas representaciones (una para cada grado de conversión tomado), se
suele tomar un valor promedio de ko y Ea. En este caso, como en el método Kissinger,
si se observara que cualquiera de los parámetros cinéticos depende del grado de
conversión, eso sería una evidencia que los mecanismos de reacción son más
complejos de lo que se ha considerado.
Método de Coats y Redfern (Coats y col., 1964)
Este método surge como consecuencia de sustituir p(x) por una ecuación
aproximada para la correspondiente integral de la temperatura:
k E
k E  e x
g    o a p( x )  o a  2
R
R  x
 2   k oE a
1  x    R

 


E
  a RT 

2RT   RT 2k o
 e
1
 
2 
E
Ea 
Ea 
 
a
  RT 




 Ea  2RT  
e RT 1 

E a  


De donde es fácil demostrar que puede obtenerse la expresión:
 k R  2RT
 g ( ) 
ln  2   ln  o 1 
Ea
T 
  E a 
En algunos casos se cumple que  2RT ´

Ea
 E a
 
 RT
 0  :

43
Introducción
k R  E
 g ( ) 
ln  2   ln  o   a
T 
 Ea  RT
De este modo ko y Ea pueden ser calculados a partir de la pendiente y la
 g ( ) 
ordenada en el origen de gráficas en las que se representa ln  2  vs 1 .
T
T 
Método de Flynn–Wall- Ozawa (Ozawa, 1965 y Flynn y col., 1966)
Se basa en el empleo de una ecuación distinta para p(x), y propuesta por Doyle
(Doyle, 1962):

E 
k E
k E
k E  5.3311.052 RTa 
g    o a p( x)  o a e5.3311.052 x   o a e 
R
R
R
Reorganizando dicha expresión es posible llegar a la ecuación alternativa:
E
k E 
ln   ln  o a   5.331  1.052 a
RT
 Rg(  ) 
Método IKP (Criado y col., 1977, Criado y col., 1978)
El método IKP se basa en la existencia de un factor de compensación entre los
parámetros cinéticos (Brown y col., 2002; Liu y col., 2002), de modo que por ejemplo
ko, Ea y f() pueden adoptar distintos valores de forma que para distintos conjuntos de
valores, el modelo propuesto puede representar los datos experimentales. Sin
embargo, dicho efecto de compensación, aunque no puede ser eliminado
completamente, para el caso de experimentos en condiciones no isotermas, se ha
observado que puede ser paliado en gran medida utilizando datos experimentales
obtenidos a distintas velocidades de calefacción (Maciejewski, 1999).
El método IKP sigue tres pasos diferenciados:
Paso I: Como el método propuesto asume el efecto compensatorio entre el
triplete cinético, considera distintas f() y calcula la energía de activación y el factor
preexponencial para cada modelo a partir de representaciones gráficas de
ln 
d
 ln f   frente a 1/T. Un método alternativo consiste en la utilización de la
dT
ecuación de Coats-Redfern.
44
Introducción
Paso II: Para los valores calculados de ko y Ea se asume el efecto de
compensación y que éste puede ser descrito con ayuda de dos parámetros (  v* ,  v* ):
ln k inv   v*   v* E inv
Para cada velocidad de calefacción ln k inv se representa frente a E inv ,
calculando así los parámetros de compensación.
Paso III: Finalmente, los parámetros de compensación se emplean para
construir lo que se conoce como la relación de supercorrelación (“supercorrelation
relation”) (  v*vs v* ), cuya pendiente y ordenada en el origen facilitan los valores
invariantes de ko y Ea:
 v*  ln k o inv   v* E inv
Métodos basados en la integración numérica y optimización de parámetros (Conesa y
col., 2001; Marcilla y col., 2006)
Estos métodos se basan en la selección de una f() y la integración de la
expresión cinética para obtener el grado de conversión en función del tiempo.
t
d / dt  k o exp( Ea / RT )f ( )     k o exp( Ea / RT )f ( )dt
o
En los métodos clásicos, la optimización de los parámetros cinéticos, ko, Ea y n,
se realiza mediante linealización de la expresión y esto normalmente lleva asociados
los siguientes problemas:
1.
Los datos originales obtenidos en el equipo son demasiado manipulados (el
uso de logaritmos puede enmascarar los datos obtenidos en el TG).
2.
Los métodos son únicamente válidos para procesos de descomposición
simples (si se observa más de un proceso, se debe aplicar otro método
previamente).
3.
Se suele emplear la temperatura programada, en lugar de la real, es decir, la
medida por el termopar en cada tiempo.
4.
La mayoría de los métodos obtiene los parámetros cinéticos ajustando los
datos de una velocidad de calefacción. Se ha comprobado que el ajuste de una
curva puede ser llevado a cabo con distintos modelos sin observar diferencias en la
calidad del ajuste obtenido.
45
Introducción
Por tanto, la optimización de los parámetros cinéticos se debe llevar a cabo
mediante el ajuste de varios experimentos realizados a diferentes velocidades de
calefacción de manera simultánea y utilizando el mismo modelo cinético y los mismos
parámetros cinéticos.
En los equipos modernos de TG, se obtiene una gran cantidad de datos para
un experimento, y estos deben ser filtrados cuidadosamente, puesto que, si se eligen
unos puntos distribuidos en periodos regulares de tiempo, se obtendrá una gran
cantidad de puntos en la parte inicial y final y sólo unos pocos en la parte más
importante, la parte central, donde casi toda la descomposición tiene lugar. Por otro
lado, si se selecciona una gran cantidad de puntos, para evitar este problema, el
tiempo de cálculo puede ser excesivo. Por consiguiente, se podrían seleccionar puntos
experimentales a intervalos regulares de conversiones.
La calidad del modelo se evalúa normalmente empleando una función objetivo.
El criterio más común es minimizar la diferencia de los cuadrados entre los valores
experimentales y los calculados. A continuación se muestran las formas absoluta y
relativa de la función objetivo integrada y la forma absoluta de la derivada.
F .O.   fi  ( ijexp   ijcal ) 2
i
j
  exp   ijcal 
ij

