MICROBIOLOGIA VETERINARIA II

MICROBIOLOGIA VETERINARIA II
Características generales, estructura y taxonomía viral
TEMATICA
• Generalidades
• Estructura viral
• Taxonomía viral
• Glosario
Generalidades
• Los virus son mucho más pequeños que las células procariontes o eucariontes
• En general, a diferencia de las células, los virus tienen una estructura simple y estática
• No tienen un sistema metabólico propio.
• Dependen de la maquinaria de la célula hospedera para su replicación (parásitos intracelulares
estrictos)
• Tienen genomas de ADN o ARN , pero carecen de ribosomas y otros factores necesarios para la
traducción de proteínas. Así pues, dependen de la célula hospedera para la producción de proteínas
virales.
• Sus genomas codifican información mínima para asegurar lo siguiente:
1) replicación del genoma y empaquetamiento
2) producción de proteínas virales
3) subvertir funciones celulares para permitir la producción de viriones.
• Algunos virus (bacteriófagos) infectan células procariontes, mientras que otros infectan células
eucariontes.
• Algunos virus destruyen las células, produciendo enfermedad; otros persisten en estado latente o
persistente en la célula infectada; y otros pueden causar transformación maligna de las células a las que
infecta.
Estructura viral
Los virus se componen, al menos, de un genoma de ácido nucleico ADN o ARN y una cubierta de
proteínas. Muchos virus tienen además una membrana externa llamada envoltura.
• La cubierta proteica o cápside de un virión (virus completamente ensamblado o partícula viral) está
compuesta de múltiples copias de uno o más tipos de proteínas. Estas proteínas se ensamblan,
formando unidades estructurales llamadas capsómeros.
• Al ácido nucleico más la cubierta o cápside de una partícula viral es frecuentemente llamada
nucleocápside
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• Los virus más simples son aquellos que carecen de envoltura y tienen ADN o ARN de cadena sencilla
(Fig. 1.1).

Los virus envueltos contienen una membrana externa que rodea a la nucleocápside (Fig.1.2). La
envoltura viral se deriva de membranas de la célula hospedera (nuclear, de aparato de Golgi, de
retículo endoplásmico o membrana plasmática). Tal como estas membranas, la envoltura viral se
compone de una bicapa lipídica con proteínas insertadas en ella, proteínas que son codificadaspor el
virus.
• Algunos virus, como los bacteriófagos, tienen colas proteicas complejas que se requieren para el
anclaje y/o la penetración del ADN viral en la célula hospedera susceptible.
Figura 1-1. Virión no envuelto con cápside icosahédrica. El ácido nucleico está en el interior de la
cápside.
Figura 1-2. Virión envuelto con cápside helicoidal. El ácido nucleico se localiza en el interior del virión
como indica la línea punteada en forma de espiral. Las líneas en la superficie exterior de la envoltura
representan espículas glicoprotéicas.
Genoma viral
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El genoma viral está compuesto por ADN o ARN. Un virus no contienen ADN y ARN simultáneamente.
El ADN puede ser de una sola cadena (ss por sus siglas en inglés) (parvovirus y circovirus), de doble
cadena (ds por sus siglas en inglés) (polyomavirus, adenovirus, herpesvirus), o parcialmente de doble
cadena (hepadnavirus). El genoma de ADN puede tener sus extremos covalentemente ligados el uno al
otro (circular = polyomavirus, circovirus) o no estar unido por sus extremos (lineal = adenovirus,
herpesvirus, parvovirus). El genoma de los virus de viruela (poxvirus) es ssADN cuyos extremos están
covalentemente unidos uno al otro. Todos los genomas virales de ARN son lineales. La mayoría de
estos son cadena sencilla y unos pocos son de cadena doble (reovirus, bornavirus). La mayoría de los
virus de ARN tienes sus genomas en una sola pieza (monopartita) mientras que otros lo tienen dividido
en 10 segmentos (reovirus), 7 u 8 segmentos (ortomyxovirus), tres segmentos (bunyavirus) y dos
segmentos (arenavirus). En cuanto a ssARNs, hay dos posibilidades importantes de secuencia:
• Si el ssARN funciona como mensajero para la traducción de proteínas (tiene la misma orientación que
el mARN), se le llama sentido positivo.
• En contraste, si el ARN viral es antisense (o complementario) a ese mARN – y entonces no puede ser
traducido directamente - se dice que es sentido negativo.
• En algunos virus (Arenavirus y Bunyavirus) se transcriben porciones del genoma de ARN, generando
ARNs mensajeros que son entonces traducidos. La copia de estos mARNs (complementaria,
supuestamente ARNs sentido negativo) puede ser también traducida. Este arreglo es único entre los
virus, y se dice que es ambos sentidos (ambisense). Los genes contenidos dentro del genoma pueden
codificar desde unos pocos productos génicos diferentes (Polyomavirus, 6 - 7 genes, 5000 nucleótidos
de longitud) hasta más de 70 - 100 productos génicos diferentes (Herpesviridae, 60 a 120 genes,
120,000- 220,000 pares de bases de nucleótidos de longitud). En general, los genomas de los virus
ARN son más pequeños, con un tamaño máximo de 30,000 nucleótidos como se ve en los Coronavirus.
Una hipótesis para esto es que las polimerasas ARN virales tienden a cometer más errores que las
polimerasas ADN. Así, la fidelidad de la replicación puede limitar el tamaño. En contraste, los genomas
de virus de ADN pueden alcanzar un tamaño de hasta 300,000 nucleótidos, como se ve en algunas
especies de Herpesvirus.
La cápside
La función de la cápside es proteger el genoma viral durante su transferencia de célula a célula. La
cápside puede estar hecha de múltiples copias de una sola proteína o de una asociación de varias
proteínas diferentes. Las cápsides hechas de múltiples copias de una sola proteína representan un
buen ejemplo de economía, ya que un solo gene puede codificar los productos necesarios para cubrir
con la cápside el genoma completo.
• La cápside de un virus puede tener diferentes formas geométricas que son características de varias
familias virales. Estas incluyen:
1. Icosaédrico desnudo (picornavirus, polyomavirus) o envuelto (herpesvirus). Esta figura
geométrica tiene varias caras triangulares y esquinas; el número de caras y esquinas puede
variar de acuerdo al número y tipo de asociación entre las proteínas estructurales (unidades).
2. Estructura helicoidal, desnudo (virus del mosaico del tabaco) o envuelto (virus de la rabia).
3. Complejos, que tienen una mezcla de arreglos (por ejemplo, bacteriófagos, virus de viruela).
• Los virus varían en tamaño, desde los circovirus con 17 - 22 nm de diámetro, hasta los virus de viruela
o poxvirus que alcanzan los 300 nm. Estos virus tienen forma de ladrillo u ovoide y son suficientemente
grandes como para ser vistos con microscopio óptico, no como los otros virus para cuya visualización es
necesario el uso de microscopio electrónico.
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• Se han utilizado varias técnicas para la visualización de los virus. La cristalografía de rayos X es un
medio para determinar su estructura física, así como las dimensiones de las proteínas individuales y
componentes virales. La información obtenida por esta técnica se usa luego para "construir" (un
modelo) de la estructura total de la partícula viral. La microscopía electrónica se usa para generar
información en torno a la forma general de los virus, y se usa también con fines diagnósticos a través de
la detección de partículas virales en especímenes o muestras clínicas.
Cinco formas estructurales básicas
De acuerdo a su morfología básica, y tal como se mencionó anteriormente, hay cinco estructuras virales
básicas diferentes. Estas formas, con ejemplos, se enlistan a continuación:
1. icosaédrico desnudo - adenovirus y picornavirus.
2. helicoidal desnudo - virus del mosaico del tabaco; no se conocen virus de humanos o de
animales que tengan esta estructura.
3. icosaédrico envuelto - togavirus y flavivirus.
4. helicoidal envuelto - rhabdovirus y paramyxovirus.
5. complejos - bacteriófagos y virus de viruela.
Envolturas virales
La envoltura viral, característica de algunas familias virales, se deriva de membranas de la célula
hospedera por protrusión de yemas, lo cual ocurre durante la liberación de viriones de la célula
(infectada). Esta membrana es frecuentemente una porción de la membrana plasmática, sin embargo
puede ser parte del aparato de Golgi, del retículo endoplásmico o de la membrana nuclear,
dependiendo del tipo de virus y del compartimiento celular donde la replicación se lleva a cabo.
Independientemente de su origen, la membrana se compone de una bicapa lipídica - de origen celular –
con proteínas asociadas. Estas proteínas asociadas con la bicapa lipídica son principalmente de origen
viral (codificadas por el virus) y son en su mayoría glicoproteínas. El número de proteínas virales en la
envoltura puede variar desde una hasta más de diez, dependiendo del virus. Las glicoproteínas de la
envoltura viral llevan a cabo varias funciones, incluyendo el anclaje inicial del virión a la célula blanco,
penetración, fusión y diseminación de una célula a otra, entre otros. El anclaje del virión a la superficie
celular requiere que la envoltura esté intacta y las glicoproteínas tengan su conformación nativa. Los
fármacos antivirales están dirigidos contra las proteínas de la envoltura y pueden disminuir la habilidad
del virus para anclarse e iniciar la infección, disminuyendo así la infectividad. El proceso de protrusión
de yemas, y la consecuente adquisición de la envoltura por los viriones recién formados, puede o puede
no resultar en la muerte de la célula hospedera. Si son liberados muchos viriones simultáneamente, la
integridad de la membrana celular puede estar suficientemente comprometida como para conducir a la
muerte celular. De manera alternativa, la liberación de los viriones puede ser lenta, resultando en una
excreción crónica e infecciones persistentes. De hecho, a diferencia de la liberación de virus no
envueltos, que se lleva a cabo principalmente a través de la lisis y muerte celular; el egreso de virus
envueltos frecuentemente es compatible con la supervivencia de la célula. Por tanto, el fenómeno de
protrusión de yemas provee de un medio de liberación viral sin conducir a la muerte celular. Proteínas
Virales hay dos tipos básicos de proteínas codificadas por los virus: estructurales y no estructurales.
Las proteínas estructurales son aquellas que son parte de la estructura física del virión (cápside,
envoltura) , mientras que las proteínas no estructurales se producen dentro de la célula infectada y
juegan diferentes papeles en los pasos de replicación viral. El número de proteínas codificadas por los
genomas virales varía enormemente, desde tan pocas como dos proteínas, hasta cientos de ellas.
Típicamente las proteínas estructurales son aquellas que componen la cápside y que empaquetan el
ácido nucleico del genoma viral. En algunos virus envueltos hay una capa proteica entre la cápside y la
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envoltura (el tegumento). Las proteínas que forman el tegumento también son proteínas estructurales.
Las proteínas de la estructura externa de la cápside o envoltura son ligandos, que interactúan con
receptores en la superficie de la célula blanco. Algunas de estas proteínas (glicoproteínas) se procesan
en el lumen del retículo endoplásmico rugoso, donde se añaden oligosacáridos a la cadena
polipeptídica. Estas proteínas son enviadas al aparato de Golgi, a las vesículas secretoras, y finalmente
se fusionan con la membrana plasmática haciéndose presentes sobre la superficie de la célula
infectada. Esto es especialmente importante para los virus envueltos. Las glicoproteínas de la envoltura
juegan papeles en la mediación de la interacción entre los viriones y las células (anclaje, penetración,
fusión, diseminación de una célula a otra) y son los blancos principales de los anticuerpos
neutralizantes. Las proteínas no estructurales son principalmente, pero no exclusivamente, enzimas
como aquellas asociadas con el proceso de transcripción del genoma, replicación y procesamiento de
proteínas. Un ejemplo de proteínas no estructurales es la trancriptasa reversa de los retrovirus, que
hace copias de ADN a partir de un molde de ARN. Este paso es una característica importante de los
retrovirus cuyo ARN necesita ser convertido a ADN para ser incorporado al cromosoma del hospedero.
Algunos virus codifican varias proteínas no estructurales que juegan diversos papeles accesorios en la
regulación de la expresión genética celular y viral, regulación de diferentes pasos del ciclo viral,
neutralización de la defensa del hospedero, transformación celular, etcétera.
Otros componentes virales
Lípidos
Los lípidos de los virus se derivan de las membranas celulares de la célula hospedera. Éstos son en su
mayoría fosfolípidos (50 - 60%) y el resto es colesterol. Como consecuencia de que se derivan de la
célula hospedera, su composición lipídica varía. La bicapa lipídica de la membrana de la célula
hospedera que rodea al virión de los virus envueltos, también posee proteínas virales y glicoproteínas,
como las espículas características de algunos virus envueltos. La composición lipídica global de los
virus envueltos representa aproximadamente el 25 - 30% de su peso seco. El resto se divide entre la
porción del ácido nucleico y la porción proteica.
Carbohidratos
Los carbohidratos virales están presentes típicamente como los residuos de oligosacáridos de las
glicoproteínas, glicolípidos y mucopolisacáridos. La composición de los carbohidratos corresponde a
aquella de la célula hospedera. Sin embargo las glicoproteínas frecuentemente tienen un enlace N- u Oglucosídico. Los carbohidratos virales se encuentran principalmente en la envoltura. Algunos de los
virus más grandes y complejos contienen glicoproteínas internas o proteínas glicosiladas en la cápside.
Taxonomía viral
Los virus constituyen un grupo numeroso y heterogéneo. Se clasifican en categorías taxonómicas
jerárquicas basadas en muchas características. La clasificación es dinámica ya que continuamente se
van descubriendo nuevos virus y se acumula nueva información sobre virus ya conocidos. La
clasificación y nomenclatura usadas en este documento esta actualizada hasta el momento de ser
escrito. Los cambios más recientes aparecen en informes del Comité Internacional de Taxonomía Viral
(ICTV por sus siglas en inglés) , séptima edición (Disponible en amazon.com).
El esquema básico de clasificación jerárquica es:
Orden - Familia - Subfamilia –Género - Especie - Cepa / Tipo.
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Ciertas características virales, referidas más adelante, definen cada una de estas categorías
taxonómicas. Las Órdenes tienen el sufijo -virales, las familias tienen el sufijo -viridae, mientras que los
géneros contienen el sufijo -virus. Una especie viral está constituida por un linaje replicante que ocupa
un nicho ecológico, por ejemplo una enfermedad en particular. Los virus se clasifican en familias con
base en muchas características. Una característica básica es el tipo de ácido nucleico (ADN o ARN) y la
morfología, esto es, el tamaño y forma del virión así como la presencia o ausencia de una envoltura.
También se usan el rango de hospederos y las propiedades inmunológicas del virus (serotipos).
También se usan en la clasificación las propiedades físicas y fisicoquímicas como masa molecular,
densidad de flotación, inactivación térmica, estabilidad al pH y sensibilidad a varios solventes. Algunos
aspectos importantes de la taxonomía actual de los virus son si su material genético es ADNA o ARN, si
es de cadena sencilla o doble, la organización de su genoma y la presencia de ciertos genes. Todo lo
anterior se utiliza para ubicar a los virus en órdenes o familias particulares. Por ejemplo, el orden
Mononegavirales estácompuesto por aquellos virus que poseen genoma de cadena sencilla de ARN
con orientación negativa. Finalmente, la clasificación se basa en las macromoléculas producidas
(proteínas estructurales y enzimas), propiedades antigénicas y propiedades biológicas (por ejemplo,
acumulación de viriones en las células, infectividad, hemoaglutinación).
Las Familias virales se enlistan en la tabla de contenidos bajo varias categorías de sus ácidos
nucleicos. Las familias se presentan en el libro usando el mismo orden en el que aparecen en esta lista.
Partículas atípicas asociadas con infecciones
Virus defectuosos
Los virus defectuosos son aquellos cuyo genoma carece de un gen o genes específicos, debido a
mutación o deleción. Como resultado de lo anterior, los virus defectuosos no son capaces de llevar a
cabo un ciclo de vida productivo en las células. Sin embargo, si la célula infectada con el virus
defectuoso está co-infectada con un "virus ayudante" el producto del gen que carece el virus defectuoso
es complementado por el virus ayudante, y el virus defectuoso puede replicarse. Es interesante que,
para algunos virus, durante la infección se produce una mayor cantidad de viriones defectuosos que de
viriones infecciosos (tanto como 100:1). La producción de partículas defectuosas es característica de
algunas especies virales y se cree que modera la severidad de la infección/enfermedad in vivo. Los
virusoides, que son ejemplo de virus defectuosos, se discutirán más adelante en esta sección.
