ATP (Adenosín trifosfato) Sintetasa

ATP SINTETAS: ESTRUCTURA − F (X) PARENTESCOS.
INTRODUCCIÓN
La ATP sintetasa mitocondrial posee dos componentes principales:
*F1 pp localizada en la matriz mitocondrial, en bacterias en el citosol, y contiene cinco
subunidades {3a ,3b ,d ,g ,e }
*Fo, es un canal de protones que presenta tres subunidades en bacterias y muchas mas en cariotas.
En hígado de ratón el Fo presenta un min. 8 polipéptidos distintos. F1 ha sido estudiado profundamente con
relación a sus cadenas de nucleótidos y a sus propiedades cinéticas.
Aunque hay un convenio que dice que existe un mínimo de seis lugares de cadena de nucleótidos en F1, uno
en cada una de las subunidades de a y b.
Cuando son usados sustratos mas naturales o análogos solo los sitios mas ligados son detectados y la
estequiometría cae a menos de 6 moles de nucleótidos por mol de F1.
Este s entonces un pequeño convenio sobre cómo las subunidades de F1 trabajan mecánicamente durante la
sintetización de ATP . algunos investigadores creen que es necesario entender la dinámica de las pequeñas
subunidades para entender el mecanismo enzimático.
¿Realizan el movimiento de un par de ab a otro específico en torno al papel del ATP sintético?, o bien lo
hacen las pequeñas subunidades limitando sus papeles a unir F1 a Fo y tal vez a regular el flujo de protones a
F1.
En este artículo podemos comprobar que las investigaciones no tienen resuelto este dilema.
MATERIAL Y MÉTODOS:
Incluye:
• Reactivos usados o uso de reactivos.
• Contrastar funciones.
• Preparaciones y cristales de F1.
• Técnicas de biología molecular.
• Péptido−sintetasa.
• Cristalografía de rayos−X.
Todos los estudios están referidos a la mitad de F1 del hígado de rata de ATP−sintetasa.
RESULTADOS Y CONCLUSIONES:
• Estudios biofísicos:
Modelo de la fig.1 en la estructura cuaternaria de F1 del hígado de rata de la molécula de ATP− sintetasa
obtenida con rayos−X. Basado en 3.6 A de reducción. En el modelo, las subunidades b se ven desde arriba y a
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desde el botón cerrando al canal de protones (H*). Estos datos bioquímicos indican que a yace cerca de la
molécula. Existen cinco estructuras distintas que nos son de interés.
• Un sitio de tres subunidades bs sobre unos sitios de subunidades as (alternada).
• Las subunidades b no interactúan físicamente.
• En cambio, a interactúa, pero sólo cerca de las tres envolturas del eje.
• En áreas significativas de sus estructuras, interactúan a y b.
• Hay espacios vacíos entre ellos (cavidades).
Una sexta diferencia del modelo que puede tener implicaciones funcionales en la localización del fuerte
espacio atómico para el agente mersalyl.
Los tres espacios atómicos se sitúan cerca de la interfase de ab. La subunidad b de la enzima del hígado de
rata no tiene residuo de cisteína, mientras que la subunidad a tiene dos, las cuales están localizadas entre los
temas del consenso del Walker A y B, aunque deben estar incluidos en cadenas de nucleótidos.
Estos resultados sugieren que las cadenas de nucleótidos de subunidades a se sitúan cerca de la interfase con
subunidades b.
Actualmente, los trabajos están enfocados en definir la localización de los dominio de las cadenas de
nucleótidos, en difundir fuertes átomos de nucleótidos análogos entre simples cristales y en determinar si las
coordenadas de cristalografía de un o más de uno está ligando polipéptidos de ATP se ajusta dentro de ellos,
en la mitad de F1.
ESTUDIOS QUÍMICOS Y DE BIOLOGÍA MOLECULAR:
Los dos tipos de estudios están enfocados inicialmente en determinar si el tema del consenso Walker A en la
subunidad b incluiría la cadena de nucleótidos, y si es así, la naturaleza de esa interacción.
Químicos: 50 péptidos de aminoácidos (Asp−Thr) estaban sintetizados, extendiendo esta referencia en la
subunidad b. Conteniendo el tema del consenso de Walker A GX4 8GKT y el predictor entero del lazo
flexible del correspondiente a la fusión con la Adenilata Kinasa. Este péptido se llama pp−50 (Fig. 2 a),
perificado homogéneamente para estructuras secundarias y para interactuar con Adenosil−trifosfato.