F .O.   fi   exp
cal 




i
j
ij 
 ij
F.O.  min  fi  (
i
j
d ical
,j
dt

2
d iexp
,j
dt
)2
El parámetro fi es un parámetro que se incluye para asegurar que todos los
experimentos tienen el mismo peso en la función objetivo. En el caso de correlacionar
un conjunto de curvas de TG a distintas velocidades de calefacción, se ha sugerido
que este parámetro podría tomar la siguiente forma:
fi 
1
2
max j (d iexp
, j / dt )
Al elegir la forma integrada de la función objetivo, los datos obtenidos del
equipo no necesitan ningún tratamiento, y pueden ser usados casi como son
recogidos; sin embargo, las curvas de la fracción másica no son muy sensibles a los
46
Introducción
procesos que pueden superponerse parcialmente o incluso pasar desapercibidos. La
función objetivo de la derivada es mucho más sensible a estos cambios pero se debe
tener cuidado al calcular la derivada porque pequeños errores experimentales pueden
producir errores mayores con respecto a la derivada.
47
OBJETIVOS
3
Objetivos
El objetivo del presente trabajo, realizado para optar al Grado de Doctor, se
centra básicamente en el estudio del crecimiento y las posibilidades del
aprovechamiento termoquímico de las microalgas Nannochloropsis gaditana y
Nannochloropsis oculata.
El objetivo general se puede estructurar en los siguientes
puntos,
correspondientes a las diferentes publicaciones que forman parte del presente trabajo:
- Estudio de la distribución del tamaño de partícula de la microalga
Nannochloropsis gaditana durante los ciclos de luz/oscuridad y su evolución con el
tiempo. Modelado cinético simultáneo de la concentración celular y las curvas de
distribución de tamaño de partículas.
- Evaluación de la influencia de la concentración inicial de nitratos en el medio
de cultivo sobre el crecimiento al aire libre de la microalga Nannochloropsis oculata en
dos tipos de reactores a escala piloto, fotobiorreactores y estanques abiertos.
- Evaluación de la influencia de la concentración inicial de nitratos en la
composición bioquímica de la microalga Nannochloropsis oculata en dos etapas
diferentes de crecimiento de los cultivos de los fotobiorreactores: fase exponencial y
fase estacionaria.
- Análisis de los perfiles de pH durante el crecimiento de la microalga
Nannochloropsis oculata en un fotobiorreactor de tipo columna de burbujas para
obtener información sobre la relación entre el CO2 consumido por las algas y el
perdido por arrastre.
- Estudio de la viabilidad del TG y el Py-GC/MS como métodos para comparar
cualitativamente
la
composición
bioquímica
de
muestras
de
la
microalga
Nannochloropsis oculata obtenidas en diferentes concentraciones de nitrógeno e
intensidades de la radiación fotosintéticamente activa.
- Revisión actualizada del estado de la técnica de la pirólisis de microalgas en
el ámbito de los aspectos experimentales y teóricos (modelos matemáticos y de
simulación) y llevar claridad al estado actual de la investigación en el campo de la
licuefacción hidrotérmica.
51
MATERIALES
Y MÉTODOS
4. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1. Materiales empleados
4.1.1. Microalgas
4.1.2. Medio de cultivo y escalado de cepas
4.1.3. Reactores
4.1.3.1. Fotobiorreactores situados en una sala blanca
4.1.3.2. Reactores abiertos situados en el exterior
4.1.3.3. Fotobiorreactores de tipo de columna de burbujas situados
en el exterior
4.1.3.4. Fotobiorreactores de tipo airlift situados en el exterior
4.2. Equipos y técnicas analíticas utilizadas
4.2.1. Determinación de la evolución celular
4.2.2. Control de la contaminación y conteo celular
4.2.3. Determinación de la distribución del tamaño de partícula
4.2.4. Determinación de nutrientes en el medio de cultivo
4.2.4.1. Determinación de fosfatos
4.2.4.2. Determinación de nitratos
4.2.5. Determinación de la composición bioquímica de la biomasa
4.2.5.1. Determinación de las proteínas
4.2.5.2. Determinación de los carbohidratos
4.2.5.3. Determinación de los lípidos transesterificables
4.2.5.4. Determinación de los lípidos totales
4.2.6. Análisis termogravimétrico
4.2.7. Pyroprobe conectado a un cromatógrafo de gases con detector masas
4
Materiales y Métodos
4.1. MATERIALES EMPLEADOS
4.1.1. MICROALGAS (http://www.ecimat.org)
Para el presente estudio se han utilizado dos especies de microalga, la
Nannochloropsis gaditana y la Nannochloropsis oculata.
La clasificación científica de estas especies es:
•
Reino: Chromalveolata
•
Phylum: heterokontophyta
•
Clase: Eustigmatophyceae
•
Familia: Monopsidaceae
•
Género: Nannochloropsis
La identificación precisa de la microalga Nannochloropsis gaditana es difícil
debido a su pequeño tamaño. En su fase de crecimiento presenta una forma elipsoidal
de 3,5-4 x 2,5-3 m (Figura 4.1a), pudiendo distinguirse en estas circunstancias de la
microalga Nannochloropsis oculata (Figura 4.1b). Las restantes características
morfológicas son similares en las dos algas. Son inmóviles, desprovistas de flagelos y
poseen un cromatóforo sencillo parietal de color verde pálido que ocupa gran parte de
la célula. El citoplasma posee una gran acumulación de lípidos. Además, se observa
frecuentemente la presencia de un glóbulo extraplastidial, de color rojo, sobre todo en
cultivos envejecidos. La pared celular es lisa siendo más gruesa y resistente en la
Nannochloropsis gaditana. No tienen zoósporas ni formas de resistencia y la
reproducción se realiza exclusivamente mediante fisión binaria de las células (Lubian,
1982). En cuanto a su composición pigmentaria, la Nannochloropsis gaditana se
diferencia de la otra especie en su capacidad para producir caroteno.
La microalga Nannochloropsis gaditana es una fuente importante productora de
clorofila a, zeaxantina, cantaxantina y astaxantina, así como de ácidos grasos
poliinsaturados (PUFAs) de interés reconocido por eso se eligió para los cultivos en el
interior.
55
Materiales y Métodos
a)
b)
Figura 4.1. a) Nannochloropsis gaditana. b) Nannochloropsis oculata.
Sin embargo, en estudios preliminares se decidió utilizar la especie
Phaeodactylum Tricornutum debido a la superior tasa de crecimiento que el resto, pero
los experimentos estuvieron muy limitados por la elevada sensibilidad a la
contaminación por parte de otros microorganismos depredadores tales como ciliados,
amebas y otras bacterias que dificultaban de manera considerable el crecimiento de
los cultivos. La Figura 4.2a muestra un depredador del tipo Euplotes encontrado en los
cultivos y la Figura 4.2b una ameba.
a)
b)
Figura 4.2. Muestra de la contaminación. a) Euplotes. b) Ameba.
Por esta razón, para los cultivos que se han realizado en el exterior se ha
utilizado una microalga menos sensible a la contaminación (Ushilo y col., 1999), la
Nannochloropsis oculata.
56
Materiales y Métodos
La microalga Nannochloropsis gaditana ha sido suministrada por la empresa
Fitoplancton Marino S.L. (Cádiz) y la microalga Nannochloropsis oculata por el banco
de algas Algobank-Caen de la Universidad de Caen Basse-Normandie (Francia).
4.1.2. MEDIO DE CULTIVO Y ESCALADO DE CEPAS
Con objeto de obtener una cantidad de cultivo apropiado para inocular a los
reactores en los que se ha llevado a cabo la experimentación, es necesario hacer un
escalado previo, evitando en la medida de lo posible la contaminación. El escalado
consiste en sucesivas inoculaciones en las cuales es recomendable emplear siempre
un volumen de inóculo de microalga igual al 10-20 % del volumen total a alcanzar.
El proceso de escalado se ha llevado a cabo en una sala especialmente
acondicionada y que denominaremos sala blanca. Esta sala cuenta con un sistema de
filtración HEPA para la eliminación de los posibles contaminantes de los cultivos y que
dispone de una precámara donde el personal encargado del manejo de los cultivos
dispone de batas, mascarillas, etc... para evitar la posible entrada de contaminación a
la zona de trabajo.
El primer paso del escalado consiste en dejar el inóculo recibido en un volumen
de 10 mL el tiempo suficiente para que alcance una buena concentración celular.
Finalizada esta etapa se traspasa la cantidad necesaria de inóculo a un matraz y se
diluye con agua de mar hasta obtener un volumen final de 50 mL. Para concluir esta
etapa, se adiciona al conjunto 1 mL/L de medio de nutrientes f/2 modificado (medio
con el doble de concentración del f/2 (Guillard, 1973)) previamente filtrado mediante un
filtro de 0.45 m. La boca del matraz se tapa con algodón y papel de aluminio para
evitar la contaminación de las microalgas. El algodón es necesario para favorecer el
intercambio de gases entre el medio ambiente y el recipiente.
Una vez alcanzada la fase estacionaria (aproximadamente una semana
después), se puede llevar a cabo el siguiente paso del escalado. Para ello se lleva el
contenido del matraz anterior (50 mL) a 500 mL. Como en la etapa anterior, se
incorpora el medio de nutrientes f/2 modificado a razón de 1 mL/L de cultivo. Al igual
que se ha comentado en el paso anterior, es necesario tapar la boca del matraz
durante el crecimiento del cultivo. En este paso, y debido a que el volumen empleado
es considerable se introduce aireación como medio de agitación favoreciendo así la
homogeneización de la mezcla y evitando la fotoinhibición, que se produciría al no
57
Materiales y Métodos
recibir suficiente luz aquellas células que estuvieran en la zona del fondo del matraz y
por el posible sombreado de unas microalgas a otras. Para evitar la contaminación que
podría aparecer debido a la incorporación de aire directamente de la atmósfera, se
emplean filtros de aire HEPA de 0.3 m a la entrada de cada matraz.
El último paso del escalado consiste en llevar el volumen de 500 mL a 6 L
obteniendo así suficiente cantidad para poder empezar la experimentación. En este
caso, la cantidad de nutrientes a incorporar es de 6 mL. Estos matraces cuentan con
un sistema de cierre que permite la incorporación de aire (previamente filtrado con
filtros de aire HEPA). En la Figura 4.3 se muestra un esquema de todo el proceso
comentado.
2ª Etapa
50 mL
Cultivo inicial
10 mL
3ª Etapa
500 mL
Reactores
4ª Etapa
5L
Figura 4.3. Esquema del proceso de escalado.
El medio de cultivo se compone de agua de mar y de los nutrientes necesarios
para que las microalgas se alimenten. El agua de mar utilizada para el medio de
cultivo, tanto en el proceso de escalado para el mantenimiento de las cepas así como
en los diferentes estudios realizados, es agua de mar natural recogida siempre del
mismo lugar (Golfo de Mazarrón, Murcia). Para evitar la contaminación de la biomasa
y la posible muerte de los cultivos, se ha esterilizado el agua de mar mediante la
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Materiales y Métodos
lámpara ultravioleta. Antes del proceso de esterilización del agua de mar se ha
utilizado una etapa previa de filtración para eliminar los posibles sólidos en suspensión
del agua. El sistema de filtración consta de dos cartuchos, el primero de ellos con un
tamaño de poro de 20 m y el segundo de 5 m.
4.1.3. REACTORES
4.1.3.1. Fotobiorreactores situados en una sala blanca
Los reactores son recipientes esféricos (236 mm de diámetro externo) de 6
litros de capacidad situados en el interior de una sala blanca. La temperatura se
mantiene a 18 ºC y los cultivos se airean con un caudal de 1.6 L/min a través de un
tubo con 3 mm de diámetro interno. La luz natural se ha sustituido por un tubo
fluorescente redondo TDL 965 de 18 W que se sitúa alrededor del reactor e intenta
simular las distintas longitudes de onda a las que absorbe la clorofila. La Figura 4.4
muestra el espectro de emisión del tubo TDL y las zonas en las que la clorofila tiene
picos de absorción. Ahora bien, la iluminación no ha sido continua, estableciéndose un
fotoperiodo (horas de iluminación y oscuridad: L/O) con el fin de simular las horas de
irradiación solar que las algas podrían experimentar en el exterior.
Figura 4.4. Espectros de emisión de los tubos TDL 965. Las zonas sombreadas se
corresponden con las zonas en las que la clorofila tiene picos de absorción.
59
Materiales y Métodos
4.1.3.2. Reactores abiertos situados en el exterior
Los reactores son de 40 cm de largo, 30 cm de ancho y 20 cm de alto, en los
que se introducen 6 litros de cultivo, lo que corresponde a 5 cm de camino óptico.
Para la agitación de los cultivos, se ha mantenido un burbujeo continuo a
través de un difusor de aire microporoso (Figura 4.5) que lo distribuye de manera
homogénea y proporciona un diámetro de burbuja uniforme. Dicho tubo perforado ha
sido situado en el fondo del reactor siguiendo una disposición de tipo serpentín y
abarcando la mayor superficie posible. El aire se ha introducido con un caudal de 0.2
L/min, caudal que reduce la sedimentación de las algas; con el objeto de mitigar aún
más dicha sedimentación, los reactores han sido provistos de bombas que recirculan
el medio a razón de 5 L/min. La temperatura en el fotobiorreactor se mantuvo entre 20
± 5 ° C por medio de agua que circula en un intercambiador de serpentín sumergido en
el medio de cultivo.
Figura 4.5. Detalle del distribuidor microporoso de CO2.
Además, para regular el pH, cada reactor ha sido provisto de un controlador
que regula una electroválvula, de forma que se libera CO2 en la corriente de aire
suministrado a cada reactor cada vez que el pH sube por encima del valor de
consigna.
Con esta disposición se pretende abarcar una etapa intermedia entre el
escalado en los matraces y un reactor tipo carrusel o “raceway” como los descritos por
Weissman y Goebel (1987). La Figura 4.6 muestra un esquema del reactor.
Por otro lado, la principal diferencia de este tipo de reactores con respecto a los
reactores de tipo cerrado es la mayor pérdida de agua por evaporación, por lo que, es
necesario reponerla diariamente para mantener el contenido en sales (medido a partir
de la conductividad) de los cultivos. Si no se repusiera continuamente el agua perdida
60
Materiales y Métodos
por evaporación, se podría llegar a observar un “aparente” incremento de la
concentración de microalgas achacable al crecimiento de los cultivos, y que sería
realmente consecuencia de la concentración por pérdida de agua del medio.
Figura 4.6. Esquema del reactor abierto utilizado en el exterior: 1. Filtro de carbón activo;
2. Electroválvula; 3. Controlador de pH; 4. Rotámetro; 5. Controlador de temperatura; 6.
Sonda de pH; 7. Bomba; 8. Sistema de burbujeo de aire y CO 2.
4.1.3.3. Fotobiorreactores de tipo de columna de burbujas situados
en el exterior
Los reactores consisten en un tubo de PVC transparente de 0.14 m de
diámetro interno y 1.7 m de altura, lo que corresponde a un volumen de
aproximadamente 25 litros (Figura 4.7).
Figura 4.7. Fotografía de los fotobiorreactores de tipo columna de burbujas situados en
el exterior.
61
Materiales y Métodos
La mezcla del cultivo en la columna de la burbuja se ha realizado mediante la
inyección de aire a través de un tubo circular microperforado situado en la parte
inferior del fotobiorreactor (Figura 4.8). Con este sistema de inyección de aire y un
caudal de 1,5 L/min se obtiene un régimen de burbujas y una mezcla del cultivo
apropiados. El pH del medio de cultivo se ha medido usando una sonda de pH
equipado con un Pt 100 para la medida de la temperatura. El pH se mantuvo en el
valor de consigna establecido mediante la inyección automática de CO2 utilizando un
controlador. El CO2 liberado se mezcla con el aire inyectado en la columna de
burbujas.
Figura 4.8. Distribuidor microporoso de gas.
La temperatura en el fotobiorreactor se mantuvo entre 20 ± 5 ° C por medio de
agua que circula en un intercambiador de serpentín sumergido en el medio de cultivo.
La radiación fotosintéticamente activa (PAR) se midió usando un sensor cuántico
esférico situado cerca de la superficie del fotobiorreactor.
4.1.3.4. Fotobiorreactores de tipo airlift situados en el exterior
Los fotobiorreactores consisten en módulos que están compuestos por una
estructura metálica con tres reactores de metacrilato con funcionamiento de agitación
tipo “airlift” (Figura 4.9).
62
Materiales y Métodos
Figura 4.9. Fotografía de los fotobiorreactores de tipo airlift situados en el exterior.
Los reactores con agitación de tipo “airlift” tienen la ventaja de crear patrones
de mezcla circular en los que el cultivo pasa continuamente a través de la zona oscura
y de la zona iluminada dando, de este modo, un efecto de luz intermitente a las células
de las algas (Barbosa y col., 2003). Además, el tiempo de residencia del gas en las
distintas zonas controla el rendimiento y afecta a parámetros como la transferencia de
masa gas-líquido, la transferencia de calor, la mezcla y la turbulencia.
En el reactor de bucle externo, que es la configuración de los reactores que se
describen en este apartado (Figura 4.10), la zona ascendente y la descendente están
separadas físicamente por dos tubos diferentes. La mezcla se lleva a cabo haciendo
burbujear el gas a través de un distribuidor en el tubo de subida sin ninguna agitación
física, obteniéndose una configuración similar a la columna de burbujas donde el gas
se mueve hacia arriba al azar y sin orden. Esto disminuye la densidad de la columna
ascendente haciendo que el líquido se mueva hacia arriba. En la zona superior del
reactor, el gas que no ha sido absorbido en el líquido sale al exterior y el rendimiento
de la absorción depende del diseño del reactor y las condiciones de funcionamiento.
63
Materiales y Métodos
Bucle interno
con división
Salida de gas
Entrada de gas
Bucle interno
con tubo
concéntrico
Salida de gas
Bucle externo
Salida de gas
Entrada de gas Entrada de gas
Figura 4.10. Diseño de un fotobiorreactor de tipo airlift de bucle externo (Singh y Sharma,
2012).
Cada reactor tiene 0.3 m de diámetro interno y 2 m de altura, lo que
corresponde con un volumen de aproximadamente 150 L/reactor y 450 L/módulo. La
radiación fotosintéticamente activa (PAR) se midió usando un sensor cuántico esférico
situado cerca de la superficie del fotobiorreactor. La temperatura en el fotobiorreactor
se mantuvo entre 18 ± 2 ° C por medio de agua que circula en un intercambiador de
serpentín sumergido en el medio de cultivo. El pH del medio de cultivo se ha medido
usando una sonda de pH equipado con un Pt 100 para la medida de la temperatura. El
pH se mantuvo en el valor de consigna establecido mediante la inyección automática
de CO2 utilizando un controlador. El CO2 se añade mediante un distribuidor situado en
el fondo de la zona descendente del fotobiorreactor para aumentar el tiempo de
contacto entre el gas y el cultivo. El distribuidor es un difusor microporoso que
distribuye de manera homogénea el CO2 igual que el que se utiliza en los
fotobiorreactores de tipo columna de burbujas situados en el exterior (Figura 4.8).
4.2. EQUIPOS Y TÉCNICAS ANALÍTICAS UTILIZADAS
4.2.1. DETERMINACIÓN DE LA EVOLUCIÓN DEL CRECIMIENTO
CELULAR
La evolución del crecimiento del cultivo diario se puede seguir fácilmente
mediante espectrofotometría. Distintos autores como Sánchez Mirón y col., (2003)
usan este tipo de técnica que correlaciona el peso seco de la muestra en g/L en
función de la absorbancia de la muestra medida a una determinada longitud de onda.
El máximo pico de absorción de la clorofila se encuentra comprendido entre 570-680
nm, por lo que éstos son los límites empleados.
64
Materiales y Métodos
Con el fin de obtener el peso seco, se parte de una muestra de volumen
conocido. Ésta se filtra con un filtro de 0,45 m previamente secado durante 24h a
100ºC y pesado. Una vez filtrado, el filtro con la muestra sólida se seca durante 24h y
finalmente se vuelve a pesar con objeto de determinar el peso de cultivo seco que hay
en el filtro.
Se ha determinado la correlación entre el peso seco y la absorbancia para la
microalga Nannochloropsis Oculata. Para ello, se ha partido de un cultivo con una
concentración celular elevada (correspondiente a un peso seco de 0,436 g/L) y se han
realizado sucesivas diluciones en las que se ha medido su peso seco mediante el
procedimiento descrito, y su absorbancia a una longitud de onda de 540 nm tal y como
especifican Spolaore y col., (2006) en un espectrofotómetro modelo Termo Spectronic
Helios Epsilon. La Figura 4.11 muestra la correlación obtenida.
Peso seco (g/ L)
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
Absorbancia
Figura 4.11. Correlación entre el peso seco y la absorbancia para la especie
Nannochloropsis.
La relación obtenida es peso seco (g/L)= 0.33·Absorbancia540 y el coeficiente
de determinación R2 es 0.9893.
4.2.2. CONTROL DE CONTAMINACIÓN Y CONTEO CELULAR
Para el control de la contaminación en los cultivos, se ha realizado un
seguimiento al microscopio y además se ha llevado a cabo el conteo celular mediante
una cámara Neubauer (Figura 4.12).
65
Materiales y Métodos
Figura 4.12. Esquema del procedimiento de conteo con la cámara Neubauer.
La Cámara de Neubauer es un instrumento utilizado en medicina y biología
para realizar el recuento de células en un medio líquido, que puede ser un cultivo
celular, sangre, orina, líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial, etc.
Esta cámara de conteo está adaptada al microscopio de campo claro o al de
contraste de fases. Se trata de un portaobjetos que tiene dos zonas ligeramente
deprimidas y que en el fondo de las cuales se ha marcado con la ayuda de un
66
Materiales y Métodos
diamante una cuadrícula de dimensiones conocidas. Se cubre la cámara con un
cubreobjetos que se adhiere por simple tensión superficial.
A continuación se introduce el líquido a contar, al que generalmente se ha
sometido a una dilución previa con un diluyente, por capilaridad entre la cámara y el
cubreobjetos; puesto que tiene dos zonas esto permite hacer dos recuentos
simultáneamente. Para contar las células se observa el retículo al microscopio con el
aumento adecuado y se cuentan las células.
Con el número de células contadas y conociendo el volumen de líquido que
admite el campo del retículo, se calcula la concentración de células por unidad de
volumen de la muestra líquida inicial.
La fórmula de valoración del número de células es: nº partículas/μL=nº
partículas contadas/superficie contada (mm²)∙profundidad de la cámara(mm)∙ dilución.
4.2.3. DETERMINACIÓN DE LA DISTRIBUCIÓN DEL TAMAÑO DE
PARTÍCULA
La distribución del tamaño de partícula se ha obtenido usando un Coulter
LS230 capaz de medir partículas de tamaños comprendidos entre 0.04 y 2000 m.
El funcionamiento de este equipo está basado en el principio Coulter. Cuando
una partícula pasa a través de un orificio pequeño sumergido en una solución
electrolítica, se modifican las líneas de corriente dentro del orificio, y por lo tanto la
conductividad electrolítica entre dos electrodos situados a un lado y otro del orificio
(Figura 4.13). La señal eléctrica obtenida al pasar una partícula a través del orificio
está relacionada con su diámetro, siempre y cuando dicho diámetro sea del mismo
orden de magnitud que el diámetro del orificio.
Figura 4.13. Principio de los aparatos de orificio de tipo contador "Coulter".
67
Materiales y Métodos
Todos estos aparatos tienen los problemas del contador Coulter, los cuales
limitan sus aplicaciones:
(1) La emulsión tiene que estar extremadamente diluida para evitar que dos o
más gotas pasen a través del orificio.
(2) Del lado de la emulsión se debe mantener una cierta agitación para
homogeneizar el sistema y evitar la sedimentación en el transcurso del experimento,
ya que requiere un cierto tiempo.
(3) Para una señal de conductividad adecuada, y para cualquier tipo de señal
en general, el diámetro de la gota debe estar entre 10 y 60% del diámetro del orificio,
lo que obliga a cambiar de orificio para analizar emulsiones con polidispersidad ancha.
(4) En todos los aparatos de orificio, éste se puede tapar, y se requiere un
chequeo continuo con un microscopio. Este inconveniente puede ser particularmente
serio para emulsiones de crudo en agua.
Por tanto, la cantidad de muestra analizada depende de la concentración de la
misma y se debe agitar mientras se adiciona.
4.2.4. DETERMINACIÓN DE NUTRIENTES EN EL MEDIO DE CULTIVO
El proceso de crecimiento celular estará condicionado, entre otros aspectos,
por la concentración de nutrientes (CO2, nitratos, fósforo, etc…) en el medio. En el
presente apartado se mostrarán las técnicas analíticas utilizadas para el estudio de la
evolución de la concentración de nutrientes durante el proceso de crecimiento.
4.2.4.1. Determinación de fosfatos
El método utilizado para la determinación del fósforo soluble en forma de
fosfatos es el método colorimétrico descrito por Murphy y Riley (1962), cuyo principio
es la reacción del molibdato amónico y tartrato antimónico potásico en medio ácido
con ortofosfato que se encuentra en disolución en la muestra para formar un
heteropoliácido fosfomolíbdico (PMo12O40−3) que tiene un α-estructura de Keggin. Este
anión entonces se reduce, por reacción con el ácido ascórbico, para formar el ion
coloreado azul de molibdeno (PMo12O40−7), que tiene una estructura β-keggin. La
cantidad del ion coloreado azul producido es proporcional a la cantidad de fosfatos
68
Materiales y Métodos
presente en el medio y la absorción se puede medir usando un colorímetro para
determinar la cantidad de fosfatos.
El procedimiento experimental seguido para analizar este nutriente en el medio
de cultivo es:
1. Filtrar una porción de muestra a través de un filtro de membrana de 0.45 m de
diámetro de poro.
2. Diluir 5 mL de muestra hasta 25 mL con agua destilada.
3. Añadir 4 ml de reactivo combinado y mezclar.
4. Esperar 20 minutos y medir la absorbancia a 890 nm.
El reactivo combinado se prepara en el mismo instante de la determinación y
está formado por ácido sulfúrico, tartrato de antimonio y potasio, molibdato amónico y
ácido ascórbico. El reactivo combinado se obtiene tras la adición de las siguientes
cantidades (en el mismo orden que se indica):
1. 50 ml de H2SO4 2.5 M
2. 5 ml de disolución de tartrato de Sb y K de concentración 2.7 g/L
3. 15 ml de disolución de molibdato amónico de concentración 40 g/L
4. 30 ml de solución de ácido ascórbico 0.1 M
Con el objetivo de poder cuantificar el contenido en fosfatos de la muestra de
agua se preparan una serie de patrones que se someten al mismo proceso que las
muestras. La concentración de fosfatos de las muestras se calcula por interpolación en
la curva de calibrado obtenida a partir de las absorbancias de los patrones (Figura
4.14).
69
Concentración de PO43- (ppm)
Materiales y Métodos
Concentración de PO43- (ppm)= 1.5763·Absorbancia
R2= 0.9936
Absorbancia
Figura 4.14. Correlación entre absorbancia y concentración de fosfatos en el medio.
4.2.4.2. Determinación de nitratos
El método que se emplea para la determinación de los iones nitratos en el
medio consiste en medir la absorbancia de la muestra, filtrada a través de un filtro de
0.45 m, en un espectrofotómetro ultravioleta a una longitud de onda de 220 nm
(Collos y col. 1999).
Con el objetivo de poder cuantificar el contenido en nitratos de la muestra de
agua se preparan una serie de patrones que se someten al mismo proceso que las
muestras.
4.2.5. DETERMINACIÓN DE LA COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA DE LA
BIOMASA
4.2.5.1. Determinación de las proteínas
La cuantificación de proteínas se realiza utilizando el kit de ensayo de
determinación de proteínas mediante el método de Lowry modificado de la casa
Thermo Scientific.
Las muestras se preparan según lo especificado por Sukenik y col., (1990):
1. Se filtran 20 mL de cultivo con filtros de diámetro de poro de 0.45 μm.
70
Materiales y Métodos
2. Cada filtro se introduce en un tubo de ensayo con 5 mL de NaOH 1M y se
calienta a 100 ºC durante 1 hora.
3. Transcurrido ese tiempo, el líquido se centrifuga a 5000 rpm durante 5
minutos y se aprovecha el líquido sobrenadante.
Los patrones se preparan con albúmina de suero bovino con una concentración
de 2000 ppm. Se preparan por dilución de la ampolla con la disolución de NaOH 1M
obteniendo concentraciones de 50, 100, 200 y 400 ppm. Es importante que cada vez
que se realice el análisis de determinación de proteínas, se lleve a cabo un calibrado
con los patrones.
El procedimiento experimental es el siguiente:
1. Tomar 0,2 mL de cada muestra, patrones y un blanco.
2. Añadir 1 mL del reactivo de Lowry del kit de proteínas.
3. Agitar y dejar reposar durante 10 minutos.
4. Añadir 5 mL de una disolución de fenol de concentración 80% en peso.
5. Esperar durante 30 minutos (tiempo de reacción).
6. Medir la absorbancia a λ = 750 nm.
4.2.5.2. Determinación de los carbohidratos
La preparación de muestras para proceder a la extracción de carbohidratos se
realiza según Brown y col. (1998):
1. Filtrar 20 mL de cultivo con un filtro de diámetro de poro de 0.45 μm.
2. A cada filtro se le añaden 5 mL de H2SO4 0.5 M y se calienta a 100ºC
durante 4 horas.
3. Transcurrido ese tiempo, el líquido se centrifuga a 5000 rpm durante 5
minutos y se aprovecha el líquido sobrenadante.
Los patrones se preparan con glucosa partiendo de una disolución madre de
150 ppm de la misma y diluyendo con agua destilada hasta obtener concentraciones
de 5.8, 11.6, 23.2, 46.6 y 69.6 ppm, siendo conveniente que cada vez que se realice el
análisis de extracción de carbohidratos, se lleve a cabo una calibración con los
patrones.
71
Materiales y Métodos
El procedimiento experimental es el siguiente:
1. Tomar 2 mL de cada muestra, patrones y un blanco.
2. Añadir 50 μL de disolución de fenol de concentración 80% en peso.
3. Añadir 5 mL de H2SO4 al 98% en peso.
4. Agitar y dejar reaccionar durante 15 minutos a temperatura ambiente y
posteriormente durante 15 minutos en un baño con agua.
5. Medir la absorbancia a λ = 485 nm.
4.2.5.3. Determinación de los lípidos transesterificables
El contenido en lípidos transesterificables se determina llevando a cabo el
procedimiento descrito por Rodríguez-Ruíz y col. (1988):
1. Se filtran aproximadamente 50 mL de cultivo en un filtro de diámetro de
poro de 0,45 μm.
2. Se introduce el filtro en un tubo de ensayo al que se añaden 5 mL de una
mezcla recién preparada 20:1 (v/v) de metanol/cloruro de acetilo y 100 L
de una disolución de 2500 ppm de ácido nonadecanoico (25 mg en 10 ml
de tolueno).
3. Se ultrasonica durante 15 minutos.
4. Se añaden 2.5 mL de hexano y se agita.
5. Se calienta la mezcla resultante a 100 ºC durante 15 minutos.
6. Se añaden 5 mL de agua destilada.
7. Se decantan las fases en la centrífuga.
8. Se utiliza la fase orgánica para ser analizada mediante un cromatógrafo de
gases con detector de espectrometría de masas (GC-MS).
La espectrometría de masas es una técnica de alta sensibilidad que permite la
determinación de la estructura e identidad de compuestos. Consiste en la ruptura e
ionización en fragmentos de las moléculas presentes. Los espectros de masas se
obtienen por conversión de los componentes de una muestra en iones gaseosos que
se mueven rápidamente y se separan en función de su relación masa/carga. Esta
técnica es capaz de proporcionar elevada información sobre una muestra como su
72
Materiales y Métodos
composición cualitativa y cuantitativa, la estructura de especies complejas, las
relaciones isotópicas de los átomos de una muestra así como su estructura y
composición.
El equipo en el cual se han realizado los experimentos es un espectrómetro de
masas Agilent 5973 de baja resolución con analizador de cuádruplo acoplado a un
cromatógrafo de gases (Agilent 6890N) para columnas capilares. La ionización de las
muestras se realiza por impacto electrónico. El equipo incorpora un inyector
automático (Agilent 7683B) con bandeja muestreadora con capacidad para 8 viales.
Para la identificación de compuestos se dispone de una librería Wiley.
La columna utilizada para el análisis de los lípidos transesterificables es una
Agilent DB23 (60 m de longitud, 0.25 mm de diámetro interno y 0.3 m de espesor). La
temperatura de la columna se programa de 120 a 245 ºC con una velocidad de
calefacción de 15 ºC/min. La columna se mantiene a la temperatura final durante 20
min. El inyector se fija a 250 ºC. La inyección de la muestra se realiza en modo split
(10:1). Se selecciona un solvent delay de 3 min. Se utiliza Helio como gas portador
con un flujo constante de 1 mL/min. La velocidad promedio del Helio en la columna es
de 0.37 m/s.
Para la cuantificación de los lípidos transesterificables presentes en la fase
orgánica se han empleado patrones de distintas concentraciones, en los que se añade
el éster metílico del ácido nonadecanoico como patrón interno (PI).
Los patrones se preparan poniendo en un vial de cromatografía las siguientes
cantidades de la disolución madre de los patrones de 10000 ppm (Tabla 4.1) y de
patrón interno (en este caso se añade el éster metílico del ácido nonadecanoico) y
añadiendo 1.5 mL de hexano (Tabla 4.2). La recta de calibrado se hace representando
mdis madre/mPI frente a Áreadis madre/ÁreaPI.
73
Materiales y Métodos
Tabla 4.1. Preparación de disolución madre de los patrones (disolvente: hexano).
Compuesto
Gramos en 10 mL para 10000 ppm
Número de carbonos
Metilmiristato
0.1
14
Metilpalmitato
0.1
16
Metilestearato
0.1
18
Metiloleato
0.1
18 con 1 doble enlace
Metillinoleato
0.1
18 con 2 dobles enlaces
Metillinolenato
0.1
18 con 3 dobles enlaces
Metilbehenato
0.1
22
Tabla 4.2. Preparación de los patrones.
Patrón
Vdis madre (L)
Vdis PI (L)
mdis madre/mPI (gdis madre/gPI)
1
150
100
6
2
50
40
5
3
100
100
4
4
50
100
2
5
25
100
1
6
15
100
0.6
7
10
200
0.2
4.2.5.4. Determinación de los lípidos totales
Los lípidos totales se han determinado en el instituto de la grasa del CSIC
(Sevilla). Su extracción de las algas se ha llevado a cabo por duplicado siguiendo el
protocolo descrito por Bligh and Dyer (1959) aunque con alguna modificación que se
detalla a continuación. Se mezclan 2 g de muestra húmeda y 4.7 mL de una disolución
cloroformo/metanol 1:2 (v/v). La mezcla se agita y se calienta a 80 ºC, temperatura a la
que se deja durante 15 min para que se produzca la inactivación de las enzimas. A
continuación, las muestras se sonican durante 15 min y después se centrifugan a 500g
74
Materiales y Métodos
durante 10 min. El sobrenadante obtenido se transfiere a un tubo limpio y el resto de la
muestra se vuelve a extraer con 6 mL de una disolución cloroformo/metanol/agua
1:2:0.8 (v/v/v). La mezcla se agita, se sonica y centrifuga de nuevo en las mismas
condiciones. El nuevo sobrenadante obtenido se mezcla con el anterior y se vuelve a
repetir el proceso con el resto de muestra. Una vez que se ha realizado la extracción
por tercera vez y se ha añadido el sobrenadante al mismo tubo donde se habían
introducido las otras dos veces, a la mezcla de los sobrenadantes obtenidos se le
añade 5 mL de cloroformo y 5 mL de NaCl 0.88 %. La mezcla se agita y se centrifuga
a 500g durante 5 min. La fase inferior es la que contiene los lípidos y se transfiere a un
tubo limpio y el sobrenadante se extrae de nuevo con 5 mL de cloroformo. Las fases
inferiores se combinan y el disolvente se elimina con nitrógeno. Los residuos obtenidos
se pesan, se disuelven en 1 mL de cloroformo y se almacenan a -20 ºC en atmósfera
de nitrógeno.
La determinación de los distintos tipos de lípidos se lleva a cabo mediante
cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) usando el método descrito por Salas y
col. (2006). Este método hace posible la cuantificación de lípidos neutros
(triacilgliceroles y ácidos grasos libres) y lípidos polares (fosfolípidos y galactolípidos).
Como paso previo al análisis en el HPLC, los lípidos totales se fraccionan en un
cartucho de gel de sílice (Lichrolut Si, Merck). Se cargan en el cartucho, previamente
equilibrado con cloroformo, 0.5 mL de la mezcla de los lípidos totales obtenidos. Los
lípidos neutros se eluyen con 5 mL de cloroformo y después los lípidos polares se
eluyen con 10 mL de metanol. El disolvente se elimina de la muestras con nitrógeno y
las muestras secas se disuelven en 1.5 mL de una disolución hexano/acetona 70:30
(lípidos neutros) y hexano/2-propanol 3:2 (lípidos polares) para el análisis en HPLC.
Para el análisis se usa un modulo de separación Waters 2695 dotado con un detector
Waters 2420 ELS. Los lípidos polares se analizan en un Lichrosphere 100 Diol 250-4
(5 m) a 30 ºC y con un flujo de 1 mL/min. La columna se eluye con una mezcla
hexano/2-propanol/ácido acético/ trietilamina 82:17:1:0.8 (disolvente A) y una mezcla
2-propanol/agua/ácido acético/trietilamina 85:14:1:0.08 (disolvente B). Inicialmente la
columna se equilibra con el disolvente A al 100 %, después de la inyección el
disolvente se modifica al 90 % del disolvente A y el 10 % del disolvente B durante 1
min. Entonces, se aplica un gradiente lineal de 24 min hasta el 40 % del disolvente B.
La composición del disolvente se mantiene durante 1 min y después la columna se
equilibra con disolvente A al 100 % para la siguiente inyección durante 15 min. Los
lípidos neutros se analizan en un Lichrospher Si 60 250-4 (5 mm) con fase de columna
75
Materiales y Métodos
normal a 30 ºC y con un flujo de 1 mL/min de la mezcla hexano/acetona/ácido acético
70:30:0.1 (v/v/v) como disolvente en régimen isocrático (con el mismo disolvente
durante toda la separación).
4.2.6. ANÁLISIS TERMOGRAVIMÉTRICO
En este trabajo se ha utilizado el análisis termogravimétrico (TGA) para llevar a
cabo el estudio de la descomposición de las microalgas. Se ha empleado para ello una
Termobalanza METTLER TOLEDO, modelo TGA/SDTA851e/SF/1100 (Figura 4.15).