Pseudoviriones
Los pseudoviriones pueden ser producidos durante la replicación viral cuando el genoma del hospedero
se fragmenta. Como resultado de este proceso algunos fragmentos del ADN del hospedero se
incorporan en la cápside en lugar del ADN viral. Entonces, los pseudoviriones poseen la cápside viral a
la cual los anticuerpos pueden unirse y facilitar el anclaje y penetración en la célula hospedera, pero no
pueden replicarse una vez que logran el acceso a la célula, debido a que no tienen ninguno de los
genes virales esenciales para el proceso de replicación.
Priones
Aunque no son virales, los priones son partículas proteicas infecciosas asociadas con encefalopatías
espongiformes transmisibles (TSE por sus siglas en inglés) de humanos y de animales. TSE incluye la
enfermedad de Creutzfeldt-Jacob en humanos, "scrapie" en ovejas y encefalopatía espongiforme
bovina. En el análisis a la necropsia, el cerebro presenta grandes vacuolas en las regiones de la corteza
y del cerebelo, por lo que la enfermedad causada por priones se llaman "encefalopatías
espongiformes". Una examinación más detallada del tejido cerebral revela la acumulación de fibrillas y
placas amiloideas asociadas con proteínas de priones. Estas enfermedades se caracterizan por la
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pérdida del control motor, demencia, parálisis, desgaste y eventualmente la muerte. Los detalles de la
patogenia son en su mayoría desconocidos.
Viroides
Los viroides son ácidos nucleicos de bajo peso molecular, desnudos, extremadamente resistentes al
calor, a la radiación ultravioleta y la radiación ionizante. Estas partículas se componen exclusivamente
de una pieza de ARN circular de cadena sencilla, con algunas regiones de cadena doble. Los viroides
causan en su mayoría enfermedades de plantas, como la enfermedad del tubérculo ahusado de la
papa.
Virusoides
Los virusoides (también llamados ARN satélites) son similares a los viroides en el sentido de que son
ácidos nucleicos desnudos, de bajo peso molecular, extremadamente resistentes al calor y a las
radiaciones ultravioletas y ionizantes. Sin embargo, dependen de un virus ayudante para la replicación.
Los virusoides se replican en el citoplasma de la célula a través de una polimerasa ARN dependiente de
ARN. Nueva familia viral – Mimiviridae Mimiviridae es una familia viral que contiene un miembro,
Mimivirus. El nombre de Mimivirus se deriva de "microbio imitador". Fue descubierto en 1992 dentro de
un protozoario y, a la fecha, es el virus conocido de mayor tamaño, alrededor de 400 nm de diámetro.
La cápside es de forma icosahédrica, el virión carece de envoltura y su genoma es de ADN circular de
cadena doble (dsADN), de 1.2 Mb de longitud y con1,260 genes. La secuencia del genoma de Mimivirus
fue publicada en el año 2004.
Glosario
Bacteriófago: Un virus que infecta células procariontes y tiene muchos de los atributos de los virus de
plantas y animales. Requiere una bacteria viva para llevar a cabo su ciclo reproductivo.
Protrusión de yemas: A través de este proceso los virus envueltos adquieren su envoltura. Es precedido
por la inserción de glicoproteínas virus-específicas en la membrana celular del hospedero. Este proceso
ocurre más frecuentemente en la membrana plasmática y confiere infectividad.
Mucopolisacárido: Una clase de polisacárido (glucoaminoglicanos) como heparina, ácido hialurónico y
sulfato de condroitina, que absorben agua para formar un material espeso mucoide, gelatinoso.
Oligosacárido: Una azúcar que contiene un número pequeño y conocido de unidades de
monosacáridos.
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Cultivo y caracterización de virus
Temática 3
• Métodos de propagación viral
• Concentración y purificación de virus
• Infectividad y almacenamiento
• Visualización de virus
• Cuantificación directa de virus
• Cuantificación indirecta de virus
• Métodos misceláneos usados para caracterización
• Glosario
Se han desarrollado métodos para el almacenamiento, visualización, cuantificación (directa e indirecta) y
propagación de virus. También hay métodos para el diagnóstico de laboratorio de enfermedades virales,
muchos de los cuales son métodos serológicos, basados en la detección de la respuesta del hospedero a la
infección. A lo largo del tiempo, fue posible observar que el contagio de ciertas enfermedades era capaz
de pasar a través de filtros que las bacterias no podían pasar. Los filtrados obtenidos no eran capaces de
crecer en medios de cultivos para bacterias, y eventualmente se demostró experimentalmente que eran
infectivos y que contenían virus. A excepción de los virus de viruela, los virus no pueden ser observados
con microscopio óptico. Eventualmente los virus fueron observados con microscopio electrónico.
Algunos de los métodos importantes usados en los estudios básicos de virus se describen a continuación.
Tal como se mencionó en el capítulo anterior, los virus animales presentan una considerable diversidad en
sus características físicas. La característica que más refleja las propiedades del virión es la presencia o
ausencia de la envoltura viral. Los virus no envueltos son, en general, sensibles a la radiación ultravioleta,
relativamente termoestables y susceptibles al daño por los cristales de hielo. Debido principalmente a la
presencia de la envoltura de membrana, los virus envueltos se inactivan con solventes lipídicos (como
cloroformo y éter) y detergentes (como el desoxicolato), son sensibles a la radiación gama y ultravioleta,
relativamente termolábiles y el daño que les produce la formación de cristales de hielo es más extenso que
el que se produce en los virus no envueltos o desnudos.
Métodos de propagación viral
Para aislar, caracterizar e identificar virus, así como para producir vacunas virales, se necesita una
cantidad considerable de partículas virales. Esto se logra a través de diferentes métodos de propagación,
los cuales se enlistan a continuación:
Hospederos animales
En el pasado, la propagación de virus en organismos hospederos susceptibles no infectados era la única
manera de obtener grandes cantidades de virus. Actualmente el uso de animales experimentales como
hospederos para propagación viral está limitado por razones éticas. La propagación viral en animales es
más útil para aquellos virus que no crecen fácilmente en cultivos celulares. Por ejemplo: cepas vacunales
del virus de la enteritis hemorrágica de pavo pueden ser propagadas tanto en aves vivas como en cultivos
celulares. Sin embargo los productos propagados en bazo (de aves vivas) parecen ser más usados que los
propagados en cultivo. Para fines diagnósticos la inoculación de animales es un medio para detectar virus
en muestras clínicas, como el virus de la rabia en ratones lactantes.
Huevos embrionados
Antes del desarrollo de las técnicas de cultivo de células y de tejidos, el uso de huevo embrionado para
propagación viral fue una de las primeras alternativas al uso de organismos animales hospederos. El
huevo embrionado es aún el método preferido para la propagación de virus de influenza tipo A y para
muchos otros virus aviares. El huevo embrionado también es útil en la diferenciación de algunos virus
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que producen lesiones similares, como los virus de la viruela de la vaca y los virus de la pseudo viruela de
la vaca. Aunque el virus de la enfermedad de la lengua azul (BTV) es un virus de mamíferos, se replica
bien en huevo embrionado, por lo que este sistema se usa para propagación viral con fines diagnósticos y
de investigación. Cuando se usa huevo embrionado, uno debe considerar la posible presencia de
anticuerpos maternos (IgY) en el saco vitelino del huevo. Por lo tanto, frecuentemente es preferible
obtener huevo embrionado de parvadas libres de patógenos específicos (SPF). El dar pases en embrión de
pollos es útil en la atenuación de ciertos virus para vacunas de virus vivo modificado.
Cultivo de células/tejidos
El cultivo de tejidos se refiere al crecimiento y mantenimiento de células de tejidos vivos in vitro. Hay
básicamente dos tipos: cultivo de explantes y cultivo de células. Los explantes son pequeños fragmentos
de tejidos del hospedero que se mantienen en cultivo, mientras que el cultivo de células se obtienen
mediante de la disgregación de diferentes tejidos del hospedero en células individuales. La mayoría de los
sistemas usados en virología son en realidad cultivos celulares y no cultivos de tejidos, aunque ambos
términos se usan de manera indistinta. Los cultivos celulares se subdividen a su vez en cultivos primarios,
cultivos semi-continuos y cultivos continuos.
Cultivo de explantes
Estos son cultivos de pequeños fragmentos de tejidos específicos, tomados directamente del hospedero
animal. Los cultivos de explantes son útiles para el aislamiento viral y se requieren para el aislamiento de
algunos coronavirus. La demostración de latencia de algunos alfa herpesvirus humanos y animales puede
requerir explantes de ganglio nervioso sensitivo (por ejemplo, trigémino).
Cultivos celulares primarios
Estos se derivan de tejidos frescos que han sido digeridos enzimáticamente con tripsina u otras proteasas,
para liberar células individuales. Como resultado, con frecuencia los cultivos primarios están compuestos
de muchos tipos celulares diferentes. En condiciones in vitro las células de los cultivos primarios
raramente pueden dividirse, o se dividen a una velocidad muy baja. Es por esto que tienen un tiempo de
vida limitado, conocido como límite de Hayflick. A pesar del tiempo de vida limitado de los cultivos
primarios, son ideales para el aislamiento de algunos virus. Los cultivos primarios raramente sobreviven
más allá del vigésimo pase in vitro.
Cultivos semi-continuos
Son también conocidos como líneas celulares diploides, debido a que contienen el cromosoma diploide
normal característico de la especie de la que ellos se derivan. Los cultivos semi-continuos son cultivos
primarios que tienen algunas células que pueden ser cuidadas para sobrevivir más allá del límite de
Hayflick. Los cultivos semicontinuos tienden a morir entre el 30° y el 50° pase in vitro. A pesar de esta
limitante, los cultivos semi-continuos son útiles en la propagación de una gran variedad de virus. Los
cultivos semi-continuos son por lo general de fibroblastos.
Cultivos celulares continuos
Se les conoce también como líneas celulares heterodiploides, debido a que poseen un número anormal de
cromosomas. Estos cultivos se derivan de tejidos normales o neoplásicos y se caracterizan por su
habilidad para ser propagados in vitro indefinidamente. De manera general, las líneas celulares continuas
no son tan sensibles como las otras para propagación viral. Sin embargo, facilitan la propagación a gran
escala de algunos virus para vacunas e investigación. Muchas líneas continuas están disponibles de
proveedores como la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC por sus siglas en inglés). La mayoría
de los laboratorios de virología almacenan en congelación alícuotas iniciales de sus cultivos continuos,
debido a que las líneas celulares que están continuamente en cultivo pueden sufrir cambios en sus
características celulares. Las causas de estos cambios pueden ser infección por Micoplasma spp., o virus
contaminantes (por ejemplo, circovirus porcino y virus de la diarrea viral bovina).
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Concentración y purificación de virus
Una vez que un virus ha sido propagado adecuadamente, necesita ser recuperado de las células
hospederas y los restos de éstas, y luego ser purificado. Esto se logra por varios procesos que involucran
centrifugación diferencial (a diferentes velocidades), diálisis, precipitación, cromatografía y gradientes de
densidad. El paso inicial de este proceso es la centrifugación diferencial; se usa una velocidad baja
(~2,000 x g) para quitar restos celulares y a para concentrar se usa a continuación, en el caso de
volúmenes pequeños, una velocidad alta de centrifugación (40K a 80K x g) y en el caso de volúmenes
mayores, se usa diálisis y precipitación o precipitación con metanol frío (-70°C) o con polietilenglicol. La
purificación se lleva a cabo mediante cromatografía o centrifugación usando gradientes de densidad. Los
virus envueltos pueden ser purificados aprovechando su velocidad de sedimentación en gradientes de
sacarosa. Los virus desnudos pueden ser purificados por centrifugación a través de gradientes de cloruro
de cesio.
Infectividad y almacenamiento
Infectividad
La infectividad es la habilidad de la partícula viral para infectar una célula hospedera. La temperatura en
el exterior de la célula hospedera afecta fácilmente la capacidad del virus para conservar su infectividad,
particularmente en el caso de los virus envueltos. Debido a que los virus no tienen actividad metabólica
propia, la infectividad es el mejor medio para evaluar la integridad de la partícula viral después de que se
ha expuesto a cierta temperatura. Las siguientes son consideraciones importantes al respecto:
• A 60°C, la infectividad del virus disminuirá rápidamente, en segundos.
• A 37°C, la infectividad disminuirá dramáticamente, en minutos.
• A 20°C, la infectividad disminuirá, en cuestión de horas.
• La infectividad en las temperaturas antes mencionadas influyen en la transmisión del virus por contacto
directo (a 37°C) y por fomites (a 20°C).
• A 4°C, la infectividad en tejidos se pierde en cuestión de días. Los clínicos deben tener esto en cuenta al
considerar los especímenes clínicos. Con frecuencia se usan temperaturas abajo del punto de congelación
para almacenamientos por periodos largos. Lo importante a considerar es mantener al
mínimo la formación de cristales de hielo. Debe mantenerse en mente el hecho de que los virus presentan
gran diversidad en su resistencia y labilidad Algunos son capaces de sobrevivir por horas, días, o incluso
meses bajo condiciones ambientales, mientras que otros se inactivan en pocos minutos bajo las mismas
condiciones. Los tres métodos principales para almacenar virus son:
• Congelación a -70°C, con o sin criopreservante.
• Para almacenamiento por largos periodos: congelamiento en nitrógeno líquido (-196°C).
• Liofilización con almacenamiento en congelación o a temperatura ambiente.
Visualización de los virus
Los dos métodos principales usados para visualizar la estructura / morfología de los virus son: la
microscopía electrónica y la microscopía de fuerza atómica. Otros tipos de microscopía se usan para
observar cambios inducidos por la replicación viral en las células infectadas. Sin un medio para visualizar
los virus es difícil obtener información acerca de la estructura o las interacciones célula-virus. Más aún, el
visualizar las partículas virales le permite a uno estimar directamente el número de partículas (virales)
presentes en una suspensión. Hay otros métodos que le permiten a uno estimar el número de virus
indirectamente. En cualquier caso, la cuantificación directa o indirecta es siempre un estimado. Este
estimado numérico es importante al preparar vacunas, al determinar el número mínimo de viriones
necesarios para producir una enfermedad y en procedimientos virales de investigación.
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Microscopía óptica
Si bien la microscopía óptica no es útil para la examinación directa de los virus (con excepción de los
virus de la viruela), es útil para observar los efectos de la infección viral en la célula hospedera. El daño
celular o la destrucción causada por el virus es conocida como efecto citopático (CPE por sus siglas en
inglés). Los efectos citopáticos que pueden observarse incluyen:
1. Células redondeadas y agregados en forma de racimo de uvas, como se observa con adenovirus;
2. Células redondeadas, encogidas, lisadas, dejando gran cantidad de restos celulares, como se observa
con los enterovirus
3. Células agrandadas y redondeadas en áreas focales, como con herpesvirus
4. Fusión de células que se convierten en células multinucleadas (sinsicios) como en el caso de
paramyxovirus. Además es posible observar cuerpos de inclusión, característicos de algunos virus.
Microscopía de fluorescencia
La microscopía de fluorescencia puede ser usada para visualizar células o tejidos infectados por virus,
usando anticuerpos antígeno-específicos marcados con fluorocromos. El anticuerpo se une
específicamente a los antígenos virales presentes dentro de las células o tejidos y los marca con la
molécula fluorescente (generalmente fluoresceína). La marca fluorescente se observa posteriormente con
un microscopio de luz ultravioleta que excita a la molécula del fluorocromo, lo que uno observa como
una zona coloreada sobre un fondo relativamente oscuro. De manera alternativa, la visualización puede
llevarse a cabo de forma indirecta usando anticuerpos sin marca (como los de sueros convalecientes)
seguidos de la aplicación de anticuerpos marcados con fluoresceína que se unen al primer anticuerpo. Los
ensayos basados en el uso de anticuerpos fluorescentes son usados comúnmente en el diagnóstico viral y
la investigación.
Microscopía electrónica
La microscopía electrónica involucra la aceleración de electrones a un estado de alta energía y el enfoque
magnético de los mismos hacia la muestra. Los electrones de alta energía tienen longitudes de onda muy
cortas, proporcionando así una mejor resolución de estructuras muy pequeñas. La microscopía electrónica
tiene suficiente poder de resolución para observar polímeros grandes como ADN y ARN, así como
proteínas grandes. Para facilitar la visualización, las muestras pueden ser cubiertas con metales pesados
como osmio, antes de la examinación con el microscopio electrónico. Los electrones impactan el metal
pesado y posteriormente son visualizados en una pantalla fluorescente. La microscopía electrónica
proporciona imágenes tridimensionales de viriones y de su localización (nuclear o citoplasmática) dentro
de la célula hospedera en un momento dado durante la infección. La observación de viriones en células
vivas no es posible, debido a que las muestras tienen que ser tratadas con metales pesados.