Estos datos explican que en 10mM tris−HCl (tampón a pH=7.4), el pp−50 interactuaba con ATP y
precipitaba. Significativamente, GTP e ITP (sacados de F1) también inducen este precipitado, dando
pirofosfato.
AMP (deja de estar unido a F1) no produce precipitación. Esto sugiere que la mayor interacción entre pp−50 y
los ligandos que precipitaban inducían pirofosfato.
Usando el análogo del nucleótido trinitrofenil, la interacción entre pp−50 y el análogo puede seguirse
fluorométricamente en soluciones sin precipitado pp−50.con lo cual TNP− ATP y TNP−ADP interactuan
fuertemente con el pp−50 .mientras que TNP−AMP tiene poca capacidad de interacción.
Dando lugar a la misma conclusión de antes. En estudios biomoleculares se confirmo que en E.C. que la que
unía TNP−ATP y TNP−ADP era un fragmento mas largo de subunidad b. Al suprimir una sección de b ( Gly
− Lys ) que contienen el consenso A y la espiral flexible de Gly (fig 2 a) la pp resultante despliega una
marcada reducción de afinidad por el TNP−ATP.(Kd de 5 a 60 mM)
Uniendo los resultados vemos que se recalca que la región de la subunidad b que contiene el Walker A y la
espiral flexible de glicina esta probablemente relacionada directamente en unir tanto ATP como ADP y que
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dicha reacción de unión implica un enlace de pirofosfato.
Región de b: receptor de pirofosfato .también muestran que no es la única región implicada en esta unión y su
supresión no previene completamente la unión de nucleotidos mas bien disminuyendo la afinidad.
ESTUDIOS BIOQUIMICOS:
Los estudios de la unión de nucleotidos se han llevado a cabo en un F1 con mucho detalle. se han establecido
3 criterios estrictos:
• Todos los preparados de F1 usados fueron expuestos previamente a un restablecimiento de la síntesis de
ATP hacia F1 mermando sus vesículas de la membrana interior viendo que la enzima es competente
restaurando la función fisiológica normal.
• Las muestras de F1 han sido expuestas a procedimientos inmunológicos para liberarse de la pp inhibidora
de la ATPasa , la cual es conocida por aumentar las cadenas de nucleotidos al F1.
• Evitar el uso de muchos análogos de nucleotidos hidrofóbicos o fotoafines. Solo usan ADP, el sustrato
natural de la síntesis del ATP , y AMP− PNP( análogo del DTP no hidrolizable )
Encuentran que 1 mol de F1 del hígado de rata intactos une irreversiblemente 4 moles de nucleotidos. Hay un
solo lugar donde se detecte ADP (Kd 1 mM ) , un solo sitio AMP−PNP con una similar Kd y dos AMP−PNP
con nivel mas bajo de Kd (20−30 mM). Significativamente AMP−PNP no tiene efecto en la unión sobre ADP
y viceversa, indicando que están separados y distinguidos de la superficie del F1.
La enzima también contiene un sitio que une MG +2 no cambiable, demuestra que F1 distribuye nucleotidos y
MG +2 asimétrico, una interpretación mas simple es (fig. 3) que el par asimétrico ab (en contacto con
pequeñas subunidades) une ADP,AMPPNP y MG +2 mas fuertemente( que cualquier otro par ab el cual solo
un AMP PNP )
Aunque el nucleotido que une mas fuertemente sitios en F1 es llamado nocatalitico esto significa que los
nucleotidos de estos sitios no combinan durante la hidrólisis del ATP. Aun así el interés real de la reacción
fisiológica es la síntesis del ATP y se da por sentado que el papel del gradiente de H+ es el de separar
nucleotidos fuertemente unidos. Parece que estas separaciones tuviesen lugar desde el asimétrico ab, con las
subunidades entonces especificadas los dos pares de ab restantes en secuencia para una fuerte unión de
nucleotidos seguido de una liberación de energía inducida.
Hoy en día los experimentos están enfocados en determinar la exacta localización de la subunidad de los
cuatro nucleotidos reversibles que unen el F1 del hígado de rata y el efecto del gradiente de H+
electroquímico en la unión de estos nucleotidos así como sus efecto sobre nucleotidos unidos endógenamente
no detectado en estos estudios.
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