Se ha trabajado con un caudal de nitrógeno de 50 mL/min, sometiendo a la
muestra (aproximadamente 6 mg) a un calentamiento desde 25 ºC hasta 900 ºC con
una velocidad de calefacción de 5 ºC/min.
Para la preparación de la muestra se han llevado a cabo lavados sucesivos con
agua destilada para disminuir la concentración de NaCl de la misma, controlada a
partir de la medida de conductividad; se ha centrifugado la muestra a 5000 rpm
durante 3 min y por último se ha liofilizado a -40 ºC y 1800 Pa.
Figura 4.15. Esquema de la termobalanza TGA/SDTA851.
4.2.7. PYROPROBE CONECTADO A UN CROMATÓGRAFO DE GASES
CON DETECTOR MASAS
Para la pirólisis flash de las muestras se ha utilizado el equipo pyroprobe 2000.
La cantidad de muestra pirolizada en cada experimento fue de aproximadamente 200
µg, introducidos en un capilar de cuarzo. El capilar se introduce automáticamente en el
centro de una resistencia espiral de platino que se calienta en atmósfera inerte.
76
Materiales y Métodos
En la Figura 4.16 se muestran los componentes principales del equipo. La
velocidad nominal de calefacción fue de 20 ºC/ms, con un tiempo de pirolizado de 20 s
y una temperatura nominal de 500 ºC. Los experimentos se realizaron por duplicado,
mostrando una buena reproducibilidad de los resultados.
Este dispositivo permite el arrastre rápido desde la zona de reacción (capilar de
cuarzo rodeado por la resistencia) de los productos generados en la pirólisis mediante
el flujo del gas portador (Helio). Los volátiles circulan a través de una línea de
transferencia a temperatura de 280 ºC hasta introducirse en un cromatógrafo de gases
provisto de detector de espectrometría de masas para su análisis (HP-5973 MSD). Los
volátiles generados fueron analizados utilizando la columna capilar HP-5MS (30 m de
longitud y 0,250 mm de diámetro interno). El programa del horno utilizado para el
análisis es de 38 a 320 ºC con una velocidad de 12 ºC/min después de un periodo
isotermo de 10 min. La columna se mantiene a la temperatura final durante 20 min. El
inyector se fija a una temperatura de 250 ºC. La inyección de la muestra se realiza en
modo Split (10:1). Se utiliza Helio como gas portador a una presión constante de
62742 Pa.
El análisis cualitativo del cromatograma obtenido se realizó mediante la librería
comercial WYLEY275.
Figura 4.16. Componentes principales del pirolizador Pyroprobe 2000.
77
PUBLICACIONES
5
Publicaciones
A continuación se muestra el listado de las publicaciones de las que consta la presente
tesis doctoral junto con un pequeño resumen que también se presenta antes de cada
publicación.
Publicación I.- Kinetic model for microalgae cell concentration and size distribution:
Application to Nannochloropsis gaditana. L. Catalá and A. Marcilla. En revisión, Journal
of Biochemical Engineering.
La velocidad de la división celular y otros procesos fisiológicos son función del
tamaño celular y éste varía durante todo el proceso de crecimiento. Para obtener un
valor preciso del tamaño celular y la velocidad de crecimiento de las microalgas, el
análisis de las distribuciones de tamaño de partícula es esencial.
En este trabajo se ha medido el número de células y la distribución de tamaño
de partículas de la microalga Nannochloropsis gaditana durante el proceso de
crecimiento completo, tomando varias muestras durante los distintos periodos de luz y
oscuridad.
Además, tras analizar los resultados obtenidos, se ha propuesto un modelo
cinético considerando el modelo logístico para la división celular en función del tiempo
de oscuridad y procesos de respiración celular y crecimiento durante los periodos de
oscuridad y luz, respectivamente.
Los resultados obtenidos en este trabajo han permitido cubrir los siguientes
objetivos específicos:
- Estudio de la evolución de la distribución de tamaño de partículas de la
microalga Nannochloropsis gaditana en los periodos de luz y oscuridad con el tiempo.
- Desarrollo de un modelo cinético para ajustar simultáneamente la evolución
de la concentración celular y la distribución de tamaño de partículas.
Publicación II.- Study of the evolution of the biochemical composition of outdoor
cultures of the microalgae Nannochloropsis oculata as a function of the initial nitrate
concentration. A. Marcilla, M.R. Hernández, F.J. Valdés, L. Catalá, J.C. García-
81
Publicaciones
Quesada, A. Sánchez-García, J.J. Salas, E. Martinez-Force and R. Garcés. En
revisión, Aquaculture.
Se han evaluado distintos procesos para la obtención de biodiesel, empleando
materias primas diferentes. Las microalgas pueden ser unas candidatas excelentes
para obtener este biocombustible porque contienen lípidos similares a los aceites
vegetales.
En este trabajo se ha cultivado la microalga Nannochloropsis oculata en el
exterior con reactores cerrados de tipo airlift y reactores abiertos tipo raceway. En los
reactores cerrados se ha estudiado la influencia de la concentración inicial de nitratos
en la composición bioquímica en dos etapas de crecimiento diferentes (exponencial y
estacionaria). De este modo, se pueden seleccionar las condiciones de cultivo y el
momento más adecuado para la recolección dependiendo de la aplicación que vayan a
tener las microalgas. En el caso de la producción de biodiesel, interesa obtener la
mayor productividad de lípidos posible. Además, en los reactores abiertos se ha
llevado a cabo un estudio preliminar y los resultados obtenidos se han comparado con
los obtenidos en los reactores cerrados.
Los resultados obtenidos en este trabajo han permitido cubrir los siguientes
objetivos específicos:
- Estudio de la influencia de la concentración inicial de nitratos en la
composición bioquímica de la microalga Nannochloropsis oculata cultivada en el
exterior en dos tipos de reactores: fotobiorreactores y estanques abiertos.
- Estudio de la influencia de la etapa de crecimiento en la composición
bioquímica de la microalga Nannochloropsis oculata cultivada en el exterior en
fotobiorreactores.
Publicación III.- Estimation of CO2 stripping/CO2 microalgae consumptions ratios in a
bubble column photobioreactor using the analysis of the pH profiles. Application to
Nannochloropsis oculata microalgae culture. F.J. Valdés, M.R. Hernández, L. Catalá
and A. Marcilla. Bioresource Technology 119 (2012) 1-6.
El potencial de las microalgas no se debe únicamente a su capacidad de
producir biodiesel, sino que también se debe a que consume CO2, disminuyendo de
82
Publicaciones
este modo, las consecuencias del efecto invernadero. Por lo tanto, del mismo modo
que es importante el empleo de condiciones específicas que permitan obtener
elevadas tasas de crecimiento, se debe evaluar la capacidad de fijación de CO2 por el
sistema fotobiorreactor/microalga. En este sentido, es interesante el empleo de
tecnología simple y económica para obtener información sobre estos parámetros.
En este trabajo, se cultiva la microalga Nannochloropsis oculata en un
fotobiorreactor de tipo columna de burbujas situado en el exterior. Se ha llevado a
cabo un análisis exhaustivo de los perfiles de pH y radiación fotosintéticamente activa
que se han obtenido. Además, se ha medido el coeficiente volumétrico de
transferencia de masa global para el CO2 y se ha evaluado la eficiencia del CO2 fijado
frente al CO2 perdido por arrastre en el fotobiorreactor.
Los resultados obtenidos en este trabajo han permitido cubrir los siguientes
objetivos específicos:
-
Análisis de los perfiles de pH durante el crecimiento de la microalga para
obtener
información
acerca
del
comportamiento
del
sistema
microalga/fotobiorreactor en relación con el balance neto de CO2.
-
Uso del equilibrio químico del carbonato y del coeficiente volumétrico de
transferencia de masa global de CO2 en el fotobiorreactor para obtener
información sobre las relaciones de CO2 perdido por arrastre y CO2
consumido por las microalgas.
Publicación IV.- Thermogravimetry and Py-GC/MS techniques as fast qualitative
methods for comparing the biochemical composition of Nannochloropsis oculata
samples obtained under different culture conditions. Bioresource Technology 131
(2013) 86-93.
Las microalgas tienen muchas aplicaciones, entre las que se encuentran la
producción de biodiesel o el suplemento alimenticio. Dependiendo de la aplicación, se
requiere la optimización de ciertas fracciones de la composición bioquímica (contenido
en proteínas, carbohidratos y lípidos transesterificables). Por lo tanto, muestras
obtenidas en condiciones de cultivo diferentes se deben analizar para comparar el
contenido en dichas fracciones. Sin embargo, los métodos tradicionales para la
83
Publicaciones
determinación de la composición bioquímica necesitan procedimientos analíticos de
larga duración y con tiempos de preparación de muestra extensos.
En este trabajo se ha cultivado la microalga Nannochloropsis oculata en
distintas concentraciones de nitrógeno y de radiación fotosintéticamente activa, ya que
estas variables tienen una gran influencia en la composición bioquímica.
A las muestras obtenidas en estas condiciones se les ha medido la
composición bioquímica mediante los métodos tradicionales, se han analizado
mediante análisis termogravimétrico y por pirólisis conectada a cromatografía de gases
con detector masas. Después, se ha establecido un método que permite la
comparación de la composición bioquímica de las muestras mediante la integración de
sólo 21 picos del cromatograma y por último, se ha procedido a la comparación de los
resultados obtenidos con éstas técnicas y las convencionales, observándose una
buena correlación.
Los resultados obtenidos en este trabajo han permitido cubrir el siguiente
objetivo específico:
-Estudio de la viabilidad del empleo del análisis termogravimétrico y la pirólisis
conectada a cromatografía de gases con detector masas como posibles métodos para
cualitativamente comparar la composición bioquímica
de distintas muestras de
microalgas.
Publicación V.- Comments on “Thermogravimetric analysis of microalgae combustion
under different oxygen supply concentrations” (Appl. Energy 88 (2011) 3189-3196).
J.C. García-Quesada, L. Catalá, A. Marcilla. Applied Energy 93 (2012) 212-214.
En el artículo “Thermogravimetric analysis of microalgae combustion under
different oxygen supply concentrations” (Appl. Energy 88 (2011) 3189-3196) se estudia
el comportamiento termogravimétrico de la combustión de la microalga Chlorella
vulgaris y se describe un análisis cinético basado en los métodos de KissingerAkahira-Sunose (KAS) y Flynn-Wall-Ozawa (FWO). En nuestra opinión, y teniendo en
cuenta la bibliografía existente, el análisis cinético llevado a cabo por los autores en
dicho trabajo presenta algunos puntos débiles que plantea ciertas dudas sobre su
84
Publicaciones
validez. Estos puntos débiles se discuten en este trabajo (carta al editor) y pueden ser
resumidos de la siguiente manera:
1. La complejidad de las reacciones que tienen lugar en la combustión de las
microalgas no está en concordancia con la complejidad del modelo cinético
considerado.
2. La energía de activación obtenida no es constante, como debería ser,
teniendo en cuenta las suposiciones realizadas.
3. Los parámetros cinéticos no se validan comprobando si pueden ser usados
para reconstruir las curvas cinéticas experimentales.
Publicación VI.- Review of thermochemical conversion of microalgae. A. Marcilla, L.
Catalá, J.C. García-Quesada, F.J. Valdés and M.R. Hernández. Renewable and
Sustainable Energy Reviews 27C (2013) 11-19.
Después de comprobar que existen varios trabajos en los que no se lleva a
cabo correctamente el análisis cinético, tal y como se ha puesto de manifiesto en la
publicación anterior, y la gran variedad de resultados obtenidos en las distintas
técnicas de la conversión termoquímica, se decidió realizar una revisión y
actualización del estado del arte de la investigación y el desarrollo de la conversión
termoquímica de microalgas, haciendo un especial hincapié en la licuefacción
hidrotérmica, la pirólisis, sus aplicaciones analíticas y modelado cinético.
Los resultados obtenidos en este trabajo han permitido cubrir los siguientes
objetivos específicos:
-Actualización del estado de la investigación en el campo de la conversión
termoquímica.
-Revisión actualizada del estado de la técnica en el ámbito de los aspectos
experimentales y teóricos (modelado matemático y simulación) asociados con la
pirólisis de microalgas.
85
Publicaciones
Otras publicaciones
I.- “Sistema de reactor abierto para el cultivo de microalgas”, A. Marcilla, J.C. GarcíaQuesada, A. Gómez, A. García, M.I. Beltrán and L. Catalá, P201030394, España
17.03.2010.
La invención resuelve los inconvenientes del mantenimiento de espacios naturales,
como los barrancos, las zonas medioambientalmente degradadas o los cauces de ríos
secos, por medio de un sistema de reactor abierto para el cultivo de microalgas que
comprende un reactor abierto consistente en uno de estos espacios naturales,
convenientemente habilitados para funcionar como reactor abierto.
La utilización o habilitación de estos parajes naturales para su uso como reactores
para el cultivo de algas aporta la ventaja de mantenerlos en unas condiciones
operativas como un cauce limpio, libre de obstáculos y facilita la evacuación de las
acumulaciones de agua de las riadas de su origen y su destino actual.
El sistema de reactor abierto para el cultivo de microalgas objeto de la presente
invención comprende:
- Un reactor abierto que soporta el cultivo de microalgas produciendo un cultivo final de
microalgas a partir de un cultivo de sembrado.
- Medios de sembrado para aportar un cultivo de sembrado al reactor abierto.
- Medios de aporte de agua.
- Medios de aporte de nutrientes.
II.- “Fotobiorreactor combinado tipo air-lift para la producción de biomasa”, A. Marcilla,
M.R. Hernández, F.J. Valdés and L. Catalá, P201200903, España 21.09.2012.
La presente invención presenta un nuevo sistema de agitación de los cultivos de
microalgas contenidos en fotobiorreactores verticales. El sistema presentado combina
un reactor tipo airlift y una columna de burbujas. Existen diversos diseños de
fotobiorreactores en la bibliografía, algunos de ellos solamente emplean la acción de
un sistema airlift para la agitación del cultivo. En este caso, se plantean una serie de
86
Publicaciones
inconvenientes puesto que la agitación alcanzada no es capaz de evitar, por ejemplo,
la deposición del cultivo en las paredes del fotobiorreactor, hecho que reduce la
llegada de luz al interior del cultivo.
La acción combinada del airlift y la columna de burbujas favorece una serie de
aspectos como es una mejor agitación del cultivo, evitándose la aparición de zonas
oscuras en el mismo que retardan el crecimiento de las microalgas, evitar la
deposición de microalgas en las paredes del fotobiorreactor, hecho que dificulta la
penetración de la luz en el cultivo o un mejor aprovechamiento del CO2 y por tanto
menor consumo del mismo.
87
Publicaciones
Publicación I. Kinetic model for microalgae cell concentration and size distribution:
Application to Nannochloropsis gaditana. L. Catalá and A. Marcilla. En revisión,
Journal of Biochemical Engineering.
P.I
La velocidad de la división celular y otros procesos fisiológicos son función del
tamaño celular y éste varía durante todo el proceso de crecimiento. Para obtener un
valor preciso del tamaño celular y la velocidad de crecimiento de las microalgas, el
análisis de las distribuciones de tamaño de partícula es esencial.
En este trabajo se ha medido el número de células y la distribución de tamaño
de partículas de la microalga Nannochloropsis gaditana durante el proceso de
crecimiento completo, tomando varias muestras durante los distintos periodos de luz y
oscuridad.
Además, tras analizar los resultados obtenidos, se ha propuesto un modelo
cinético considerando el modelo logístico para la división celular en función del tiempo
de oscuridad y procesos de respiración celular y crecimiento durante los periodos de
oscuridad y luz, respectivamente.
Los resultados obtenidos en este trabajo han permitido cubrir los siguientes
objetivos específicos:
- Estudio de la evolución de la distribución de tamaño de partículas de la
microalga Nannochloropsis gaditana en los periodos de luz y oscuridad con el tiempo.
- Desarrollo de un modelo cinético para ajustar simultáneamente la evolución
de
la
concentración
celular
y
la
distribución
de
tamaño
de
partículas.
89
EVOLUTION OF MICROALGAE SIZE DISTRIBUTION WITH TIME AS A TOOL
TO OBTAIN INFORMATION ABOUT THE MICROALGAE GROWTH PROCESS.
KINETIC MODEL FOR CELL CONCENTRATION AND PARTICLE SIZE
DISTRIBUTION: APPLICATION TO Nannochloropsis gaditana
L. CATALÁ* and A. MARCILLA
Department of Chemical Engineering, University of Alicante, Ap.99, P.O.Box 03080, Spain
*Corresponding author. Tel.: +34965902953; fax: +34965903826. E-mail address:
[email protected]
ABSTRACT
Cell number and particle size distribution of the microalgae Nannochloropsis gaditana
were studied during the whole growth process and different samples were taken during the
light and dark periods. The distributions have positive skew and no variation of the type of
curve was observed during the growth process. Only the division process was not able to
describe the evolution of the size distribution observed. Therefore, the specific growth rate
and the Logistic growth models can not explain properly the cell concentration and particle
size distribution evolution with time unless only dark periods time is considered. A
satisfactory fitting for particle size distribution curves was obtained when a kinetic model
including a slimming process suffered by the cells during the dark period and a fattening
process suffered by the cells during the light period, was applied. This model provides a
closer approach to reality than the Logistic model.
Keywords: microalgae, growth rate, coulter counter, size distribution.
1. INTRODUCTION
Photosynthetic microalgae are organisms that can convert solar energy into biomass
with high efficiency and multiplication rates (Thomas et al., 1984). Their growth rates and
photosynthetic activities are widely higher than superior plants, representing more than 90%
of the photosynthetic activity in the Earth (Bitaubé et al., 2008).
In recent years, the study of different aspects related to the behavior of microalgae has
received renewed interest due to the wide field of application of these microorganisms. Algae
cultures have been principally developed as an important source of many products, such as
aquaculture feeds, human food supplements, and pharmaceuticals (Apt and Behrens, 1999;
91
Rebolloso et al., 2001; Pulz and Gross, 2004), and they have also been suggested as a very
good candidate for fuel production (Schenk et al., 2008). For example, several papers have
been published showing the possibility to obtain biodiesel fuel from the lipids accumulated in
the microalgae cells (Chisti, 2007, 2008; Mazzuca et al., 2008; Mata et al., 2010). On the
other hand, the use of microalgae as an alternative route to obtain fuel products would allow
reducing the current dependence with petroleum and, in this sense, important environmental
benefit could be obtained related to the possibility of using microalgae as CO2 storage
organisms.
Nevertheless, microalgal commercial production has been limited by high production
costs. Currently, the cost of producing algal biomass, for example, is still one order of
magnitude higher than that of producing protein from conventional sources. Although many
efforts are being made to reduce the production costs by developing efficient
photobioreactors, installing and operating artificial light sources remains expensive. In this
regard, the utilization of solar energy is thought to be the only way of achieving commercial
production of most cheap algal products (Ogbona and Tanaka, 1996).
The microalgae grown in external conditions present light-dark cycle variations that can
modify important aspects related to cell microalgae such as size. In this sense, microalgae
exhibit a naturally phased cell division which occurs only during a particular time of the day,
generally at dark (Otero and Goto, 2005). During dark (i.e., when the light intensity is too low
to support cell growth), the cells do not grow but respire to maintain themselves. In the
absence of light, energy or some other metabolizable organic carbon source in the medium,
cells metabolize the cell components to obtain maintenance energy, thus leading to a decrease
in cell weight. It has been reported that up to 35% of biomass produced during the daylight
period may be lost through respiration at night (Ogbona and Tanaka, 1996).
Microalgal cell growth rates are affected by a combination of environmental parameters
such as light intensity, photoperiod, temperature, and nutrient composition in the culture
system (Kitaya et al., 2008). Parmar et al. (2011) in their review article mentioned that the
light intensity and photoperiod (light and dark) cycles are the prime factors that determine the
growth rate of microalgae cultivation. For photoautotrophic culture, the light regime and
photoperiod are the critical components in determining the biomass production of a culture
(Wahidin et al, 2013).
Understanding the kinetics of algae growth plays an important role in improving algae
cultivation technology since it is an important parameter for determining the suitability of
algae culture for commercial or large scale mass production (Govindarajan et al., 2010).
92
Growth is defined as an increase in living substance, usually the number of cells for
unicellular microorganisms (Tomaselli, 2004). Some classic growth models such as that of
Monod are based on the specific growth rate and consequently, in most of the growth kinetics
and photosynthetic cell growth models, the specific growth rate during the exponential growth
phase is used as growth parameter (Ogbona et al., 1995).
The specific growth rate is usually obtained as
(1)
where Nt and N1are the cell number at time t and t1, respectively, and  is the growth rate
(Wahidin et al., 2013). It defines the fraction of increase in biomass over a unit of time.
Specific growth rate represents the average growth rate of all cells present in the culture, as
most microbial cultures divide asynchronously (Lee and Shen, 2004).
As the growth phases of microalgae proceed through lag phase, exponential phase and
stationary phase, the Logistic model can be used to fit the whole time course of the cell
concentration (Yang et al., 2006)
(2)
where Nf and Noare the cell number at stationary phase and initial time, respectively, and max
is the maximum growth rate, which can thus be obtained after nonlinear-fitting.
Size dependent growth rate have been reported in many references, indicating that cell
division rates and other physiological processes are a function of cell size (Eppley and Sloan,
1966; Taguchi, 1976; Makoto, 1991; Ogbona et al., 1995, Yang et al, 2006). Cell size varies
throughout the growth process (Makoto, 1991; Nobuaki et al., 2002), and in order to get an
accurate value of cell size and microalgae growth rate, analysis of size distributions is
essential. Nevertheless, to our knowledge, there are no papers related with the variation of
size distributions during the light/dark cycles.
The purpose of this study is to investigate the size distributions of the microalgae
Nannochloropsis gaditana during the light/dark cycles, in order to obtain a better
understanding of the microalgae growth process and develop a kinetic model to fit
simultaneously cell concentration and particle size distribution curves.
2. MATERIALS AND METHODS
2.1. Microalgae and experimental conditions
93
Nannochloropsis gaditana obtained from Fitoplancton Marino S.L. (Cadiz, Spain) was
used in the present study. The microalgae have been cultivated in 6 liter flasks situated in a
clean room to create a particle free environment. The medium for the microalgae growth was
natural sea water from the “Golfo de Mazarrón” (Spain) enriched with f/2 modified (nutrient
solution with a concentration double than the f/2 (Guillard and Ryther, 1962)) supplied by
Fitoplancton Marino S.L. The cultures have been illuminated with a 40 W fluorescent tube on
a 8:8 h light/dark cycle. The ambient temperature has been kept at 18 ºC and each culture has
been artificially aerated.
Samples were taken every 2 h from 7:30 h in the morning, when the change between
light/dark takes place, until 15:30 in the afternoon, when the change between light/dark takes
place again. Thus, every day samples were taken in different periods (as it is possible to see in
Table 1) and four cycles were measured.
The evolution of the culture has been evaluated by measuring the optical density at 540
nm every day. The dry weight of the cultures (g/L) was obtained through a correlation
previously obtained, i.e. dry weight (g/L) = 0.33·OD540 (R2 = 0.99).
The number of cells per unit of volume has been determined by placing the cells in a 0.1
mm deep counting Neubauer chamber using a light microscope.
Information about the particle size distribution has been obtained using a Coulter LS230
able to measure particles from 0.04 m to 2000 m.
3. RESULTS AND DISCUSSION
3.1. Dry weight and cell number
It can be seen from Figure 1a that the number of cells per unit of volume increased
during the dark period and it remained almost constant during the light period, however, as
presented in Figure 1b, the dry weight followed the opposite trend, during the dark period it
was practically constant and during the light period it increased. This is in concordance with
the fact that during the dark period cell division takes place (Otero and Goto, 2005) and
during the light period cell growth occurs.
The final cell concentration was 1.18·108 cell/mL representing an increase of 9.9·107
cell/mL in 248 h. The final dry weight was 0.45 g/L and the productivity was 0.0142 g/(Lh).
3.2. Kinetic modeling of cell concentration
Generally, samples are taken every 24 h and the cell concentration is fitted by the
Equation 1. The value of the growth rate obtained for the exponential growth phase (max) is
94
0.012 h-1, which is similar to that found by Wahidin et al. (2013) for the microalgae
Nannochloropsis sp.
Using the Logistic model the fit obtained is quite good as it can be seen in Figure 2a if
only the samples taken at 7:30 in the morning are taken into account. The value of the
maximum growth rate obtained is 481863 cell/mL h. Nevertheless, if a more detailed analysis
is done and all the samples are considered, then, the fit obtained is not so good, as it is shown
in Figure 2b. Obviously the model can not represent the detail of the dark/light cycles since it
is not considered in the equation. Thus, it is a type of averaging model not considering the
detail of the actual process and only taking into account the division process that occurs
during the dark period. Therefore, the Logistic model has been applied only considering the
time that microalgae have remained under dark conditions. In this case, as it is possible to see
in Figure 2c, the fit obtained is really good and it allows to predict the experimental behavior
observed quite well. In this case, the value of the maximum growth rate obtained is 94992
cell/mL h darkness.
Consequently, since during the light and dark periods different processes take place,
they have been modeled independently and the kinetic model proposed for fitting the cell
concentration is a discontinuous function.
For light periods, the number of particles is supposed to remain constant and for dark
periods, it has been calculated by a modification of the Logistic model:
(3)
where tdarkness is calculated for each time t as the time that the culture has remained under dark
conditions up to this time.
The results obtained are shown in Figure 2d. The fitting of the evolution of the cell
concentration obtained is better than the one obtained by the Logistic model (Figure 2b)
because with the proposed model it has been considered the different behavior that cells
undergo in the light/dark cycles.
3.3. Particle size distribution
Figure 3a shows the particle size distribution in terms of differential percentage of
particle number corresponding to each cell size for the first and the fourth cycles. The second
and the third cycles have not been included since they followed the same trend. The
distributions have been normalized in order to compare the curves obtained during the whole
95
process. It can be seen from Figure 3a that Nannochloropsis gaditana showed a distribution
with positive skew since the right tail is longer; the mass of the distribution is concentrated on
the left of the figure. This distribution is said to be right-skewed, right-tailed, or skewed to the
right. No variation of the type of size distribution during the growth process was observed.
If each cycle is separately analyzed, the same trend is observed, during the dark period
the size distribution shifted to lower diameters (Figure 3b) while during the light period the
opposite behavior occurred (Figure 3c). The fact that particle size is displaced to lower values
in the dark period is in agreement to the standard behavior of microalgae due to cell division
is produced in the dark period. Moreover, during the growth process, from one cycle to the
next one, a slight decrease in the shift to lower diameters for the dark period (i.e. in Figure 3b
the difference between the bars corresponding to 0 and 8 h of dark in each cycle decreases)
and to higher diameters for the light period (i.e. in Figure 3c the difference between the bars
corresponding to 0 and 8 h of light in each cycle decreases) can be observed. Yang et al.
(2006) stated that variation of size distribution during the growth process is probably related
to the development of the colony since in the same way that diurnal changes in cell diameter
may be attributable to its daily growth process.
On the other hand, it can be clearly observed that the distribution shifted to larger cell
diameters during the growth process (Figure 3b and 3c). This fact is in concordance with the
results obtained in previous studies where N-limitation leads to an increase in individual cell
volume (Sterner et al., 1993; Van Donk et al., 1997; Dean et al., 2010).
Yang et al. (2006) also observed no variation of the type of size distribution during the
growth for the phytoplankton species Chaetoceros curvisetus, Skeletonema costatum,
Phaeodactylum tricornutum, Platymonas helgolandic, and Heterosigma akashiwo. However,
Gymnodinium sp. and Prorocentrum micans showed first a normal distribution with a singlepeak in the lag growth stage and then shifted to a double-peak in the exponential stage. In
spite of this fact, none of the distributions obtained by Yang et al. (2006) showed a positive
skew and the size distribution with a single peak could be well described by the original
Gaussian distribution function and curves with doubled peak by the combined Gaussian
distribution. In the case of Nannochloropsis gaditana, we are not aware of other reports about
the size distribution during the growth process and as the particle size distribution curves are
not symmetric, as it can be seen in Figure 4a, they can not be well fitted neither by a Gaussian
distribution (Equation 4) nor by a log normal distribution (Equation 5) although the latter
function can provide asymmetric curves.
96
(4)
(5)
where y is the cell number percentage, σ is the standard deviation, μ is the median equivalent
spherical diameter and x is the cell equivalent spherical diameter.
3.4. Kinetic modeling of particle size distribution
The growing process of a microalgae culture is more complex than what the specific
growth rate model and the Logistic model predict. Both, population and their size, change
with time and those models only consider the change in number, in addition, they do not
contemplate the light and dark periods, but only the time. With the aim of obtaining a deeper
insight of the microalgae growth, particle size distributions must be modeled to explain the
experimental observations during both, dark and light periods. Thus, a kinetic model has been
developed taking into account cell division and a slimming process, in order to explain the
shift of the curves to lower sizes during the dark periods, and a fattening process, to model the
shift to larger sizes occurring in the light periods.
The slimming process has been included in the model for the undivided particles since
only with the cell division is not possible to explain the evolution of the particle size
distribution curves with time during the dark cycles (data not shown). This assumption was
introduced based in previous results showed in the literature. Torzillo et al. (1991a) observed
in experiments carried out in a tubular photobioreactor with Spirulina Platensis that the rates
of night biomass loss ranged from 5-7.6 % depending on the temperature. Grobelaar and
Soeder (1985) for the algae Coelastrum sphaericum and Scenedesmus falcatus estimated that
the overall loss during 12 h of darkness was between 2–10% of the biomass prior to
darkening. Sukenik et al. (1991) reported that, under optimal operational conditions, the
diurnal respiration loss of the microalga Isochrysis galbana averaged 35% of the daylight
photosynthesis. Torzillo et al. (1993) estimated the night loss of Spirulina cultures grown in
tubular bioreactor outdoors to be from 12 to as much as 42% of daylight productivity. Night
biomass loss of Chlorella sp. grown in our thin-layer bioreactors was 9–14% (Doucha and
Lívanský 2006).
As it has been done with the model for cell concentration, since during the light and
dark periods different processes take place, they have been modeled independently, therefore
97
a discontinuous function has been proposed for the kinetic model of the particle size
distribution.
Thus, the model is based on the following assumptions:
- The number of particle follows almost a straight line with time in each dark period
(Figure 1a), therefore, it has been supposed that the slope is constant for each period
and equal to the division factor fd.
(6)
where Nop is the number of particles when each period starts.
- The slimming and fattening processes are characterized by the factors fs and ff,
respectively, and they are defined by the following equations:
(7)
(8)
where Dop is the diameter of the original particles when each period starts, Dup is the diameter
of the undivided particles after the slimming process that takes place during the dark period
and Dp is the diameter of the particles after the fattening process occurring during the light
period.
- Only undivided particles lose weight due to the slimming process.
- Cell death is not considered since dead cells continue in the culture and they are also
counted by the Neubauer chamber and the Coulter Counter.
To enable the proper calculation to be done, the particle size distribution curves must be
properly fitted. To that end, it has been proposed a change of variable that allows, through the
use of the Gaussian distribution function, to obtain a good fit of the curves and to operate
them in a relatively easy way. This procedure yields very good results that allow the
combinations of particle size distributions to be done with a very good accuracy and thus
apply the kinetic model considering the fattening and slimming factors.
The Gaussian distribution function has been redefined as:
(9)
where A, B and C are parameters to optimize and y is a new variable defined to obtain an
adequate fit of the distribution. Equations 10-13 define the variables in Equation 9:
98
(10)
(11)
(12)
(13)
where dp, dpo and dpf are the particle diameter at time t, zero and final, respectively, and C, D,
E and F are parameters to optimize.
As it is possible to see in Figure 4b, the fit obtained with this procedure is much better
than the one obtained by the original Gaussian distribution function for symmetric curves or
the log normal distribution for asymmetric curves (Figure 4a).
Once, the particle size distribution have been properly fitted it is possible to model the
evolution with time of the curves during the light and dark periods.
3.4.1. Kinetic modeling the dark period distribution
The procedure carried out for each dark period is sketched in Figure 5a. Firstly, the
values of the division factor have been calculated taking into consideration its definition
(Equation 6) and that the kinetic model proposed for cell concentration (Equation 3) can
properly fit the experimental values (Figure 2d). The values of the division factor obtained
experimentally and calculated by combination of Equations 3 and 6 are shown in Table 2.
Secondly, the distribution obtained when the dark period starts is fitted by Equations 9-13 to
obtain the equation representing the size distribution function of the divided particles. Next,
the diameter of the particles originated from division (Ddp) is calculated taking into account
that the original particle is divided into two particles, therefore, the volume of the divided
particle Vdp is half the volume of the original particle Vop.
. Once
the diameter is calculated, the number of particles with each diameter is obtained through the
calculated division factor fd (Ndp=2·Nop·fd) and the corresponding parameters A-F (Equation