Microscopía de fuerza atómica
La microscopía de fuerza atómica trabaja a través de la medición de una propiedad local (tal como altura,
absorción óptica, magnetismo, etc.) de una sonda puesta muy cerca de la muestra. Esto hace posible
tomar mediciones en un área muy pequeña de la muestra. Los electrones son capaces de "atravesar por
túnel" entre los átomos, provocando una fuerza pequeña pero cuantificable. El resultado de estas
mediciones es un mapa detallado del contorno o la superficie de la estructura. La ventaja de la
microscopía de fuerza atómica es que la preparación de la muestra es mínima y pueden usarse
especímenes vivos. Este método ha sido útil para obtener imágenes detalladas de estructuras de cápsides y
de interacciones virus-célula.
Microscopía inmunoelectrónica
Esta técnica permite la visualización de complejos antígeno / anticuerpo que son específicos para un virus
en particular. En este método se obtienen cortes ultra finos (de la muestra) y se incuban con un anticuerpo
específico para el virus. Después de un paso de lavado, el corte se incuba con Proteína A conjugada con
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partículas de oro (de unrango de 5 a 20 nm). Este conjugado se une a la porción Fc del anticuerpo y se
detecta por microscopía electrónica.
Enumeración directa de virus
Estimar el número de virus tiene una cantidad importante de usos, incluyendo producción de vacunas e
investigación. La microscopía electrónica se usa para cuantificar las partículas virales en una solución
libre de células. Se examina un volumen conocido de la muestra y se cuenta el número de viriones. Este
número se usa para calcular el número de virus. Una limitante es que las cápsides vacías, es decir,
partículas no infectantes, también son contadas. En investigación, se compara el número de partículas
infectantes y el número total, y se establece una relación de partículas totales / partículas infecciosas para
un virus dado.
Enumeración indirecta de virus
Los métodos indirectos de cuantificación viral son aquellos que usan factores asociados con la
infectividad (actividad biológica). Los tres métodos principales usados para determinar indirectamente
concentraciones virales son: ensayos de hemoaglutinación, ensayos de formación de placas y el método
de la dilución limitante.
Hemoaglutinación
Este ensayo se basa en la propiedad que tienen muchos virus envueltos para aglutinar glóbulos rojos
(RBCs) o (GR). El ensayo se lleva a cabo en una microplaca, añadiendo glóbulos rojos a diluciones de la
muestra que contiene virus, y observando posteriormente la hemoaglutinación. Son necesarias muchas
partículas virales para cubrir los glóbulos rojos y producir hemoaglutinación. Por ejemplo: se necesitan
aproximadamente 104 viriones de influenza por unidad hemoaglutinante (1 unidad de HA). Una unidad de
HA se define como la máxima dilución de la muestra viral que causa hemoaglutinación completa.
La hemoaglutinación es útil en la concentración y purificación de algunos virus, y como prueba
presuntiva rápida para la presencia de este tipo de virus en fluidos de cultivos celulares infectados y de
embriones de pollo. Es especialmente útil para probar actividad viral en cultivos celulares infectados con
virus hemoaglutinantes que producen un efecto citopático (CPE) mínimo o no detectable. También
pueden ser examinados directamente especímenes clínicos como heces, para buscar actividad
hemoaglutinante de partículas virales. Otros ensayos del mismo tipo, en los que se prueba una actividad
enzimática de un virus en particular (como aquellos que producen transcriptasa reversa), pueden ser
llevados a cabo de manera similar.
Ensayo de formación de placas
Este ensayo involucra la inoculación de células hospederas susceptibles con un virus, y usar su actividad
biológica para estimar el número de viriones presentes. En este procedimiento se usan diluciones
decimales seriadas del virus para inocular monocapas de células hospederas. Después de un periodo de
incubación en el que se permite la adsorción del virus a la superficie de las células hospederas, la
monocapa es cubierta por una capa de un gel compuesto por medio de cultivo para células hospederas y
agarosa. La presencia del agar evita la diseminación a gran escala del virus en el cultivo celular, pero
permite la diseminación localizada de célula a célula. Con los virus citopáticos la destrucción de las
células lleva a la formación de zonas desocupadas llamadas placas, que pueden ser vistas entre las 24 y 72
horas de incubación. Un cálculo que involucra el número de placas observadas, el factor de dilución de la
muestra y el volumen de muestra diluida utilizada, da como resultado las unidades formadoras de placa
(PFU) por mililitro de muestra.
El método de dilución limitante
Este ensayo basado en titulación mide un efecto in vitro sobre las células, como el CPE, cuando éstas se
expone a varias diluciones de la solución que contiene el virus. Si es posible, se usa una concentración
conocida de un virus de referencia como control positivo. Dependiendo del virus, se hacen diluciones
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seriadas dobles o diluciones seriadas decimales del material viral y se ponen en contacto con las células.
El título infectivo (el recíproco de la dilución más alta que provoca el 50% de CPE en el cultivo
infectado) se expresa como TCID50/ml (dosis infectiva 50 cultivo celular). Este ensayo puede usarse con
células en cultivo, embriones de pollo o incluso con animales de laboratorio.
Métodos misceláneos usados para caracterización
Hay algunos métodos en virología que son útiles en la identificación y clasificación de virus
desconocidos. Algunas de esas técnicas serán mencionadas brevemente aquí, pero si se usan en el
diagnóstico de laboratorio de un virus en particular, se explicarán con detalle posteriormente.
Sensibilidad a solventes lipídicos
La sensibilidad de los virus a solventes lipídicos como cloroformo y éter es útil en la taxonomía de ciertos
virus. Cualquier virus que posea envoltura es susceptible a solventes lipídicos. Todos los virus envueltos
de animales, excepto algunos virus de la viruela, son sensibles al éter.
Identificación del tipo de ácido nucleico
Esto se lleva a cabo examinando la síntesis de ácido nucleico en la célula, en presencia mde inhibidores
de la síntesis de ADN, como la 5-bromo-2-desoxiuridina (BRU). Si se inhibe la síntesis viral como
consecuencia disminuirá la multiplicación viral. En el caso de que el crecimiento viral no sea inhibido se
presume que al virus contiene ARN.
Análisis con enzimas de restricción
Las enzimas de restricción (RE) son endonucleasas que cortan el ADN de doble cadena en sitios de
reconocimiento específicos que son secuencias palindrómicas que van desde cuatro hasta ocho pares de
bases de longitud. El análisis con enzimas de restricción es particularmente útil en la clasificación de
"subserotipos" virales, en la diferenciación de virus vivos modificados vacunales de virus virulentos y en
el rastreo epidemiológico de brotes de enfermedades. Metodológicamente esta técnica consiste en tratar el
ADN viral con una o varias enzimas de restricción y luego separar los fragmentos resultantes por medio
de electroforesis en geles de poliacrilamida. Los virus de ARN pueden ser analizados de una manera
similar haciendo primero el ADN complementario (ADNc) al ARN viral usando la enzima transcriptasa
reversa, y luego amplificando este ADNc por el método de PCR.
Hemoadsorción
Virus envueltos como los ortomixovirus y paramixovirus adquieren su envoltura externa por protrusión
de yemas a través de la membrana celular. Antes de la protrusión, se incorporan a la membrana celular
proteínas codificadas por el virus (hemoaglutininas). Esas células (aquellas a las se incorporaron
hemoaglutininas a su membrana) adsorben eritrocitos a su superficie, lo que trae como consecuencia la
formación de focos de hemoadsorción que pueden ser detectados microscópicamente.
Métodos inmunológicos
Los animales infectados con virus responden produciendo anticuerpos específicos. La detección y
cuantificación de estos anticuerpos, que reflejan el estado de la enfermedad, son útiles en la planeación de
programas de salud para el hato y estudios epidemiológicos de los brotes de enfermedades. Si bien la
detección de anticuerpos es útil en el diagnóstico de enfermedades también, con frecuencia es un proceso
tardado que requiere la comparación de los niveles de anticuerpos en sueros de la fase aguda de la
enfermedad y de la convalecencia, sueros que se colectan con 10 a 14 días de diferencia unos de otros.
Una estrategia más rápida es usar anticuerpos específicos anti-virus para detectar antígenos virales
directamente en especímenes clínicos. Estos anticuerpos generalmente se obtienen por hiperinmunización
de conejos o cabras con un virus específico. De manera alternativa pueden usarse anticuerpos
monoclonales, si hay disponibles. Los anticuerpos monoclonales (mAbs) se preparan en ratones primero
exponiendo al ratón al antígeno viral, que sensibiliza a las células B del bazo. Estas células se colectan
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y se fusionan químicamente con una línea celular de plasmocitoma de ratón que secreta IgG.
Posteriormente estas células híbridas son clonadas y los hibridomas resultantes, que son derivados de una
sola célula, se analizan para buscar secreción de la IgG antiviral específica. Las células del hibridoma
seleccionado son inyectadas de regreso por vía intraperitoneal al ratón, donde las células se multiplican
rápidamente y causan la acumulación de un fluido ascítico que contiene una alta concentración de
anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales son especialmente útiles en la tipificación y
subtipificación de virus. Cuando son acoplados a fluorocromos, los mAbs son muy usados para la
detección de virus en tejidos. También son usados para la identificación de virus en muchos estuches
diagnósticos comerciales de ELISAs.
Glosario
Virus citopáticos: Son aquellos que alteran la apariencia microscópica de células en cultivo. Estos
cambios pueden incluir redondeo de las células, fusión celular, desprendimiento celular, producción de
cuerpos de inclusión.
Gradientes de densidad: Procedimiento para separar células o macromoléculas como proteínas y ácidos
nucleicos, generalmente usando centrifugación a través de un gradiente de densidad. Este último consiste
en una solución en la que hay un rango de densidades del soluto (generalmente sacarosa o cloruro de
cesio), menos concentrado en la superficie y más concentrado en el fondo. Como resultado de la
centrifugación las células o macromoléculas se desplazan a través del gradiente y forman una banda que
se ubica donde su gravedad específica es igual a la densidad del medio.
Palíndromos: Secuencias que se leen igual en ambas direcciones. La mayoría de los sitios de
reconocimiento de las endonucleasas de restricción son palíndromos, por ejemplo la secuencia de
reconocimiento de EcoR1 (E.coli) es: 5' GAATTC 3', 3' CTTAAG 5'
Interacciones virus-célula y patogénesis viral
Indice
• Interacción entre Virus y Células Hospederas
• Patogénesis de las Infecciones Virales
• Glosario
Para el entendimiento de la interacción entre el virus y la célula hospedera es necesario tener
conocimiento de la replicación y la genética viral. La interacción a nivel celular y la progresión de una
infección viral particular determinan la patogénesis de la enfermedad y sus manifestaciones clínicas.
Interacción entre virus y células hospederas
La interacción entre los virus y sus células hospederas está íntimamente ligada al ciclo de replicación
viral. Más aún: la interacción del virus con los componentes y las estructuras celulares durante el proceso
de replicación influye en cómo el virus causa la enfermedad. En total hay cuatro posibles efectos
primarios de la infección viral a una célula hospedera. La mayoría de las infecciones no cusan patología
celular o alteración morfológica aparente, sin embargo la replicación puede causar citopatología
(redondeamiento celular, desprendimiento, formación de sinsicios, etc.), transformación maligna o lisis
(muerte).
Muerte celular
La muerte celular durante la replicación viral puede ser causada por diversos factores. El factor más
probable es la inhibición de la síntesis celular basal de biomoléculas tales como proteínas. Durante el
ciclo de replicación, el virus induce a la maquinaria celular a fabricar principalmente productos virales,
más que aquellos que la célula fabricaría normalmente. Como resultado de esto, la célula sintetiza
predominantemente productos virales, y los productos celulares necesarios para la supervivencia de la
célula no están presentes, o lo están pero en cantidades demasiado bajas como para mantener su
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viablildad. Además de la carencia de productos celulares esenciales, este evento resulta en la acumulación
excesiva de productos virales (ARN, ADN, proteínas), que pueden ser tóxicos para las células. En la fase
de liberación del ciclo de replicación de algunos virus se estimula la apoptosis de la célula hospedera. En
otras instancias la inhibición de la síntesis de macromoléculas celulares causa daños a las membranas de
los lisosomas, y por consecuencia la liberación de enzimas hidrolíticas, provocando la muerte celular.
Efectos celulares
Los efectos citopáticos (CPE por sus siglas en inglés) son todos aquellos cambios morfológicos en las
células provocados por la infección viral. Las células infectadas algunas veces tienen alterada su
membrana celular. Como resultado de esto, la membrana de la célula infectada es capaz de fusionarse con
su célula vecina. Se piensa que esta alteración es el resultado de la inserción, durante el ciclo de
replicación, de proteínas virales. El resultado de la fusión es la generación de una célula multinucleada
o sinsicios. La formación de sinsicios es una característica de numerosos virus envueltos, como los
herpesvirus y paramyxovirus. La membrana celular alterada también está alterada en lo que se refiere a su
permeabilidad, permitiendo la entrada de varios iones, toxinas, antibióticos, etc. Estas células
multinucleadas son grandes, por lo que algunas veces son llamadas "células multinucleadas gigantes".
Otro aspecto del efecto citopático es la alteración del citoesqueleto, que da lugar al aspecto "redondeado"
de las células infectadas. En estos casos la célula va a sufrir lisis o va a formar sinsicios. La presencia de
CPE en especímenes clínicos puede indicar infección viral, y el CPE es usado como base para el ensayo
de formación de placas usado para cuantificación viral . La infección de células por algunos virus (por
ejemplo virus de viruela y rabia) se caracteriza por la formación de cuerpos de inclusión en el citoplasma.
Los cuerpos de inclusión son áreas discretas que contienen proteínas o partículas virales. Frecuentemente
tiene una apariencia y localización características en la célula infectada, dependiendo del tipo de virus.
Transformación maligna
En este proceso la infección viral da como resultado células hospederas que se caracterizan por tener
alteraciones en su morfología, en su control de crecimiento, en sus propiedades celulares y/o bioquímicas.
La transformación maligna y la neoplasia resultante puede ocurrir cuando el genoma viral (o una porción
de éste) se incorpora en el genoma del hospedero, o cuando los productos virales son, por sí mismos,
oncogénicos. Los virus que causan transformación maligna se conocen como virus tumorales. Se ha
demostrado que virus de diferentes familias poseen la habilidad de transformar células hospederas. Los
virus tumorales no tienen propiedades comunes (forma, tamaño, composición química) más que provocar
el desarrollo de malignidad en las células que infectan. La transformación maligna frecuentemente se
caracteriza por alterar la morfología celular. Esto incluye la pérdida de su forma característica, y la
adopción de la apariencia redondeada y refráctil descrita para el CPE. Esto es el resultado de la
disgregación de filamentos de actina y la disminución de la adhesión de la superficie. El crecimiento
celular alterado, la característica distintiva de la transformación maligna, se muestra en células infectadas
que han perdido la inhibición por contacto de su crecimiento o movimiento, que tienen disminuidos sus
requerimientos de factores de crecimiento de suero, y/o ya no responden a las señales de ciclo celular
asociadas con crecimiento y maduración celular (inmortalidad). Algunas de las alteraciones en las
propiedades celulares que exhiben las células con transformación maligna incluyen la inducción continua
de la síntesis de ADN, cambios cromosomales, aparición de antígenos de superficie nuevos
embrionarios, e incremento de aglutinación por lectinas. Las características bioquímicas que
frecuentemente se ven alteradas en células con transformación maligna incluyen la reducción de los
niveles de AMP cíclico. El AMP cíclico es una señal química asociada con el ciclo celular y al mantener
los niveles reducidos, la célula se divide continuamente. También está involucrado en el incremento de la
secreción del activador plasminógeno (formación de coágulo), fermentación para la producción de ácido
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láctico (conocido como efecto Warburg), pérdida de fibronectina, y cambios en los azúcares de las
glicoproteínas y los glicolípidos.
Oncogénesis
Aunque ha sido difícil comprobar la causa-efecto, varios virus de ADN y de ARN se han asociado con
transformación neoplásica. Los virus implicados en la oncogénesis o llevan consigo una copia del gen
asociado con el crecimiento y la proliferación celular, o alteran la expresión de la copia del gen que tiene
la célula hospedera. Los genes afectados incluyen aquellos que estimulan y aquellos que inhiben el
crecimiento celular. Los genes virales que transforman a las células infectadas se conocen como
oncogenes (genes v-onc), los cuáles estimulan el crecimiento y la proliferación descontrolada de la célula.