9-13) are obtained for the divided fraction. On the other hand, the diameter of the undivided
particles that lose weight (Dup) is calculated taking into account the definition of the slimming
factor fs (Equation 7) and the number of undivided particles Nup is calculated through the
calculated division factor fd (Nup=Nop·1-fd)). Then, the parameters A-F of the non-divided but
slimmed fraction are obtained for the guessed fs. Finally, the new distribution function, that is,
99
the number of particles at time t, is obtained as the sum of the values of the divided and
undivided particles (Np=Nup+Ndp) having the same diameter. The squared sum of the
difference with the experimental value for each diameter is the objective function to be
optimized as a function of fd and fs.
Table 2 shows the values of the division and slimming factors obtained for each sample
for every cycle. If the values of each cycle are analyzed separately, it is possible to see that
the slimming factor increased with time in the dark period. This increase was lower as the
number of cycles increased. Moreover, if the values from the different successive cycles are
compared it is observed that they decreased getting closer to 0 what means that cells
decreased their size less due to the respiration process when biomass concentration increased
and therefore the available irradiance for the cells decreased.
These results are in agreement with those obtained by Torzillo et al. (1991b) and
Masojídek et al. (2003). These authors reported that the biomass concentration strongly
influence this parameter. It was concluded that the night biomass loss depended on the
temperature and irradiance experienced by the cells in the preceding day, due to significant
effect of both temperature and irradiance on the cell composition. Cells exposed to a high
irradiance direct biomass synthesis towards carbohydrates, which can be used as a sink to
store an excess of reducing power. However, during night carbohydrates are lost due to dark
respiration, thus increasing the biomass loss during night.
In general, the fitted achieved is good (Table 2) and in Figure 6a the results of the
samples obtained after 8 hours of dark in each cycle are shown as an example of the quality of
the fit attained.
3.4.2. Kinetic modeling during the light period.
The procedure carried out for each light period is represented in Figure 5b. Firstly, the
distribution obtained when the light period starts is fitted by Equations 9-13. Next, the
diameter of the particles that gain weight (Dp) is calculated taking into consideration the
definition of the fattening factor ff (Equation 8) and the number of particles is the same since
the division process occurs during the dark period. Then, the fit of the parameters A-F
depending on the guessed ff is done by Equations 9-13 to obtain the equation representing the
size distribution function of the fattened particles. Finally, the new distribution function for
the original diameters is calculated with the optimized parameters obtained and the sum of the
squared difference of the calculated and experimental values for each diameter is the objective
function to optimize as a function of the guessed fattening factor.
100
Table 3 shows the values of the fattening factor obtained for each sample for every
cycle. If the values of each cycle are analyzed separately, it is possible to see that the fattening
factor increased with time in the light period. This increase was lower as time increased.
Moreover, if the values from the different cycles are compared, as time increased, it is
observed that the fattening factor was lower and getting closer to 0 what means that cells did
not gain weight due to nutrients were progressively exhausted.
The results of the samples obtained after 8 hours of light in each cycle are shown Figure
6b as an example of the quality of the fit attained.
This procedure allows a deeper insight in the cell culture studied, providing a more
complete picture than the Logistic model and other growth model, since both cell
concentration and particle size distribution are fitted simultaneously thereby obtaining
information that would not be obtained by only adjusting the cell concentration. This point of
view and information are very useful and set the basis of the analysis and optimization of the
duration of the light and dark cycles to be chosen depending on the desired application of the
microalgae.
4. CONCLUSIONS
During dark periods size distribution shifted to lower diameters while in light periods
the opposite behavior occurred. Throughout growth process, distribution shifted to larger cell
diameters and differences between initial and final distribution of each period were lower. A
model has been proposed and successfully applied using factors associated to the slimming
suffered by cells during respiration and the cells fattening during light periods. The model
provides a picture closer to the reality of culture growth and evolution and a clear effect of
light and dark periods on the different mechanism of cell number and diameter evolution with
time.
ACKNOWLEDGEMENTS
The Authors wish to thank Repsol YPF for the financial support that provided (Project
reference: Ingenio 2010-CDTI-Sost CO2-CEN-2008-1027) and the Generalitat Valenciana by
the fellowship of one of the authors (Program VALI + D).
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104
TABLE CAPTIONS
Table 1. Samples taken during the growth experiment and their light/dark condition.
Table 2. Results from the fitting of particle size distribution for dark periods.
Table 3. Results from the fitting of particle size distribution for light periods.
105
FIGURE CAPTIONS
Figure 1. Nannochloropsis gaditana growth evolution with time of a) cell number
for the microalgae and b) dry weight.
Figure 2. Kinetic analysis of the Nannochloropsis gaditana growth. a) Logistic
Model and the experimental points result of taking samples only every 24 hours. b)
Logistic Model and all the experimental results. c) Logistic Model only taking into
account the dark periods. d) Kinetic model proposed, the solid line represents the results
fitted by Equation 3.
Figure 3. a) Number percentage of Nannochloropsis gaditana evolution with time
used in the growth experiment (first cycle: from 0 h (0 h of dark) to 32 h (8 h of light
and fourth cycle: from 216 h (0 h of light) to 248 h (8 h of dark)). b) Values of the cell
diameter with higher abundance for the dark periods of each cycle. c) Values of the cell
diameter with higher abundance for the light periods of each cycle.
Figure 4. Kinetic analysis of the Nannochloropsis gaditana particle size
distribution. a) Using the Gaussian distribution function (Equation 4) and log normal
distribution function (Equation 5). b) Using the change of variable proposed in
Equations 9-13.
Figure 5. a) Scheme of the calculating proposed in the second model for the dark
period. b) Scheme of the calculating proposed in the model for the light period.
Figure 6. Results of the kinetic model for cell concentration and particle size
distribution. a) Nannochloropsis gaditana cell size distribution for the dark period, the
solid lines represent the results fitted by the model proposed, from top to bottom: first
cycle, second cycle, third cycle and fourth cycle. b) Nannochloropsis gaditana cell size
distribution for the light period, the solid lines represent the results fitted using the
fattening factor and the points the experimental values, from top to bottom: first cycle,
second cycle, third cycle and fourth cycle.
106
TABLES
Table 1
First cycle
Time
(h)
Sample
Second cycle
Time
(h)
Sample
Third cycle
Time
(h)
Sample
Fourth cycle
Time
(h)
Sample
0
0 h of dark
48
0 h of dark
168
0 h of light
216
0 h of light
2
2 h of dark
50
2 h of dark
170
2 h of light
218
2 h of light
4
4 h of dark
52
4 h of dark
172
4 h of light
220
4 h of light
6
6 h of dark
54
6 h of dark
174
6 h of light
222
6 h of light
8
8 h of dark
56
8 h of dark
176
8 h of light
224
8 h of light
24
0 h of light
72
0 h of light
192
0 h of dark
240
0 h of dark
26
2 h of light
74
2 h of light
194
2 h of dark
242
2 h of dark
28
4 h of light
76
4 h of light
196
4 h of dark
244
4 h of dark
30
6 h of light
78
6 h of light
198
6 h of dark
246
6 h of dark
32
8 h of light
80
8 h of light
200
8 h of dark
248
8 h of dark
107
Table 2
Cycle
1
2
3
4
Time (h)
2
4
6
8
2
4
6
8
2
4
6
8
2
4
6
8
fd experimental(1)
0.054
0.091
0.151
0.231
0.046
0.068
0.114
0.168
0.024
0.044
0.064
0.080
0.016
0.022
0.034
0.048
fd calculated(2) fs calculated(3) Objective function
0.046
0.073
0.007
0.095
0.113
0.008
0.145
0.173
0.010
0.197
0.287
0.010
0.042
0.052
0.003
0.084
0.080
0.006
0.128
0.118
0.006
0.174
0.183
0.011
0.019
0.022
0.004
0.037
0.040
0.004
0.055
0.062
0.005
0.072
0.084
0.006
0.012
0.014
0.001
0.023
0.025
0.003
0.034
0.039
0.004
0.045
0.072
0.005
(1) Obtained from fd definition (Equation 6)
(2) Obtained from the fitting of the experimental values of the number of
particles by the combination of Equations 3 and 6.
(3) Obtained from the fitting of the experimental values of the particle size
distribution by Equations 9-13.
108
Table 3
Cycle
1
2
3
4
Time (h)
2
4
6
8
2
4
6
8
2
4
6
8
2
4
6
8
ff calculated(1) Objective function
0.053
0.090
0.050
0.159
0.051
0.240
0.047
0.349
0.033
0.076
0.031
0.129
0.033
0.203
0.038
0.284
0.025
0.059
0.025
0.102
0.027
0.147
0.030
0.208
0.019
0.051
0.019
0.074
0.021
0.099
0.024
0.130
(1) Obtained from the fitting of the experimental values of the particle size
distribution by Equations 9-13.
109
FIGURES
a)
b)
Figure 1
110
Cell concentration (·107 nº cells/mL)
14
Calculated with the Logistic Model
12
Experimental
10
8
6
4
2
0
0
50
100
150
Time (hours)
200
250
200
250
a)
Cell concentration (·10 7 nº cells/mL)
14
Calculated with the Logistic Model
12
Experimental
10
8
6
4
2
0
0
50
100
150
Time (hours)
b)
111
Cell concentration (·10 7 nº cells/mL)
14
12
10
8
6
4
Calculated with the Logistic Model only taking
into account the dark periods
2
Experimental
0
0
20
40
60
80
Time (hours)
100
120
140
c)
14
Cell concentration (·10 7 cells/mL)
12
10
8
6
4
2
0
0
50
100
150
Time (hours)
d)
Figure 2
112
200
250
First cycle
Fourth cycle
a)
2.0
0 h of dark
1.8
8 h of dark
Cell diameter (m)
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
Cycle 1
Cycle 2
Cycle 3
Cycle 4
b)
2.0
0 h of light
1.8
8 h of light
Cell diameter (m)
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
Cycle 1
Cycle 2
Cycle 3
Cycle 4
c)
Figure 3
113
Normalized cell number
0.85
0.80
0.75
0.70
0.65
0.60
0.55
0.50
0.45
0.40
0.35
0.30
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
Experimental
Calculated with the Gaussian
distribution function
Calculated with the log normal
distribution
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0
Cell diameter (m)
Normalized cell number
a)
0.85
0.80
0.75
0.70
0.65
0.60
0.55
0.50
0.45
0.40
0.35
0.30
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
Experimental
Calculated with the change of variable
0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0
Cell diameter (m)
b)
Figure 4
114
fd calculated by combination of Equations 3 and 6
a)
115
Equations 9-13 and
parameters A-F
obtained for Dfp and
Nop
b)
Figure 5
116
a)
117
b)
Figure 6
118
Publicaciones
Publicación II. Study of the evolution of the biochemical composition of outdoor
cultures of the microalgae Nannochloropsis oculata as a function of the initial nitrate
concentration. A. Marcilla, M.R. Hernández, F.J. Valdés, L. Catalá, J.C. GarcíaQuesada, A. Sánchez-García, J.J. Salas, E. Martinez-Force and R. Garcés. En
revisión, Aquaculture.
Se han evaluado distintos procesos para la obtención de biodiesel, empleando
materias primas diferentes. Las microalgas pueden ser unas candidatas excelentes
para obtener este biocombustible porque contienen lípidos similares a los aceites
vegetales.
En este trabajo se ha cultivado la microalga Nannochloropsis oculata en el
exterior con reactores cerrados de tipo airlift y reactores abiertos tipo raceway. En los
reactores cerrados se ha estudiado la influencia de la concentración inicial de nitratos
en la composición bioquímica en dos etapas de crecimiento diferentes (exponencial y
estacionaria). De este modo, se pueden seleccionar las condiciones de cultivo y el
momento más adecuado para la recolección dependiendo de la aplicación que vayan a
tener las microalgas. En el caso de la producción de biodiesel, interesa obtener la
mayor productividad de lípidos posible. Además, en los reactores abiertos se ha
llevado a cabo un estudio preliminar y los resultados obtenidos se han comparado con
los obtenidos en los reactores cerrados.
Los resultados obtenidos en este trabajo han permitido cubrir los siguientes
objetivos específicos:
- Estudio de la influencia de la concentración inicial de nitratos en la
composición bioquímica de la microalga Nannochloropsis oculata cultivada en el
exterior en dos tipos de reactores: fotobiorreactores y estanques abiertos.
- Estudio de la influencia de la etapa de crecimiento en la composición
bioquímica de la microalga Nannochloropsis oculata cultivada en el exterior en
fotobiorreactores.
119
P.II
STUDY OF THE EVOLUTION OF THE BIOCHEMICAL COMPOSITION OF
OUTDOOR CULTURES OF THE MICROALGAE NANNOCHLOROPSIS OCULATA
AS A FUNCTION OF THE INITIAL NITRATE CONCENTRATION
Antonio Marcillaa, Lucía Cataláa*, Mª del Remedio Hernándeza, Francisco J.
Valdésa, Juan Carlos García-Quesadaa, Alicia Sánchez-Garcíab, Joaquín J. Salasb,
Enrique Martínez-Forceb and Rafael Garcésb
a Department of Chemical Engineering, University of Alicante P.O. Box 99, Alicante
(Spain)
b Instituto de la Grasa, CSIC. Av. Padre García Tejero, 2. 41012 Sevilla (Spain)
*mail: [email protected]
Abstract
Studies to find alternatives to fossil fuels are very common in the literature.
Different processes to obtain biodiesel have been evaluated, employing different raw
materials. Microalgae can be an excellent candidate to obtain such fuel because they
contain lipids very similar to those of vegetable oils.
This paper presents the culture of microalgae biomass and lipid accumulation in
an outdoor, pre-industrial scale photobioreactor. For this, the evolution of the
biochemical composition of outdoor cultures of the microalgae Nannochloropsis oculata
when employing different initial nitrate concentration has been evaluated, to determine
the best culture conditions. The influence of initial nitrate concentration has been
studied in different growth stages to establish the relation among harvesting time and
proportion and composition of lipids. Results from closed photobioreactors are
compared with those obtained in open reactors.
Results obtained show that lipid accumulation increased in the stationary growth
phase with respect to the exponential. This value is higher when a lower initial nitrate
concentration is used. With high initial nitrate concentration, transesterified lipids
contained in cells are long chain and unsaturated, being the eicosapentaenoic acid
methyl ester one of the main components of this biochemical fraction in both
photobioreactors configurations studied.
Keywords: microalgae, lipids, proteins, carbohydrates, bioreactors, scale-up.
121
1. Introduction
Nowadays, one of the most important energetic worries is the shortage of fossil
fuels. In Spain, along a year, from December 2011 to November 2012, the
consumption of these fuels represented around 44 % of the consumption of primary
energy (IDAE, 2013).
It is necessary to find renewable fuels in order to reduce the fossil fuels
dependence. This situation has led to the development of alternative fuels such as
biodiesel. Biodiesel is a biodegradable and renewable fuel obtained from the fatty acids
present in oils by a transesterification process where an alcohol reacts with a molecule
of acylglyceride to produce mono alkyl esters (Antolín et al., 2002; Antunes et al., 2008;
Bautista et al., 2009; Dorado et al., 2004; Helwani et al., 2009; Kulkarni and Dalai,
2006; Marchetti et al., 2007; Meher et al., 2006; Van Gerpen, 2005; Yang and Xie,
2007).
Large-scale development of biodiesel would displace cropland of the current
sources of biodiesel (for example, soybean or sunflower) devoted to food crops (Lie et
al., 2008). In this way, it is necessary to find raw materials different from the traditional
oil seed crops for biodiesel production.
Microalgae appear as a promising alternative to higher plants in this end,
because lipids present in microalgae are chemically similar to those present in vegetal
oils, they grow much faster and do not compete with croplands.
The use of microalgae presents several advantages such as not requiring land
areas due to they grow in aquatic medium. In addition to this, the photosynthetic
efficiency of microalgae is higher than that shown by higher plants, so the use of this
kind of microorganisms can reduce the atmospheric CO2 and the greenhouse gases
effects.
Another interesting aspect of the microalgae is that their biochemical composition
can be modulated by varying their growth conditions, so the oil content or the presence
of certain valuable products such as polyunsaturated fatty acids can be increased
(ugoala et al., 2012).
In this respect, many studies exist in the literature employing different species of
microalgae and modifying different aspects of their growth.
Rodolfi et al. (2009) evaluated the lipid accumulation in the Nannochloropsis sp.
by modifying the nutrients supplied and the irradiance. They observed that fatty acids in
the microalgae increase with high irradiances and in nitrogen and phosphorous
deprivation.
Widjaja et al. (2009) used the microalgae Chlorella vulgaris in order to evaluate
the increase of lipid production by varying different aspects such as CO2 concentration,
122
nitrogen depletion, harvesting time and the method of extraction. They found that these
variables can modify the amount of lipids present in the microalgae. Moreover, the
content of triglycerides decreased when biomass was dried at temperatures higher
than 60 ºC and cultivating in nitrogen depletion media caused an increase of total lipid
content and a change in the lipid composition.
The effect of CO2 on the accumulation of lipids in the N. oculata has been studied
by Chiu et al. (2009). In this paper is shown that increasing cell density and preadapting microalgal cells in an adequate CO2 concentration, allows high CO2 aeration
without drastic harmful effects on microalgal cell growth.
On the other hand, the scalability of microalgae growth systems is the main
drawback to be overcome to achieve the commercialization of microalgae-based
biofuels (Quinn et al., 2011). To date, most of the studies have been carried out in
small scale indoor photobioreactors and there is little published data on the productivity
of microalgae in outdoor growth systems. The use of outdoor photobioreactors or open
pond systems is likely to be the only feasible way to grow the large amount of
microalgae that would be required for energy purposes (Mata et al., 2010). Moreover,
in the case of the microalgae N. oculata, we have found no reports studying outdoor
cultures or the use of growth systems with a working volume higher than 240 L (Chiu et
al., 2009; Hodgson et al., 1991; Quinn et al., 2012; Su et al., 2011), all of them were
photobioreactors and we neither have found data on open pond systems.
Thus, the objective of the present work is to evaluate the influence of the variation
of initial nitrate concentration in the culture medium on the outdoor growth of N. oculata
in two types of pilot scale reactors, i.e. photobioreactors and open ponds. The influence
of this variable has been evaluated on the biochemical composition of the microalgae
in two different growth stages of the cultures from the photobioreactors; i.e.: the third
day from the beginning of the experiment (exponential phase) and the eighth day of
culture (stationary phase). In addition to this, the more adequate moment for cell
harvesting can be stated, depending on the initial growth conditions, to obtain the
highest proportion of lipids in microalgae. Moreover, a preliminary study in open
reactors has been carried out and the results obtained have been compared with those
obtained in photobioreactors. For these reasons, the data reported may be of great
interest for the eventual scaling up of the culture of this type of microalgae with
energetic purposes.
123
2. Materials and methods
2.1. Microalgae
Nannochloropsis oculata obtained from Algobank Caen (France) was used in the
present study. The culture was grown in two types of reactors: closed photobioreactors
and open ponds. The closed photobioreactors consist in modules with three
interconnected 150 L air-lift reactors, whose dimensions are 0.3 m of diameter and 2 m
of height (Figure 1). The open ponds have a volume of 6 L (0.4 x 0.3 x 0.2 m) and a
light path length of 0.05 m (Figure 2). The reactors were located outdoors in Alicante
(Southeast of Spain). The medium for the microalgae growth in the reactors was
natural sea water from the “Golfo de Mazarrón” (Spain) enriched with nutrient solutions
of nitrates and phosphates for marine algae supplied by Fitoplancton Marino S.L. The
photosyntethetically active radiation (PAR) was measured and registered using a
spherical quantum sensor located close the surface of the reactors. Figure 3, shows,
as an example, the evolution of PAR profiles obtained along a whole day of the
experiment. Obviously, the PAR level measured is a function of the hour in the day and
the behavior observed during the days that the microalgae growth presents similar
patterns. The PAR level increases from 0
mol/m2s at 8 a.m. until approximately 2200
mol/m2s at 12 p.m. obtaining at this point the maximum PAR level during the day,
subsequently, the PAR level begins to decrease obtaining a minimum level at
approximately 6 p.m. The dark cycle occurs between the 6 p.m. until 8 a.m. of the next
day approximately with 14 hours duration.
The temperature was kept at 15-20ºC by using a coil exchanger immersed in the
culture and the pH was maintained at 8 by injecting carbon dioxide automatically as
needed, being both magnitudes also recorded. Figure 4 shows, as an example, the
evolution of the pH and the temperature profiles obtained along a whole day of the
experiment. As occurs with the PAR profiles, the behavior observed during the days
that the microalgae growth presents a similar pattern, for this reason Figure 4 can be
used as a model to explain the different experimental observations. The CO2 injection
cycles are intimately related with the photosynthetic activity of the microalgae as it is
shown by the different patterns observed for the pH profiles during the dark cycle
compared with the light cycle. As can be clearly observed, when the PAR level is close
to 0 the frequency of the CO2 injection cycles is much lower than that observed in the
light cycle. This behavior is explained taking into account that during the day the
microalgae uses the light and nutrients to uptake CO2 that causes an increase in the
pH of the culture, in this case, the number of CO2 injection cycles could be related with
the CO2 consumption rate. During the night the photosynthetic activity is reduced and
respiration occurs, in this case the CO2 consumption is stopped and the microalgae
124
release CO2. The pattern observed in the pH profiles cannot be completely explained
using the photosynthetic and respiration activity because, in these circumstances, the
pH of the culture at the night should not have presented CO2 injection cycles. In this
case the CO2 stripping by the air injected to the photobioreactor could be responsible
of this characteristic behavior.
2.2. Experimental conditions
In order to analyze the influence of nitrate concentration on the growth of N.
oculata, three modules (module 1, module 2 and module 3), each of them composed
by three air-lift reactors, and two open reactors as those commented previously on are
used with different experimental conditions shown in Tables 1 and 2, respectively. As
can be seen, each culture has been run with different initial nitrate concentrations,
meanwhile all other experimental variables were fixed to the same value in all reactors
employed in the present study.
The evolution of the different cultures has been evaluated by measuring the
optical density at 540 nm every day. The dry weight of the cultures (g/L) was obtained
through a correlation previously obtained, i.e. dry weight (g/L) = 0.33·OD540 (R2 = 0.99).
In
addition,
the
determination
of
macronutrients
concentration
(soluble
phosphorous and nitrates) was carried out daily.
Finally, the biochemical composition as a function of the growth stage of the
microalgae of different samples from the photobioreactors were analyzed along the
experiment, specifically on the third and eighth days from the beginning of the
experiment corresponding to the exponential and the stationary phases, respectively.
In the case of the open reactors, the samples were analyzed at the end of the
experiment to study the influence of the initial nutrient concentration on the biochemical
composition at the stationary phase when the culture will be likely to be harvested.
2.2.1. Macronutrients determination
The determination of soluble phosphorus has been carried out by the colorimetric
method based in the reaction between ammonium molybdate and antimonium
potassium tartrate in acidic medium (Murphy and Riley, 1962).
Nitrates present in the medium have been determined by spectrophotometric UV
measurements according to the method proposed by Collos et al. (1999).
2.2.2. Determination of the biochemical composition
For protein extraction, 20mL of culture were filtered through microglass filters
Whatman GF/C. The filter was extracted with NaOH 1 mol/L at 100 ºC for 1 hour
125
(Sukenik and Carmeli, 1990). The determination of proteins was carried out by the
Lowry method.
For carbohydrate extraction, 20 mL of culture were filtered in the same conditions
than in the case of proteins commented on previously. The filter obtained was heated
at 100 ºC with H2SO4 0.5 mol/L for 4 hours (Brown et al., 1998). The determination of
carbohydrates was carried out by the phenol-sulphuric method.
For transesterified lipid analyses 50 mL of culture were filtered and lipids were
extracted and transesterified by using a methanol/acetyl chloride mixture according to
Rodríguez-Ruiz et al. (1998). Transesterified lipids were measured by GC-MS.
The column temperature was programmed from 120°C to 245°C at a heating rate
of 3°C/min. The column was kept at the final temperature for 15min. The injector was
set to 250 °C. Sample injection was made in split mode (10:1). A solvent delay of 3 min
was selected. Helium was used as carrier gas with a constant flow of 1 mL/min. The
average velocity of helium in the column was 0.37 m/s.
Total lipids were extracted from algae samples in duplicates following the protocol
described by Blight and Dyer (1959) with some modifications described as follows. A
volume of 4.7 mL of chloroform/methanol 1:2 (v/v) were added to a weight of 2 g of wet
sample and the mixtures were shaken and incubated at 80ºC for 15 min. for enzyme
inactivation. Then, samples were sonicated in a bath for 15 min. and centrifuged for 10
min. at 500 x g. The resulting supernatant was transferred to a clean tube. The lower
phase was extracted again with 6 mL of chloroform/methanol/water 1:2:0.8 (v/v/v). The
sample was shaken, sonicated and centrifuged again in the same conditions and the
supernatants were combined. The resulting lower phase was extracted again with 6 mL
of chloroform/methanol/water 1:2:0.8 (v/v/v) applying the same protocol of sonication
and centrifugation. The resulting supernatant was combined with those from the
preceding extractions. The pooled supernatants were supplemented with 5 mL
chloroform and 5 mL NaCl 0.15 mol/L. Samples were shaken and centrifuged 5 min at
500g and the lower phase containing lipids were transferred to clean tubes and the
supernatant was extracted again with 5 mL extra of chloroform. The lower phases were
combined and the solvent removed under nitrogen. The residues were weighted and
then dissolved in 1 mL chloroform and stored at -20ºC under nitrogen atmosphere.
The determination of lipid species (neutrals, phospholipids and chloropastics) was
carried out by applying the HPLC method described by Salas et al. (2006). This
method made possible the quantification of neutral lipids (triacylglycerols and free fatty
acids) and polar lipids (phospholipids and galactolipids).
As a previous step to HPLC analysis total lipid extracts were fractionated in a
silica gel cartridge (Lichrolut Si, Merck). Volumes of 0.5 mL of the total extracts were
126
loaded onto the cartridges previously equilibrated with chloroform. The neutral lipids
were eluted with 5 mL of chloroform, later the polar lipids were eluted with 10 mL of
methanol. Solvent was removed from the samples under nitrogen, dry samples were
dissolved in volumes of 1.5 mL of hexane/acetone 70:30 (neutral) and hexane/2propanol 3:2 (polar) for HPLC analysis. A separation module Waters 2695 endowed
with a Waters 2420 ELS detector was used. Polar lipids were analyzed in a
Lichrosphere 100 Diol 250-4 (5 µm) at 30ºC and a flow of 1 mL/min. The column was
eluted with a binary of hexane/2-propanol/acetic acid/triethylamine 82:17:1:0.08
(solvent A) and 2-propanol/water/ acetic acid/triethylamine 85:14:1:0.08 (solvent B).
Initially the column was equilibrated in 100% solvent A, after injection the solvent is
modified to 90% solvent A and 10% solvent B in 1 min. Then, a 24 min. linear gradient
to 40% solvent B was applied. The solvent composition was kept for 1 min. and then
the column was equilibrated with 100% solvent A for the next injection during 15 min.
Neutral lipids were analyzed in a Lichrospher Si 60 250-4 (5 µm) normal phase column
at 30ºC and 1 mL/min flow using Hexane/acetone/acetic acid 70:30:0.1 (v/v/v) as the
solvent in isocratic regime.
3. Results and discussion
3.1.
Relation
between
the
growth
of
the
microalgae
and
nitrate
concentration in the culture
As was commented on previously, the growth of the microalgae was followed by
measuring the optical density of the cultures daily in each reactor. The values obtained
for the different nitrate concentrations employed in the present study are shown in
Figures 5 and 6 for the photobioreactors and the open reactors, respectively. As can be
seen,
module
1,
which
presents
the
lowest
nitrate
concentration
in
the
photobioreactors, reaches the lowest value of optical density. In modules 2 and 3,
where nitrate concentration is higher (1382 and 2291 μmol/L respectively), the
evolution observed along time is very similar in both cases and the growth observed is
higher than in module 1. The reduced growth rate when the nitrate concentration
decreases is in good agreement with the literature (Rodolfi et al., 2009; Widjaja et al.,
2009). In the case of the open reactors, both cultures have a similar growth.
Nevertheless, unlike what happens in the photobioreactors, not only does the dry
weight reached at the end of the experiment increase when a higher initial nitrate
concentration is employed, but also the values are higher than those obtained in the
photobioreactors. For example, when an initial nitrate concentration of approximately
2200 μmol/L is employed the optical densities in the stationary phase are 0.7 and 0.9 in
the photobioreactors and in the open reactors, respectively. Moreover, the optical
127
density in the open reactors reaches 1.1 when 4198
mol/L are used. It could be due
to the fact that the light path in the open reactors is much smaller.
The growth of the cultures can be related to the consumption of nitrates. The
evolution of this macronutrient along time is shown in Figures 7 and 8 for the
photobioreactors and the open reactors, respectively. In general, it can be seen that
when the growth of the microalgae reaches constant values the nitrates are not
consumed anymore and their concentration in the medium remains constant. Some
differences are observed in the case of modifying the nitrate concentration when
culturing in the photobioreactors. In this way, in module 1 the second day after the
beginning of the experiment, the nitrate concentration in the culture is negligible. This is
the reason why the microalgae in module 1 show lower growth than those observed in
module 2 and 3. As expected, nitrogen limiting conditions inhibit the growth of the
microalgae. In the case of module 2, nitrate concentration decreases noticeably at the
sixth day from the beginning of the experiment, showing at this moment values very
similar to those observed in the case of module 1 after the second day. On the other
hand, module 3 presents nearly constant values of nitrate concentration around 900
μmol/L from the sixth day after the beginning of the experiment to the end of the
experiment. Taking into account that the growth of the microalgae in module 2 and 3
are very similar, it could be concluded that the growth of N. oculata in these conditions
has reached another limiting factor than nitrates concentration, probably the light
limitation is the responsible of this behavior and not all the nitrates present can be
consumed. In the case of the open reactors, the light path is lower and the cultures can
reach higher dry weights, thus requiring and consuming higher amounts of nitrates.
The evolution of phosphorus along the experiment in each module studied is shown
in Figures 9 and 10 for the photobioreactors and the open reactors, respectively. As
can be seen, phosphorous concentration present very similar behavior in all the
cultures evaluated in each kind of reactor. At the third day of experiment practically
there is almost no phosphorous in the culture, independently of the initial nitrate
concentration employed in the photobioreactors. In the open reactors the phosphorus
concentration employed was double and they were exhausted later, at the sixth day of
experiment again regardless of the initial nitrate concentration. On the other hand, in
both reactors although the phosphorus is exhausted, the cultures continue growing;
this could be due to the fact that when the concentration of phosphorus in the culture
medium is high, the nutrient is consumed in excess by the microalgae and stored in the
cell to be later used by the organism when the concentration in their environment is a
limiting factor (Sukenik and Carmeli, 1990).
128
3.2. Evolution of the biochemical composition with nitrate concentration in
different growth stages
As was commented on previously, the main objective of the present study is to
evaluate the influence of nitrate on the biochemical composition of the microalgae and
to evaluate the evolution of this parameter depending on the growth stage of N.
oculata. For this end, proteins, carbohydrates, transesterified lipids and determination
of lipid species (neutrals, phospholipids and chloropastics) have been measured in two
different growth stages (exponential and stationary phases) in each module employed.
An example of a typical chromatogram obtained from the analysis GC-MS is shown in
Figure 11, while the fatty acid distribution for different culture times and initial nitrate
concentration are listed in Table 3 for every sample of each reactor analyzed.
Figures 12-14 show the percentage of proteins, carbohydrates and transesterified
lipids obtained in both stages for the cultures grown in the photobioreactors and Figure
15 represents the percentage of each one of these biochemical fractions in the
stationary phase for the cultures grown in the open reactors.
As can be seen, when the initial nitrate concentration increases, the amount of
proteins reaches the highest value at the medium nitrate concentration in the
exponential phase. On the other hand, an increase of proteins is observed in the
stationary phase for both types of reactors when increasing the initial nitrate
concentration (Figures 12 and 15). In this way, in the stationary phase of the
photobioreactors with the lowest initial nitrate concentration, the proportion of proteins
in the biomass is around 27 % meanwhile with the highest initial nitrate concentration
the proportion of proteins is almost duplicated reaching around 50 %. On the other
hand, when employing 302 or 1382 μmol/L of nitrates in the photobioreactors, the
amount of proteins present a slight decrease in the stationary phase respect to the
corresponding value in the exponential phase (Figure 12), meanwhile when 2291
μmol/L of nitrates is used, a noticeable increase of proteins is observed in the
stationary stage. The elemental analysis complement the protein determination due it
gives account of both soluble and insoluble protein in the dry residue, so the content of
protein estimated in function of total nitrogen is higher than that determined by the
method of Lowry (Table 4). Values determined by both methods are complementary
and are correlated. The levels of nitrogen in the dry residue of N. oculata subtracting
the
nitrogen
from
the
lipid
fraction,
due
to
phosphatidylcholine,
phosphatidylethanolamine and chlorophylls, was dependent on the initial amount of
nitrate in the medium. Thus, algae growing at the highest nitrate concentrations