El descubrimiento de los oncogenes llevó a descubrir que todas las células poseen genes análogos,
llamados proto-oncogenes (genes c-onc), que normalmente están quiescentes en las células y se activan
en algún momento del desarrollo. Los proto-oncogenes incluyen productos celulares como factores de
crecimiento, factores de transcripción y receptores de factores de crecimiento. Los virus de ADN
asociados con la oncogénesis incluyen virus de la enfermedad de Marek (Herpesviridae) y los
papillomavirus bovinos, equinos, y orales caninos (Papillomaviridae). Estos virus son típicamente de
ácidos nucleicos episómicos circulares (independientes de los cromosomas del hospedero, más que
integrados). Los oncogenes (v-onc) codifican para proteínas asociadas con el ciclo de replicación viral.
Los virus ARN asociados con oncogénesis incluyen miembros de la familia Retroviridae (por ejemplo
virus de leucosis aviar y de leucemia felina). Estos virus integran sus genomas (o una copia de sus
genomas) en el cromosoma del hospedero: se conocen como provirus o ADN proviral. La integración
viral es mediada por los extremos terminales del genoma, conocidos como LTRs (repeticiones terminales
largas, por sus siglas en inglés). Los LTR’s contienen regiones promotoras/ potenciadoras, además de las
secuencias involucradas en la integración del provirus en el genoma del hospedero. Los Retrovirus
pueden causar oncogénesis porque codifican oncogenes por sí mismos o por alterar la expresión de los
oncogenes celulares o proto-oncogenes a través de la inserción de sus genomas en el cromosoma del
hospedero, en un sitio cercano a estos genes.
Sin cambios morfológicos o funcionales
En algunos casos, la infección con producción viral puede ocurrir sin que puedan detectarse cambios en la
célula hospedera. Esto se conoce como infección endosimbiótica. Probablemente depende de las
necesidades de replicación del virus. Es muy probable que el virus requiera que los procesos celulares
estén activos para que la replicación viral se lleve a cabo, y por lo tanto no altera las características de la
célula.
Patogénesis de las infecciones virales
La patogénesis se define como la generación y desarrollo de una enfermedad. Las infecciones virales
pueden ser agudas, crónicas, latentes o persistentes. El primer paso en el proceso de una enfermedad es la
exposición.
Exposición y transmisión
La exposición pude ocurrir por contacto directo con un animal infectado, por contacto indirecto con
secreciones / excreciones de un animal infectado, o por vectores mecánicos o biológicos. La transmisión
del virus desde la madre a la descendencia (transplacentaria, perinatal o por el calostro) se conoce como
transmisión vertical. La transmisión vía cualquier otro mecanismo que no sea de la madre a la
descendencia es transmisión horizontal. Puede ocurrir activación de un virus latente no replicante dentro
de un individuo, sin que el agente infeccioso se adquiera de una fuente externa.
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Vía de entrada
Los virus penetran al hospedero a través del tracto respiratorio (aerosoles), el tracto digestivo
(contaminación oral-fecal), el tracto genitourinario (reproducción, inseminación artificial), la conjuntiva
(aerosoles), y a través de aberturas en la piel (abrasiones, agujas, picaduras de insectos, etc.). Si después
de la entrada del virus
prosigue o no la infección, depende de la habilidad del virus para enfrentarse e iniciar infección en células
susceptibles. La susceptibilidad de las células a un virus dado depende principalmente de sus receptores
de superficie, que permiten el anclaje y la posterior penetración del virus.
Infecciones localizadas y diseminadas
Siguiendo la infección, el virus se replica en el sitio o cerca del sitio de entrada (replicación primaria).
Algunos virus permanecen confinados a este sitio inicial de replicación, produciendo infecciones
localizadas. Un ejemplo de esto es el resfriado común y las infecciones similares de animales domésticos
causadas por rhinovirus. Otros virus causan infecciones diseminadas (sistémicas) por su difusión a
órganos adicionales vía torrente sanguíneo, linfático o quiescente a través de los nervios. La propagación
inicial del virus a otros órganos por el torrente sanguíneo se conoce como viremia primaria. La viremia
puede darse ya sea por presencia de virus libres en el plasma o por virus asociados con células
sanguíneas. Después de la multiplicación viral en esos órganos puede darse una viremia secundaria con
propagación a (otros) órganos blanco.
Un buen ejemplo de virus que causan infecciones sistémicas es el teschnovirus porcino 1 (género
Teschnovirus). El virus se transmite de forma fecal-oral. Se replica inicialmente en las células de las
amígdalas, migra a los intestinos y a los nódulos linfáticos mesentéricos. De estos nódulos linfáticos, el
virus entra al sistema nervioso central. Una vez en el sistema nervioso central se observan los signos
neurológicos de ataxia, temblores, pérdida de coordinación, entumecimiento de los miembros,
convulsiones, parálisis y coma. La preferencia de un virus particular por un tejido o tipo celular específico
se conoce como tropismo.
Mecanismos de infecciones virales
La replicación viral ocurre en los órganos blanco causando daño celular. El número de células infectadas
y/o la extensión del daño pueden tener como consecuencia la disfunción del órgano o tejido y la
manifestación clínica de la enfermedad. El intervalo entre la infección inicial y la aparición de signos
clínicos es el periodo de incubación. Los periodos de incubación son cortos en enfermedades en las que el
virus crece rápidamente en el sitio de entrada (por ejemplo influenza) y son más largos si las infecciones
son generalizadas (por ejemplo moquillo canino). Algunos virus infectan animales pero no producen
manifestación de signos de la enfermedad. Estas infecciones se conocen como subclínicas (asintomáticas
o inaparentes). Hay numerosos factores que pueden influir en el resultado de las infecciones virales.
Estos incluyen: inmunidad preexistente, genética del animal, edad del animal y factores relacionados a
estrés como estado nutricional, condiciones ambientales etc. Los mecanismos por los que los virus causan
enfermedad son complejos. La enfermedad puede ser resultado de efectos directos de los virus en las
células hospederas, como muerte celular, efecto citopático y transformación maligna. De manera
alternativa, la enfermedad puede ser resultado de efectos indirectos causados por la respuesta
inmunológica y fisiológica del hospedero. Un ejemplo de respuesta fisiológica indirecta es la infección
por rotavirus, que causa diarrea en animales jóvenes y humanos. La diarrea puede ser causada por los
eritrocitos infectados por el rotavirus, que están estimulados a producir citocinas, excitando las neuronas
entéricas e induciendo la secreción de exceso de fluidos y electrolitos en el intestino grueso. Un ejemplo
de patogénesis de la enfermedad mediada por la respuesta inmunológica ocurre en la enfermedad de
Borna en caballos. El virus se distribuye desde el sistema nervioso central a los nervios periféricos a
través de los axones. El hospedero responde a la presencia de neuronas infectadas por el virus induciendo
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una respuesta inmune mediada por células. Los macrófagos, neutrófilos y linfocitos T citotóxicos
específicos son activados para destruir a las neuronas infectadas por el bornavirus. El resultado es una
inflamación crónica del SNC que corresponde a los signos neurológicos asociados con la enfermedad.
Dos términos muy importantes usados para hablar de enfermedades microbianas son patogenicidad y
virulencia. Patogenicidad es la habilidad del virus u otro agente microbiano o parasitario para causar
enfermedad. Virulencia es el grado de patogenicidad. Un virus avirulento es aquel que no tiene la
capacidad para causar enfermedad. Un virus atenuado es aquel cuya capacidad para causar enfermedad ha
sido debilitada, frecuentemente por múltiples pases en cultivo celular, huevos embrionados o animales.
Eliminación (diseminación) viral
La eliminación viral es el mecanismo de excreción de la progenie viral para su diseminación hacia una
nueva población de hospederos. Los virus típicamente son eliminados vía aperturas en el cuerpo o
superficies. En infecciones localizadas, el virus es típicamente excretado vía el portal de entrada. En
infecciones diseminadas el virus puede ser excretado por diferentes rutas.
No todos los virus son excretados de sus hospederos. Estos incluyen virus que se replican en sitios como
el sistema nervioso, como en la encefalitis viral, y hospederos finales.
Evasión de las defensas del hospedero
En un esfuerzo por detener la infección, el hospedero inicia una respuesta inflamatoria. Los componentes
principales de esta respuesta incluyen interferón, linfocitos T citotóxicos, linfocitos B productores de
anticuerpos, diversas moléculas efectoras y complemento. Estos componentes trabajan en conjunto y se
potencian unos a otros en un intento de liberar al hospedero de la infección viral. En este esfuerzo por
liberarse del virus infectante, la respuesta inflamatoria causa muchos de los signos clínicos y lesiones
asociados con las infecciones virales.
Los interferones (α y β) son producidos por las células infectadas por el virus. Actúan para detener
replicación viral adicional en la célula infectada y en las células vecinas. Los interferones también
fomentan la expresión de antígenos en la célula infectada, haciéndolas más fáciles de reconocer para las
células T citotóxicas. Algunos virus como los adenovirus producen ARNs que bloquean la fosforilación
de un factor inicial, reduciendo así la habilidad del interferón para bloquear la replicación viral.
Las células T citotóxicas destruyen a las células infectadas mediante la liberación de perforinas, que crean
poros en las células infectadas por virus. Posteriormente son liberadas granzimas dentro de la célula
infectada, las que degradan a los componentes celulares. Finalmente, las células T citotóxicas estimulan la
apoptosis de la célula hospedera.
Algunos virus reducen la expresión, en la superficie de la célula hospedera, de los antígenos de superficie
del CMH (complejo mayor de histocompatibilidad) clase I (por ejemplo citomegalovirus, herpesvirus
bovino tipo I y adenovirus). Como las células T citotóxicas no pueden detectar antígenos virales que no
estén formando complejos con los antígenos del CMH clase I, las células infectadas con estos virus no
pueden ser destruidas de esta manera, permitiendo la "supervivencia" del virus dentro de la célula
hospedera. Sin embargo, células con insuficientes o ningún antígeno de CMH clase I en sus superficies
son reconocidas por las células asesinas naturales, que destruyen a la célula de manera similar a la
descrita para las células T citotóxicas.
Los linfocitos B productores de anticuerpos secretan anticuerpos específicos para neutralizar los viriones
infectantes cuando son liberados por las células. Los complejos antígeno-anticuerpo a su vez pueden
activar el sistema del complemento.
El complemento ayuda a estimular la inflamación, la neutralización efectiva de virus, y la destrucción de
células infectadas por virus. Las diferentes moléculas efectoras (citocinas) que son producidas por las
células del sistema inmune, desempeñan muchos papeles, incluyendo la inducción de fiebre y la atracción
de otras células inflamatorias (por ejemplo neutrófilos y macrófagos) al sitio dañado. Algunos virus
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poseen receptores para una variedad de citocinas (por ejemplo, el virus de la viruela bovina tiene
receptores para la interleucina 1, que estimula la producción de fiebre). Cuando las células inmunes
liberan la citocina, ésta se une al virus, reduciendo entonces la cantidad de citocinas disponibles para
modular la respuesta inmune. Esto aumenta la "supervivencia" del virus dentro del hospedero.
Un mecanismo alternativo para evadir la respuesta inmune es tener muchos tipos antigénicos (serotipos).
Una respuesta inmune hacia un serotipo no garantiza protección ontra otro serotipo del mismo virus. Por
ejemplo, hay más de 100 serotipos de rhinovirus y 24 serotipos de virus de lengua azul.
Infecciones virales persistentes
Algunos virus tienen la habilidad para abrogar la respuesta inflamatoria y causar infecciones persistentes.
Esto lo realizan de diferentes maneras, incluyendo la destrucción de linfocitos T, causando
inmunosupresión, evadiendo el reconocimiento inmunológico, alterando la expresión antigénica, y por
inhibición de la producción de interferón. Clínicamente hay tres tipos importantes de infecciones
persistentes:
Infecciones con portadores crónicos
Éstos son organismos que continuamente producen y excretan grandes cantidades de virus, por largos
periodos de tiempo. Como resultado de esto, ellos están transmitiendo continuamente el virus a otros
organismos. Algunos portadores crónicos son asintomáticos o exhiben la enfermedad con signos muy
leves. Ejemplos de esto son las infecciones por virus de la artritis equina, virus de la panleucopenia felina
y virus del polioma aviar.
Infecciones latentes
Un tipo especial de infección persistente es aquella en la que el virus permanece en el hospedero en un
estado "no-productivo". Los herpesvirus son notorios causando infecciones latentes. El genoma viral se
mantiene en las neuronas en forma de círculo cerrado, y se reactiva periódicamente (frecuentemente
durante condiciones de estrés) resultando en infección productiva y excreción viral. También ocurren
infecciones latentes con retrovirus, en los que el ADN proviral se incorpora en el genoma de la célula
hospedera. Puede resultar transformación celular y malignidad si el transcrito integrado altera la
organización normal de los procesos de control celular.
Infecciones virales lentas
Se refiere a aquellas infecciones virales en las que hay un largo periodo entre la infección inicial y el
inicio de la enfermedad. En estos casos el crecimiento viral no es lento, sino que la incubación y
progresión de la enfermedad es extensa. Un ejemplo es la enfermedad subaguda de la panencefalitis
esclerotica, que se desarrolla varios años después de la infección con el paramyxovirus de las paperas. La
"encefalitis del perro viejo" debida al recrudecimiento del moquillo parece ser una condición análoga.
Glosario
Antígeno: Una sustancia, generalmente ajena al cuerpo pero ocasionalmente producida dentro del cuerpo,
que el sistema inmune reconoce como extraña o "no propia". Cuando es reconocida de esta manera, se
producen anticuerpos específicos que reaccionan con ella.
Apoptosis: Una forma de muerte celular programada caracterizada por la fragmentación del ADN
nuclear.
Citocinas: Grupo diverso de proteínas pequeñas (< 30 kilodaltones), solubles, producidas por leucocitos,
que median una variedad de funciones inmunes.
Linfocitos T citotóxicos: Células que reconocen antígenos extraños anclados en moléculas del CMH tipo
I. Son eficaces destruyendo células sólo si éstas contienen antígenos extraños.
Endosimbiosis: Forma de simbiosis en la que un organismo vive dentro de otro.
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Granzimas: Grupo de proteasas de serina que penetran a la célula blanco mediante canales
transmembranales creados por perforinas, donde interactúan con varias vías intracelulares que disparan la
apoptosis y la degradación del ADN.
Interferones: Grupo formado por tres diferentes proteínas designadas como alfa, beta y gama.
Todas ellas tienen una acción no específica contra los virus , pero los interferones alfa y beta son los más
potentes.
Interleucinas: Grupo de citocinas secretadas por células efectoras del sistema inmune que provocan
respuesta en otras células del sistema inmune.
Lectinas: Glicoproteínas vegetales que se unen específicamente a ciertos azúcares, parte de lo cual ocurre
en la superficie de las células.
Macrófagos: El principal fagocito de tejidos, órganos y aquellas membranas serosas como la pleura y el
peritoneo.
Antígenos del CMH clase I (complejo mayor de histocompatibilidad): Grupo de genes que codifican para
las proteínas de autorreconocimiento o antígenos importantes de la incompatibilidad. Estos antígenos se
presentan en la superficie de todas las células del cuerpo y sirven para identificarlas como pertenecientes
al organismo, y no como extrañas. Algunos antígenos de CMH se presentan en la superficie de células del
sistema inmune. La región del CMH humano se conoce como la región HLA (antígeno leucocitario
humano por sus siglas en inglés) y se localiza en el cromosoma 6.
Células asesinas naturales (células NK): Linfocitos citotóxicos que componen aproximadamente el 5 a
15% de los linfocitos circulantes, carecen de los marcadores fenotípicos de las células T y B. Tienen la
capacidad de destruir ciertas células tumorales y células infectadas por virus que carecen de marcadores
del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) en la superficie celular, y su mecanismo para destruir
a las células es similar al de las células T citotóxicas.
Neutrófilos: Células fagocíticas de vida corta que poseen gránulos que contienen varios compuestos
bactericidas; son los más numerosos de los linfocitos circulantes constituyendo aproximadamente el 60 a
70% en humanos. Microscópicamente tienen una forma irregular y núcleo multilobulado; también se
conocen como leucocitos polimorfonucleares.
Perforinas: proteínas formadoras de poros que requieren de la presencia de calcio para polimerizar y
formar canales transmembranales en la célula plasmática de la célula blanco.
Defensas del hospedero contra los virus
Tal como los virus son capaces de causar enfermedad gracias a su habilidad de infectar células e iniciar el
proceso de replicación mediada por el hospedero, el hospedero y las células de éste poseen algunos
mecanismos para prevenir, minimizar, o contener las infecciones virales. En este capítulo se discuten
estas defensas, desde las respuestas innatas y las barreras protectoras, hasta las respuestas inmunes
específicas. El resultado de la interacción entre el hospedero y el virus se refleja en el carácter de la
enfermedad.