increased the N content by 30 to 50% (Table 4). Figure 16 shows values of percentage
of proteins obtained by considering the elemental analysis. As can be seen, in this
129
case an increase of percentage of this biochemical fraction is observed in exponential
and stationary phase. By Lowry method, in the exponential phase, the increase of
proteins is not so evident. But insoluble proteins can remain in dry residue and by
elemental analysis this protein fraction is quantified. Because of this, an increase of the
amount of proteins in exponential phase can be assumed.
Carbohydrates present a different behavior (Figures 13 and 15). In this case,
when nitrate concentration increases, the amount of carbohydrates decreases in the
exponential and the stationary phases of both reactors. For example, in the exponential
phase of the photobioreactors with an initial nitrate concentration of 302 μmol/L, the
proportion of carbohydrates in the biomass obtained is around 37 % meanwhile in the
cultures with 2291 μmol/L of nitrates this proportion is around 22 %. Moreover, there is
a higher difference between the proportions of this fraction measured in both stages by
using low initial nitrate concentration than that observed by using high initial nitrate
concentration (Figure 13).
The proportion of transesterified lipids obtained in each stage (Figure 14),
increases in the stationary phase independently of the initial nitrate concentration with
respect to the corresponding exponential phase. This fact can be related to the
decrease of nitrates that is observed at the end of the experiment as was commented
on previously (Figure 7). The proportion of transesterified lipids present in the
microalgae slightly decreases when increasing the initial nitrate concentration,
independently of the growth stage and in both reactors, (Figures 12 and 15). For
example, biomass presents around 18 % of transesterified lipids in the module with the
highest nitrate concentration, and around 25 % for the module with the lowest nitrate
concentration.
The algae N. oculata contained triacylglycerols and free fatty acids as the main
components of the neutral lipid fraction. This fraction increased when the initial amount
of nitrate in the culture medium was increased in the photobioreactor (Figure 17a). So
the amount of fatty acids resulting from cultures growing at 2291 µg/L N-NO3- was
three times higher than at 302 µg/L, whereas the free triacylglycerols increased by 2fold (Figure 17 b and c). No important differences were found in the two different
phases of growth analyzed.
With regard to polar lipids, N. oculata accumulated high amounts of the
chroloplastic lipids digalactosyldiacylglycerol, sulfoquinovosyldiacylglycerol, and lower
amounts of monogalactosyldiacylglycerol and phospholipids. The proportion of these
lipid species did not changed importantly when different amounts of nitrate were used
in
the
culture
media.
Only
a
certain
increase
of
-
the
proportion
of
monogalctosyldiacylglycerol was found at 302 µg/L N-NO3 in the stationary phase
130
(Figure 19 a). These results indicated that the proportion of polar lipids is maintained
unmodified by the algae in different conditions, probably because it is essential for its
correct growth and development.
To sum up, it can be concluded that a correlation exists between the initial nitrate
concentration and the proportion of the different biochemical fractions. At the end of the
experiment, by increasing the initial nitrate concentration, proteins increase meanwhile
transesterified lipids and carbohydrates decrease. Moreover, this tendency is observed
in both reactors.
This behavior is similar to that observed by other authors in the bibliography. In
this way, J. Fabregas et al. (1996) reported that in cultures of the microalgae
Phaeodactylum tricornutum carried out in 80 mL tubular units (0.03 m diameter)
arranged on a special rack with a central fluorescent lamp, with a 12 h light/12 h dark
periodicity and a light intensity of 152
mol/m2s, the evolution of the proportion of
proteins follows a contrary tendency than that observed by carbohydrates and lipids.
The proportion of proteins (expressed as weight percentage) increased when nutrient
concentration increased meanwhile the percentages of lipids and carbohydrates
decreased.
Another important aspect that has been evaluated in the present study is the
distribution of FAMEs present in the lipids analyzed and how this composition is
modified by the experimental conditions employed. Figures 20 and 21 show the
distribution of FAMEs depending on the growth stage for the photobioreactors. Figure
22 presents this distribution for the open reactors.
As can be seen, in the exponential phase (Figure 20a), FAMEs obtained mainly
present 16 and 20 carbon atoms. With all initial nitrate concentration studied, the
composition of this biochemical fraction is very similar, the proportion of the different
FAMEs detected remains constant independently of the initial nitrates supplied to the
photobioreactor. For example, the proportion of C16 is between 49-56 % and in the
case of C20 is between 35-41 % in all cases evaluated.
In relation to the degree of unsaturation (Figure 20b), there are not important
variations in the samples analyzed, and there is a homogeneous distribution between
saturated, monounsaturated and polyunsaturated.
In the stationary phase (Figures 21a and 22a), the composition of FAMEs
obtained presents a different behavior to that commented on previously for the
exponential phase with the initial nitrates supplied to the culture. A clear influence of
the initial nitrate concentration on the composition of lipids is observed in both reactors.
When the composition of lipids is analyzed by taking into account the number of carbon
atoms (Figures 21a and 22a), in all cases, the major lipids are those with 16 and 20
131
carbon atoms. A decrease of the proportion of C16 and an increase of C20 is observed
when initial nitrate concentration increase in both reactors. Moreover, by employing the
lowest initial nitrate concentration C16 are the major lipids obtained, meanwhile by
employing the highest initial nitrate concentration, C20 are the major components of this
fraction. For example, with 302 μmol/L of nitrates in the photobioreactors C 16 represent
around the 61 % of the total FAMEs analyzed, meanwhile C20 are around 25 %.
Nevertheless, by using 2291 μmol/L of nitrates, C16 reach a proportion near 39 % of the
total FAMEs analyzed, meanwhile C20 is near 55 %.
A similar behavior is observed when the composition of lipids is analyzed by
taking into account the degree of unsaturation (Figures 21b and 22b). The percentage
of saturated and monounsaturated decrease with an increase of the initial nitrate
concentration, meanwhile polyunsaturated increase. In this way, the lipid fraction is
mainly composed by saturated and monounsaturated in the case of using the lowest
initial nitrate concentration in the photobioreactors, meanwhile when this concentration
increases, polyunsaturated are the main lipids obtained reaching a proportion of
around 55 % of the total FAMEs analyzed. One of the polyunsaturated FAMEs
obtained in highest proportion is the eicosapentaenoic acid methyl ester (EPA C20:5
(n-3)), that presents a proportion near to 80 % of the polyunsaturated compounds
obtained.
These results observed in the variation of the composition of FAMEs for N.
oculata are similar to those obtained by other authors with artificial light and smaller
culture volumes (Hodgson et al. 1991; Su et al., 2011).
By considering the distribution of number of carbon atoms and the degree of
unsaturation of FAMES obtained in the transesterification of lipids present in the
biomass, some information related to the kind of lipids accumulated in the microalgae
can be shown. In this way, Sukenik and Carmeli (1990) affirmed that in N. sp., the
presence of fatty acids C20:5 is related to galactolipids (bio-structural lipids),
meanwhile, triglycerides (lipid storage) are composed by C16:0 and C16:1 compounds
mainly. By comparing these affirmations with the results found in the present study, it
can be pointed out that N. oculata in cultures with low initial nitrate concentration
accumulate triglycerides, meanwhile by using cultures with high initial nitrate
concentration, galactolipids are synthesized by this microalgae. This fact is in
agreement with the idea of culturing with less nutrient concentration increases
triglycerides and the cells are not able to reproduce.
4. Conclusions
132
Results obtained in the present study have shown the influence of initial nitrate
concentration and the growth stage on the biochemical composition of microalgal
biomass obtained outdoors. By employing the lowest initial nitrate concentration, N.
oculata present the lowest growth in both reactors.
The influence of the initial nitrate concentration shows that in the last growth
stage of both reactors, by increasing the concentration of this nutrient, proteins
increase, meanwhile carbohydrates and transesterified lipids decrease.
On the other hand, a variation in the composition of FAMEs obtained with the
initial nitrate concentration and the growth stage is observed. This influence is clearly
observed at the end of the growth, around the eighth and the ninth days from the
beginning of the experiment in the photobioreactors and the open reactors,
respectively. In this case, by employing high initial nitrate concentrations, FAMEs
majority obtained present 20 carbon atoms and high degree of unsaturation, being the
eicosapentaenoic acid methyl ester one of the major compounds obtained under these
conditions.
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Acknowledgement:
The authors wish to thank Repsol YPF for the financial support that provided (Project
reference: Ingenio 2010-CDTI-Sost CO2-CEN-2008-1027) and the Generalitat
Valenciana by the fellowship of one of the authors (Program VALI+D).
135
Tables
Table 1. Experimental conditions employed in photobioreactors.
Experimental conditions
Module 1
Module 2
Module 3
Agitation (L/h)
200
200
200
[N-NO3-]initial (μmol/L)
302
1382
2291
[P-PO43-]initial (ppm)
1.4
1.7
1.48
pH
8
8
8
Table 2. Experimental conditions employed in open reactors.
Experimental conditions
Agitation (L/h)
[N-NO3-]initial (μmol/L)
R1
50
2085
R2
50
4198
[P-PO43-]initial (ppm)
3.0
8
3.1
8
pH
136
Table 3. Fatty acid composition of Nannochloropsis oculataat different culture
times and initial nitrate concentrations in two types of reactors. Figures are in
terms of percentage mass. For the purposes of clarity only major component
fatty acids are shown in detail. a) Samples from the exponential stage (third day)
in the photobioreactors, b) samples from the stationary stage (eighth day) in the
photobioreactors, c) samples from the stationary stage (ninth day) in the open
reactors.
Fattyacid
302μmol/L N-NO₃¯
%
1382μmol/L N-NO₃¯
%
2291μmol/L N-NO₃⁻
%
C10:0
C12:0
C14:0
C16:0
C16:1
C18:0
C18:1
C18:2
C20:3
C20:4
C20:5
0.17
4.53
27.78
25.47
0.81
4.39
1.12
4.83
29.89
0.09
0.19
3.54
23.92
24.84
2.09
2.05
0.91
0.72
4.69
35.83
0.10
0.21
4.15
26.81
28.94
0.93
2.01
0.87
1.01
4.37
30.58
b)
Fattyacid
302μmol/L N-NO₃¯
%
1382μmol/L N-NO₃¯
%
2291μmol/L N-NO₃⁻
%
C10:0
C12:0
C14:0
C16:0
C16:1
C18:0
C18:1
C18:2
C20:3
C20:4
C20:5
0.06
0.15
4.67
32.59
28.03
0.46
7.43
1.63
24.96
0.07
0.15
4.55
23.69
23.48
0.41
4.75
1.33
0.91
4.55
36.10
0.09
0.14
3.28
15.95
22.60
0.57
1.68
0.79
0.87
4.98
48.55
a)
137
Table 3. (Continued)
c)
Fatty acid
2085 μmol/L N-NO₃¯
%
4198 μmol/L N-NO₃⁻
%
C10:0
C12:0
C14:0
C16:0
C16:1
C18:0
C18:1
C18:2
C20:3
C20:4
C20:5
0.05
0.18
4.97
33.62
25.44
0.47
7.43
1.11
0.68
3.33
22.34
0.10
0.16
4.17
22.66
20.23
0.21
3.94
1.05
0.67
5.78
40.67
Table 4. Elemental analysis of Nannochloropsis oculata.
Content (%)
Exponential phase
Stationary phase
Initial nitrate (µmol/L)
and phase
302
1382
2291
302
1382
2291
C
52
53.2
52.6
55.9
53.2
51.4
H
9.2
7.7
7.5
8.7
7.8
7.7
N
6.5
9.3
9.4
5.1
7.3
8.8
S
0.4
0.5
0.4
0.4
0.5
0.5
138
Figure captions
Figure 1. Scheme of the airlift module used for the culture of the microalgae
Nannochloropsis oculata: 1. Activated carbon filter; 2. Electrovalve; 3. pH
controller; 4. Rotameter for the CO2; 5. Refrigeration equipment; 6. pH probe; 7.
Airlift; 8. Bubbling manifold of filtered CO2; 9. Rotameter for the air.
Figure 2. Scheme of the open reactor used for the culture of the microalgae
Nannochloropsis oculata: 1. Activated carbon filter; 2. Electrovalve; 3. pH
controller; 4. Rotameter; 5. Refrigeration equipment; 6. pH probe; 7. Pump; 8.
Bubbling manifold of filtered air and CO2.
Figure 3. PAR profiles during the light/dark cycles.
Figure 4. Temperature and pH profiles during the light/dark cycles.
Figure 5. Evolution of the growth of the microalgae along the experiment in
the photobioreactors.
Figure 6. Evolution of the growth of the microalgae along the experiment in
the open reactors.
Figure 7. Evolution of nitrate concentration in each airlift module evaluated.
Figure 8. Evolution of nitrate concentration in each open reactor evaluated.
Figure 9. Evolution of phosphorous along the experiment in each airlift
module studied.
Figure 10. Evolution of phosphorous along the experiment in each open
reactor studied.
Figure 11. Typical chromatogram obtained from the GC-MS for FAMEs
analysis. Peak number 1: Decanoic acid, methyl ester (C10:0). 2: Dodecanoic
acid, methyl ester (C12:0). 3: Tetradecanoic acid, methyl ester (C14:0). 4:
Hexadecanoic acid, methyl ester (C16:0). 5: Monounsaturated hexadecanoic
acid, methyl ester (C16:1). 6: Octadecanoic acid, methyl ester (C18:0). 7:
Monounsaturated
octadecanoic
acid,
methyl
ester
(C18:1).
8:
Diunsaturedoctadecanoic acid, methyl ester (C18:2). 9: Nonadecanoic acid
(internal standard). 10: 7,10,13-Eicosatrienoic acid, methyl ester (C20:3). 11:
5,8,11,14-Eicosatetraenoic
acid,
methyl
ester
(C20:4).
12:
5,8,11,14,17-
Eicosapentaenoic acid, methyl ester (C20:5).
139
Figure 12. Percentage of proteins analyzed on the third and the eighth day
from the beginning of the experiment in the photobioreactors.
Figure 13. Percentage of carbohydrates analyzed on the third and the eighth
day from the beginning of the experiment in the photobioreactors.
Figure 14. Percentage of transesterified lipids analyzed on the third and the
eighth day from the beginning of the experiment in the photobioreactors.
Figure 15. Percentage of proteins, carbohydrates and lipids analyzed on the
ninth day from the beginning of the experiment in the open reactors.
Figure 16. Percentage of protein measured by elemental analysisreferred to
dry weight.
Figure 17. Percentage of neutral lipid composition of the lipid extracts from
Nannochloropsis oculata analyzed by HPLC. a) % Total neutral lipids, b) % FFA
(free fattyacids), c) % TAG (triacylglycerol).
Figure
18.
Phospholipid
composition
of
the
lipid
extracts
from
Nannochloropsis oculata analyzed by HPLC. a) % PA (phosphatidic acid); b) %
PE (phosphatidyl ethanolamine); c) % PC (phosphatidyl choline); d) % PI
(phosphatidyl inositol).
Figure 19. Chloroplastic lipid composition of the lipid extracts from
Nannochloropsis.
oculata
analyzed
by
HPLC.
a)
%
MGDG
(monogalactosyldiacylglycerol); b) % PG (phosphatidyl glycerol); c) % DGDG
(digalactosyldiacylglycerol); d) % SQVDG (sulfoquinovosyldiacylgygerol).
Figure 20. Distribution of FAMEs generated in the transesterification
process on the third day of the experiment with different initial nitrate
concentration in the photobioreactors. a) According to the number of carbon
atoms. b) According to the degree of unsaturation.
Figure 21. Distribution of FAMEs generated in the transesterification
process on the eighth day of the experiment with different initial nitrate
concentration in the photobioreactors. a) According to the number of carbon
atoms. b) According to the degree of unsaturation.
Figure 22. Distribution of FAMEs generated in the transesterification
process on the ninth day of the experiment with different initial nitrate
concentration in the open reactors. a) According to the number of carbon atoms.
b) According to the degree of unsaturation.
140
7.98
3
8.00
2
4
CO2
6
7
Air
1
21.8
20.0
9
8
5
Figure 1
3
7.98
8.00
2
5
4
CO2
21.8
20.0
Air
6
1
7
8
Figure 2
141
Photosynthetically active radiation
(mmol/m 2 s)
2500
2000
1500
1000
500
0
0
4
8
12
16
20
24
Time (h)
Figure 3
25
9
pH
8
7
6
15
5
Temperature
4
10
3
2
5
1
0
0
0
4
8
12
Time (h)
Figure 4
142
16
20
24
pH
Temperature (ºC)
20
0.8
Optical density
0.7
0.6
0.5
302 μmol/L N-NO₃¯
0.4
1382 μmol/L N-NO₃⁻
2291 μmol/L N-NO₃⁻
0.3
0.2
0
1
2
3
4
5
Time (days)
6
7
8
9
Figure 5
1.2
Optical density
1.0
0.8
0.6
0.4
2085 µmol/L N-NO₃¯
0.2
4198 µmol/L N-NO₃¯
0.0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Time (days)
Figure 6
143
2500
302 μmol/L N-NO₃¯
1382 μmol/L N-NO₃⁻
2291 μmol/L N-NO₃⁻
-
N-NO3 (mmol/L)
2000
1500
1000
500
0
0
1
2
3
4
5
Time (days)
6
7
8
9
Figure 7
N-NO₃¯ (µmol /L)
4500
4000
2085 µmol/L N-NO₃¯
3500
4198 µmol/L N-NO₃¯
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
0
1
2
3
4
5
Time (days)
Figure 8
144
6
7
8
9
1.8
302 μmol/L N-NO₃¯
1.6
1382 μmol/L N-NO₃⁻
1.4
2291 μmol/L N-NO₃⁻
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Time (days)
Figure 9
3.5
2085 µmol/L N-NO₃¯
3.0
4198 µmol/L N-NO₃¯
2.5
P-PO₄¯ (ppm)
3-
P-PO 4 (ppm)
1.2
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
0
1
2
3
4
5
Time (days)
6
7
8
9
Figure 10
145
12
5
9
3
7
11
8
1
4
2
6
10
Figure 11
60
exponential phase
Proteins (%)
50
stationary phase
40
30
20
10
0
302 μmol/L N-NO₃¯ 1382 μmol/L N-NO₃⁻ 2291 μmol/L N-NO₃⁻
Figure 12
146
Carbohydrates (%)
40
exponential phase
35
stationary phase
30
25
20
15
10
5
0
302 μmol/L N-NO₃¯ 1382 μmol/L N-NO₃⁻ 2291 μmol/L N-NO₃⁻
Transesetrified lipids (%)
Figure 13
30
exponential phase
25
stationary phase
20
15
10
5
0
302 μmol/L N-NO₃¯ 1382 μmol/L N-NO₃⁻ 2291 μmol/L N-NO₃⁻
Figure 14
147
40
Proteins
Carbohydrates
Lipids
35
Concentration (%)
30
25
20
15
10
5
0
2085 µmol/L N-NO₃¯
4198 µmol/L N-NO₃¯
Figure 15
60
Proteins (%)
50
exponential phase (by elemental analysis)
stationary phase (by elemental analysis)
40
30
20
10
0
302 μmol/L N-NO₃¯
1382 μmol/L N-NO₃⁻ 2291 μmol/L N-NO₃⁻
Figure 16
148
% Total neutral lipids
40
exponential phase
35
stationary phase
30
25
20
15
10
5
0
302 μmol/L N-NO₃¯ 1382 μmol/L N-NO₃⁻ 2291 μmol/L N-NO₃⁻
a)
35
exponential phase
30
stationary phase
% FFA
25
20
15
10
5
0
302 μmol/L N-NO₃¯
1382 μmol/L N-NO₃⁻ 2291 μmol/L N-NO₃⁻
b)
149
8
exponential phase
7
stationary phase
% TAG
6
5
4
3
2
1
0
302 μmol/L N-NO₃¯
1382 μmol/L N-NO₃⁻ 2291 μmol/L N-NO₃⁻
c)
Figure 17
150
6
exponential phase
5
stationary phase
% PA
4
3
2
1
0
302 μmol/L N-NO₃¯
8
1382 μmol/L N-NO₃⁻ 2291 μmol/L N-NO₃⁻
a)
7
exponential phase
stationary phase
6
% PE
5
4
3
2
1
0
302 μmol/L N-NO₃¯
1382 μmol/L N-NO₃⁻ 2291 μmol/L N-NO₃⁻
b)
151
12
exponential phase
10
stationary phase
% PC
8
6
4
2
0
302 μmol/L N-NO₃¯
1382 μmol/L N-NO₃⁻ 2291 μmol/L N-NO₃⁻
c)
6
exponential phase
5
stationary phase
% PI
4
3
2
1
0
302 μmol/L N-NO₃¯
1382 μmol/L N-NO₃⁻ 2291 μmol/L N-NO₃⁻
d)
Figure 18
152
14
exponential phase
12
stationary phase
8
6
4
2
0
302 μmol/L N-NO₃¯
1382 μmol/L N-NO₃⁻
2291 μmol/L N-NO₃⁻
a)
16
exponential phase
14
stationary phase
12
% PG
% MGDG
10
10
8
6
4
2
0
302 μmol/L N-NO₃¯
1382 μmol/L N-NO₃⁻ 2291 μmol/L N-NO₃⁻
b)
153
25
exponential phase
stationary phase
% DGDG
20
15
10
5
0
302 μmol/L N-NO₃¯
1382 μmol/L N-NO₃⁻ 2291 μmol/L N-NO₃⁻
c)
exponential phase
25
stationary phase
% SQVDG
20
15
10
5
0
302 μmol/L N-NO₃¯
1382 μmol/L N-NO₃⁻ 2291 μmol/L N-NO₃⁻
d)
Figure 19
154
60
50
302 μmol/L N-NO₃¯
1382 μmol/L N-NO₃⁻
2291 μmol/L N-NO₃⁻
%
40
30
20
10
0
C10
C12
C14
C16
C18
C20
%
a)
302 μmol/L N-NO₃¯
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
1382 μmol/L N-NO₃⁻
2291 μmol/L N-NO₃⁻
Monounsaturated
Polyunsaturated
Saturated
b)
Figure 20
155
70
60
302 μmol/L N-NO₃¯
1382 μmol/L N-NO₃⁻
2291 μmol/L N-NO₃⁻
50
%
40
30
20
10
0
C10
C12
C14
C16
C18
C20
a)
60
50
302 μmol/L N-NO₃¯
1382 μmol/L N-NO₃⁻
2291 μmol/L N-NO₃⁻
%
40
30
20
10
0
Monounsaturated
Polyunsaturated
b)
Figure 21
156
Saturated
70
2085 µmol/L N-NO₃¯
60
4198 µmol/L N-NO₃¯
50
%
40
30
20
10
0
c10
c12
c14
c16
c18
c20
a)
60
50
2085 µmol/L N-NO₃¯
4198 µmol/L N-NO₃¯
40
% 30
20
10
0
Saturated
Monounsaturated
Polyunsaturated
b)
Figure 22
157
Publicaciones
Publicación III. Estimation of CO2 stripping/CO2 microalgae consumptions ratios in a
bubble column photobioreactor using the analysis of the pH profiles. Application to
Nannochloropsis oculata microalgae culture. F.J. Valdés, M.R. Hernández, L. Catalá
and A. Marcilla. Bioresource Technology 119 (2012) 1-6.
El potencial de las microalgas no se debe únicamente a su capacidad de
producir biodiesel, sino que también se debe a que consume CO2, disminuyendo de
este modo, las consecuencias del efecto invernadero. Por lo tanto, del mismo modo
que es importante el empleo de condiciones específicas que permitan obtener
elevadas tasas de crecimiento, se debe evaluar la capacidad de fijación de CO2 por el
sistema fotobiorreactor/microalga. En este sentido, es interesante el empleo de
tecnología simple y económica para obtener información sobre estos parámetros.
En este trabajo, se cultiva la microalga Nannochloropsis oculata en un
fotobiorreactor de tipo columna de burbujas situado en el exterior. Se ha llevado a
cabo un análisis exhaustivo de los perfiles de pH y radiación fotosintéticamente activa
que se han obtenido. Además, se ha medido el coeficiente volumétrico de
transferencia de masa global para el CO2 y se ha evaluado la eficiencia del CO2 fijado
frente al CO2 perdido por arrastre en el fotobiorreactor.
Los resultados obtenidos en este trabajo han permitido cubrir los siguientes
objetivos específicos:
-
Análisis de los perfiles de pH durante el crecimiento de la microalga para
obtener
información
acerca
del
comportamiento
del
sistema
microalga/fotobiorreactor en relación con el balance neto de CO2.
-
Uso del equilibrio químico del carbonato y del coeficiente volumétrico de
transferencia de masa global de CO2 en el fotobiorreactor para obtener
información sobre las relaciones de CO2 perdido por arrastre y CO2
consumido por las microalgas.
159
P.III
Bioresource Technology 119 (2012) 1–6
Contents lists available at SciVerse ScienceDirect
Bioresource Technology
journal homepage: www.elsevier.com/locate/biortech
Estimation of CO2 stripping/CO2 microalgae consumption ratios in a bubble column
photobioreactor using the analysis of the pH profiles. Application to Nannochloropsis
oculata microalgae culture
F.J. Valdés, M.R. Hernández, L. Catalá ⇑, A. Marcilla
Dpto. Ingeniería Química, Universidad de Alicante, Apdo. 99, 03080 Alicante, Spain
h i g h l i g h t s
" Nannochloropsis oculata cultured in an outdoor bubble column photobioreactor.
" pH probe and equilibrium CO2-water.
" CO2 stripping consumption model.
a r t i c l e
i n f o
Article history:
Received 17 April 2012
Received in revised form 21 May 2012
Accepted 23 May 2012
Available online 30 May 2012
Keywords:
CO2
Microalgae
Nannochloropsis oculata
a b s t r a c t
Nannochloropsis oculata was grown in an outdoor bubble column photobioreactor. To obtain information
about the behaviour of microalgae/photobioreactor system related to the CO2 net balance, an analysis of
the pH profiles during microalgae growth was carried out. The use of the carbonate equilibrium chemistry and the overall CO2 volumetric mass transfer in the photobioreactor has permitted to obtain information of the CO2 losses/CO2 microalgae consumption ratios. The simplicity of the technique used (a pH
probe) could extend the use of this methodology for the correct selection of the photobioreactor/microalgae parameters with the aim to maximize the [CO2 uptaken/(CO2 uptaken + CO2 stripped)] ratios.
Ó 2012 Elsevier Ltd. All rights reserved.
1. Introduction
In recent years, the study of different aspects related to the
behaviour of microalgae has received renewed interest due to the
wide field of application of these microorganisms. Algae cultures
have been principally developed as an important source of many
products, such as aquaculture feeds, human food supplements,
and pharmaceuticals (Apt and Behrens, 1999; Borowitzka, 1995;
Pulz and Gross, 2004; Rebolloso et al., 2001), and they have also
been suggested as a very good candidate for fuel production
(Schenk et al., 2008; Singh and Sharma, 2012). For example, several
papers have been published showing the possibility to obtain biodiesel fuel from the lipids accumulated in the microalgae cells
(Chisti, 2007, 2008; Mata et al., 2010; Pruvost et al., 2011).
The potential use of these microorganisms is not only focused on
their capacity to produce fuel related products but their potential as
a CO2 storage organism must be taken into account (Bilanovic et al.,
2009; Jacob-Lopes et al., 2009; Kumar et al., 2010). Therefore, it is
⇑ Corresponding author. Tel.: +34 96 590 2386; fax: +34 96 590 3826.
E-mail address: [email protected] (L. Catalá).
important the use of specific conditions for the obtention of elevated microalgae growth rates and productivities, but the CO2 fixation capacity of the microalgae and photobioreactor system as a
function of CO2 injected into the culture must be evaluated too (efficiency of CO2 uptake). In this sense is interesting the use of simple
and low cost technology to obtain information about these parameters. In the present paper we have analysed the pH profiles during
the microalgae growth in a bubble column photobioreactor to obtain information about the behaviour of the microalgae/photobioreactor system in relation to the CO2 stripped and CO2 uptaken by
the microalgae. The use of the carbonate equilibrium chemistry
has been used previously for quantifying algal carbon uptake kinetics (Brune and Novak, 1981) but no information about the CO2 net
balance and its relation with the photosynthetic active radiation
has been analysed previously using this methodology.
2. Methods
The microalgae Nannochloropsis oculata was obtained from the
Microalgal culture collection of University of Caen Basse-Normandie. The photobioreactor consists in a 1.70 m height and 0.14 m
0960-8524/$ - see front matter Ó 2012 Elsevier Ltd. All rights reserved.
http://dx.doi.org/10.1016/j.biortech.2012.05.120
161
2
F.J. Valdés et al. / Bioresource Technology 119 (2012) 1–6
internal diameter PVC transparent pipe with an approximate volume of 25 l. The photobioreactor was located outdoors in Alicante
(Southeast Spain) during September.
The inoculum for the photobioreactor was grown in an indoor
chamber equipped with an HEPA filtration system in a 5 l vessel
using natural seawater enriched with a modified f/2 medium.
The mixing of the culture was provided by bubbling air at regular
pressure where inorganic CO2 from the atmosphere was the only
source of carbon. The temperature of the chamber was kept at
20 °C and the artificial illumination has been provided using two
fluorescent tubes of 40 W and using a light–dark cycle of 12:12
during the growth.
Natural seawater from the ‘‘Golfo de Mazarrón’’ (Spain) and enriched with a modified f/2 medium was used as the medium for the
microalgae growth in the bubble column photobioreactor. The
mixing of the culture present in the bubble column was provided
by air injection using a microperforated circular pipe as sparger located at the bottom of photobioreactor. An appropriate bubble formation and culture mixing was obtained using this air injection
system with an air flow rate of 1.5 l/min. The pH of the culture
medium in the photobioreactor was measured using a pH probe
equipped with a Pt 100 for the temperature measurement. The
pH was maintained in the 7–8 range by the automatic injection
of CO2 using and adequated controller, the released CO2 is mixed
with the air injected in the bubble column. The photobioreactor
temperature was maintained between 20 ± 2 °C using water circulating in a coil exchanger immersed in the culture medium. The
photosynthetically active radiation (PAR) was measured using a
spherical quantum sensor located close the surface of the
photobioreactor.
The initial concentration of the microalgae in the photobioreactor was approximately 0.072 g/l, the microalgae culture was maintained in batch growing during 7 days. The evolution of the
microalgae growth was obtained measuring the optical density of
the culture at a wavelength of 540 nm. A correlation between dry
weight and optical density was used. On the other hand, the pH
profiles generated during the microalgae growth were analysed
to obtain information about the possible CO2 consumption.
3. Results and discussion
3.1. Analysis of the behaviour of the pH profiles during the microalgae
growth
Fig. 1 shows, as an example, the evolution of the pH, temperature and PAR (photosynthetically active radiation) profiles obtained along 24 h between the 8 AM of a day (72 h after
photobioreactor inoculation) and 8 AM of the next day (96 h after
photobioreactor inoculation). The behaviour observed for the different analysed profiles present a similar pattern during the days
that the microalgae growth has been measured, for this reason,
the Fig. 1 can be used as a model to explain the different experimental observations.
Obviously, the PAR level measured is a function of the hour in
the day, as can be observed the PAR level increases from 0 lmol/
sm2 at 8 AM until approximately 2200 lmol/sm2 at 1 PM obtaining
at this point the maximum PAR level during the day, subsequently,
the PAR level begins to decrease obtaining the minimum level at
approximately 8 PM. The night period occurs between the 8 PM
until 8 AM of the next day approximately with 12 h duration.
The temperature profile observed in the photobioreactor is related
with the PAR profile, for example, a slight increase of the culture
temperature can be observed coincident with the maximum PAR
level. Nevertheless temperature variation along the day was maintained low because of the use of water circulating in a coil exchan-
162
ger immersed in the culture that permits to maintain the
temperature close to 20 °C.
The photoautotrophic growth of the microalgae needs several
important factors as: light, nutrients as N, P, Fe, etc. and a carbon
source, usually carbon dioxide. When the microalgae uptake CO2
and nitrates, the pH of the culture increases (Camacho Rubio
et al., 1999; Hulatt and Thomas, 2011). In the system studied
there is not an important pH increase during the growth because
of the pH is maintained between 7 and 8 by the automatically
CO2 addition. This CO2 addition occurs when the pH of the culture
increases until 8, in this case an electrovalve is actuated by the
action of a controller and pure CO2 is released and mixed with
the air injected at the bottom of the bubble column. Taking into
account this mechanism for the pH control it is possible to explain the pH profile obtained along a day (24 h) of microalgae
growth. At the first hours of the day (8 AM) the pH of the culture
is close to 7.5. Approximately 1 h later the pH of the culture increases until 8 and the CO2 injection occurs, at this moment the
pH of the culture decreases and a CO2 injection stops. Several
minutes later, another CO2 injection cycle occurs when the pH increases to 8. This CO2 injection cycles are closely related with the
photosynthetic activity of the microalgae as it is shown by the
different patterns observed for the pH profiles during the night
cycle (8 PM until 8 AM next day) compared with the light cycle.
As can be clearly observed, when the PAR level is close to 0 the
frequency of the CO2 injection cycles is different to that the observed in the light cycle. While in the night cycle, the CO2 injection occurs approximately every 3 h, in the light cycle, the time
between CO2 injections decreases. This behaviour is explained
taking into account that during the day the microalgae uses the
light and nutrients to uptake CO2 that causes an increase in the
pH of the culture, in this case, the number of CO2 injection cycles
could be related with the CO2 consumption rate. During the night
the photosynthetic activity is reduced and respiration occurs, in
this case the CO2 consumption is stopped and the microalgae release CO2. The pattern observed in the pH profiles cannot be completely explained using the photosynthetic and respiration
activity because, in this case, the pH of the culture at the night
should not have presented CO2 injection cycles. In this case the
CO2 stripping by the air injected to the photobioreactor could
be the responsible of this characteristic behaviour. Therefore if
the pH profiles want to be used to obtain information about the
CO2 consumption by the microalgae, the CO2 losses by the air injected flow should be taken into account.
3.2. Carbonate equilibrium chemistry and dissolved inorganic carbon
balance
In the bubble column, it is assumed that the culture is well
mixed and the pH profiles obtained with the pH probe are the corresponding to the bulk of the microalgae media culture. Taking into
account the carbonate equilibrium chemistry it is possible to correlate the pH profiles with the inorganic carbon present in the culture media and therefore use this method to monitor the rate of
inorganic carbon uptake by the microalgae according to Brune
and Novak (1981). The equilibrium used for this study and the
equilibrium constants values are the same as those used by Brune
and Novak (1981) and Camacho Rubio et al. (1999).
CO2 þ H2 O () H2 CO3 () HCO3 þ Hþ
K1 ¼
½HCO3 ½Hþ ¼ 106:381
½CO2 þ
HCO3 () CO2
3 þH
K2 ¼
þ
½CO2
3 ½H ¼ 1010:377
½HCO3 ð1Þ
ð2Þ
3
F.J. Valdés et al. / Bioresource Technology 119 (2012) 1–6
14
24
20
Temperature
10
16
8
12
pH
6
Temperature (ºC)
pH
12
8
NIGHT
DAY
4
4
2
0
0
4
8
12
08:00 AM
16
20
08:00 PM
24
08:00 AM
Time (hours)
2500
DAY
NIGHT
2
PAR (μmol/sm )
2000
1500
1000
500
0
0
4
8
12
08:00 AM
16
20
08:00 PM
24
08:00 AM
Time (hours)
Fig. 1. pH, Temperature and PAR profiles during the day/night.
H2 O () Hþ þ OH K w ¼ ½OH ½Hþ ¼ 1014
ð3Þ
The inorganic carbon present in the microalgae culture can be
expressed as:
½CTotal ¼ ½CO2 þ ½HCO3 þ ½CO2
3 ð4Þ
Taking into account the simplified alkalinity definition for the
culture media:
þ
½Alkalinity ¼ ½HCO3 þ 2½CO2
3 þ ½OH ½H C Total ¼
½alk ½OH þ ½Hþ ða1 þ 2a2 Þ
ð5Þ
ð6Þ
Combining Eqs. (1)–(5) we can relate the total inorganic carbon
in the culture media as a function of the Alkalinity and pH:Where:
a1 ¼ ½1 þ
K2
½Hþ -1
þ þ
K1
½H ð7Þ
a2 ¼ ½1 þ
½Hþ 2 ½Hþ -1
þ
K2
K2K1
ð8Þ
These expressions permit to obtain the evolution of the inorganic carbon in the culture knowing the alkalinity and the pH profiles. In our case, the alkalinity in the culture media does not
change as a result of CO2 injection or CO2 consumption by the microalgae or stripping by the air injected into the photobioreactor
(Wolf-Gladrow et al., 2007).
The evolution of the inorganic carbon dissolved in the culture
media during the pH raise observed in the pH profile can be associated to the CO2 photosynthetic consumption and CO2 stripping,
therefore the next expression can be written:
dCTotal
¼ K L að½CO2 ½CO2 Þ þ Rphoto
dt
ð9Þ
where KLa (h1) is the overall volumetric mass transfer coefficient
for the CO2, [CO2 ] (mol/l) represents the saturation concentration
of CO2 in the liquid phase and Rphoto (mol CO2/l h) represents the
CO2 consumption rate by the microalgae photosynthetic activity.
The [CO2 ] can be calculated using the CO2 solubility Henry’s
constant in seawater and the partial pressure of CO2 in the air
injected into the reactor:
163
4
F.J. Valdés et al. / Bioresource Technology 119 (2012) 1–6
½CO2 ¼ PCO2 =H
ð10Þ
where H is expressed in atm/(mol/l) and PCO2 in atm. The Henry
constant for the solubility of CO2 in seawater can be calculated as
a function of the salinity and temperature (Millero, 1995).
The different expressions obtained reveal that the pH profiles
monitorized during the microalgae growth could be used to evaluate the extension of the CO2 losses in the bubble column photobioreactor in comparison with the CO2 capturated by the microalgae.
3.3. Measurement of overall volumetric mass transfer coefficient for
CO2
pH
As has been previously commented onto obtain information
about the CO2 stripping and CO2 photosynthetic consumption ratios it is necessary to estimate the overall volumetric mass transfer
coefficient for CO2. This estimation can be obtained using the information of the pH profiles in the photobioreactor. In fact, Hill (2006)
developed a method that uses the pH profile and the experimentally measured carbon dioxide profiles to calculate the overall volumetric mass transfer coefficients in a well mixed reactor.
In this case, the pH profiles obtained by the pH probe in the
same reactor with the culture media but without the microalgae
strain (to avoid the influence of the photosynthetic activity on
the pH profiles) could be used. For this purpose, the evolution of
(a)
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
0
Qair=1,5 l/min
2
4
6
8
10
(b)
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
pH
ð11Þ
The overall volumetric mass transfer coefficient for CO2 can be
obtained by the integration of the Eq. (11) and comparing the CTotal
experimental profile (obtained with the evolution of the pH profiles using Eq. (6)) with that calculated by Eq. (11). In this case,
KLa parameter was optimised using the tool ‘Solver’ included in
the calculation sheet Excel 7.0 for Windows. The integration of