Defensas del hospedero
Barreras físicas / químicas
Las barreras físicas / químicas son parte del sistema inmune innato, aquel que posee cada hospedero al
nacer. Estas barreras previenen o limitan la infección. Cualquier factor que comprometa la integridad de
alguna de estas barreras proporciona un acceso del virus a las células del hospedero. Por el contrario,
algunos virus son capaces de atravesar estas barreras fácilmente, gracias a su ciclo de replicación.
• Piel. La piel es una barrera eficaz para la mayoría de las infecciones, incluyendo aquellas causadas por
virus. Esto es debido a que la piel está compuesta en parte de células muertas queratinizadas, que no
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pueden dar sustento a la replicación viral. Para traspasar esta barrera, los virus necesitan penetrar más
profundamente en el epitelio, a través de cortaduras, quemaduras, o picaduras de insectos.
• Membranas mucosas. Estas actúan como barreras físicas, previniendo el acceso directo a las células
hospederas. Adicionalmente, el moco interfiere con el anclaje del virus a la célula hospedera porque
contiene receptores virales en sí mismo. Por ejemplo, los paramyxovirus se unen a los receptores de ácido
siálicoasociados con las células hospederas. La presencia de glicoproteínas-ácido siálico en el moco
interfiere con el anclaje a esos sitios.
• Epitelios ciliados. La acción combinada de los cilios con el moco del epitelio facilita el desplazamiento
físico de los virus atrapados hacia afuera del cuerpo, disminuyendo así la infectividad viral. El tamaño del
inóculo, tamaño de la gota, corrientes de aire, humedad y temperatura son factores asociados con la
penetración de esta barrera.
• pH ácido. El pH ácido del tracto gastrointestinal (pH 2) fácilmente desnaturaliza las proteínas asociadas
con muchos virus. Sin embargo, los virus entéricos pueden ya sea resistir este pH o usar la exposición a
este pH para facilitar su descapsidación y volverse entonces infectantes en el intestino.
• Lágrimas. Estas proveen lavado constante para minimizar la cantidad de partículas virales disponibles
para infectar las células de la conjuntiva.
• Carencia de receptores. Esto involucra el rango de hospederos o la presencia de receptores en tejidos
específicos. Si el receptor necesario para el anclaje no está presente, entonces la infección no puede
ocurrir.
Respuestas inmunes no específicas
Las respuestas inmunes no específicas ocurren con cualquier infección viral. Estas respuestas sirven
principalmente para limitar la diseminación viral desde el sitio de infección, impedir la replicación viral y
colaborar con la respuesta inmune específica para un ataque dirigido al virus infectante.
• Fiebre. Esta inhibe la replicación viral a través de la estimulación de otras respuestas inmunes y de la
disminución de la replicación viral. Adicionalmente, el incremento de la temperatura puede mediar la
inactivación directa de las partículas virales. La importancia de la fiebre sola durante la infección viral no
es clara.
• Inflamación. Esta se refiere a la respuesta inmune local no específica caracterizada por enrojecimiento,
inflamación, calor y dolor. Neutrófilos y macrófagos son atraídos a la zona por citocinas. Este proceso
ayuda a limitar la infección. La producción constante de citocinas y el reclutamiento de células
inmunes continúa hasta que el antígeno es neutralizado eficazmente. Después sigue la reparación del
tejido. En algunos casos, la respuesta inflamatoria se vuelve crónica, dando origen a una inmunopatología
inducida por el virus.
• Interferones (IFN). Son un grupo de glicoproteínas específicas del hospedero inducidas por el virus, que
inhiben la replicación viral por inducción de la degradación del ARN viral y bloqueando la traducción de
proteínas virales. Adicionalmente los interferones confieren resistencia a las infecciones virales en las
células vecinas. Hay tres tipos de interferones producidos por el cuerpo: alfa, beta y gama. Los
interferones alfa y beta son llamados interferón tipo 1 y están involucrados en la respuesta inmune innata.
El interferón gama (IFN-gama) está involucrado en la respuesta inmune específica y será considerado
posteriormente. Los interferones alfa y beta trabajan por interferencia específica con la traducción viral, y
tienen poco efecto sobre la traducción celular. Este fenómeno se conoce como inhibición selectiva. Los
ARNm virales son reconocidos por secuencias de nucleótidos específicas del virus, que no se encuentran
en las células del hospedero. Adicionalmente, el IFN estimula el incremento en la producción de
complejos mayores de histocompatibilidad (CMH) de clase I y de clase II en la superficie de las células
hospederas. Esto ayuda para el reconocimiento de los antígenos virales, y el disparo de la respuesta
inmune específica en las células blanco infectadas por el virus.
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•
Interferón alfa (IFN alfa). Estable a pH.2; producción inducida por productos de la replicación viral (los
virus ARN estimulan su producción en mayor medida que los virus ADN) y ARNds. También llamados
IFN leucocitario.
• Interferón beta (IFN beta). Estable a pH.2; producción inducida por productos de la replicación viral (los
virus ARN estimulan su producción en mayor medidque los virus ADN) y ARNds. También llamado IFN
fibroblástico.
• Células asesinas naturales (NK). Las células NK son células sanguíneas blancas de linaje linfopoyético.
Son llamadas también la tercera población de linfocito (T, B y NK), células nulas o linfocitos grandes
granulares. Algunos virus, como parte de su ciclo de replicación, provocan la disminución de CMH clase
I hecho por la célula hospedera. Las células NK reconocen a aquellas células que carecen o que expresan
menos el CMH clase I, y las destruyen por apoptosis. De esta manera ellas reconocen y destruyen a las
células infectadas por virus. Las células NK destruyen células infectadas por virus de la misma manera
que las células T citotóxicas descritas posteriormente. Las células NK también son importantes en el
reconocimiento y destrucción de células tumorales.
• Fagocitosis. Es la acción de macrófagos y neutrófilos para englobar y destruirpartículas virales. Los
macrófagos se activan (se hayan más dispuestos para englobar y destruir) en respuesta a interferón
gamma y otras citocinas.
• Cascada del Complemento. La mayoría de los virus son incapaces de fijar complemento por la vía
alternativa. Sin embargo, como la vía clásica emplea anticuerpos específicos en el primer paso de la
cascada, este mecanismo puede lisar virus o células infectadas fácilmente.
Respuestas inmunes específicas
Las respuestas inmunes específicas son respuestas a una infección diseñadas para cada patógeno. Estas
respuestas toman de varios días a varias semanas para desarrollarse. Entonces, el cuerpo depende de la
acción de la respuesta inmune no-específica para ayudarse a localizar la infección hasta que se genera la
respuesta inmune específica. Las respuestas inmunes específicas son humorales (producción de
anticuerpos) o mediadas por células. En algunas instancias la infección viral provoca inmunopatologías
características o inducen inmunosupresión.
Respuesta inmune humoral
La respuesta inmune humoral involucra la producción de anticuerpos contra antígenos virales específicos.
Estos anticuerpos son producidos por células plasmáticas, que se derivan de linfocitos B. La estimulación
de la producción de anticuerpos es el mecanismo primario involucrado en la recuperación de infecciones
virales, en particular de infecciones virales citolíticas acompañadas de viremia, y de infecciones virales de
superficies epiteliales. Los anticuerpos producidos pueden ser, respecto al virus, neutralizantes o no
neutralizantes, dependiendo de su interacción con los viriones y sus efectos sobre el ciclo de replicación.
En la mayoría de las instancias, la producción de anticuerpos es el resultado de infecciones virales. Esto
es inmunidad activa. De manera alternativa, a un individuo puede administrársele anticuerpos
preformados de un individuo recuperado. Este es un ejemplo de inmunidad pasiva. Estos anticuerpos
preformados pueden ser administrados a individuos que pudieron haberse expuesto a un virus en
particular, como el virus de la rabia.
• Anticuerpos neutralizantes. Estos son los anticuerpos que inhiben la habilidad del virus para invadir a las
células y replicarse. Interfieren con el anclaje viral, su penetración y/o su descapsidación. Además son
capaces de dañar la envoltura viral con la ayuda del complemento (vía clásica). Los anticuerpos
neutralizantes son más eficaces en el momento de la infección o durante la viremia.
• Anticuerpos no-neutralizantes. Estos son anticuerpos que no tienen actividad neutralizante directa, pero
pueden colaborar a controlar la infección por otros medios, como mejorar la degradación viral.
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Adicionalmente funcionan como opsoninas para incrementar la fagocitosis de los viriones. Los
anticuerpos antivirales unidos a las proteínas virales en la superficie de las células infectadas
pueden también disparar la cascada del complemento y conducir a la destrucción celular mediada por
complemento.
Respuesta inmune mediada por células
La inmunidad mediada por células (CMI por sus siglas en inglés) involucra la acción de los linfocitos T
citotóxicos, la citotoxicidad dependiente de anticuerpos mediada por células (ADCC), la acción de las
células asesinas naturales y los macrófagos activados. La CMI es el mecanismo de defensa más
importante en las infecciones no citolíticas en las que la membrana de la célula infectada es alterada por
el virus.
• Linfocitos T citotóxicos. Estos son células T específicas que reconocen a los antígenos virales asociados
con las moléculas del CMH clase I en la superficie de la mayoría de las células. Estos linfocitos T tienen
un antígeno de superficie llamado CD8. La interacción entre la célula infectada y la célula T citotóxica
provoca la liberación de perforinas por parte de la célula T citotóxica, lo que crea poros en la membrana
de la célula infectada. La célula T citotóxica también libera granzimas, (nota de la traductora: un grupo de
proteasas de serina). La acción combinada de las perforinas y granzimas provocan la lisis celular. De
manera adicional, las células T citotóxicas activan las proteínas Fas, que estimulan la apoptosis en la
célula infectada por el virus.
• Citotoxicidad dependiente de anticuerpos mediada por células. La ADCC se refiere a una respuesta
inmune en la que las células infectadas por el virus, cubiertas por anticuerpos son usadas como blanco
para ser atacadas por células inmunes como macrófagos y células asesinas naturales.
• Linfocitos T ayudadores o cooperadores. Estos linfocitos T tienen un antígeno de superficie llamado
CD4. Son capaces de reconocer antígenos proteicos asociados con antígenos del CMH clase II, que se
encuentran sólo en unos pocos tipos celulares como macrófagos, linfocitos B y células dendríticas.
Linfocitos T ayudadores o cooperadores conciertan la respuesta inmune contra el antígeno ya sea por
secreción de citocinas que estimulan la producción de anticuerpos por linfocitos B específicos, o por
estimulación de la producción de células específicas para una respuesta inmune celular.
Efectos inmunológicos de la infección viral
Estos son el resultado de las interacciones entre el sistema inmune del hospedero y la replicación viral.
Inmunopatología inducida por virus
La inmunopatología inducida por virus es el daño al tejido, resultante de la respuesta inmune a un virus.
Esta inmunopatología puede ser el resultado de diversas interacciones inmunológicas, tales como
complejos antígeno-anticuerpo y daño tisular debido a células T citotóxicas, anticuerpos o complemento.
El tipo y localización de la inmunopatología puede ser característico de una infección viral en particular.
Algunos ejemplos de inmunopatologías inducidas por virus son:
• Uveitis anterior. Los complejos antígeno-anticuerpo se depositan en el ojo, estimulan la inflamación
local, y provocan uveitis anterior. Adicionalmente, los complejos inmunes que quedan en la circulación se
depositan en el riñón, provocando la inmunopatología de nefritis glomerular. Esto se observa
frecuentemente durante el periodo de recuperación de las hepatitis infecciosas caninas.
• Coriomeningitis linfocítica. Infección de ratones causada por un arenavirus. Tiene como consecuencia
daño en el SNC, resultado de la destrucción de las células infectadas por los linfocitos T citotóxicos. La
encefalitis del perro viejo (virus del moquillo canino, un paramixovirus) es similar ya que la
inmunopatología es también el resultado de una respuesta inmune celular a la infección viral persistente.
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• Hepatitis de la marmota y hepatitis B del pato. Se piensa que la mayor parte del daño hepático asociado
a estas infecciones es causado por la acción continua de los linfocitos T CD8+ al destruir hepatocitos
infectados, más que por la acción del virus por sí mismo.
Inmunosupresión inducida por el virus
Como resultado de su replicación, algunos virus suprimen la respuesta del sistema inmune del hospedero,
y al hacerlo son capaces de establecer la infección. La inmunosupresión causada por virus ocurre en
infecciones citolíticas y no citolíticas. Frecuentemente se observa como consecuencia de las infecciones
virales que involucran infección de los linfocitos, tal como sucede con el virus humano de
inmunodeficiencia adquirida (VHI) y el virus felino de inmunodeficiencia.
Evasión del sistema inmune
Algunos virus, por su método de replicación, son capaces de evadir la acción del sistema inmune del
hospedero. Hay varias maneras en que esto puede llevarse a cabo durante la replicación viral. Algunos
ejemplos incluyen infección de sitios inmunológicamente privilegiados, variabilidad antigénica de los
viriones, inhibición del INF-β, disminución de la expresión del CMH clase I, inhibición del
procesamiento de péptidos, y expresión de estructuras homólogas al sistema inmune. Los sitios
inmunológicamente privilegiados son aquellas partes del cuerpo que no tienen contacto directo con la
circulación y por esto son normalmente segregados del sistema inmune. Estos sitios incluyen el cerebro,
los testículos y la próstata, la retina ocular y los abazones del hámster. La producción por virus de
estructuras análogas al sistema inmune incluye:
• Cytomegalovirus producen glicoproteínas que son análogas a los receptores de IgG-Fc.
• El virus del fibroma de Shope produce un análogo al receptor de TNF (factor de necrosis tumoral por
sus siglas en inglés).
• Virus Epstein-Barr produce un análogo de la interleucina (IL)-10.
El fenómeno de latencia (herpesvirus, retrovirus) es otro mecanismo para evadir al
sistema inmune. Los adenovirus producen segmentos cortos de ARN que bloquean la activación de los
interferones.
Prevención de las enfermedades virales, vacunas y fármacos antivirales
Prevención de la infección
La única forma certera de prevenir la infección viral es previniendo la exposición. Esto se realiza en la
práctica permitiendo la mezcla solamente de animales sin evidencia de exposición previa. Esta restricción
al contacto se refiere con frecuencia a los "hatos cerrados". Para mantener efectivamente este estado de
cerrado, todos los animales de reemplazo y de exhibición deben ser aislados del resto de animales por al
menos 2 – 3 semanas. Durante este tiempo, los animales son monitoreados con el fin de observar signos
clínicos y realizando pruebas serológicas (o virológicas) para poner en evidencia la exposición. El
prevenir la exposición mediante la restricción al contacto es bastante eficaz en áreas en donde un virus en
particular es relativamente desconocido, pero es poco práctico en áreas en donde estos virus son
endémicos. En tales casos, los esfuerzos están dirigidos desde prevenir la "infección" hasta prevenir la
enfermedad.
Control de la infección y la enfermedad
Para controlar las infecciones virales y la enfermedad, son fundamentales las buenas prácticas de manejo.
Los factores de estrés juegan un papel importante en la predisposición del animal a la infección y la
diseminación de la enfermedad. Son particularmente importantes la asociación del estrés con la mala
nutrición, la sobrepoblación y el alojamiento con ventilación inapropiada.
Las prácticas de manejo deben incluir medidas preventivas para proteger al feto y al recién nacido.
Algunos virus que producen una infección moderada o inaparente en animales adultos, pueden ser causa
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de abortos o afecciones serias en neonatos (por ejemplo el parvovirus porcino). Por lo tanto, los esfuerzos
deben encaminarse a restringir el contacto de animales preñados y recién nacidos con otros animales.
Igualmente es importante asegurar que el recién nacido reciba calostro, el cual contiene anticuerpos que
confieren protección durante las primeras semanas de vida. Otro aspecto de buen manejo, es la necesidad
de minimizar el contacto entre diferentes especies de animales, ya que algunos virus producen infecciones
inaparentes en una especie pero enfermedad severa en otras. Un ejemplo es el virus de la pseudorrabia, el
cual produce infección subclínica en cerdos viejos pero comúnmente es fatal en lechones, ovejas, perros y
gatos. Es esencial la limpieza y desinfección, el empleo de overoles limpios y lava-patas para prevenir la
diseminación de los virus por los fomites. Estos aspectos de manejo deben practicarse todo el tiempo,
esencialmente durante los brotes de la enfermedad. Cuando se presenta un brote, todos los animales deben
ser puestos en cuarentena (aislados y observados) y si está indicado tratarlos sintomáticamente. Por
ejemplo:
• Recibir el apoyo terapéutico necesario, como líquidos de reemplazo en casos de diarrea severa.
• La solución acuosa de clorato de sodio es eficaz para desinfectar.
• Puede ser aconsejable el tratamiento con antibióticos para prevenir infecciones bacterianas secundarias.
Vacunas
En algunas instancias, la prevención de la enfermedad puede lograrse mediante la vacunación. Mientras
que la vacunación no necesariamente previene la infección, la "preparación" previa del sistema inmune
del huésped permite una rápida respuesta y desalojo del virus antes de que se presente la enfermedad o
una enfermedad ligera de corta duración. En efecto, la vacunación es la forma más eficaz y barata dentro
de las medidas de prevención de enfermedades en la salud animal.
Existen dos tipos principales de vacunas que son utilizadas corrientemente en la práctica veterinaria,
aquellas que se hacen con virus muerto (inactivado) y aquellas preparadas con virus vivo modificado.
Las vacunas con virus muerto consisten de virus, generalmente cultivados en cultivos de tejidos o en
huevos embrionados, que han sido químicamente inactivados, con frecuencia con formalina o betapropiolactona. Frecuentemente, estas vacunas contienen adyuvantes que las hacen más inmunogénicas.
Las vacunas con virus muerto por lo general requieren más de una dosis para inducir la inmunidad y la
dosis periódica de refuerzo para el mantenimiento adecuado de inmunidad.
Las vacunas inactivadas inducen a menudo una inmunidad menos protectora y de menor duración que la
inducida por vacunas a virus vivo modificado. Las ventajas de las vacunas con virus muerto son: No se
revierten a virulentas y son seguras al aplicarlas en animales preñados e inmunosuprimidos.
Las vacunas a virus vivo modificado poseen virus que han sido hechos menos virulentos por distintos
métodos. Esto se efectúa por el cultivo seriado del virus en cultivos de células, en huevos embrionados o
animales de laboratorio. Los virus también pueden ser atenuados al suprimir genes específicos
responsables de la virulencia. Esta manipulación genética se empleo en la preparación de la vacuna
pseudorrabica disponible comercialmente. Las vacunas atenuadas generalmente confieren una inmunidad
de por vida, puesto que la replicación del virus vacunal imita la infección natural. Una vacuna viva
atenuada suficientemente no debería causar la enfermedad en animales sanos vacunados; sin embargo,
puede producir la enfermedad en animales inmunocomprometidos y en fetos. Algunas vacunas a virus
vivo modificado pueden administrarse por vía oral, nasal o genital (prepucial o vaginal), en donde estas
estimulan una respuesta local de anticuerpos de secreción (IgA). La principal desventaja de las vacunas
vivas modificadas es que algunas producen una enfermedad leve, infecciones letales del feto y la
posibilidad de que el virus atenuado pueda recuperar su virulencia. El virus de las vacunas a virus vivo
puede transmitirse por contacto entre los animales.
Varias nuevas vías se están explorando en un esfuerzo por hacer vacunas más seguras y más eficaces. A
continuación, algunas de estas vías:
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La vacuna de subunidad es un tipo de vacuna inactivada que contiene las porciones del virus necesarias
para inducir la inmunidad (proteínas, fragmentos).
Los péptidos sintéticos son producidos por síntesis química de pequeñas porciones de proteínas virales
(péptidos) y se emplean como vacunas de subunidades refinadas.
Las vacunas recombinantes son de tres clases:
Proteínas recombinantes: El gen para el antígeno viral blanco es clonado y el cDNA introducido en una
bacteria o levadura por medio de un plasmido, en donde cualquiera de los dos producen grandes
cantidades de antígeno. Este antígeno se emplea como vacuna.
Vectores virales: El gen o genes de varios virus (generalmente virus de la viruela, herpesvirus o
A denovirus) son eliminados y reemplazados con un gen (o genes) que codifica el antígeno (o antígenos)
deseado; estos últimos son introducidos en el animal y seexpresan como células infectadas. Los virus que
llevan los genes del antígeno deseado son llamado vector.
Vacunas de gen eliminado: El virus virulento se hace menos virulento mediante la eliminación del gen o
el reemplazo de regiones clave de genes con otro material genético.
Algunas vacunas recombinantes están siendo usadas, incluyendo la de la proteína de la hepatitis B
humana expresada en levaduras; la proteína del virus de la rabia expresada en virus vacunal; las proteínas
F y HA del virus del moquillo canino insertado en el genoma del virus de Viruela del canario.
Vacunas anti-idiotipo: los anticuerpos anti-idiotipo se elaboran en un proceso de dos pasos. Primero se
introduce el antígeno a un organismo que posee una respuesta inmune. Estos anticuerpos se emplean para
inmunizar un segundo individuo, al cual se produce una respuesta inmune. Algunos de estos anticuerpos
tienen características antigénicas del antígeno original y son llamados anticuerpos anti-idiotipo. Estas
vacunas anti-idiotipo solo han sido empleadas experimentalmente.
Vacunas de ADN: en este acercamiento, el gene(s) viral(es) del antígeno de la proteína es introducido en
el sujeto vía un plasmido, estimulando la producción de un anticuerpo viral específico, protector. Hasta el
momento este tipo de vacuna se ha utilizado sobre todo de manera experimental. En un esfuerzo por
encontrar una vacuna eficaz para prevenir una pandemia potencial de gripe, se está investigando la
posibilidad de usar vacunas de ADN. Su eficacia en los seres humanos para generar una
inmunorrespuesta apropiada tiene todavía que ser establecida. Sin embargo, una vacuna de ADN ha sido
aceptada en los EE.UU. para la prevención de la infección del virus del Nilo Occidental en caballos.
Vacunas con marcador: Estas vacunas únicas carecen de un péptido característico o poseen un péptido
nuevo que no está presente en la cepa tipo del virus de campo. De esta forma el péptido faltante o nuevo
sirve como marcador para la cepa vacunal de un virus en particular. Estos permiten las pruebas
diagnosticas para diferenciar entre animales vacunados y portadores o infectados. Las pruebas
diagnosticas serológicas detectan anticuerpos para la cepa viral de campo pero no para la vacuna del virus
alterado. Los métodos empleados para crear una vacuna con marcador son la eliminación del gen
(eliminación de un péptido) o la creación de una vacuna subunidad (péptido nuevo). Las vacunas con
marcador están disponibles comercialmente e incluyen la pseudorrabia (vacuna de eliminación) y el
herpes virus-1 bovino (vacuna de eliminación), y otras vacunas están siendo desarrolladas actualmente
para otras enfermedades.
Vacunación en el huevo
Esta forma de vacunación es practicada para prevenir la enfermedad de Marek. Los huevos embrionados
son inoculados con un dispositivo automático a los 18 días de incubación. El proceso, el cual es seguro y
efectivo, se emplea para vacunar contra la bronquitis infecciosa y la enfermedad infecciosa de la bolsa.
Generalmente, vacunas eficaces están disponibles para aquellos virus que tienen uno o pocos tipos
antigénicos estable y que pueden obtenerse en cantidad suficiente para la preparación de la vacuna.
Interesantemente, es a causa de esta inestabilidad antigénica que la composición de la vacuna contra la
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influenza humana tiene que ser cambiada regularmente (anualmente), de acuerdo con la cepa actual
circulante entre la población.
Inmunización pasiva
La inmunización pasiva se refiere a la transferencia de inmunoglobulinas a individuos no inmunes. Las
inmunoglobulinas presentes en sueros inmunes contienen anticuerpos neutralizantes que previenen la
unión de virus específicos a las células susceptibles. La inmunidad pasiva natural incluye la recepción de
anticuerpos maternos por vía placentaria (IgG), calostro (IgG) o el amnios de la yema del huevo (Igy). La
recepción de niveles inadecuados de anticuerpos maternos puede producir unas altas tasas de morbilidad
y mortalidad en muchas de las enfermedades virales en animales jóvenes. En la práctica clínica, las
inmunoglobulinas son generalmente suministradas antes de la exposición o durante el período de
incubación para modificar la infección. Los antisueros (producidos en animales donadores), protegen por
un período corto de tiempo y tienen un uso muy limitado en la prevención de enfermedades virales. Los
antisueros han sido empleados para prevenir el moquillo canino, la panleucopenia felina y la infección
con el virus del Este del Nilo en equinos. En algunos rebaños de equinos y bovinos, el almacenamiento de
calostro con su posterior administración a neonatos se emplea para incrementar su inmunidad.
Inmunidad del rebaño
Este fenómeno ocurre cuando una proporción suficientemente grande del hato ha sido inmunizada y por
lo tanto es inmune a un virus en particular. Un individuo que pueda eventualmente carecer de inmunidad
al mismo virus está protegido, ya que el resto del rebaño es incapaz de trasmitir el virus. Para que sea
eficaz, la vacuna en cuestión debe prevenir la enfermedad causada por el virus y su transmisión. Un
efecto similar se observa con la enfermedad natural, si la mayoría de la población se ha recuperado de
una enfermedad y posee una inmunidad prologada, entonces algunos de los individuos no infectados
pueden ser protegidos por la inmunidad del rebaño mientras que no existan animales reservorios en el
rebaño.
Fármacos antivirales
Los fármacos antivirales han tenido un uso muy limitado en veterinaria. Parece ser que algunos de estos
fármacos son eficaces contra virus animales que están estrechamente relacionados con los virus humanos,
contra los cuales han mostrado cierta eficacia. Estos fármacos pueden ser separados en dos grandes
categorías con base en su mecanismo de acción. Estos son los análogos de nuclseosidos y los análogos no
nucleósidos discutidos más abajo. En 2006, el CDC (Centre for Disease Control, EUA) informó que una
cepa humana de influenza tipo A ha desarrollado resistencia a dos fármacos antivirales usados
comúnmente, rimantidina y amantadina. La cepa gripal H3N2, predominante en la época de gripas,
tratada anteriormente con estos fármacos antivirales, ha desarrollado resistencia. Esta información apoya
la necesidad para el desarrollo de fármacos antivirales adicionales y para la posibilidad del uso de
mezclas de fármacos antivirales para el tratamiento de la influenza.
Inhibidores de nucleósidos
Muchos de los fármacos antivirales disponibles comercialmente son análogos de nucleósidos, los cuales
afectan el ácido nucleico de las polimerasas virales. Los más comunes de estos son: acicloguanosina
(acyclovir), dihidroxipropoxi-metilcuanina (ganciclovir), adenina-arabinosida (vidarabine) y
azidotimidina (zidoyudine). Los fármacos antivirales no son ampliamente utilizados en medicina
veterinaria. El aciclovir es eficaz contra el virus herpes y se ha empleado para tratar infecciones por
herpesvirus ocular en gatos. Este fármaco también se ha empleado para tratar profilácticamente a pájaros
psitacinos caros que han sido expuestos al herpesvirus psitacino.
Inhibidores no nucleósidos
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Los interferones y los fármacos antivirales se emplean en el tratamiento específico de enfermedades
virales. Tienen importancia en la terapia viral ya que aparecen en forma temprana en la infección y
juegan un papel mayor en la recuperación. Actúan inhibiendo la síntesis de proteína viral.
El tratamiento de animales con interferones exógenos no se practica ampliamente debido a la poca
disponibilidad de interferones de especies hospederas. Mientras que los interferones no necesariamente
son específicos de una especie hospedera, su acción depende de su capacidad de ligarse a receptores
específicos en la superficie celular. El interferón-α humano, comercialmente disponible como ADN
recombinante, tiene alguna actividad cruzada entre especies y ha sido empleada para tratar oralmente a
gatos infectados con el virus de la leucemia felina.
• Además de los interferones, otros fármacos que inhiben la traducción de mARN viral, son el fomiversin
y la metisazona. El fomiversin (Vitranene) es un ADN antisense que bloquea la replicación del
citomegalovirus. La metizasona (Nmetilsatin- β-tiosemicarbazona) es específicado para el mARN del
virus de la viruela.
• La amantadina (Symmetrel) y la rimantidina (Flumadina) interfieren con la penetración y/o
descubrimiento de muchos virus envueltos, pero es eficaz solo contra las infecciones de influenza A en
humanos. Estos antivirales no se emplean comúnmente en los EUA.
• El saquinavir (Invitasa), indinavir (Crixivan), ritonavir (Norvir) y nelfinavir (Viracept) son inhibidores
de proteasas virales. Actúan uniéndose al sitio activo de la proteasa, impidiendo a la enzima el fragmentar
otras proteínas. Estos fármacos se emplean a menudo en los cócteles para tratar la infección con el VIH
en humanos.
• El zanamivir (Relenza) y oseltamivir (Tamiflu) inhiben la liberación del virus de la célula hospedera.
Son específicos para la neuraminidasa del virus de la influenza, previene la liberación y por lo tanto limita
la diseminación del virus.
Glosario
Adyuvantes: Substancias o formulas químicas empleadas para aumentar la respuesta inmune en respuesta
a vacunas inactivadas. Estas actúan reteniendo el inmunógeno en el sitio de la inyección, como en un
efecto de depósito y así retardar su liberación; la estimulación antigénica es prolongada por consiguiente
aumentada. Algunos adyuvantes pueden estimular igualmente a los macrófagos, linfocitos y otras células
involucradas en la respuesta inmune. Las sales metálicas, tales como el aluminio, emulsiones aceitosas
(adyuvantes de Freund) y vesículas lipídicas sintéticas (liposomas), son algunos de los adyuvantes
empleados.
Neuraminidasa: Es una glicoproteína que se presenta como una punta sobre el exterior de la
envoltura del virus de la influenza. La neuraminidasa separa en sus componentes a un inhibidor de la
proteína de hemaglutinina del virus de la influenza.
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Procedimientos diagnósticos en las infecciones virales
Procedimientos diagnósticos
Los procedimientos básicos para el diagnóstico de laboratorio de virus, son el aislamiento del virus, la
demostración del virus o algún producto viral en las muestras clínicas (método directo), y la detección y
medición de los anticuerpos específicos contra un virus (método indirecto). Cada procedimiento tiene sus
méritos, pero la demostración directa del virus y/o de los productos virales es el método más eficaz y útil
en el diagnóstico de rutina.
Procedimientos de demostración
Los métodos directos incluyen la visualización de los viriones al microscopio electrónico, detectando el
genoma viral empleando sondas de referencia de ADN y detectando antígenos virales por
inmunofluorescencia. Este último método ha sido el más útil en el diagnóstico por laboratorio.
Métodos de serología general
Durante los estados tardíos de la enfermedad, la prueba del suero de los animales infectados, en busca de
anticuerpos para virus específicos puede ser el único medio de diagnóstico. Esto puede lograrse mediante
varias pruebas serológicas. Las pruebas serológicas más comúnmente empleadas en los laboratorios de
diagnóstico veterinario para el diagnóstico de infecciones virales son: prueba de seroneutralización(SN);
prueba de inhibición de la hemoaglutinación (IH); prueba de la inmunodifusión en gel de agar (AGID
por sus siglas en ingles) y prueba de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Estas
pruebas se basan en el hecho de que la actividad viral puede ser inhibida y/o las proteínas virales se ligan
a un anticuerpo específico. Se prueban las diluciones del suero y se comunican los resultados como el
reciproco de la dilución mas elevada en la cual se observa actividad antiviral. De manera ideal, se
compararían los resultados del suero colectado durante la fase aguda de la enfermedad con los resultados
del suero colectado durante la convalecencia (dos colecciones de suero 14 - 21 días aparte). El
diagnóstico se confirma si se observa un incremento cuatro veces mayor de los títulos de anticuerpos
entre estos dos pares de muestras. Los resultados de una sola muestra de suero (no pareada) son más
difíciles de interpretar. Para los virus que causan una infección aguda y se limitan así mismos, los
resultados positivos solamente indican que el animal ha estado expuesto, ya sea naturalmente o a través
de una vacunación. La interpretación se hace más fácil al muestrear un porcentaje de aquellos animales
que estuvieron enfermos versus aquellos que no lo estuvieron, pues los títulos más altos generalmente
indican una infección reciente. Para los virus que causan una infección persistente o latente (ejemplo los
herpesvirus o retrovirus), una serología positiva indica que el animal es un portador potencial del virus.
Los resultados positivos de pruebas reguladoras son siempre significativos sin importar el título de
anticuerpo. Por ésta razón, se han desarrollado otras pruebas serológicas más estandarizadas y en forma
de estuche de muestreo (kit). Por ejemplo la prueba de inmunodifusión en gel de agar (AGID), conocida
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también como prueba de Coggins, para la anemia equina infecciosa y la prueba de ELISA y aglutinación
de látex (LA) para seudorrabia. Los resultados de estas pruebas son comunicados como positivos o
negativos. A continuación una discusión sobre los diferentes procesos de diagnósticoempleados.