the kinetic equations was carried out using the Euler method.
Fig. 3 shows, as an example, the comparison between experimental
and calculated evolution of the inorganic carbon dissolved in the
culture media during a pH raise for the air flowrate 1.5 l/min.
The values obtained for the KLa parameter are: 3.8, 8.6 and
12.6 h1 for Qair 1.5, 3.3 and 5.8 l/min, respectively.
3.4. Evaluation of the efficiency of CO2 fixation vs CO2 stripping in the
photobioreactor using the pH profiles data
Fig. 4 shows, as an example, the comparison between the evolutions of the inorganic carbon fixation rate (obtained using the
information provided by the pH probe) by the microalgae culture
during the third and seventh day after the inoculation, the PAR
profile is presented too. As can be clearly observed, there is a clear
relation between the profile obtained for the inorganic carbon consumption rate and the PAR profile. For the 2 days analysed, the CO2
fixation rate during first hours of the day, where the photosyn-
Qair=3,3 l/min
0,005
0
2
(c)
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
4
6
8
Qair=1,5 l/min
10
time (h)
0,0045
Qair=5,8 l/min
0,004
experimental
calculated
0,0035
0,003
0,0025
0
2
4
6
8
10
time (h)
Fig. 2. pH profiles for the KLa estimation at several air flowrates (a) 1.5 l/min, (b)
3.3 l/min and (c) 5.8 l/min.
164
dCTotal
¼ K L að½CO2 ½CO2 Þ
dt
CT(mol/l)
pH
time (h)
the pH and the CO2 injection cycles has been obtained at three different air flowrates: 1.5, 3.3, 5.8 l/min. Fig. 2 shows the evolution of
the pH profiles obtained in the reactor for the three different air
flowrates used. As can be clearly observed the CO2 stripping rate
in the bubble column is a function of the air flowrate as the duration between CO2 injection cycles shows. The explanation of the pH
profiles obtained in Fig. 2 is very simple, when the pH in the photobioreactor is 8 a CO2 injection occurs and the pH of the culture
media decreases because of the CO2 dissolved in the culture media,
when the CO2 injection stops part of the inorganic carbon dissolved
as CO2 is stripped by the air injected in the reactor and the pH of
the reactor increases, when the pH is equal to 8 another CO2 injection cycle occurs. For the lower air flowrate (1.5 l/min) the interval
between CO2 injections is close to 3 h and close to 0.7 h to the higher flowrate (5.8 l/min).
The evolution of the dissolved inorganic carbon in the culture
media during the pH raise observed in the pH profile is caused
by the CO2 stripping, therefore:
0,002
13,5
14
14,5
15
15,5
16
16,5
17
17,5
time (h)
Fig. 3. Comparison between experimental and calculated dissolved inorganic
carbon profiles in the culture media during a pH raise for the air flowrate 1.5 l/min.
5
F.J. Valdés et al. / Bioresource Technology 119 (2012) 1–6
(a)
60
3rd day post inoculation
7th day post inoculation
50
0,0006
40
0,00045
η(%)
CO2 consumption rate (mol/lh)
0,00075
0,0003
30
20
3rd day post inoculation
0,00015
7th day post inoculation
10
0
09:36
1st day
12:00
14:24
16:48
19:12
0
09:36
Hour
12:00
14:24
16:48
19:12
Hour
2000
1800
(b)
3rd day post inoculation
7th day post inoculation
1600
2
PAR (μ mol/sm )
Fig. 5. Evolution of g ¼ CO2 uptaken=ðCO2 uptaken þ CO2 strippedÞ 100 in the
bubble column as a function of the day hour.
1400
with that obtained at the noon (25% vs 55%). Again, the effect of the PAR
level on the g ratio can be observed analysing the profiles of this ratio in
the third (clear day) and seventh day post inoculum (cloudy day): the values of this ratio are very similar until the noon and at this moment a different pattern in these ratios can be observed related with the different
PAR level for the 2 days studied.
1200
1000
800
600
400
200
4. Conclusions
0
09:36
12:00
14:24
16:48
19:12
Hour
Fig. 4. CO2 consumption rate and PAR profiles for 3rd and 7th day post inoculation.
thetic active radiation is close to 200 lmol/sm2, is very low, when
the PAR reaches high values at the noon, the CO2 fixation rate increases in both cases reaching their maximum value. At this moment, the PAR profiles and, consequently, the CO2 fixation rate,
suffer different evolution for the 2 days analysed. At the seventh
day post inoculation (cloudy day), after noon hours, the PAR level
decreases to low levels causing an important reduction of the photosynthetic activity of the microalgae as the CO2 fixation rate reflects. However, in the third day post inoculation (clear day), the
PAR level still presents a high value that produces elevated CO2 fixation rates.
The use of the pH profiles during the light day and the KLa value permit
to obtain relevant information about the behaviour of the microalgae/
photobioreactor system related to the CO2 net balance. Fig. 5 shows the
evolution of g ¼ CO2 uptaken=ðCO2 uptaken þ CO2 strippedÞ 100 in
the bubble column as a function of the day hour for three different days:
the first day of inoculum (0.07 g/l), third day post inoculum (0.14 g/l) and
seventh day post inoculum (0.36 g/l). Important differences in the efficience of CO2 uptaked by the culture can be observed for the 3 days analysed. In the first day, when the microalgae density at the culture is
close to 0.07 g/l, an important part of the CO2 is stripped by the air injected
in the photobioreactor, in this case, the g ratio is close to 30%. This low value is attributed to the low microalgae cell density in the culture. When the
microalgae cell density in the photobioreactor increases, see for example
the variation of the g ratio for the third day post inoculum, the efficiency
for the CO2 capture increases until values close to 55% at the noon. Evidently, the g ratio profiles are intimately related with the photosynthetic
active radiation (Hulatt and Thomas, 2011) and the evolution of this ratio
is a function of the part of the day. For example, the g ratios for the third
day post inoculum at the morning and at the evening are low compared
The analysis of the pH profiles has permitted to obtain information about the behaviour of the microalgae/photobioreactor system
in relation to the [CO2 uptaken/(CO2 uptaken + CO2 stripped)] ratio.
The evolution of this ratio is a function of the phothosynthetic active radiation (PAR) and the microalgae concentration. For N. oculata/bubble column photobioreactor a maximum value close to 55% is
obtained close to the noon when the microalgae concentration in
the culture is around 0.14 g/l. The information provided by this
methodology could be used to the correct selection of the photobioreactor/microalgae parameters with the aim to maximize the CO2
net balance.
Acknowledgements
The Authors wish to thank Repsol YPF for the financial support
that provided (Project reference: Ingenio 2010-CDTI-Sost
CO2-CEN-2008-1027) and the Generalitat Valenciana by the fellowship of one of the authors (Program VALI + D).
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Publicaciones
Publicación IV. Thermogravimetry and Py-GC/MS techniques as fast qualitative
methods for comparing the biochemical composition of Nannochloropsis oculata
samples obtained under different culture conditions. Bioresource Technology 131
(2013) 86-93.
Las microalgas tienen muchas aplicaciones, entre las que se encuentran la
producción de biodiesel o el suplemento alimenticio. Dependiendo de la aplicación, se
requiere la optimización de ciertas fracciones de la composición bioquímica (contenido
en proteínas, carbohidratos y lípidos transesterificables). Por lo tanto, muestras
obtenidas en condiciones de cultivo diferentes se deben analizar para comparar el
contenido en dichas fracciones. Sin embargo, los métodos tradicionales para la
determinación de la composición bioquímica necesitan procedimientos analíticos de
larga duración y con tiempos de preparación de muestra extensos.
En este trabajo se ha cultivado la microalga Nannochloropsis oculata en
distintas concentraciones de nitrógeno y de radiación fotosintéticamente activa, ya que
estas variables tienen una gran influencia en la composición bioquímica.
A las muestras obtenidas en estas condiciones se les ha medido la
composición bioquímica mediante los métodos tradicionales, se han analizado
mediante análisis termogravimétrico y por pirólisis conectada a cromatografía de gases
con detector masas. Después, se ha establecido un método que permite la
comparación de la composición bioquímica de las muestras mediante la integración de
sólo 21 picos del cromatograma y por último, se ha procedido a la comparación de los
resultados obtenidos con éstas técnicas y las convencionales, observándose una
buena correlación.
Los resultados obtenidos en este trabajo han permitido cubrir el siguiente
objetivo específico:
-Estudio de la viabilidad del empleo del análisis termogravimétrico y la pirólisis
conectada a cromatografía de gases con detector masas como posibles métodos para
cualitativamente comparar la composición bioquímica
de distintas muestras de
microalgas.
167
P.IV
Bioresource Technology 131 (2013) 86–93
Contents lists available at SciVerse ScienceDirect
Bioresource Technology
journal homepage: www.elsevier.com/locate/biortech
Thermogravimetry and Py–GC/MS techniques as fast qualitative
methods for comparing the biochemical composition of Nannochloropsis
oculata samples obtained under different culture conditions
F. Valdés, L. Catalá ⇑, M.R. Hernández, J.C. García-Quesada, A. Marcilla
Department of Chemical Engineering, University of Alicante, Ap. 99, P.O. Box 03080, Spain
h i g h l i g h t s
" TGA and Py–GC/MS for biochemical composition analysis.
" Biochemical composition by usual methods highly correlated with TGA and Py–GC/MS.
" TGA and Py–GC/MS fast methods to compare the composition of different samples.
a r t i c l e
i n f o
Article history:
Received 12 June 2012
Received in revised form 18 December 2012
Accepted 19 December 2012
Available online 27 December 2012
Keywords:
Biochemical composition
Thermogravimetric analysis
Pyrolysis
a b s t r a c t
Microalgae have many applications, such as biodiesel production or food supplement. Depending on the
application, the optimization of certain fractions of the biochemical composition (proteins, carbohydrates
and lipids) is required. Therefore, samples obtained in different culture conditions must be analyzed in
order to compare the content of such fractions. Nevertheless, traditional methods necessitate lengthy
analytical procedures with prolonged sample turn-around times. Results of the biochemical composition
of Nannochloropsis oculata samples with different protein, carbohydrate and lipid contents obtained by
conventional analytical methods have been compared to those obtained by thermogravimetry (TGA)
and a Pyroprobe device connected to a gas chromatograph with mass spectrometer detector (Py–GC/
MS), showing a clear correlation. These results suggest a potential applicability of these techniques as fast
and easy methods to qualitatively compare the biochemical composition of microalgal samples.
Ó 2012 Elsevier Ltd. All rights reserved.
1. Introduction
Microalgae are claimed to be an especially ‘promising biomass
source’ because of their higher photosynthetic efficiency, faster
biomass production and faster growth than other biomasses, like
trees (Calvin and Taylor, 1989). Furthermore, whereas most agricultural crops used for biodiesel produce yields of less than 5% of
the biomass required to obtain it (Banerjee et al., 2002; Chisti,
2008), the oil content of some algae can exceed 80% (Chisti, 2008).
On the other hand, the knowledge of the biochemical composition of the microalgae is of utmost importance because it provides
information about the possibilities of their potential use as an alternative fuel source. Normally, these analyses are carried out by conventional methods (Brown et al., 1998; Dubois et al., 1956;
Rodríguez-Ruiz et al., 1988; Sukenik and Carmeli, 1990) requiring
tedious sample preparation, three independent tests and significant
amounts of sample. Moreover, with respect to the duration of the
⇑ Corresponding author. Tel.: +34965902953; fax: +34965903826.
E-mail address: [email protected] (L. Catalá).
analysis, in the traditional methods, the three different tests necessary to obtain a complete evaluation of the biochemical composition of each sample involve the following extraction times: 60 min
for protein extraction, 240 min for carbohydrates and 30 min for lipid extraction. Furthermore, these times are only extraction times,
and another intermediate manipulation times are necessary to obtain the data. On the other hand, protein and carbohydrates methods are colorimetric, and the standards must be prepared in each
analysis in order to obtain the calibration curves. Therefore, it would
be very convenient to develop easier, faster methods requiring a
smaller amount of sample.
Analytical pyrolysis has been extensively used in the bibliography to obtain information about the composition of different
organic materials. For example, Fabbri et al. (2005) used Py–GC/
MS as a rapid analytical technique for sourcing continental organic
matter in marine sediments, Çoban-Yildiz et al. (2000) studied the
chemical composition of black sea suspended particulate organic
matter, Nguyen et al. (2003) studied the biochemical changes produced in Botryococus braunnii during the decomposition under oxic
conditions, Cejka and Sobalik (1997) used Py–GC/MS to analyze
fossil organic matter from sediments, which consist of different
0960-8524/$ - see front matter Ó 2012 Elsevier Ltd. All rights reserved.
http://dx.doi.org/10.1016/j.biortech.2012.12.133
169
87
F. Valdés et al. / Bioresource Technology 131 (2013) 86–93
types of algae, Derrene et al. (1991) used flash pyrolysis with GC/
MS to characterize intractable organic molecules in algae, Kruge
et al. (1998) used Py–GC/MS to study the aquatic organic matter
in open water sediment samples and nitrogen compounds including pyrroles, pyridines and indoles were identified in the pyrolyzate; these compounds are characteristic pyrolysis products of
proteins and degraded proteinaceous matter (in this case largely
from marine algae and bacteria). Ishida et al. (1998) applied reactive Py–GC to determine the lipid content and the fatty acid composition of every zooplankter individual at different algae
concentration. Alves et al. (2006) presented a method for the quantification of the lignin content (Py–lignin) of Maritime pine and
spruce wood samples directly from the pyrograms.
On the other hand, thermogravimetry (TGA) is widely used to
study solid decomposition reactions such as the pyrolysis processes of the different biomasses including microalgae. For instance, Peng et al. (2001) pyrolyzed the microalgae Spirulina
platensis (SP) and Chlorella protothecoides (CP) at the heating rates
of 15, 40, 60 and 80 °C/min up to 800 °C to investigate their pyrolytic characteristics. Three stages (dehydratation, devolatilization
and solid decomposition) appeared in the pyrolysis process. SP
and CP devolatilized mainly at 190–560 and 150–540 °C, respectively. Likewise, Marcilla et al. (2009) identified three main stages
in the decomposition process of the microalgae Nannochloropsis sp.
at 35 °C/min, i.e., the 25–180 °C range corresponding to dehydration, the 180–540 °C range corresponding to devolatilization and
the 540–800 °C range, where the solid residue from the previous
step undergoes a slow decomposition. The main step of the decomposition, the devolatilization, was actually described as a very
complex process involving at least three overlapped steps, at
290, 340 and 460 °C, respectively. On the other hand, analysis by
IR spectroscopy of the gases evolved in the pyrolysis of the microalgae Nannochloropsis sp., showed that the peak related to the C–H
absorption band, presents its maximum at 462 °C, which corresponds to the third process of the second stage, and it is more
important in the raw microalgae than in the microalgae that has
undergone lipid extraction with hexane. Based on TG-FTIR experiments with some standard components (glucose (saccharide), glutamine (aminoacid) and tripalmitine (lipid) whose maximum
decomposition rate takes place at 250, 345 and 450 °C, respectively), the authors suggested that the biochemical components
of the microalgae decomposed in the following order: polysaccharides, proteins and finally, lipids.
Therefore, to study the decomposition process under inert
atmosphere of different samples of microalgae, techniques such
as TGA or Py–GC/MS could be used to qualitatively compare their
biochemical composition. Such studies could be prior to the quantitative ones used to determine the biochemical composition and
could be used for estimating the conditions that could yield the
highest content of a determined fraction. The advantages of these
methods to achieve a comparison of different samples with respect
to traditional methods of analysis of biochemical composition are
mainly two: they require lower test times and, on the other hand,
they require a smaller amount of sample. This fact is a consequence
of avoiding the previous stages of extraction of the different compounds and, on the other hand, one single analysis permits to obtain an approximation of the protein, carbohydrate and lipid
contents.
Thus, the aim of the present work is to study the viability of TGA
and Py–GC/MS as likely methods to qualitatively compare the biochemical composition (i.e.: the protein, carbohydrate and lipid
contents) of different samples of microalgae. In order to achieve
this goal, samples with different biochemical composition have
been employed; these samples were obtained by culturing outdoors the microalgae Nannochloropsis oculata in different nitrogen
concentrations and photosynthetically active radiation intensity
170
(through different light path lengths) since these variables have a
great influence on the biochemical composition (Feng et al.,
2011; Hodgson et al., 1991; Su et al., 2011; Tam and Wong, 1996).
2. Methods
2.1. Microalgae and experimental conditions
N. oculata obtained from the Algobank–Caen culture collection
(University of Caen Basse-Normandie, France) was used in the
present study. Samples obtained at different culture conditions
(nitrogen concentration and photosynthetically active radiation
intensity) were collected in order to achieve samples with different
biochemical composition. The experimental conditions used to obtain the samples are shown in Table 1. The temperature was kept
at 20–25 °C by using water circulating in a coil exchanger immersed in the culture and the pH was maintained at 7 ± 0.2 by
the automatic injection of carbon dioxide. The reactors were located outdoors in Alicante (Southeast of Spain). The medium for
the microalgae growth in the reactors was natural sea water from
the ‘‘Golfo de Mazarrón’’ (Spain) enriched with f/2 modified (nutrient solution with a concentration double than the f/2 (Guillard and
Ryther, 1962)) supplied by Fitoplancton Marino S.L. The photosynthetically active radiation (PAR) was measured and registered
using a spherical quantum sensor located close to the surface of
the reactors. The samples used to explain the procedure carried
out were collected after 8 days of culture.
2.2. Determination of the biochemical composition by traditional
methods
2.2.1. Protein measurement
Protein extraction was performed by filtering 20 ml (corresponding to 8 106 kg microalgae) of culture through Whatman
GF/C microglass filters. The filter was extracted with NaOH
4 104 ppm at 100 °C for 60 min (Su et al., 2011). After this time
the liquid was transferred to centrifuge tubes and centrifuged at
5000 rpm for 5 min. The determination of proteins was carried
out by the Lowry method. This method means that 1 ml of Lowry
reagent is added to 0.2 ml of samples and standards. After stirring,
the mixture was allowed to react for 10 min. To the mixture obtained with the Lowry reagent, 0.1 ml of 1 N phenol reagent, prepared from the concentrate 2 N phenol reagent, was added,
mixed well and the mixture was allowed to react and develop color
for 30 min. After that, the absorbance was measured at a wavelength of 750 nm. Therefore, approximately 135 min are necessary
with this procedure. A repeatability test carried out with three
samples by quintuplicate showed an average relative error of 5%.
2.2.2. Carbohydrate measurement
Carbohydrate extraction was achieved by filtering 20 ml (corresponding to 8 106 kg microalgae) of culture in the same conditions as in the case of proteins commented on previously. The filter
was then heated at 100 °C with H2SO4 4.9 104 ppm for 240 min
(Brown et al., 1998). After this time the liquid was transferred into
centrifuge tubes and centrifuged at 5000 rpm for 5 min. The deter-
Table 1
Experimental conditions used to obtain samples with different biochemical
composition.
Sample
[N–NO3]o (lmol/l)
Light path length (cm)
1
2
3
2000
200
200
15
10
15
88
F. Valdés et al. / Bioresource Technology 131 (2013) 86–93
mination of carbohydrates was carried out by the phenol-sulphuric
method (Dubois et al., 1956). This method involves adding 0.05 ml
of a solution of 8.6 105 ppm of phenol and 5 ml of 1.7 106 ppm
H2SO4 to 2 ml of standards and the samples. After 30 min developing color, the absorbance was measured at a wavelength of
485 nm. Thus, approximately 270 min are necessary with this procedure. A repeatability test carried out with three samples by quintuplicate showed an average relative error of 5%.
2.2.3. Transesterified lipids measurement
Transesterified lipid (FAMEs) content was determined by filtering 50 ml (corresponding to 2 105 kg microalgae) of culture
before extracting and transesterifing by using a methanol/acetyl
chloride mixture according to the method reported by RodríguezRuiz et al. (1988). This method establishes that the filter is
introduced into a test tube to which was added 5 ml of a freshly
prepared mixture 20:1 (v/v) methanol/acetyl chloride and 0.1 ml
of a solution of 2500 ppm nonadecanoic acid (internal standard
(IS)). The mixture is subjected to ultrasound for 15 min. After that,
2.5 ml of hexane are added and after stirring, the resulting mixture
is heated to 100 °C for 15 min. Then, 5 ml of distilled water are
added, phases are separated in the centrifuge (5000 rpm for
3 min) and the hexane phase was used for analysis by GC–MS together with the standard samples.
FAMEs were measured by a GC/MS. The GC–MS system was an
Agilent 6890 equipped and an Agilent 5973 mass selective detector
and integrated with Agilent chemstation software. The column was
an Agilent DB23, (60 m 0.25 mm 0.3 lm film thickness). The
column temperature was programmed from 120 to 245 °C at a rate
of 15 °C/min. The column was kept at the final temperature for
20 min. The injector was set to 250 °C. Sample injection was made
in the split mode (10:1). A solvent delay of 3 min was selected. Helium was used as a carrier gas with a constant flow of 1 ml/min.
The average velocity of helium in the column was 0.37 m/s. In
addition to the samples, standards of different concentrations with
nonadecanoate methyl ester (IS) were used in order to obtain the
response factor. Therefore, approximately 100 min are necessary
with this procedure. A repeatability test carried out with three
samples by quintuplicate shows an average relative error of 3%.
2.3. Study of the biochemical composition using thermogravimetric
and Py–GC/MS analysis
2.3.1. Sample preparation
Cells were harvested by centrifugation (5000 rpm, 3 min) and
finally lyophilized (40 °C, 1800 Pa).
2.3.2. Thermogravimetry
TGA analyses were performed using a Thermobalance METTLER
TOLEDO, model TGA/SDTA851e/SF/1100. Approximately 6
106 kg of each sample were heated from 25 to 900 °C in a nitrogen atmosphere (50 ml/min) with a heating rate of 5 °C/min. Thus,
an analysis takes approximately 180 min. The temperature of the
sample was measured with an R type thermocouple. The temperature values used were those recorded by the probe of the device,
located under the crucible, and not the programmed values. The
tests were carried out in duplicate to check the reproducibility of
the test, which was found to be acceptable as the difference in
measurements was less than 1 °C and 2% in the weight loss.
At the start of the study the equipment was calibrated using indium and aluminum standards and periodic checks were made to
ensure that the equipment remained in good conditions according
to the calibration specifications.
2.3.3. Pyroprobe connected to a gas chromatograph with mass
spectrometer detector (Py–GC/MS)
Samples of all the cultures were pyrolyzed by using a CDS
Pyroprobe 2000 connected on line to a gas chromatograph with
an Agilent GC–MS mass detector (GC 6890N-MD 5973N). Approximately 2 107 kg of sample were introduced into a quartz capillary tube in each experiment. The capillary was automatically
introduced into the center of a platinum resistor which heats up
in an inert atmosphere.
Different combinations of pyrolysis time (1–40 s) and temperature (400–600 °C) were evaluated. The optimal temperature and
time conditions that led to the most defined peaks in the liquid
compounds obtained in the flash pyrolysis of the microalgae (compounds at 5–45 min in the chromatogram) was 500 °C with a holding time of 20 s. The nominal heating rate of the equipment was
333 °C/min.
Each experiment was repeated by quintuplicate, and taking into
account the pyrolyzed mass, the results show a good reproducibility of the experiments, since the differences between the peak
areas corresponding to all samples were always lower than 13%.
The products generated in pyrolysis were rapidly removed from
the reaction zone (quartz capillary surrounded by the resistor)
using a flow of helium, through a transfer line at the temperature
of 280 °C until introduced into the gas chromatograph provided
with a mass spectrometry detector for analysis (HP-5973 MSD).
The products were separated on an HP-5MS column (30 m–
0.25 mm i.d.). The column temperature was programmed from
38 to 320 °C at a rate of 12 °C/min after an initial 10 min isothermal period. The column was kept at the final temperature for
20 min. The injector was set to 250 °C. The detector was set to
210 °C. Sample injection was made in the split mode (10:1). Helium was used as a carrier gas at a constant pressure of
62742 Pa. Therefore, an analysis takes approximately 60 min.
Identification of different compounds obtained in this analysis
has been carried out by using the Wiley 275 mass spectral library.
3. Results and discussion
3.1. Culturing of the microalgae N. oculata under different conditions
In order to achieve the aim of the present work, studying the
viability of TGA and Py–GC/MS as likely methods to qualitatively
compare the biochemical composition (i.e.: the protein, carbohydrate and transesterified lipid content) of different samples of microalgae, three samples were chosen. These samples were selected
in order to have two with different biochemical composition and
two with similar biochemical composition, and test the potential
of the method.
These samples were obtained by culturing outdoors the microalgae N. oculata under different conditions of nitrogen concentration and photosynthetically active radiation (through different
light path lengths) (Table 1).
The evolution of the growth and the consumption of the
macronutrients (phosphorus and nitrogen) were measured and
the results obtained followed the expected trends, i.e. microalgae
grew until macronutrients starvation occurred.
3.2. Determination of the biochemical composition by traditional
methods
Table 2 shows the protein, carbohydrate and transesterified lipid (FAME) contents determined by traditional methods of the
samples of N. oculata obtained from the different cultures. In view
of the results obtained, there are no significant differences in the
carbohydrate composition in the different samples. Nevertheless,
171
F. Valdés et al. / Bioresource Technology 131 (2013) 86–93
Table 2
Biochemical composition of the three different samples obtained by the traditional
methods.
Sample
% Proteins*
% Carbohydrates*
% Transesterified lipids*
1
2
3
30.8 ± 2.1
21.7 ± 0.7
20.1 ± 0.7
20.2 ± 0.8
21.0 ± 0.3
20.5 ± 1.8
12.0 ± 0.5
17.6 ± 0.5
17.4 ± 0.4
89
(a)
*
Uncertainties represent standard deviations from independent tests conducted by
quintuplicate.
there are significant differences in the protein content when comparing the sample 1 (sample with the highest initial nitrogen
concentration) with the other samples. For example, the sample
1 has a protein content of around 31% and in the samples 2 and
3 is around 21%. This behavior was also observed for the microalgae Chlorella vulgaris (Tam and Wong, 1996), Dunaliella Tertiolecta
(Fábregas et al., 1989), Phaeodactilum Tricornutum (Fábregas
et al., 1996) and different green and blue–green algae (Piorreck
et al., 1984). These studies have shown that the concentration of
proteins in aged cultures, where the nitrogen proportion in the
medium was very low, was much lower than that exhibited by
the microalgae in the early stages of growth, where the nitrogen
content in the medium was higher. Concerning the percentage of
FAMEs, there are important differences between the three samples.
The microalgae present in the samples 2 and 3 (samples with the
lowest initial nitrogen concentration) had a transesterified lipid
content 1.5 times higher than the value of the sample 1; i.e.
17.6% vs. 12%., demonstrating that microalgae subjected to nitrogen starvation accumulate higher amount of lipids. Another aspect
that has been observed in this study is that the transesterified lipid
content of the sample 2 was slightly higher than in the sample 3.
This fact could be due to the reduction of the light path length
since the lipid content increases with increasing irradiance, presumably because of the higher amount of energy available for photosynthesis (Su et al., 2011).
Furthermore, the variation of the FAME composition generated
in the process of transesterification of the lipid content in biomass
varies depending on the growth conditions, in concordance with
the bibliography. With regard to the number of carbon atoms,
the proportion of C20 compounds within the transesterified lipid
decreased with nitrogen starvation while the proportion of C16
compounds increased (Hodgson et al., 1991; Su et al., 2011). With
respect to the degree of unsaturation, the polyunsaturated compounds decreased with nitrogen starvation while in the case of
the saturated and monounsaturated compounds proportion, the
sum of these compounds increased in nitrogen-deficient cultures
(Hodgson et al., 1991; Su et al., 2011).
3.3. Study of the biochemical composition using thermogravimetric
and Py–GC/MS analyses
3.3.1. Thermogravimetric analysis
The weight loss curves obtained by TGA and the derivative of
the TGA curves (DTG) for the three samples of the microalgae N.
oculata are shown in Fig. 1a and b, respectively.
A deeper study of Fig. 1b reveals that, in good agreement with
the bibliography, the weight loss is actually a superposition of at
least three processes i.e.: dehydration between 25 and 180 °C, devolatilization at 180–500 °C and solid residue decomposition between 500 and 900 °C.
In the dehydration stage, there are two peaks, the first one (50–
70 °C) is probably caused by the loss of free water and the second
one (100–180 °C) by the water loosely bound to biomolecules
(Pane et al., 2001).
172
(b)
Fig. 1. Weight loss curve (TGA) (a) and derivative weight loss curve (DTG) (b) as a
function of the temperature.
In the same way that was shown by Marcilla et al. (2009) for the
microalgae Nannochloropsis sp., the stage in which the main weight
loss takes place, i.e. devolatilization, is actually a complex process.
For the microalgae N. oculata, at least four reactions are overlapped,
i.e.: peaks approximately at 260, 300, 370 and 400 °C, as can be
seen in Fig. 1b.
It is in the main decomposition process, the devolatilization,
where there are important differences between the sample 1 and
the other samples. As can be seen in the DTG curve (Fig. 1b), the
samples 2 and 3 have a more pronounced peak than that observed
in the sample 1 at 370 °C. Something similar occurs at lower temperatures, in this case, the sample 1, which has a more pronounced
decomposition process at an approximate temperature of 300 °C.
The different behavior exhibited by the samples in the thermogravimetric experiments could be explained taking into account
the biochemical composition of these samples. The main differences in composition between the sample 1 with respect to samples 2 and 3 are related with the protein and transesterified lipid
content. The sample 1 has a protein content 15% higher than the
other samples. By contrast, the samples 2 and 3 have almost 1.5
times the transesterified lipid content of the sample 1, 17.6% compared to 12%.
Therefore, the fact that the decomposition peak observed at
370 °C in the samples 2 and 3 is more pronounced than in the sample 1 could be closely related to the higher transesterified lipid
content in these samples. By contrast, the decomposition peak at
300 °C is more clearly observed in the sample 1 and it may be more
closely related to the protein content.
These results are in good agreement with the literature.
Marcilla et al. (2009) analyzed the evolution of the compounds
generated in the decomposition of Nannochloropsis sp. samples
90
F. Valdés et al. / Bioresource Technology 131 (2013) 86–93
by TG/FTIR, and they reported that compounds such as lipids
tended to decompose at higher temperatures than other
compounds. In addition, Na et al. (2011) conducted a thermogravimetric analysis study with samples of the microalgae Chlorella,
observing that the decomposition peak taking place at higher
temperatures was closely related to the lipid content and more
specifically with the triglyceride content.
On the other hand, in the case of the TG analysis, once the standard samples have been analyzed, and the TG peaks ‘‘assigned’’, it
can be used in order to elucidate the relevance of each peak, and
hence a rough ratio between the different fractions. Nevertheless,
unlike what happens in the case of the protein, carbohydrate and
transesterified lipid contents analysis, TG analysis does not require
to use these standard samples each time that it is done, in fact,
once the decomposition temperature of each fraction is known it
is not needed to use the standard samples anymore, provided the
instrument is adequately calibrated.
3.3.2. Py–GC/MS
Products obtained by pyrolysis of microalgal biomass have been
analyzed by chromatography and mass spectrometry. Evidently,
the study performed in this section considers that different compounds present in the chromatogram can be related to, or are
derived from, products of the main components of the microalgae:
protein, carbohydrates and lipids.
Fig. 2 shows an example of the chromatogram obtained for a
sample up to a retention time of 26 min since after this time no
peaks are observed in the chromatogram.
The chromatograms obtained are relatively complex, since they
generally exhibit a high number of peaks (above 180). The following procedure was followed in order to analyze chromatograms.
Firstly, all the peaks were analyzed and, if possible, assigned to
a particular compound using the Wiley 275 library present in the
chromatographic analysis program of Agilent Technologies. Using
this library, it was possible to identify approximately 60% of the
peaks present in the chromatogram to a specific compound with
a probability higher than 80%.
The next step consists in the assignation of the potential source
of these compounds, i.e. to classify the compounds according to the
most likely chemical origin: carbohydrates, lipids or proteins. This
identification was done by considering the data published in the
literature concerning different samples of similar chemical nature:
microalgae, organic matter present in marine sediments and other
similar materials (Çoban-Yildiz et al., 2000; Fabbri et al., 2005;
Nguyen et al., 2003). At the same time, different standards of carbohydrates, lipids and proteins were previously used in order to
Fig. 2. Example of a chromatogram obtained by Py–GC/MS with the compounds retained for analysis identified. Number scheme corresponds to Table 3. (a) From 0 to 13 min
and (b) from 13 to 26 min.
173
F. Valdés et al. / Bioresource Technology 131 (2013) 86–93
91
Fig. 3. Chromatograms obtained for standards of carbohydrates. Peak number: (1) furfural, (2) furanmethanol, (3) 2-propanone, 1-(acetyloxy), (4) ethanone, 1-(2-furanyl), (5)
2(5H)-furanone, (6) 2-furancarboxaldehyde, 5-methyl, (7) 2-cyclopenten-1-one, 2-hydroxy-3-methyl, (8) ethanone, 1-(5-methyl-2-furanyl), (9) 2,3-dihydro-3,5-dihydroxy6-methyl-4H-pyran-4-on, (10) 2-furancarboxaldehyde, 5-[(acetyloxy)methyl].
Fig. 4. Chromatograms obtained for standards of proteins. Peak number: (1) 1H-pyrrole, (2) toluene, (3) styrene, (4) 1H-pyrrole, 2-ethyl, (5) phenol, (6) phenol, 4-methyl, (7)
benzeneacetonitrile, (8) benzenepropanenitrile, (9) 1H-indole, (10) 7-methylindole.
analyze the most likely compounds that can be obtained during the
analytical pyrolysis of the samples (Figs. 3–5). For example, the
breakdown of carbohydrates yields compounds derived from furan
such as furfural and furanmetanol (Fig. 3). In the case of proteins,