Aislamiento del virus
Empleo: aislamiento e identificación del virus. Durante la fase aguda de la enfermedad es el mejor
momento para demostrar y aislar virus. A medida que la enfermedad avanza, se desarrollan los
anticuerpos, se reduce la excreción de virus y el virus es despejado de los tejidos. Las manifestaciones
clínicas de la enfermedad generalmente encausan la selección de la muestra clínica apropiada, tales como
hisopos nasales y oculares en las infecciones de las vías respiratorias altas, heces de infecciones entéricas,
sangre de infecciones sistémicas, etc.
Los virus requieren de células vivas para poderse replicar. En el laboratorio, se proporcionan células vivas
como cultivos celulares, cuyas células han sido obtenidas por digestión enzimática de tejidos animales.
Las células son cultivadas en superficies de vidrio o plástico. Cuando las muestras clínicas que contienen
virus son inoculadas en cultivos celulares susceptibles, el virus (si está viable) se replica y a menudo
produce un comportamiento característico de patología celular, caracterizado por cambios en la apariencia
celular, llamado efecto citopático (CPE por sus siglas en ingles). En algunos casos, el virus se replica sin
ningún efecto apreciable sobre las células y debe ser demostrado mediante pruebas de tinciones especiales
que revelan cuerpos de inclusión viral o anticuerpos fluorescentes (AF), para detectar antígenos virales.
El tiempo requerido para el aislamiento del virus fluctúa entre menos de 24 horas y hasta varias semanas.
Anticuerpo fluorescente
Empleo: Para detectar antígeno viral en materiales clínicos o en cultivos celulares infectados.
La prueba de anticuerpos fluorescentes (AF) detecta antígenos virales en células infectadas con
anticuerpos antivirales específicos que han sido marcados con un colorante fluorescente (isotiocianato de
fluoresceína). Las pruebas de AF se efectúan en secciones de tejidos congelados, frotis de sangre,
impresiones tisulares, raspados o en cultivos celulares. Los resultados están disponibles en menos de una
hora y son exactos a condición de que el anticuerpo sea específico y las muestras estén en condiciones
moderadamente buenas. Hay dos tipos básicos de técnicas de AF: directa (DFA) e indirecta (IFA). En la
prueba directa se marca el antígeno antiviral. Este antígeno marcado se emplea para detectar los antígenos
virales en secciones congeladas de tejidos, raspados, frotis sanguíneos, etc.
La técnica IFA es un procedimiento en dos pasos: La muestra a ser examinada se hace reaccionar con un
anticuerpo antiviral no marcado. Después de proporcionar un período de incubación suficiente para que
haya una interacción antígeno-anticuerpo (generalmente una hora o menos), se lava la muestra y se
incuba con un anticuerpo marcado dirigido contra IgG de la muestra en la cual se preparó el anticuerpo
antiviral no marcado. Este anti-anticuerpo marcado se anclará al anticuerpo no marcado anclado al virus,
y si esto ocurre, se observa la fluorescencia y la prueba se considera positiva. Ambas pruebas FA tienen
ventajas y desventajas. La técnica DFA se lleva a cabo más rápidamente y se emplea más a menudo
debido a la disponibilidad de los conjugados DFA. La técnica IFA, por otra parte, generalmente es más
sensible y específica (si se emplean anticuerpos monoclonales); se tarda más tiempo pero solo requiere un
anticuerpo marcado si todos los anticuerpos antivirales son preparados en una sola especie. La prueba de
inmunofluorescencia o anticuerpo fluorescente (FA) es la prueba más útil empleada rutinariamente en el
diagnóstico viral. Comercialmente está disponible un buen número de conjugados AF para la detección de
virus. Los conjugados que detectan virus en perros y gatos están disponibles comercialmente. Se emplea
un método indirecto llamado prueba de inmunofluorescencia para detectar y medir anticuerpos. Esto
involucra el infectar un cultivo de células con un virus y después preparar“puntos” en láminas de
microscopio con estas células infectadas. El suero puede entonces ser examinado para un anticuerpo
específico haciéndolo reaccionar con las células infectadas seguido de una reacción con el conjugado
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antiespecie IgG. Los "puntos" que fluorescen (resultantes de la unió anticuerpo sérico más conjugado
anti-especie IgG) indica que el suero es positivo para la presencia de anticuerpos específicos.
Inmunoperoxidasa
Empleo: para detectar antígeno viral en materiales clínicos y cultivos celulares.
La técnica de inmunoperoxidasa es similar en principio al proceso de anticuerpo fluorescente. La
diferencia está en que el anticuerpo es conjugado a una enzima (peroxidasa de rábano o fosfatasa
alcalina), más que a un compuesto fluorescente. Aunque la enzima está ligada al anticuerpo, esta
permanece activa y cuando se le suministra su substrato, reacciona y da una reacción en color. Esta
técnica tiene la ventaja sobre la AF de que no requiere de microscopio fluorescente y es específicamente
útil para localizar antígenos virales en lesiones histopatológicas.
Prueba de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)
Empleo: Para detectar antígeno o anticuerpo.
La sensibilidad de ELISA es comparable con el radioinmunoensayo (RIA), el cual es similar en principio
a la prueba de ELISA. Se emplea un sistema de fase sólida para la mayoría de las pruebas ELISA. Para la
detección de virus, primero se adsorbe un anticuerpo específico a la superficie de un tubo de poliestireno,
placa de microtítulo, etc. y se añade la muestra que contiene el virus sospechoso. Si el virus está presente,
este se une al anticuerpo adsorbido. Después de lavado, se adiciona un anticuerpo antiviral específico
marcado con una enzima (generalmente fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano). El anticuerpo marcado
reacciona con el complejo, creando un "efecto Sándwich". Luego del lavado, se adiciona el substrato para
la enzima, produciéndose una reacción de coloración. Algunas pruebas se interpretan visualmente, pero se
obtiene una mayor sensibilidad mediante el análisis espectrofotométrico.
Un proceso indirecto de ELISA es empleado para la detección de anticuerpos. El antígeno es primero
adsorbido a una fase sólida, seguido por la adición del suero a analizar. Después del lavado, se adiciona
una anti-gamaglobulina marcada con una enzima, seguida de la adición de substrato enzimático. Las
variaciones de la prueba corriente de ELISA incluye la competitividad de ELISA para detectar el
anticuerpo, en el cual la anti-gamaglobulina marcada con una enzima es reemplazada con un
anticuerpo antiviral marcado con una enzima. El desarrollo de la coloración posterior después de la
adición del substrato enzimático es inversamente proporcional al nivel de anticuerpo presente en la
muestra analizada. En otras palabras, si el anticuerpo específico ha sido ligado, el anticuerpo marcado con
una enzima no se ligará. Así, las pruebas positivas son aquellas que no presentan una reacción de color o
una reacción menor que aquella de los controles apropiados. Otra variación es la cinética por ELISA,
la cual se emplea para detectar anticuerpos contra la borreliosis canina (enfermedad de Lyme), virus de la
leucemia felina, peritonitis infecciosa felina, toxoplasmosis felina y herpes virus bovino 1. En la cinética
por ELISA, la reacción se monitorea continuamente durante cierto período de tiempo, en lugar de pararla
después de un tiempo predeterminado.
La prueba de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y los sistemas de aglutinación de látex
(LA) detectan antígenos virales mediante la "captura" de los mismos con anticuerpos específicos
adsorbidos a un substrato apropiado. Estas técnicas proporcionan un diagnóstico rápido y están a menudo
disponibles para su uso en "la oficina". Los estuches disponibles comercialmente incluyen los estuches de
ELISA y LA para detectar rotavirus en heces de una gran variedad de especies animales, y estuches de
ELISA rápidos para detectar parvovirus canino en las heces yantígeno de la leucemia viral felina en
sangre.
Aglutinación de látex (LA)
Empleo: Para detectar antígeno o anticuerpo.
Las pruebas de LA son similares en principio a la aglutinación bacterial ya que las partículas de látex
cubiertas con anticuerpo, se aglutinarán cuando se mezclen con el antígeno correspondiente y así lo
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identificarán. A la inversa, las partículas de látex pueden ser cubiertas con antígenos y emplearlas para
detectar anticuerpos. Estas pruebas son fáciles de efectuar y producen resultados en pocos minutos. Los
estuches comerciales empleados "en la oficina" están disponibles para detectar anticuerpos de algunas
enfermedades y para detectar algunos virus.
Microscopio electrónico (ME)
Empleo: Para demostrar virus en muestras clínicas.
En la técnica de microscopia electrónica con tinción negativa, las muestras clínicas lisadas con agua
destilada, se "tiñen" con una solución de átomos pesados. Esta técnica se emplea principalmente para el
examen de aquellas muestras clínicas en las que se espera contengan un gran número de partículas virales,
tales como heces (coronavirus, rotavirus y parvovirus) y lesiones vesiculares y similares a la viruela
(herpesvirus y virus de la viruela). La preparación de la muestra y el examen ME generalmente puede
completarse en 30 minutos.
Microscopio inmunoelectrónico
Empleo: Demostración e identificación de virus.
La técnica de tinción negativa del microscopio electrónico mencionada anteriormente para la
demostración de virus, es también útil para la identificación. El virus se hace reaccionar con el suero
inmune, produciendo una agrupación que puede ser vista cuando se observa bajo el microscopio
electrónico.
Neutralización del virus (NV)
Empleo: para detectar y medir anticuerpos.
La neutralización del virus es el método más ampliamente empleado para detectar y medir anticuerpos
virales de importancia en veterinaria. Esta prueba es considerada como la más exacta de todos los
procesos serológicos, siendo menos propensa a variaciones y menos subjetiva en su interpretación. El
principio de ésta prueba se basa en el hecho de que la replicación y actividad del virus, ya sea el efecto
citopático (EC) en el cultivo celular, signos clínicos, lesiones o muerte en huevos embrionados y en
animales, que pueden ser inhibidos por un anticuerpo viral específico. Las pruebas De NV son casi
siempre desarrolladas empleando cultivos celulares. La cepa de virus para utilizar en las pruebas se
cultiva, se alícuota y se almacena a temperaturas ultra-bajas. Estos virus son dosificados varias veces para
determinar la cantidad de virus presente. Las diluciones del suero de prueba se hacen en placas
microtituladoras, seguido de la adición de un volumen igual de una suspensión viral diluida para contener
aproximadamente 100 a 300 dosis infectantes (una dosis infectante es el número mínimo de partículas
virales necesarias para establecer una infección). Después de incubar el suero + virus durante 1 - 2 horas a
temperatura ambiente (algunos sistemas utilizan 37°C o aún 4°C), se adicionan indicadores de cultivos
celulares. Las placas se sellan, se incuban a 37°C, y se observan diariamente para ver el desarrollo del
efecto citopático viral. La presencia de anticuerpo específico en el suero a analizar inhibe la producción
de este efecto citopático. La prueba de NV se emplea también para identificar un virus desconocido,
aislado de la misma manera descrita anteriormente. La única diferencia es que el anticuerpo es conocido y
el virus es desconocido. Si el anticuerpo específico inhibe el desarrollo de EC del virus desconocido, se
realiza la identificación.
Prueba de inhibición de la hemoaglutinación
Empleo: Para detectar y medir anticuerpos.
La prueba de inhibición de la hemoaglutinación (IH) es similar en principio a la prueba NV, excepto que
la actividad viral inhibida es la hemoaglutinación. Las pruebas IH son muy sensibles y altamente
específicas, y particularmente útiles para medir anticuerpos contra aquellos virus hemoaglutinantes que se
replican mal en cultivos celulares o producen poco o ningún efecto citopático. Los ejemplo s de tales
virus son el virus de la influenza Tipo A en la mayoría de las especies, el virus de Newcastle de las aves y
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el parvovirus porcino. Las pruebas IH se efectúan en placas microtituladoras. Se hacen las diluciones del
suero a analizar, seguido de la adición de un volumen igual de suspensión viral diluida que contenga
aproximadamente 4 a 8 unidades HA (una unidad HA es la dilución más alta de la muestra viral que
produce una hemoaglutinación completa). Se añade una suspensión apropiada de glóbulos rojos y las
placas se mezclan suavemente y se dejan en incubación por 1 - 2 horas a 4°C (para la mayoría de los
virus). Si esta presente el anticuerpo específico en el suero a analizar, se inhibirá la aglutinación de los
glóbulos rojos y estos se posarán en un "botón" bien definido. Las células aglutinadas, en contraste, se
posarán completamente en una capa delgada sobre todo el fondo del pozo de la placa o formarán un botón
de borde desigual e irregular. El suero a analizar contiene frecuentemente inhibidores no específicos de la
aglutinación y debe primero ser adsorbido con glóbulos rojos antes de hacer la prueba.
Prueba de fijación de complemento
Empleo: Detección y medición de anticuerpos.
Las pruebas de fijación de complemento (FC) son más útiles como ayuda en el diagnóstico de una
infección viral aguda o reciente, porque estas detectan primero IgM, la primera clase de
inmunoglobulinas en responder a la infección. La prueba impone el empleo de antígenos virales,
complemento de cobayo y un sistema indicador de CRS de oveja sensibilizadas. Al reaccionar
directamente al anticuerpo dirigido contra los antígenos virales, sensibiliza los CRS de oveja. Este
anticuerpo anti- CRS de oveja se refiere como hemolisina y se prepara en conejos. El antígeno y el
complemento son dosificados y diluidos. Si no hay presencia de anticuerpos específicos en el suero
problema, el complemento queda libre para reaccionar con los CRS sensibilizados produciendo lisis. Si
están presentes suficientes anticuerpos, el complejo antígeno-anticuerpo específico habrá fijado al
complemento y no se presentará lisis de los CRS.
Inmunodifusión
Empleo: Para detectar anticuerpos y antígenos específicos.
Las dos técnicas más empleadas de inmunodifusión son el sistema de placa de dobledifusión y la
imunoelectroforesis. Ambas pruebas se realizan en medio semisólido generalmente agar o agarosa. La
diferencia esencial entre estos métodos es que en la imunoelectroforesis el antígeno es previamente
fraccionado electroforéticamente antes de ser cubierto por el anticuerpo. En ambos métodos, el antígeno y
el anticuerpo se funden uno contra otro formando una línea de precipitación en donde ellos reaccionan.
El sistema de placa de doble-difusión es la prueba de diagnostico más comúnmente empleada. El ejemplo
más conocido es la "Prueba de Coggins" para la anemia equinainfecciosa.
La prueba de inmunodifusión se puede hacer más sensible empleando un marcador radioactivo, el cual
permitirá la detección de reacciones antígeno-anticuerpo no visibles al ojo humano. El marcador
radioactivo generalmente es el yodo (125I),tanto el antígeno el anticuerpo pueden ser marcados. El marcaje
ocurre por el acoplamiento de 125I al aminoácido tirosina. Las pruebas se leen cubriendo las placas o
laminillas con una película de rayos x (radiografía) que registran las líneas radioactivas (precipitación).
Pruebas de protección
Empleo: identificación de virus.
Las pruebas de protección se emplean para la identificación de virus cuando no se dispone de otros
métodos menos engorrosos. Estas pruebas involucran la producción de una inmunidad activa o pasiva en
un animal o animales seguidos por desafíos por el agente en cuestión. Un ejemplo de la prueba de
protección empleada anteriormente, es para la identificación del virus del cólera porcino. La prueba se
llevo a cabo mediante la inyección de suero de anti-cólera porcino simultáneamente con sangre o
suspensión de bazo de animales sospechosos de tener cólera porcino. Si el agente era el virus del cólera
porcino, la inmunidad pasiva aportada por el suero anti-cólera porcino podría proteger al cerdo de la dosis
de desafío. El control, un cerdo no protegido, padecería el cólera porcino.
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Hibridación del ácido nucleico
Empleo: Para detectar secuencias de AADN o ARN viral en el ácido nucleico extraído de muestras
clínicas.
La hibridación del ácido nucleico consiste en lo siguiente:
• La doble cadena del ácido nucleico de un virus es desnaturalizado con un álcali par separar las cadenas.
• Las cadenas sencillas del ácido nucleico se unen a un soporte sólido, generalmente nylon o membrana
de nitrocelulosa, para prevenir que las cadenas se vuelvan a unir. El ácido nucleico se une a la membrana
por medio de su columna vertebral de azúcar-fosfato; de esta forma las bases de nitrógeno están
proyectadas hacia el exterior.
• Una sondas de referencia (molécula de ADN o ARN de cadena sencilla de origen conocido –
conteniendo la secuencia de nucleótidos específica del virus blanco – marcada con una enzima o átomo
radioactivo) es añadida a la membrana.
• Ocurre la formación de uniones de hidrógeno entre las bases complementarias. Las sondas de referencia
que no reaccionaron son removidas mediante lavado y se detecta la hibridación mediante un ensayo para
detectar a la sondas de referencia. Se emplean diferentes formas de ensayos de hibridación de fase sólida:
Hibridación de Southern. Es una técnica empleada para identificar la presencia de un fragmento
específico de ADN.
Hibridación de Northern. Se emplea para detectar secuencias específicas de RNA.
Hibridación de mancha (Dot Blot). Es un proceso similar al Southern y al Northern y puede emplearse
para detectar tanto AADN como ARN. La diferencia es que el ácido nucleico es colocado dentro de la
nitrocelulosa en un aparato que se enfoca sobre los puntos individuales en áreas de concentración,
parecido a las placas microtituladoras.
Hibridación in situ. El principio de estas técnicas es similar a la hibridación de Southern y de Northern
(detección de secuencias especificas de nucleótidos mediante una sondas de referencia marcada) excepto
en que más que la extracción del ácido nucleico y su transferencia a una membrana de nitrocelulosa, se
prueban las células intactas o secciones de tejido al microscopio. Esta técnica se emplea poco en el
diagnostico rutinario, sin embargo es muy valiosa en estudios de investigación y patogénesis.
Las técnicas de análisis de restricción enzimática, reacción en cadena de la polimerasa y análisis de datos
obtenidos de microarreglos de ADN, son particularmente útiles y se discutirán enseguida.
Análisis de restricción de enzimas
Empleo: identificación de virus específicos.
El análisis de restricción de enzimas utiliza las enzimas llamadas endonucleasas de restricción para
"perfilar" la secuencia del genoma de los virus. La presencia de mutaciones y/o variaciones genéticas en
los sitios potenciales de clivaje en algunas cepas virales, producen diferentes modelos de fragmentos
cuando son separados en un gel de agarosa. Este análisis es llamado polimorfismo en la longitud de los
fragmentos de restricción (RFLP) y se ha empleado para caracterizar y comparar entre muestras aisladas
en el campo de un virus dado. La técnica requiere gran cantidad de ADN viral purificado o parcialmente
purificado, un juego de enzimas restrictivas para clivar el ADN, la capacidad para separar los fragmentos
de ADN resultantes por electroforesis y un método para documentar los resultados.
El clivaje por restricción del genoma de virus con genomas grandes, tales como los citomegalovirus,
puede producir 20 a 50 bandas ADN, mientras que los virus con genomas más pequeños como los
adenovirus, generalmente producen solo cinco a diez bandas ADN. No hay una forma fácil, ni es por lo
general necesario, para correlacionar el modelo (bandas faltantes o extras) con mutaciones de
localizaciones específicas en el genoma sin un estudio amplio de hibridación molecular o aún de
secuencias del genoma que se está comparando. Una limitación distinta del método es que la presencia de
una mutación no puede ser detectada a menos que esa mutación se encuentre dentro de la secuencia de
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reconocimiento de la endonucleasa de restricción que se esta empleando la digestión del ADN. El empleo
de diferentes enzimas de restricción optimizar la probabilidad de detección mutaciones en un genoma en
particular o en una porción de genoma.
Reacción de cadena de la polimerasa
Empleo: identificación/ detección de virus específicos o secuencias especificas de un gen.
La reacción de cadena de la polimerasa (PCR) un método in vitro de replicación de ADN, es capaz de
amplificar segmentos de ADN por más de un millón de veces. Una sola copia del genoma viral se amplía
- si está presente en el material clínicoproduciendo millones de copias que pueden ser fácilmente
detectadas por electroforesis. Esto es logrado al crear una reacción mixta que, además de la muestra de
ADN (conteniendo potencialmente el genoma blanco), contiene dos sondas de referencia de
oligonucleótidos que complementan los extremos opuestos de cada cadena de la secuencia blanco,
deoxinucleosidos trifosfatos y una polimerasa termoestable de ADN (polimerasa Taq).
La mezcla de reacción está entonces sujeta a un ciclo de temperatura con el fin de facilitar la replicación
ADN y así aumentar la cantidad de ADN. Lo siguiente representa un ciclo típico:
• El primer paso del ciclo PCR es la desnaturalización de la muestra ADN mediante calentamiento de la
mezcla de reacción a 95°C.
• Segundo, la mezcla es enfriada para permitir que los fragmentos se unan al ADN blanco.
• Tercero, la mezcla es calentada a 72°C para permitir la polimerización del ADN por la polimerasa Taq
ADN. Se repite el ciclo de temperatura del PCR, típicamente 35 a 40 ciclos. De esta manera se pueden
obtener más de un millón de copias del ADN. Una vez completado el número de ciclos deseados, se
separa el ADN blanco por electroforesis en gel y se analiza midiendo las bandas ADN o mediante la
hibridación de Southern con sondas de referencia específicas.
En la actualidad se dispone comercialmente de cierto número de pruebas diagnosticas basadas en PCR.
La PCR es aplicable al estudio de virus ARN si se emplea primero la transcriptasa reversa para hacer un
cADN a partir del ARN blanco; denominado PCR transcriptasa reversa. Otras alternativas de PCR son la
PCR "en tiempo real", la cual analiza simultáneamente las muestras espectrofotometricamente para
visualizar la polimerización y la PCR anidada, la cual emplea un segundo equipo de sondas de referencia
dentro de la región amplificada por el primer grupo. Cualquier técnica es útil cuando los niveles de ácido
nucleico viral son bajos. La eficacia del PCR "en tiempo real" en diagnostico clínico todavía tiene que ser
establecido.
Radioinmunoanálisis
Empleo: Para detectar antígeno o anticuerpo.
En la actualidad, los sistemas de radioinmunoanálisis se utilizan rara vez en los laboratorios de
diagnostico veterinario. Hay dos sistemas básicos de radioinmunoanálisi (RIA), fase líquida y fase sólida.
En el sistema de fase líquida, los complejos antígeno-anticuerpo son precipitados por la subsiguiente
adición de anti-gammaglobulina. El precipitado se recolecta por centrifugación y secado. La cantidad de
radioactividad en el precipitado comparado con el total de radioactividad es una medida cuantitativa de la
reacción antígeno-anticuerpo. El marcaje se hace con 125 I (ver inmunodifusión) y cualquiera de los tres
componentes puede ser marcado.
En el sistema de fase sólida, se cubre el interior de un tubo de poliestireno con el anticuerpo y entonces
reacciona con el antígeno. Brevemente, la muestra se adiciona al tubo de poliestireno previamente
cubierto con un anticuerpo antiviral. Si el antígeno está presente, este se fijara al anticuerpo que cubre el
tubo. Después del lavado, se adiciona el anticuerpo antiviral marcado con 125 I, el cual reacciona con el
complejo produciendo un "efecto Sándwich". Se lava el tubo y se determina la cantidad de radioactividad.
Mientras que las técnicas mencionadas para la detección de antígeno se emplean como la primera
aproximación para el diagnostico viral, en muchos casos estas técnicas no son aplicables porque
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frecuentemente las muestras apropiadas de animales vivos no están disponibles. Además, los sistemas de
detección rápida del antígeno no están disponibles para muchas enfermedades virales. En estos casos, se
intenta el aislamiento del virus.
Análisis de datos obtenidos de microarreglos de ADN
Empleo: identificación de virus específicos o secuencias virales específicas.
El desarrollo de los microarreglos ha sido propulsado por la aplicación de la tecnología robótica de rutina
en la biología molecular, más que por cualquier descubrimiento fundamental. Las técnicas de hibridación
de Southern y de Northern para la detección de ADN específico y especies de mARN aporta la tecnología
básica para la hibridación de microarreglos.
La construcción de microarreglos implica el ver secuencias específicas de ADN sobre una lámina de
vidrio o contenedor de sílice con la ayuda de tecnología robótica. La lámina de vidrio puede contener más
de 50 000 genes. Las láminas son expuestas a una fuente de ADN marcado fluorescentemente. Un
computador monitorea la fluorescencia sobre la lámina, indicando en done el ADN marcado se ha unido a
la secuencia de ADN sobre la lámina.
Puesto que muchas de las secuencias ADN pueden presentarse sobre una lámina, es posible para el
análisis de microarreglos el muestrear múltiples patógenos simultáneamente. Esto es particularmente
importante para la determinación de armas biológicas y en el diagnostico de enfermedades. Se dispone
comercialmente de varias microarreglos, tales como el sistema de detección CapitalBio_ SARSarrayTM1.8 para identificar estados iniciales de infección con el virus de SARS .
Además de los microarreglos de ácidos nucleicos, también se esta llevando a cabo el análisis de
microarreglo de proteínas. En este caso, uno está buscando la presencia de una proteína en particular.
Colección y remisión de especímenes
El diagnostico de laboratorio de enfermedades clínicas depende en gran parte de la clase y condiciones de
las muestras remitidas. También depende de que el veterinario y laboratorio trabajen en estrecha
colaboración. Puesto que muchas de las pruebas de laboratorio son para agentes específicos de
enfermedad, todas las remisiones deben ir acompañadas de una historia clínica adecuada. Esto permitirá
al personal del laboratorio el hacer pruebas adicionales si es necesario.
Las guías generales para la colección y remisión de muestras se presentan abajo. La mayoría de los
laboratorios proporcionan un formulario de remisión de las muestras que puede ser completado con la
información pertinente disponible. En ausencia de un formulario, el veterinario podrá proporcionar una
historia clínica tan completa como sea posible. Los veterinarios deben contactar al laboratorio de
diagnostico si tienen cualquier pregunta.
Animales
Se prefieren animales vivos o enfermos a animales muertos. Siempre que sea posible, los animales deben
ser remitidos directamente al laboratorio de diagnostico para una necropsia completa. Si hay problema de
hato, se debe remitir más de un animal. Se puede emplear el servicio de correo para embarcar animales
pequeños, siempre y cuando sean empacados en contenedores herméticos aislados con suficiente hielo o
"paquetes fríos". No congelar animales que serán remitidos para necropsia.
Tejidos
Para minimizar la contaminación durante la necropsia, es mejor recolectar rutinariamente un grupo de
tejidos, antes del examen completo. Los tejidos recomendados son pulmón, riñón, hígado, bazo, intestino
delgado, intestino grueso y nódulos linfáticos mesentéricos. Tejido cerebral o la cabeza deben también ser
colectados si se sospecha de enfermedad del sistema nervioso central. Deben recolectarse otros tejidos
que presenten anormalidades notadas durante el examen completo. Una porción de estos tejidos debe
colocarse en bolsas plásticas herméticas y colocarlas en refrigeración. Mientras que se recomienda que
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MICROBIOLOGIA VETERINARIA II
cada tejido sea colocado en una bolsa separada, es absolutamente esencial que el intestino esté separado
de otros tejidos, de otra manera el examen bacteriológico estará comprometido.
Los tejidos deben ser llevados directamente al laboratorio o enviados en refrigeración por correo
certificado servicio de noche, autobús, o por servicio de mensajería. Los tejidos recolectados durante la
segunda parte de la semana deben congelarse y enviarse el lunes. Puesto que muchos virus producen
lesiones microscópicas características, pequeños trozos de cada tejido (1/4 de pulgada de grueso) deben
colocarse en formalina buferada al diez por ciento para examen histopatológico. Debe remitirse una mitad
longitudinal completa del cerebro. Estas muestras no deben congelarse.
Heces
Las heces pueden ser recolectadas de animales con enfermedad aguda y colocadas en recipientes
herméticos. Mientras los hisopos bien saturados son adecuados para muchos de los exámenes virológicos
individuales, algunos mililitros o gramos de heces permiten un trabajo de diagnostico más completo,
incluyendo el examen bacteriológico y parasitario. Las muestras deben ser remitidas al laboratorio
empleando "paquetes fríos" como refrigerantes.
Hisopos
Se emplean hisopos nasales u oculares para el aislamiento de virus de animales con infecciones del tracto
respiratorio superior. Las infecciones genitales también pueden diagnosticarse por el examen de hisopos
recolectados del tracto reproductivo (vagina, pene, mucosa etc.). Estos hisopos deben recolectarse de
animales con enfermedad aguda y deben ser colocados directamente en tubos con tapa de rosca que
contienen un medio de transporte viral. El muestreo de varios animales en diferentes estados de la
enfermedad incrementa la posibilidad de aislar el agente causal. Los hisopos también son útiles para el
muestreo de lesiones vesiculares. Las vesículas frescas deben romperse y saturar el hisopo con el líquido
exudado. Se deben recolectar dos hisopos, uno para el aislamiento de virus y uno para microscopía
electrónica. Los hisopos para el aislamiento de virus deben ser colocados en medios de transporte viral y
los hisopos para microscopía electrónica deben colocarse en un tubo con tapa de rosca que contenga una o
dos gotas de agua destilada. También se debe remitir el material de costras de lesiones más avanzadas.
Laminillas
Un número de enfermedades infecciosas puede diagnosticarse mediante el examen de laminillas
preparadas con sangre y tejidos. Los frotis de sangre se emplean para el diagnostico de leucemia felina,
mientras que los frotis de sangre y raspados conjuntivales se emplean en el diagnostico de distemper
canino. Los raspados conjuntivales en particular son útiles para el diagnostico de infecciones por
herpesvirus y clamidia en gatos. Impresiones hechas del hígado, bazo y pulmones son especialmente
útiles para el diagnostico de infecciones por clamidias y herpes virus en psitacinos.
Las laminillas deben tener suficiente cantidad de células para permitir un examen completo y no ser
demasiado gruesas lo cual podría causar dificultades a la tinción. El raspador conjuntival o algún otro
implemento (extremo romo de una hoja de bisturí) debe emplearse para raspar la conjuntiva; los hisopos
de algodón no son adecuados. Los ojos con secreción deben limpiarse y enjuagarse antes de raspar la
conjuntiva. Las impresiones de tejido deben hacerse mediante ligeros toques sobre la laminilla de
microscopio con cortes frescos de tejido previamente secados con una toalla de papel para absorber algo
de sangre. Las laminillas deben secarse al aire y ser enviadas al laboratorio en cajas para laminillas para
prevenir que se rompan. Algunas laminillas permiten un trabajo de diagnostico más completo, incluyendo
los exámenes citológicos.
Suero
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Las muestras de sangre deben ser recolectadas en tubos estériles sin anticoagulantes. Estos deben
remitirse al laboratorio en recipientes de poliestireno especialmente diseñados para evitar que se rompan.
Las muestras de sangre no deben congelarse o permitir su sobre-calentamiento. Si las muestras no pueden
ser enviadas al laboratorio dentro de un tiempo razonable, puede removerse el suero y refrigerarlo o
congelarlo.
Glosario
Alícuota: Dividir en partes iguales (como una solución)
Sondas de referencias: Estos son pequeñas extensiones de ADN o ARN empleadas para iniciar la síntesis
de ácido nucleico. Una sonda de referencia se hibridiza con una cadena modelo de ácido nucleico y
suministra la terminación 3’ hidroxílica para la iniciación de la síntesis. Estas sondas de referencia s
delimitan la región que será amplificada. En PCR, dos (a veces más) sondas de referencia s sintéticos de
oligonucleótidos (con cerca de 20 nucleótidos cada uno) que son complementarios a las regiones en
cadenas opuestas flanqueando la secuencia blanco; la terminación 3’ hidroxílica es orientada una a otra.
En PCR la secuencia blanco de una muestra tiene entre 100 y 2000 bp de longitud. Se emplean sondas de
referencia diseñadas y los sondas de referencia arbitrarias ("directamente de la repisa").
Pruebas regulatorias: Estas son pruebas se llevan a cabo bajo el auspicio de agencias oficiales de control
de enfermedades, con el fin de controlar importantes enfermedades animales infecciosas.
Endonucleasas de restricción: Son enzimas derivadas de bacterias que reconocen y clivan secuencias
específicas ADN.
Polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción: Estos revelan muchas diferencias en las
secuencias ADN entre individuos de una especie. RFLPs son producto del clivaje de ADN por enzimas de
restricción, separación de los fragmentos por electroforesis en gel y visualización de las bandas
(fragmentos de ADN) por tinción con bromuro de etidio fluorescente.
Polimerasa Taq: Esta es la polimerasa de ADN empleada en PCR. Es derivada de la bacteria Thermus
aquaticus que vive en riachuelos de agua caliente; la termo-estabilidad de la polimerasa hace posible el
PCR.
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