some of the compounds obtained were nitrogen chemicals derived
from pyrrole and indole (Fig. 4). In the case of the lipids, the compounds obtained were mainly hydrocarbons (Fig. 5). As it occurs in
the case of the TG analysis, Py–GC/MS does not require to use these
standard samples each time that it is done.
Once this classification was done, it was determined which of
these compounds had a higher proportion (based on the areas obtained during the integration) within each group and the resulting compounds are presented in Table 3. This reduces the full
chromatogram analysis of more than 180 peaks to the analysis
of the 21 peaks shown in Table 3. Thus, a semiquantitative analysis can be achieved in order to compare the relative composition
of the samples analyzed. For example, a relative lipid composition
can be calculated by dividing the addition of the areas of the
compounds derived from lipids in Table 3 by the addition of
the areas of all the compounds in Table 3. Following this procedure the obtained results for the relative concentration of the bio-
174
chemical composition for the different samples analyzed are
shown in Table 4.
As can be seen in Table 4, the information that this comparative
analysis shows is very similar to that obtained by traditional methods from a qualitative point of view and indicates that the samples
2 and 3 have a higher lipid content than the sample 1, while the
latter sample has a higher protein content than the other samples.
On the other hand, samples obtained in nitrogen starvation conditions yield pyrograms with lower C19 peaks than those obtained
in normal nitrogen conditions, in good agreement with the results
obtained by the conventional lipids analysis and the literature
(Hodgson et al., 1991; Su et al., 2011), and already commented
on in Section 3.2. The C19 peaks have not been considered in the
suggested analysis of the pyrograms, since their intensity is always
much lower than those of the other peaks from lipids considered,
and in order to simplify the procedure.
Fig. 6 shows the results of the biochemical composition obtained by traditional methods and Py–GC/MS from the three samples by quintuplicate.
In addition, as reflected in Fig. 6, there exists a linear relationship between the results obtained for the content of the different
92
F. Valdés et al. / Bioresource Technology 131 (2013) 86–93
Fig. 5. Chromatograms obtained for standards of lipids. Peak number: (1) l-octene, (2) octane, (3) 1-nonene, (4) nonane, (5) 1-decene, (6) decane, (7) 1-undecene, (8)
undecane, (9) 1-dodecene, (10) dodecene, (11) 1-tridecene, (12) tridecene, (13) 1-tetradecene, (14) tetradecene, (15) 1-pentadecene, (16) pentadecene.
Table 4
Semiquantitative analysis of the samples harvested at the end of the growth analyzed
by Py–GC/MS.
Table 3
Compounds used for the semiquantitative analysis by Py–GC/MS.
Peak in
Fig. 2
Retention time
(min)
Compound
Origin
1
2, 3
3.9
6.8, 7.2
Proteins
Proteins
4
5
6, 7, 8
7.7
11.1
12.0, 12.1, 12.4
9
15.3
10
17.9
11
12
13
14, 15
16
17, 18
19
20
21
18.3
18.6
19.3
19.4, 19.5
20.6
21.5, 21.6
21.7
23.6
23.8
Pyrrole
Derived from methyl
pyrrole
Furanmethanol
Etanone, 1-(2-furanyl)
Derived from dimethyl
pyrrole
Derived from ethyl methyl
pyrrole
Derived from ethyl
trimethyl pyrrole
Dianhydromannitol
Benzenepropanenitrile
Tridecane
Derived from indole
Derived from methyl indole
Derived from pentadecene
Pentadecane
Heptadecene
Heptadecane
Carbohydrates
Carbohydrates
Proteins
Sample
% Proteins*
% Carbohydrates*
% Lipids
*
Sample 1
Sample 2
Sample 3
22.5 ± 1.5
13.1 ± 3.0
13.2 ± 1.7
41.3 ± 4.9
41.3 ± 2.8
41.6 ± 1.5
28.8 ± 1.6
44.3 ± 1.7
42.6 ± 3.5
Uncertainties represent standard deviations from independent tests conducted by
P
quintuplicate.
Area biochemical markers
*
P
:
Relative concentration ð%Þ ¼
total area markers
Proteins
Proteins
Carbohydrates
Proteins
Lipids
Proteins
Proteins
Lipids
Lipids
Lipids
Lipids
fractions of the biochemical composition by Py–GC/MS and the
ones obtained by the analytical methods. The linear regression obtained for the different fractions are:
Fig. 6. Relationship between the results obtained for the content of the different
fractions of the biochemical composition by Py–GC/MS and the ones obtained by
the analytical methods.
% obtained by Py GC=MS ¼ 2:01% obtained by the analytical method ðr 2 ¼ 0:7489Þ:
Proteins
% obtained by Py GC=MS ¼ 0:68% obtained by the analytical method ðr 2 ¼ 0:8534Þ:
Lipids
% obtained by Py GC=MS ¼ 2:47% obtained by the analytical method ðr2 ¼ 0:9536Þ:
Carbohydrates
Consequently, these methods could be considered very valuable
to compare the biochemical composition of samples of similar
origin in an easy and fast way because using the TGA or Py–GC/MS
only one sample provides qualitative information of the
175
F. Valdés et al. / Bioresource Technology 131 (2013) 86–93
biochemical composition of the sample, using less time and sample
manipulation than the traditional methods, 180 min for TGA and
60 min for Py–GC/MS while approximately 500 min for traditional
methods.
4. Conclusions
Thermogravimetric analysis and Py–GC/MS analysis have
shown a clear correlation with the biochemical composition of
the samples. In this sense both techniques, but especially the Py–
GC/MS analysis has revealed as a powerful tool for comparative
purposes providing a qualitative idea of the biochemical composition in a rapid single analysis requiring a very small amount of
sample.
Acknowledgements
The Authors wish to thank Repsol YPF for the financial support
that provided (Project reference: Ingenio 2010-CDTI-Sost CO2CEN-2008-1027) and the Generalitat Valenciana by the fellowship
of one of the authors (Program VALI + D).
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Publicaciones
Publicación V. Comments on “Thermogravimetric analysis of microalgae combustion
under different oxygen supply concentrations” (Appl. Energy 88 (2011) 3189-3196).
J.C. García-Quesada, L. Catalá, A. Marcilla. Applied Energy 93 (2012) 212-214.
P.V
En el artículo “Thermogravimetric analysis of microalgae combustion under
different oxygen supply concentrations” (Appl. Energy 88 (2011) 3189-3196) se estudia
el comportamiento termogravimétrico de la combustión de la microalga Chlorella
vulgaris y se describe un análisis cinético basado en los métodos de KissingerAkahira-Sunose (KAS) y Flynn-Wall-Ozawa (FWO). En nuestra opinión, y teniendo en
cuenta la bibliografía existente, el análisis cinético llevado a cabo por los autores en
dicho trabajo presenta algunos puntos débiles que plantea ciertas dudas sobre su
validez. Estos puntos débiles se discuten en este trabajo (carta al editor) y pueden ser
resumidos de la siguiente manera:
4. La complejidad de las reacciones que tienen lugar en la combustión de las
microalgas no está en concordancia con la complejidad del modelo cinético
considerado.
5. La energía de activación obtenida no es constante, como debería ser,
teniendo en cuenta las suposiciones realizadas.
6. Los parámetros cinéticos no se validan comprobando si pueden ser usados
para reconstruir las curvas cinéticas experimentales.
177
Applied Energy 93 (2012) 212–214
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Applied Energy
journal homepage: www.elsevier.com/locate/apenergy
Comments on ‘‘Thermogravimetric analysis of microalgae combustion under
different oxygen supply concentrations’’ (Appl. Energy 88 (2011) 3189–3196)
J.C. García-Quesada, L. Catalá ⇑, A. Marcilla
Department of Chemical Engineering, University of Alicante, Apdo. 99, E-03080 Alicante, Spain
a r t i c l e
i n f o
Article history:
Received 17 October 2011
Received in revised form 12 December 2011
Accepted 25 December 2011
Available online 13 January 2012
Keywords:
Kinetic analysis
Thermogravimetric analysis
a b s t r a c t
In a recent publication, Chen et al. (2011) [1] studied the thermogravimetric behavior of the combustion
of the microalgae Chlorella vulgaris and described a kinetic analysis based on Kissinger–Akahira–Sunose
(KAS) and Flynn–Wall–Ozawa (FWO) methods in the work entitled: ‘‘Thermogravimetric analysis of microalgae combustion under different oxygen supply concentrations’’ (Appl. Energy 88 (2011) 3189–3196).
Some comments about this work are discussed in the present letter to the editor.
Ó 2011 Elsevier Ltd. All rights reserved.
Discussion
In a recent publication, Chen et al. [1] studied the thermogravimetric behavior of the combustion of the microalgae Chlorella
vulgaris and described a kinetic analysis based on Kissinger–Akahira–Sunose (KAS) and Flynn–Wall–Ozawa (FWO) methods in the
work entitled: ‘‘Thermogravimetric analysis of microalgae combustion under different oxygen supply concentrations’’.
In our opinion, and in view of the existing literature, the kinetic
analysis performed by the authors of the work exhibits some weak
points that pose certain doubts on its validity. They can be summarized as:
1. The complexity of the reaction pattern is not in concordance
with the complexity of the kinetic model considered.
2. The activation energy obtained is not constant, as should be
expected, bearing in mind the assumptions considered.
3. The kinetic parameters are not validated by checking if they
can be used to reconstruct the experimental kinetic curves.
It is important to bear in mind that as stated by the authors, the
decomposition of a microalgae is actually a very complex process. If
thermogravimetric curves (Fig. 1) are analyzed, it is possible to state
that in good agreement with the authors of the work, the decomposition profile consists of at least a three-step process: ‘‘The first stage
was from room temperature to about 170 °C (the temperature of
initial devolatilization), corresponded to a loss of moisture and the
very light volatile materials. The second stage was from 170 °C to
⇑ Corresponding author. Tel.: +34 965 90 3400x2386; fax: +34 965 90 3826.
E-mail address: [email protected] (L. Catalá).
612.5–657.3 °C (depending on the oxygen concentration) and was
characterized by a major weight loss, corresponded to the main
release and combustion of organic components. The third stage
was from the end of the second stage to 800 °C, and the weight loss
was very slight in this stage.’’ Furthermore, it is also possible to
notice that during the second stage, a shoulder is apparent, indicating that at least two processes are taking place. Thus, microalgae
combustion could be considered to occur following at least four
different processes whose rates exhibit a maximum at approximately 275, 340, 460 and 550 °C.
In the bibliography, different kinetic analysis methods can be
found; some of them are described by Vyazovkin et al. [2]. Most of
the papers devoted to kinetic analysis apply isoconversional procedures, which hold strictly for a single-step process. Nevertheless, the
occurrence of a multi-step process does not immediately invalidate
the application of the isoconversional principle, which continues to
work as a reasonable approximation because isoconversional methods describe the process kinetics by using multiple single step kinetics equations, each of which is associated with a certain extent of
conversion and a narrow temperature range related to this conversion. As a matter of fact, the dependencies of the activation energy
on the conversion evaluated by an isoconversional method allow
for meaningful mechanistic and kinetic analyses as well as for reliable kinetic predictions [2].
In the Chen et al. work [1], although there is a clear evidence of
a complex process (Fig. 1), the authors have used calculation procedures suitable for processes that take place following one single
reaction: Kissinger–Akahira–Sunose (KAS) and Flynn–Wall–Ozawa
(FWO) methods. These methods would be correctly applied if the
deconvolution of the specific stages was done (based e.g. on DTG
curve) and the activation energy was calculated for each separate
0306-2619/$ - see front matter Ó 2011 Elsevier Ltd. All rights reserved.
doi:10.1016/j.apenergy.2011.12.068
179
213
J.C. García-Quesada et al. / Applied Energy 93 (2012) 212–214
Table 1
The activation energies obtained by TG data at different rates by KAS and FWO
methods. Reproduced from ‘‘Thermogravimetric analysis of microalgae combustion
under different oxygen supply concentrations’’ (Appl. Energy 88 (2011) 3189–3196).
Atmosphere
20%O2/80%N2
50%O2/50%N2
Fig. 1. DTG curves of Chlorella vulgaris at a heating rate of 20 °C min1 in different
atmospheres. Reproduced from ‘‘Thermogravimetric analysis of microalgae combustion under different oxygen supply concentrations’’ (Appl. Energy 88 (2011)
3189–3196).
60%O2/40%N2
stage, using (for instance) the differential method of Friedman [3].
Alternatively, the integration of the differential equations corresponding to kinetic models involving multiple steps to obtain the
weight of the sample (or its derivative), and the minimization of
the sum of the squares of the differences between the experimental and calculated weights (or weight derivatives) could also be an
acceptable choice [2,4].
Thus, and according to the information reported, the authors of
the work presumably consider the whole degradation pattern of
the second stage in order to calculate average activation energy
values by means of the two different procedures mentioned above
for each oxygen concentration. As an example of their results, in
Fig. 2 we have plotted the activation energy data shown in Table
1, as a function of the conversion degree for the experiment under
different oxygen concentration. When the activation energy is
calculated by the authors of the work, they indicate that the activation energy varies slightly. This statement is not fulfilled, as can be
clearly observed in Fig. 2, even in the conversion range reported by
the authors, 0.2 < a < 0.8, where a variation of around 40% is apparent and a dependence of the activation energy on the conversion is
evident for the experiment of 60%O2/40%N2. For the rest of oxygen
concentrations, the activation energies values exhibit a great dispersion, but not any clear trend. This could probably be due to
the fact that the authors only use three heating rates to calculate
the activation energy, making it difficult to obtain accurate activation energy values. Additionally, the use of so high heating rates as
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
KAS method
FWO method
E (kJ mol1)
R2
E (kJ mol1)
R2
175.58
174.05
131.35
129.85
115.82
114.00
101.07
0.96039
0.96099
0.97760
0.97822
0.99561
0.99600
0.99998
166.90
153.91
142.19
131.73
122.44
114.19
106.85
0.96154
0.97895
0.98961
0.99575
0.99887
0.99996
0.99969
0.98518
0.96193
0.99997
0.99253
0.99275
0.99999
0.99999
216.32
176.14
182.67
155.52
155.52
137.00
137.00
0.99999
0.98647
0.99998
0.98523
0.96045
0.95898
0.93352
274.00
216.32
274.00
205.29
176.14
176.14
147.54
0.99999
0.99999
0.99999
0.98595
0.99998
0.98543
0.98511
274.00
274.00
216.32
216.32
274.00
216.32
216.32
Average
13.453
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
218.26
176.44
181.80
153.37
151.85
132.26
130.48
Average
163.49
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
279.13
219.05
275.70
215.89
174.12
172.32
142.46
Average
211.24
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
278.25
277.46
218.29
217.52
274.57
215.67
214.57
Average
242.33
134.03
0.98684
0.96429
0.99999
0.99324
0.99324
0.99999
0.99999
165.74
0.99999
0.98684
0.99999
0.98684
0.96429
0.96429
0.94231
209.92
0.99999
0.99999
0.98684
0.98684
0.99999
0.98684
0.98684
241.04
2
Notes: R is related coefficient.
40 °C/min is incorrect for the investigation of processes which may
be controlled by diffusion and, as the microalgae combustion is an
exothermic process, such heating rates may significantly influence
the assumed temperature profiles, at least more than during experiments carried out at lower heating rates. Thus, we found rather
questionable the obtaining of any conclusion of the type of comments shown in page 3194 of the original work or the conclusions
section, when the activation energies are compared for different
oxygen concentrations. At this point, other models, contemplating
additional steps should have been considered.
(b)
Activation energy (J/mol)
Activation energy (J/mol)
(a)
80%O2/20%N2
a
Conversion degree (α)
Conversion degree (α)
Fig. 2. Dependency of the energy activation on the conversion degree with the data reported by Chen et al. (2011) for FWO (a) and KAS (b) methods corresponding to the
combustion of Chlorella vulgaris for different oxygen concentrations.
180
214
J.C. García-Quesada et al. / Applied Energy 93 (2012) 212–214
Furthermore, the calculations are done considering a conversion
degree range between 0.2 and 0.8, while a wider conversion degree
range should have been considered, as Vyazovkin et al. [2] have
already pointed out: ‘‘It is recommended to determine the activation
energy values in a wide range of a = 0.05–0.95 with a step of not larger than 0.05’’. The utilization of wider conversion degree ranges
probably would have shown a higher variation of the activation
energy with the conversion indicating that the process has to be described as a multiple-step kinetics, i.e., by a multiple kinetic triplets.
Additionally, one of the questions that could raise concern
about the ability of the model considered to reproduce the experimental behavior. A kinetic analysis procedure that assumes an
overall process has been employed, while it is obvious that the
decomposition pattern is complex and several processes seem to
be overlapped. Nevertheless, the kinetic parameters could have a
certain sense from the point of view of a pseudo kinetic analysis
and they would be acceptable if they could be useful and capable
of correlating the samples behavior, at least roughly.
Thus, the recalculation of the weight loss (or conversion) curves
by the suggested model, and using the kinetic parameters obtained
in order to check the degree of coincidence with the raw experimental data (or alternatively the conversion deduced from such
experimental data) is much convenient or even necessary. Furthermore, it would permit the validity of all the assumptions involved
to be checked. This aspect has already been stated in literature [2],
and although it is of great importance as it is a proof of the validity
of all the assumptions considered, it is rarely used or reported in
bibliography dealing with kinetic analysis. The Chen et al. work
is one of the examples that illustrates this fact. One likely way to
achieve this verification (if the preexponential factor and the conversion degree function had been reported) could consist in using
kinetic parameters in order to theoretically calculate the derivative
of the conversion degree or in the integration of the kinetic equation in order to obtain the conversion degree profile:
da
¼ ko eEa=RT f ðaÞ ) a ¼
dt
Z
t
ko eEa=RT f ðaÞdt
ð1Þ
0
Finally, it is also worth mentioning that the analysis and comparison of one single kinetic parameter (as in this case, the activation energy) cannot be adequate, since the reaction pattern
depends on the whole kinetic triplet and it has been already demonstrated that for different activation energy values, the rest of the
kinetic triplet may adopt corresponding values to reproduce similar degradation patterns [5,6].
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paper entitled: computational aspects of kinetic analysis. Part B: the ICTAC
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181
Publicaciones
Publicación VI. Review of thermochemical conversion of microalgae. A. Marcilla, L.
Catalá, J.C. García-Quesada, F.J. Valdés and M.R. Hernández. Renewable and
Sustainable Energy Reviews 27C (2013) 11-19.
P.VI
Después de comprobar que existen varios trabajos en los que no se lleva a
cabo correctamente el análisis cinético, tal y como se ha puesto de manifiesto en la
publicación anterior, y la gran variedad de resultados obtenidos en las distintas
técnicas de la conversión termoquímica, se decidió realizar una revisión y
actualización del estado del arte de la investigación y el desarrollo de la conversión
termoquímica de microalgas, haciendo un especial hincapié en la licuefacción
hidrotérmica, la pirólisis, sus aplicaciones analíticas y modelado cinético.
Los resultados obtenidos en este trabajo han permitido cubrir los siguientes
objetivos específicos:
-Actualización del estado de la investigación en el campo de la conversión
termoquímica.
-Revisión actualizada del estado de la técnica en el ámbito de los aspectos
experimentales y teóricos (modelado matemático y simulación) asociados con la
pirólisis de microalgas.
183
Renewable and Sustainable Energy Reviews 27 (2013) 11–19
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Renewable and Sustainable Energy Reviews
journal homepage: www.elsevier.com/locate/rser
A review of thermochemical conversion of microalgae
A. Marcilla, L. Catalá n, J.C. García-Quesada, F.J. Valdés, M.R. Hernández
Department of Chemical Engineering, University of Alicante, Apdo. 99, San Vicente del Raspeig E-03080, Alicante, Spain
ar t ic l e i nf o
a b s t r a c t
Article history:
Received 3 August 2012
Received in revised form
17 June 2013
Accepted 24 June 2013
Microalgae are very effective microorganisms for CO2 capturing and a promising source of lipids for
biodiesel as well as other interesting compounds. Many different ways of exploitation of these organisms
are being tested. This work presents a review of the state of the art of the research and development of
thermochemical conversion of microalgae with a special focus on pyrolysis and hydrothermal liquefaction. Aspects related to the type of reactors, the products obtained and the analytical applications are
covered. The actual reaction scheme of pyrolysis of microalgae is extremely complex because of the
formation of over hundreds of intermediate products. Various kinetic models reported in the literature
and in a previous study with experimental validations are presented in this review to provide the current
status of the study.
& 2013 Elsevier Ltd. All rights reserved.
Keywords:
Microalgae
Pyrolysis
Hydrothermal liquefaction
Thermogravimetric analysis
Pyroprobe
Kinetic analysis
Contents
1.
2.
Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Pyrolysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.1.
Operating conditions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.1.1.
Slow pyrolysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.1.2.
Fast pyrolysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.1.3.
Flash pyrolysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.2.
Pyrolysis of microalgae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.3.
Microwave assisted pyrolysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.4.
Hydropyrolysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3. Hydrothermal liquefaction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4. Analytical applications. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.1.
Thermogravimetric analysis (TGA) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.2.
Pyroprobe reactor connected to a gas chromatograph with mass spectrometer detector (Py-GC/MS) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5. Kinetic modeling of pyrolysis of microalgae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6. Conclusions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Acknowledgements . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1. Introduction
Energy is the fundamental driving force of the economic
growth and the world's development in addition to the material
basis for human life. In recent years, the rapid development of the
n
Corresponding author. Tel.: +34 965 90 3400x2386; fax: +34 965 90 3826.
E-mail address: [email protected] (L. Catalá).
11
12
12
12
13
13
13
13
13
15
16
16
16
17
18
18
18
world economy has led to the global shortage of fossil fuels so that
their prices have increased significantly. Moreover, the use of fossil
fuels has also brought a very prominent environmental problem.
Therefore, accelerating the development and utilization of new
energy sources has become a common action around the world.
Generally, microalgae contain varying amounts of lipids, sugars,
proteins and pigments among other compounds. Presently, the
conversion of microalgae to fuel products mostly focuses on the
lipid fraction, which can be used to produce high-quality biodiesel
1364-0321/$ - see front matter & 2013 Elsevier Ltd. All rights reserved.
http://dx.doi.org/10.1016/j.rser.2013.06.032
185
12
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by the conventional esterification and transesterification. However, after lipid extraction from microalgae cells, large amounts of
microalgae residues, which may contain mainly soluble polysaccharides, proteins and some residual lipids, are disposed or
alternatively used as animal feed. However, diversified biofuels
production from microalgae is necessary to improve the overall
energy balance. One of the successful examples is the utilization of
microalgae biomass (after lipid extraction) for bioethanol production, since high concentrations of carbohydrates are still present in
the biomass. Other potential biofuels that can be derived from the
microalgae biomass residues are, such as bio-oils from pyrolysis or
hydrothermal process. This is a likely strategy to re-utilize the
waste to produce another source of energy which greatly amplifies
the sustainability of microalgae biofuels [1].
Hydrothermal liquefaction is one of the alternatives being
increasingly considered, especially at low temperatures and pressures near the water critical pressure [2–5]. Pyrolysis has been
widely studied as an alternative to obtain valuable products and
fuels from different feedstocks, mainly municipal, plastic and
lignocellulosic wastes. This technique could be applied to the
residue obtained after lipid extraction or directly to the algae.
Pyrolysis could also have a great potential for the characterization of the microalgae and it could be used as a rapid test to obtain
a tentative estimation of the biochemical composition. In this
sense, TG (thermogravimetric analysis), TG-IR(thermogravimetric
analysis-infrared spectroscopy) and Py-GC/MS (pyrolysis-gas chromatography/mass spectroscopy) are powerful analytical techniques [6–12]. On the other hand, the design of the equipments for
the thermochemical processing, models describing the kinetics
and the governing mechanisms are required [13]. Thermogravimetric analysis is broadly used to understand these pyrolytic
characteristics [14] and mainly to determine the kinetic parameters [15–18].
Extensive literature has been published on the experimental
and mechanistic aspects of lignocellulosic biomass [19–23]. Very
little information is available on pyrolysis kinetics of microalgae
[24–27], but the kinetic models used to describe the pyrolysis
behaviour are not always correctly applied [28].
The overall objectives of this review are: to present an updated
revision of the state of the art in the field of experimental and
theoretical (mathematical modeling and simulation) aspects associated with pyrolysis of microalgae and to bring out clearly the current
status of research in the field of their hydrothermal liquefaction.
Specifically, aspects related to the type of reactors and conditions employed, the products obtained and the analytical applications are considered. Various kinetic models reported in the
literature and in a previous study with experimental validations
are presented in this review to provide the current status of the
study and to show that the kinetic analysis is not always correctly
applied, because isoconversional methods are used in processes
that clearly occur in more than one stage.
which the biomass is thermally degraded at moderate temperatures (350–700 1C) in absence of oxygen. It produces solid, liquid
and gaseous products. These products are of interest, as they are
likely alternate sources of energy and/or chemicals. As a consequence, the study of pyrolysis has been gaining increasing
importance.
2.1. Operating conditions
Depending on the operating conditions, the pyrolysis process
can be divided into three subgroups: slow pyrolysis, fast pyrolysis
and flash pyrolysis (Table 1).
2.1.1. Slow pyrolysis
Slow pyrolysis is defined as the pyrolysis that occurs under a
heating rate range of 0.1 and 1 1C/s with samples particle size
ranging between 5 and 50 mm. These conditions permit the
production of solid, liquid and gaseous products in significant
proportions.
The work of Pan et al. [29] illustrates this type of process. In this
paper a fixed bed reactor designed as experimental apparatus is
used for slow pyrolysis of Nannochloropsis sp. The schematic
diagram of the reactor is shown in Fig. 1. Nitrogen as a carrier
gas was supplied to the reactor from the inlet located in the top of
the reactor and its flow rate was controlled by a flow meter. A
condenser (ice trap) connected at the exit of the reactor was used
to collect the liquid products. The direct pyrolysis of Nannochloropsis sp. residue was performed in the fixed bed reactor mentioned above. The material was heated by an electric furnace with
a heating rate of 10 1C/min from room temperature to the final
temperature, and then kept for 2 h at the final temperature. The
volatiles produced in the pyrolysis process were swept out by the
carrier gas with a flow rate of 30 ml/min.
thermocouple
nitrogen
oven
sample
holder
reactor
gas bag
2. Pyrolysis
condenser
Nowadays, pyrolysis of biomass is an alternative that has been
widely investigated. The pyrolysis typically refers to a process by
Fig. 1. The schematic diagram of the fixed bed reactor for slow pyrolysis of
Nannochloropsis sp. (Pan et al. [29]).
Table 1
Operating parameters and expected yields for pyrolysis processes (modified from Brennan and Owende, 2010).
Mode
Conditions
Liquid (%)
Char (%)
Gas (%)
Flash pyrolysis
Fast pyrolysis
Slow pyrolysis
Moderate temperature (500 1C), short residence time (about 1 s)
Moderate temperature (500 1C), moderate residence time (about 10–20 s)
Low temperature (400 1C), very long residence time (more than 30 min)
75
50
30
2
20
35
13
30
35
186
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nitrogen
sample
reactor tube
heated outlet
moving oven
condenser
GC vent
13
than that achieved by phototrophic cultivation and the results
suggest that pyrolysis has potential in algal biomass to liquids
conversion.
ice/water
mixture
Fig. 2. Experimental set-up for fast pyrolysis of algae samples (Babich et al. [31]).
2.1.2. Fast pyrolysis
If the aim is the production of mainly liquid and/or gaseous
products, a fast pyrolysis is recommended. The achievement of
heating rates between 1 and 200 1C/s requires high operating
temperatures, very short contact times and very fine particles
(o 1 mm).
Various reactors like entrained flow reactor, wire mesh reactor,
vacuum furnace reactor, vortex reactor, rotating reactor, fixed-bed
reactor, circulating fluidized bed reactor, etc. were designated for
performing fast pyrolysis [30].
Babich et al. [31] used a fixed-bed reactor for fast pyrolysis of
the microalgae Chlorella. A schematic diagram of the experimental
set-up is given in Fig. 2. An electrical oven was preheated to the
desired pyrolysis temperature (300, 350, 400 or 450 1C) and
moved over the reactor to start the pyrolysis of the samples. The
temperature in the reactor was measured with a thermocouple
placed inside the bed. The bed temperature reached the oven
temperature within 3 min, involving a heating rate in the range of
1.5–2.5 1C/s.
2.1.3. Flash pyrolysis
Flash pyrolysis gives mostly liquid products due to the high
heating rate ( 41000 1C/s). This requires special reactor configuration in which biomass residence times are only of few seconds.
Two appropriate designs are the entrained flow reactor and the
fluidized bed reactor. In addition, as flash pyrolysis requires a rapid
heating, the particle size should be fairly small (o 0.2 mm). It is
deemed to be a viable technique for future replacement of fossilfuels with biomass derived liquid fuels [32] mainly because of the
high biomass-to liquid conversion ratio (95.5%) that can be
achieved [33]. However, there are technical challenges to be solved
since pyrolysis oils are acidic, unstable, viscous, and contain solids
and chemically dissolved water [34]. Therefore, the process oil will
require upgrading hydrogenation, catalytic cracking to lower
oxygen content and removing alkalis [35].
2.2. Pyrolysis of microalgae
The use of microalgae as feedstock for pyrolysis has many
advantages over other renewable and conventional energy
sources, such as, saving arable lands and stabilizing effective
supply of food.
Compared to other conversion technologies, research on pyrolysis of algal biomass is quite extensive and has achieved reliable
and promising outcomes that could lead to commercial exploitation [36]. Pyrolysis of several algal species have been tested,
including Chlorella [33,37–40], salt-water Tetraselmis [37,41] and
Nannochloropsis residue [29]. As an example of the results obtained
(Table 2), Miao et al. [39] achieved bio-oil yields of 18% (High
heating value (HHV) of 30 MJ/kg) and 24% (HHV of 29 MJ/kg) with
fast pyrolysis of Chlorella prothothecoides and Microcystis aeruginosa grown phototrophically, respectively. Miao and Wu [39] used
fast pyrolysis to enhance oil yield from microalgae C. prothothecoides after manipulating its metabolic pathway towards heterotrophic growth. The recorded oil yield of 57.9% dry wt. basis from
heterotrophic cultivation (HHV of 41 MJ/kg) was 3.4 times higher
2.3. Microwave assisted pyrolysis
Microwave-assisted pyrolysis (MAP) is a relatively new technique that has been developed and investigated in recent decades.
This process offers several advantages over traditional processes,
including uniform internal heating of large biomass particles, ease
control, and no need for agitation or fluidization, and hence less
particles (ashes) in the bio-oil.
However, to date, there are few reports on the microwaveassisted pyrolysis of microalgae. Du et al. [42] conducted MAP of
Chlorella sp. under different microwave power levels. A schematic
diagram of the system is shown in Fig. 3. They concluded that the
microwave power of 750 W was the optimum value as the
maximum bio-oil yield of 28.6% was obtained, the algal bio-oil
exhibit a better quality than lignocellulosic bio-oils in terms of
physical and chemical properties since the algal bio-oil was
characterized by a low oxygen content with aliphatic and aromatic
hydrocarbons constituting 22.18% of the total ion chromatogram of
GC–MS. However, further upgrading to remove N and O from biooil is necessary to make it suitable as engine fuels. Hu et al. [43]
investigated the microwave-assisted pyrolysis of Chlorella vulgaris
under different microwave power levels, catalysts and contents of
activated carbon and solid residue. In this study, the microwave
power of 1500 W and 2250 W were found to be optimal for
obtaining the maximum bio-oil yield of 35.83% and the maximum
bio-fuel yield of 74.93%, respectively. The research indicated that
the maximum temperature rising rate and pyrolysis temperature
became higher as the microwave power increased. Furthermore, it
has been shown that the pyrolysis reaction can be enhanced by
mixing C. vulgaris with catalysts. Under this study, activated
carbon exhibited the best catalysis action followed by the solid
residue.
2.4. Hydropyrolysis
Hydropyrolysis refers to pyrolysis assisted by high hydrogen
pressure ( 410 MPa). Hydropyrolysis is a pyrolysis technique that,
compared to conventional pyrolysis procedures, gives rise to much
higher yields of hydrocarbons with much better structural preservation. Bennett et al. [44] reported a detailed investigation of
the nitrogen compounds released by hydropyrolysis of the macromolecular material of algae, bacteria, archaea and recent sediments (Priest Pot, UK; Lake Pollen, Norway). A schematic
representation of the hydropyrolysis apparatus is shown in
Fig. 4. Love et al. [45] evaluated (i) if the distributions of the
hydrocarbon products released by hydropyrolysis from cultured
cells were sufficiently distinct to act as molecular fingerprints for
different classes of microorganisms; (ii) if the detail of molecular
information in hydrocarbon products, in terms of retention of
biologically-inherited structural and stereochemical features, was
high or whether thermal cracking and isomerization were particularly problematic. They found that the hydropyrolysis can serve
as a useful screening tool for identifying whether a particular
biomarker structure has the potential to be used as a sourcespecific molecular marker or whether it has a wider taxonomic
distribution. Unequivocal assignment of the biological origin of
lipid compounds is of fundamental importance for improving our
overall understanding of biomarker records in the natural environment and geological record.
187
14
Table 2
Current research of typical thermochemical conversion technologies applied to microalgae.
Reference
Technology
Feedstock
Minowa et al. [55]
Hydrothermal
liquefaction
Shuping et al. [56]
Hydrothermal
liquefaction
Brown et al. [54]
Hydrothermal
liquefaction
Hydrothermal
liquefaction
100 ml stainless steel autoclave with a magnetic stirrer, 20 g
Maximum bio-oil yield (43.8%) (300 1C, 5 min, 0% Na2CO3) Heating value
(34.0 MJ/kg)
microalgae paste (78.4% water), Na2CO3 (0–5% of the dry
sample), nitrogen, initial pressure 3 MPa, 250–340 1C, 5–60 min Maximum heating value (37.8 MJ/kg) (340 1C, 5 min, 0% Na2CO3). Bio-oil yield
(42.6%)
Dunaliella tertiolecta
100 ml stainless steel autoclave with a magnetic stirrer, 7 g
Maximum bio-oil yield (25.8%) (360 1C, 50 min, 5% Na2CO3) Heating value
sample, 70 ml distilled water, 0–10% Na2CO3 (catalysts), 280–
(30.74 MJ/kg)
380 1C, 10–90 min.
Nannochloropsis sp.
35 ml stainless-steel reactor, 4.27 g microalgae paste (79%
Highest bio-oil yield (43%) (350 1C) Heating value (39 MJ/kg)
water), 200–500 1C, 60 min
Spirulina platensis
1.8 l reactor with impeller agitation (300 rpm), 500–750 ml
Biocrude obtained at 350–380 1C had fuel properties similar to that of
premixed algal slurry (10–50% solids), 200–380 1C, 0–120 min, petroleum crude and could be further refined to a liquid transportation fuel.
nitrogen, initial pressure 2 Mpa
Maximum bio-oil yield (39.9%) (350 1C, 60 min, 20% solids)
Spirulina, swine manure and digested
2 l reactor, 800 g slurry (80% water), nitrogen, initial pressure
Feedstock organic content and nutritional composition greatly affect
anaerobic sludge
0.65 Mpa, 300 1C, 30 min
hydrothermal liquefaction biocrude oil yields and chemistry, despite having
similar bulk elemental distributions.
Model biochemical components,
75 ml reactor, 3 g sample, 27 ml distilled water, 1 M Na2CO3 or Bio-oil formation follows the trend lipids 4proteins4carbohydrates.
1 M HCOOH, 350 1C, 1 h
Proteins and lipids were converted to oil most efficiently without catalysts
Chlorella vulgaris, Nannochloropsis
while carbohydrates were best processed using Na2CO3. Biochemical
oculata, Porphyridium cruentum and
components behave additively for some microalgae but not for others. Oil is
Spirulina
generated from each biochemical component.
Scenedesmus raw and defatted and
500 ml reactor, 250 g biomass slurry (80% moisture), 300 1C,
Hydrothermal liquefaction and slow pyrolysis produced bio-oils with similar
Spirulina
30 min
heating value (36 MJ/kg moisture-free). Pyrolysis bio-oils displayed a higher
100 g sample, 450 1C, 50 1C/min, 2 h, nitrogen, 100 ml/min
percentage of cyclic oxygenates and lower molecular weight and boiling
point distributions.
Chlorella protothecoides
5.5 ml stainless steel autoclave, 1 g sample, 200–600 1C, 5–
Maximum oil yield (52%) (500 1C, 5 min)
120 min
Tetraselmis chui, Chlorella like, Chlorella 100 mg sample, maximum temperature of 750 1C, 10 1C/min,
Maximum liquid percentage (43%) (T. chui, 500 1C)
vulgaris, Chaetocerous muelleri,
helium, 50 ml/min
Dunaliella tertiolecta, Synechococcus
Nannochloropsis sp. residue after lipid
1 g sample, HZSM-5/sample (0/1–1/1), 300–500 1C, 10 1C/min,
Maximum bio-oil yield (31.1%) (400 1C, 0/1). The yield gradually decreased as
extraction
2 h, nitrogen, 30 ml/min
the catalyst-to-sample ratio increased. Compared to bio-oil from direct
pyrolysis, bio-oil from catalytic pyrolysis had lower oxygen content and
higher heating value (32.2 MJ/kg).
T. chui
Fixed bed infrared pyrolysis oven, 2.4 g sample, maximum
The pyrolytic oil fraction exhibits a wide variety of fatty acids, alkanes,
temperature of 500 1C, 20 min, 10 1C/min, helium, 50 ml/min.
alkenes, amides, aldehydes, terpenes, pyrrolidines, phytol and phenols, with a
high heating value (HHV) of 28 MJ/kg. The biochar produced has a HHV of
14.5 MJ/kg and high cation exchange capacity and large concentration of N.
Bio-oil from fast pyrolysis of microalgae has a higher HHV (29 MJ/kg), which
C. protothecoides and Microcystis
Fluid bed reactor, 4 g/min, 200 g sample, 500 1C, 600 1C/s,
is about 1.4 times of that of wood. Furthermore, the lower oxygen contents of
aeruginosa
nitrogen, 0.4 m3/h, vapor residence time (2–3 s)
microalgae make them have better storage stability.
C. protothecoides
Fluid bed reactor, 4 g/min, 200 g sample, 400–600 1C, 600 1C/s, Maximum bio-oil yield (57.9%) (450 1C) produced from heterotrophic cells
3
was 3.4 times higher than from autotrophic cells by fast pyrolysis.
nitrogen, 0.4 m /h, vapor residence time (2–3 s)
Additionally, it has a much lower oxygen content, a higher heating value
(41 MJ/kg), a lower density (0.92 kg/l) and a lower viscosity (0.02 Pa s).
Chlorella sp.
30 g sample, 6 g solid char (catalyst), 500–1250 W (462–627 1C), Maximum bio-oil yield (28.6%) (750 W). Algal bio-oil (low oxygen content)
20 min, nitrogen, 500 ml/min
exhibited a better quality than lignocellulosic bio-oils.
Jena et al. [51]
Hydrothermal
liquefaction
Biller and Ross [53]
Hydrothermal
liquefaction
Vardon et al. [50]
Hydrothermal
liquefaction
Slow pyrolysis
Peng et al. [40]
Slow pyrolysis
Grierson et al. [37]
Slow pyrolysis
Pan et al. [29]
Slow pyrolysis
Grierson et al. [41]
Slow pyrolysis
Miao et al. [39]
Fast pyrolysis
Miao and Wu [38]
Fast pyrolysis
Du et al. [42]
Microwaveassisted
pyrolysis
Microwaveassisted
pyrolysis
Hu et al. [43]
188
Main conclusions
Dunaliella tertiolecta
Chlorella vulgaris
30 g sample, 750–2250 W, 5% catalysts (activated carbon, CaO, Maximum bio-oil yield (35.83%) (1500 W). Catalysts enhanced the production
SiC and solid residue), activated carbon and solid residue (5, 10, of gas. Activated carbon was the best among the tested.
20, 30%), nitrogen, 300 ml/min
A. Marcilla et al. / Renewable and Sustainable Energy Reviews 27 (2013) 11–19
Vardon et al. [52]
Conditions
A. Marcilla et al. / Renewable and Sustainable Energy Reviews 27 (2013) 11–19
nitrogen
6
5
1
2
4
3
Fig. 3. The schematic diagram of MAP system: (1) microwave cavity; (2) quartz
reactor; (3) holder; (4) bio-oil collector; (5) condensers; (6) gas sampling [42].
High pressure
hydrogen
Control
thermocouple
Reactor tube
(incology)
Electrical
connectors
Coal/substrate bed
15
Hydrothermal liquefaction can be considered as a pressurized
aqueous pyrolysis since hydrothermal liquefaction typically uses a
feedstock with a moisture content of approximately 80%. Although
it has the advantage of converting wet biomass into energy,
reactors for thermochemical liquefaction and fuel-feed systems
are complex and therefore expensive, and the heavy oil obtained
from the liquefaction process is a viscous tarry lump, which
sometimes caused troubles in handling [48].
The process utilizes temperatures between 200 and 360 1C and
pressures high enough to keep the water in the liquid phase [4].
Reaction times usually range between 5 and 60 min. Under these
conditions, the biomacromolecules in the microalgae break down
to form a bio-oil and gases, and as it occurs in the case of the
hydropyrolysis the bio-oil obtained has a lower oxygen content,
being therefore more compatible with petroleum products.
Several studies have investigated the characteristics of algal
biomass as a feedstock for hydrothermal liquefaction, including
Scenedesmus [49,50], Spirulina [49,51,52], Nannochloropsis [53];
Chlorella [49,53,54], Dunaliella [55,56] and Botryococcus braunii
[57]. A schematic layout of the hydrothermal liquefaction process
is shown in Fig. 5. As an example of the results obtained in these
studies (Table 2), Dote et al. [57] successfully used thermochemical
liquefaction at 300 1C on B. braunii to achieve a maximum yield of
64% dry wt. basis of oil with HHV of 45.9 MJ/kg and also declared a
positive energy balance for the process (output/input ratio of
6.67:1). In a similar study, an oil yield of 42% dry wt. was obtained
from Dunaliella tertiolecta giving a HHV of 34.9 MJ/kg and positive
energy balance of 2.94:1 [55]. Moreover, Jena et al. [51] compared
the pyrolysis of Spirulina platensis with its hydrothermal liquefaction and they concluded that from the point of view of process
heater
Wire wool plug
gas vent
Gas collection and
measuring
Massflow
controller
HT reaction
vessel
Cold trap
Pressure
trasducer
products
Fig. 4. Schematic representation of the hydropyrolysis apparatus [78].
DCM Extraction
3. Hydrothermal liquefaction
All these different forms of pyrolysis use dry microalgae feedstock, and therefore require a previous drying step, that has an
impact on the economic and energetic yield of the global process.
In contrast, one of the advantages of the hydrothermal liquefaction, also known as thermochemical liquefaction, supercritical
water gasification or hydrous pyrolysis, is that it does not require
such step. Sawayama et al. [46] described the method of calculating the energy required for liquefaction and concludes that energy
requirements for algae liquefaction is 6.69 MJ/kg of oil produced
under the assumptions of organic content 50%, oil yield 64%,
heating value 45.9 MJ/kg, specific heat of water 4.18 kJ/kg K and
heating value of solids 1.25 kJ/kg K. Jena et al. [47] stated that if
pyrolysis were used as a conversion method, all the water should
be evaporated, thus consuming the latent heat of vaporization of
water 2260 kJ/kg. This means (according to Sawayama et al. [46]),
that the consumption of 28.25 MJ/kg of oil for evaporating the
water from a sample containing 80% water.
water phase
DCM phase
bio-crude
analysis
solid residue
dilution with
distilled water
spent water
analysis
centrifuge
dry microalgae
growth trials
Fig. 5. Schematic layout of the hydrothermal liquefaction (HTL) process. (DCM¼ dichloromethane) [49].
189
16
A. Marcilla et al. / Renewable and Sustainable Energy Reviews 27 (2013) 11–19
yield, fuel quality, and energy consumption ratios, the hydrothermal liquefaction process is better for thermochemical conversion
of algal biomass to liquid bio-oil than pyrolysis. These results
indicate that thermochemical liquefaction is a viable option for the
conversion of algal biomass-to-liquid fuel.
Another interesting point of hydrothermal liquefaction, which
is being studied lastly [47,49], is that the water phase is high in all
required nutrients for algae growth, so it can be used, after heavy
dilution to avoid the effect of growth inhibitors such as phenols,
fatty acids and nickel. Biller et al. [50] observed that C. vulgaris,
Scenedesmus dimorphus and the cyanobacteria S. platensis and
Chlorogloeopsis fritschii were able to grow in the recycled water
but different optimum dilutions were observed. Additionally, all
strains were able to use acetate, obtained in the process, as a
substrate for mixotrophic growth and ammonium as a source of
nitrogen.
4. Analytical applications
Pyrolysis could also have a great potential for the characterization of the microalgae and it could be used as a rapid test to obtain
an idea of their biochemical composition.
4.1. Thermogravimetric analysis (TGA)
On the one hand, thermogravimetric analysis (TGA) is one of
the techniques more widely used to study pyrolysis reactions that
involve a solid. It allows the measurement of a wide variety of
properties, such as thermal stability, moisture and volatile matter
content, and, sometimes, the composition of multicomponent
systems. Although, the most important signals that are obtained
from TGA while the sample is being analyzed are the weight, the
weight loss rate (i.e. differential thermogravimetry) and the
temperature. A differential thermogravimetry curve (DTG) is
obtained as the first derivative of the mass respect to the
temperature or the time. This curve can be used to obtain
qualitative and quantitative information of the sample composition. A qualitative analysis of the curve allows obtaining the
“fingerprint” of the material and the distinction between two or
more overlapped reactions and a quantitative analysis and the
temperature at which the maximum mass loss occurs.
TGA has been frequently employed in literature to study the
thermal decomposition of different microalgae. The pyrolysis of
microalgae is usually divided in three stages. The first stage occurs
between room temperature and 200 1C. During this stage, some
internal rearrangement, such as water elimination, bond breakage,
appearance of free radicals and formation of carbonyl and carboxyl
groups takes place. The second stage of the solid decomposition
takes places until approximately 500 1C depending on the microalgae and corresponds to the main pyrolysis process. It proceeds
with a high rate and leads the formation of the pyrolysis products.
During the third stage, the char decomposes at a very slow rate
and carbon-rich residual solid forms [58]. More specifically, Pane
et al. [59] studied the effects of temperature on the marine
planktonic alga Tetraselmis Suecica by TGA in air atmosphere,
reporting the existence of marked differences related to the
presence of different molecules being produced during the algal
growth and to the differences in the thermal properties of such
molecules. According to these authors, the first of the three weight
loss stages reported occurs in the range of 40–180 1C and corresponds to the loss of free water and the water loosely bound to
biomolecules. In this process, the cell structure is progressively
destroyed, and the alteration of lipid structures and protein
thermal unfolding may occur. The second step, occurring in the
180–400 1C range, involves the decomposition of proteins and
190
carbohydrates. This step produces the main weight loss. Finally,
the third step occurs in the 400–760 1C range and corresponds to
the complete oxidation of the organic matter. Similarly, Peng et al.
[25] pyrolyzed the microalgae S. platensis and Chlorella protothecoides at the heating rates of 15, 40, 60 and 80 1C/min up to 800 1C
to investigate their pyrolytic characteristics. Three stages (dehydration, devolatilization and solid decomposition) appeared in the
pyrolysis process. S. platensis devolatilized mainly at 190–560 1C
and C. protothecoides at 150–540 1C. Likewise, Marcilla et al. [60]
described three main stages in the decomposition process of the
microalgae Nannochloropsis sp., i.e. the 25–180 1C range corresponds to dehydration, the 180–540 1C range to devolatilization
and the 540–800 1C, slow solid residue decomposition from the
previous step. The main step of the decomposition, the devolatilization, was actually described as a very complex process involving at least three overlapped steps, at 290, 340 and 460 1C. On the
other hand, the analysis by IR spectroscopy of the gases evolved in
the pyrolysis of the microalgae Nannochloropsis sp., showed that
the peak related to the C–H absorption band, presents its maximum at 462 1C, which corresponds to the third process of the
second stage, and it is more important in the microalgae than in
the solid residue obtained after the lipid extraction with hexane.
According to TG-FTIR experiments with some standard components [glucose (saccharide), tripalmitine (lipid) and glutamine
(aminoacid)], the authors suggested that the biochemical components of the microalgae seem to be decomposed in the following
order: polysaccharides, proteins and finally, lipids. Analogous
results were obtained in pyrolytic studies under inert atmosphere
at different heating rates for the microalgae D. tertiolecta [27] and
C. vulgaris [60]. Three stages (dehydration, devolatilization and
solid decomposition) appeared in the pyrolysis process and C.
vulgaris devolatilized mainly at 250–370 1C [61], while D. tertiolecta at 170–370 1C [27].
4.2. Pyroprobe reactor connected to a gas chromatograph with mass
spectrometer detector (Py-GC/MS)
Analytical pyrolysis has been extensively used in the bibliography to obtain information about the composition of different
organic materials. For example, Fabbri et al. [9] used Py-GC/MS as a
rapid analytical technique for sourcing continental organic matter
in marine sediments, Nguyen et al. [12] studied the biochemical
changes produced in B. braunii during the decomposition under
oxic conditions, Çoban-Yildiz et al. [7] studied the chemical
composition of black sea suspended particulate organic matter,
Cejka et al. [6] used Py-GC/MS to analyze fossil organic matter
from sediments, which consist of different types of algae, Derrene
et al. [8] used flash pyrolysis with GC/MS to characterize intractable organic molecules in algae. Kruge et al. [11] used Py-GC/MS to
study the aquatic organic matter in open water sediment samples
and nitrogen compounds including pyrroles, pyridines and indoles
were identified in the pyrolyzate. These compounds are characteristic pyrolysis products of proteins and degraded proteinaceous
matter (in this case largely from marine algae and bacteria). Ishida
et al. [10] applied reactive Py-GC to determine the lipid content
and the fatty acid composition of every zooplankter individual at
different algae concentration.
In relation to microalgae, Thangalazhy-Gopakumar et al. [62]
used analytical pyrolysis of C. vulgaris in a Py/GC–MS to identify
major compounds present in bio-oil with and without catalyst (H
+ZSM-5). The flow diagram of reactant gas and GC carrier gas
during pyrolysis (adopted from the CDS pyroprobe 5200 manual)
is shown in Fig. 6.
On the other hand, Valdés et al. [63] found a clear correlation
between thermogravimetric analysis and Py-GC/MS analysis and
the biochemical composition of the samples in studies with the
A. Marcilla et al. / Renewable and Sustainable Energy Reviews 27 (2013) 11–19
heated oven chamber
GC carrier in
to GC
reactant gas in
sample vent
oven
sample
trap
probe
Fig. 6. Flow diagram of reactant gas and GC carrier gas during pyrolysis (adopted
from the CDS pyroprobe 5200 manual).
microalgae Nannochloropsis oculata. In this sense both techniques,
but especially the Py-GC/MS analysis has been revealed as a
powerful tool for comparative purposes providing a qualitative
approximation of the biochemical composition in a rapid single
analysis requiring a small amount of sample.
5. Kinetic modeling of pyrolysis of microalgae
In general, providing models describing the kinetics and the
governing mechanisms is very important in order to deal with the
design of equipments in a thermochemical process [13]. Thermogravimetric analysis (TGA) is broadly used to determine the kinetic
parameters of thermal decomposition of different materials, for
example, wood [18], wheat straw, corn stalk, cotton stalk, and
sorghum stalk [15], pine bark [16], grass: triple A, wheat straw,
corn straw [17], cellulose, hemi-cellulose (xylan) and pectin [64–
66].
However, very little information is available on kinetics of
pyrolysis of microalgae [25–27], and there is not a generally
accepted model that could predict the pyrolysis rate and provide
a priori information about the final conversion over a wide range
of culture conditions for microalgae [28].
As the decomposition reactions of microalgae usually occur
following complex mechanisms, which involve diverse reactions
with a different degree of overlapping, which could make difficult
to elucidate whether a single or a complex process is occurring. In
this case, since a complex process is occurring, it should be
remarked that kinetic parameters are actually “pseudokinetic
parameters”.
On the other hand, if there was a clear evidence of the
existence of different processes, it might be possible to consider
different steps, each one with its corresponding kinetic triplet (f
(α), ko, Ea).
However, when experimental results are analysed, it may be
difficult to assert the number of processes involved. In this sense, it
must be taken into consideration that the kinetic constants ko and
Ea should really be what their names state, i.e. constants. If
contrarily, they show a dependence on conversion, it must be
interpreted as evidence that a more complex mechanism is
governing the process [67,68].
Despite looking really obvious, in the bibliography there is a
relatively common practice consisting in concluding the kinetic
analysis with figures that reveal the dependence of the activation
energy on conversion degree, fact that reveals the necessity of a
17
subsequent step in the kinetic analysis procedure to improve the
proposed model, instead of constituting the final point and
conclusion of the analysis.
This contradiction between what is expected (kinetic constants
that should be constant) and what is possible to find in the
bibliography (the dependence between kinetic constants and
conversion degree), is still present in the current literature dealing
with kinetic analysis.
It must be indicated that, some of the methods of kinetic
analysis used date back to the beginning of the sixties, and despite
the great evolution of the computers, the use of some of these
procedures, that are based on rough approximations, is relatively
common. Though these approximations were justifiable and useful
when computational methods were not so powerful, they are now
a clear nonsense.
In our opinion, and in view of the existing literature about
pyrolysis of microalgae, the kinetic analysis usually exhibits some
weak points that pose certain doubts on its validity. They can be
summarized as:
1. The complexity of the reaction pattern is not in concordance
with the complexity of the kinetic model considered.
Isoconversional methods [69–72], useful for single step reactions, are widely applied for the kinetic analysis of microalgae
(and other feedstock) thermal decomposition. However, for
microalgae thermal decomposition this supposition is normally
not valid. As a consequence, the activation energy obtained
shows a clear dependence with the conversion degree, indicating that the process should be described in terms of multiplestep kinetics, and hence by the corresponding multiple kinetic
triplets.
Therefore, these methods would be correctly applied if the
deconvolution of the specific stages was done (based e.g. on
DTG curve) and the activation energy was calculated for each
separate stage. Alternatively, the integration of the differential
equations corresponding to kinetic models involving multiple
steps to obtain the weight of the sample (or its derivative), and
the minimization of the sum of the squares of the differences
between the experimental and calculated weights (or weight
derivatives) could also be an acceptable choice [73–76].
2. The kinetic parameters are not validated, i.e. by checking if they
fit properly, or can reconstruct, the experimental kinetic curves.
In a vast part of the bibliography, a kinetic analysis procedure
that assumes an overall process is usually employed, while it is
obvious that the decomposition pattern is complex and several
processes seem to be overlapped. Nevertheless, the kinetic
parameters could have a certain sense from the point of view
of a pseudo kinetic analysis and they would be acceptable if
they could be useful and capable of correlating the samples
behaviour, at least roughly.
Thus, the recalculation of the weight loss (or conversion) curves
by the suggested model, and using the kinetic parameters
obtained in order to check the degree of coincidence with the
raw experimental data (or alternatively the conversion profiles
deduced from such experimental data) is much convenient or even
necessary. Furthermore, it would permit the validity of all the
assumptions involved to be checked. This aspect has already been
stated in literature [76], and although it is of great importance as it
is a proof of the validity of all the assumptions considered, it is
rarely used or reported in bibliography dealing with kinetic
analysis. The Chen et al. [77] work is one of the examples that
illustrate this fact, and has been the aim of a letter to the editor
[28].
Finally, it is also worth mentioning that the analysis and
comparison of one single kinetic parameter (as in this case, the
191
18
A. Marcilla et al. / Renewable and Sustainable Energy Reviews 27 (2013) 11–19
activation energy) cannot be adequate, since the reaction pattern
depends on the whole kinetic triplet, and it has been already
demonstrated that for different activation energy values, the rest
of the kinetic triplet may adopt different values to reproduce
similar degradation patterns [68,75].
6. Conclusions
Hydrothermal liquefaction seems to be the most favorable and
promising from the energetic point of view. Nevertheless, the
residues should be recycled to improve the overall economic
viability of the process. Moreover, the fuel obtained should be
upgraded.
The design of pyrolysis reactors requires the employment of
modelling and simulation tools, which should require an adequate
kinetic analysis process. In view of the complexity of the microalgae pyrolysis pattern, the most suitable procedures would
involve multi steps kinetic analysis procedures, which could
permit a final verification of the model by a single comparison
between experimental and calculated results.
Acknowledgements
The Authors wish to thank Repsol YPF for the financial support
that provided (Project reference: Ingenio 2010-CDTI-Sost CO2CEN-2008–1027) and the Generalitat Valenciana by the fellowship
of one of the authors (Program VALI+D).
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193
CONCLUSIONES
6
Conclusiones
Las principales conclusiones obtenidas en las diferentes publicaciones que
constituyen esta Tesis Doctoral se muestran a continuación.
6.1. Publicación I: Kinetic model for microalgae cell concentration and size distribution:
Application to Nannochloropsis gaditana. L. Catalá and A. Marcilla. En revisión, Journal
of Biochemical Engineering.
1. Las distribuciones de tamaño de partícula de la microalga Nannochloropsis
gaditana tienen una asimetría positiva y la forma de la curva no varía durante el
proceso de crecimiento.
2. Las distribuciones de tamaño de partículas se desplazan a tamaños menores
durante el periodo de oscuridad mientras que en el periodo de luz se produce el
comportamiento opuesto.
3. Durante el proceso de crecimiento, las distribuciones de tamaño de
partículas se desplazan hacia tamaños mayores, debido probablemente a la falta de
nitrógeno en el medio, y las diferencias entre las distribuciones al principio y al final de
cada periodo son menores.
4. El modelo cinético propuesto consigue una mejora significativa de los
resultados obtenidos al considerar el modelo logístico teniendo en cuenta sólo el
tiempo de oscuridad para la división celular.
5. La división celular no es capaz de describir la evolución de la distribución del
tamaño de partículas con el tiempo.
6. El ajuste de la evolución con el tiempo de las curvas de distribución de
tamaño de partículas se ha conseguido cuando se ha propuesto un modelo cinético en
el que se incluyen procesos de respiración y crecimiento celular durante los periodos
de oscuridad y luz, respectivamente.
197
Conclusiones
6.2. Publicación II: Study of the evolution of the biochemical composition of outdoor
cultures of the microalgae Nannochloropsis oculata as a function of the initial nitrate
concentration. A. Marcilla, M.R. Hernández, F.J. Valdés, L. Catalá, J.C. GarcíaQuesada, A. Sánchez-García, J.J. Salas, E. Martinez-Force and R. Garcés. En
revisión, Aquaculture.
1. Las concentraciones iniciales de nitratos más bajas han provocado los
crecimientos del cultivo de la microalga Nannochloropsis oculata más pequeños en
ambos reactores.
2. En la última etapa de crecimiento de ambos reactores (estacionaria), al
aumentar la concentración inicial de nitratos en el medio, las proteínas aumentan
mientras que los carbohidratos y los lípidos transesterificados disminuyen.
3. En la última etapa de crecimiento de ambos reactores (estacionaria), al
aumentar la concentración inicial de nitratos en el medio, aumenta la concentración de
los compuestos con 20 átomos de carbono y aumenta el grado de insaturaciones,
siendo el éster metílico del ácido eicosapentanoico uno de los componentes
mayoritarios en estas condiciones.
198
Conclusiones
6.3. Publicación III: Estimation of CO2 stripping/CO2 microalgae consumptions ratios in
a bubble column photobioreactor using the analysis of the pH profiles. Application to
Nannochloropsis oculata microalgae culture. F.J. Valdés, M.R. Hernández, L. Catalá
and A. Marcilla. Bioresource Technology 119 (2012) 1-6.
1. El análisis de los perfiles de pH ha permitido obtener información sobre el
comportamiento del sistema microalga/fotobiorreactor en relación a la proporción CO2
consumido/CO2 inyectado.
2. La evolución de la proporción CO2 consumido/CO2 inyectado es función de la
radiación fotosintéticamente activa y de la concentración de microalgas.
3. Para el sistema Nannochloropsis oculata/fotobiorreactor de tipo columna de
burbujas se obtiene un valor máximo de la proporción CO2 consumido/CO2 inyectado
próximo al 55 % a mediodía cuando la concentración de microalgas es de 0.14 g/L.
4. La información proporcionada por esta metodología puede ser utilizada para
la correcta selección de los parámetros del sistema microalga/fotobiorreactor con el
objetivo de maximizar la proporción CO2 consumido/CO2 inyectado.
199
Conclusiones
6.4. Publicación IV: Thermogravimetry and Py-GC/MS techniques as fast qualitative
methods for comparing the biochemical composition of Nannochloropsis oculata
samples obtained under different culture conditions. Bioresource Technology 131
(2013) 86-93.
1. El análisis termogravimétrico y el Py-GC/MS han mostrado una clara
correlación con la composición bioquímica de las muestras (proteínas, carbohidratos y
lípidos transesterificables).
2. Ambas técnicas, pero en especial Py-GC/MS, han demostrado ser una
poderosa herramienta con fines comparativos.
3. Estas técnicas proporcionan una idea cualitativa de la composición
bioquímica mediante un análisis rápido y sencillo que requiere una cantidad de
muestra muy pequeña.
200
Conclusiones
6.5. Publicación V: Comments on “Thermogravimetric analysis of microalgae
combustion under different oxygen supply concentrations” (Appl. Energy 88 (2011)
3189-3196). J.C. García-Quesada, L. Catalá, A. Marcilla. Applied Energy 93 (2012)
212-214.
1. En el trabajo analizado, aunque hay una clara evidencia de que la
combustión de las microalgas es un proceso complejo, los autores han usado
procedimientos de cálculo adecuados para procesos que tienen lugar en una sola
etapa (métodos isoconversionales).
2. Los métodos isoconversionales podrían haberse aplicado correctamente si
se hubiera hecho la deconvolución de las distintas etapas y se hubiese calculado la
energía de activación para cada una de ellas.
3. Cuando se aplican métodos isoconversionales, la comprobación de si existe
una dependencia de la energía de activación con la conversión permite asegurarse de
que el mecanismo supuesto es adecuado para realizar predicciones cinéticas fiables.
4. Los cálculos deben realizarse considerando un rango de grados de
conversión amplio con valores comprendidos entre 0.05 y 0.95 con intervalos no
mayores de 0.05.
5. La comprobación de que con los parámetros cinéticos obtenidos se pueden
reproducir los datos experimentales obtenidos es necesaria.
6. El análisis y la comparación de un único parámetro cinético no es adecuado
ya que la velocidad de descomposición depende del triplete cinético (energía de
activación, factor preexponencial y el orden de reacción).
201
Conclusiones
6.6. Publicación VI: Review of thermochemical conversion of microalgae. A.
Marcilla, L. Catalá, J.C. García-Quesada, F.J. Valdés and M.R. Hernández. Renewable
and Sustainable Energy Reviews 27C (2013) 11-19.
1. Comparada con el resto de técnicas de conversión termoquímica
(gasificación, combustión, pirólisis), la licuefacción hidrotérmica parece ser la técnica
más favorable y prometedora desde el punto de vista energético para obtener
combustibles líquidos a partir de sólido.
2. Los residuos obtenidos de la licuefacción hidrotérmica deben ser reciclados,
por ejemplo, para aprovechar los nutrientes que quedan en el agua, y de esta forma,
mejorar la viabilidad del proceso desde el punto de vista económico.
3. El diseño de reactores de pirólisis requiere el empleo de herramientas de
modelado y simulación que necesitan de un proceso de análisis cinético adecuado.
Los procesos más adecuados para ello, teniendo en cuenta la complejidad de las
reacciones de descomposición de las microalgas, implicarían el análisis cinético en
múltiples etapas, permitiendo de este modo, la verificación del modelo mediante una
simple comparación de los resultados experimentales con los calculados a partir de los
parámetros cinéticos obtenidos.
202
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Bibliografía
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 2.1. Características de algunas de las especies de algas unicelulares utilizadas
en acuicultura (Coll Morales, 1983). ........................................................................... 14
Tabla 2.2. Selección de especies de microalgas y su método de cultivo (Harun y col.,
2010). ......................................................................................................................... 17
Tabla 2.3. Comparación de los métodos de cultivo de microalgas (Harun y col.,
2010)… ....................................................................................................................... 19
Tabla 2.4. Mecanismos de procesos en estado sólido más frecuentes (Shuping y col.,
2010). ........................................................................................................................ 38
Tabla 4.1. Preparación de disolución madre de los patrones (disolvente: hexano). ... 74
Tabla 4.2. Preparación de los patrones. ..................................................................... 74
219
Bibliografía
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 2.1. Configuraciones de reactores cerrados para el cultivo de microalgas.
Reactor tubular en espiral (Arriba). Reactor tubular horizontal (Abajo). ..................... 20
Figura 2.2. Configuración de reactor abierto para el cultivo de microalgas. Estanques
tipo carrusel. .............................................................................................................. 21
Figura 2.3. Cinco fases de crecimiento de los cultivos de microalgas. ....................... 23
Figura 2.4. Secuencia de cultivo en sistema estático. Cuando se ha alcanzado una
densidad óptima de células, se utiliza parte del cultivo como inóculo de la siguiente
fase. ........................................................................................................................... 24
Figura 2.5. Esquema de un cultivo semicontinuo. ...................................................... 25
Figura 2.6. Cultivo masivo a la intemperie de algas unicelulares. Estanques de tipo
Raceway en Cyanotech (Hawaii) (izquierda). Reactores tubulares de la empresa
Salata GmbH (Ritschenhausen, Germany) (derecha). ............................................... 26
Figura 2.7. Esquema del invernadero de Wachapreague (USA). Cultivo masivo con
temperatura controlada en invernadero con ventilador. ............................................. 27
Figura 2.8. Termogramas diferencial (curva superior, eje derecho) y convencional
(curva inferior, eje izquierdo) (Skoog y col., 2002). .................................................... 34
Figura 2.9. Diagrama de flujo del equipo CDS Pyroprobe 5200 (adaptada del manual)36
Figura 4.1. a) Nannochloropsis gaditana (Photograph from Provasoli-Guillard National
Center for Marine Algae and Microbiota posted). b) Nannochloropsis oculata (Modified
from image by SBAE Industries NV posted online). ................................................... 56
Figura 4.2. Muestra de la contaminación. a) Euplotes. b) Ameba. ............................. 56
Figura 4.3. Esquema del proceso de escalado. ......................................................... 58
Figura 4.4. Espectros de emisión de los tubos TDL 965. Las zonas sombreadas se
corresponden con las zonas en las que la clorofila tiene picos de absorción. ............ 59
Figura 4.5. Detalle del distribuidor microporoso de CO2 .............................................. 60
221
Bibliografía
Figura 4.6. Esquema del reactor abierto utilizado en el exterior: 1. Filtro de carbón
activo; 2. Electroválvula; 3. Controlador de pH; 4. Rotámetro; 5. Filtro HEPA; 6. Sonda
de pH; 7. Bomba; 8. Sistema de burbujeo de aire y CO2. ........................................... 61
Figura 4.7. Fotografía de los fotobiorreactores de tipo columna de burbujas situados en
el exterior. .................................................................................................................. 61
Figura 4.8. Distribuidor microporoso de gas ................................................................ 62
Figura 4.9. Fotografía de los fotobiorreactores de tipo airlift situados en el exterior. ... 63
Figura 4.10. Diseño de un fotobiorreator de tipo airlift de bucle externo (Singh y
Sharma, 2012) ............................................................................................................ 64
Figura 4.11. Correlación entre el peso seco y la absorbancia para la especie
Nannochloropsis. ....................................................................................................... 65
Figura 4.12. Esquema del procedimiento de conteo con la cámara Neubauer. ........... 66
Figura 4.13. Principio de los aparatos de orificio de tipo contador "Coulter" ................ 67
Figura 4.14. Correlación entre absorbancia y concentración de fósforo en el medio....70
Figura 4.15. Componentes principales del pirolizador Pyroprobe 2000. ..................... 76
222