descargar documento

Crecimiento y Cultivo vegetal
Técnicas de Laboratorio
Trabajo Práctico de Laboratorio N°1
Preparación de medios de cultivo
Objeto de la experiencia
Preparación de medio de cultivo específico para células vegetales indiferenciadas y
raíces transformadas. Se utilizará la formulación propuesta por Murashige y Skoog, Plant
Physiol. 1962, 15, 473-497.
Procedimiento
1. Preparación de soluciones stock de almacenamiento
1.1. Solución stock de macronutrientes
Pesar
NH4NO3
16,5
KNO3
19
CaCl2.2H2O
4,4
MgSO4.7H2O
3,7
KH2PO4
1,7
g
g
g
g
g
Disolver en H 2O destilada y llevar a volumen de 1000 mL. De esta manera se obtiene una
solución 100X.
1.2. Solución stock de micronutrientes
Pesar
KI
H3BO3
MnSO4.4H2O
ZnSO4.7H2O
NaMO4 .2H 2O
CuSO4.5H2O
CoCl2.6H2O
166
1240
4460
1720
50
5
5
mg
mg
mg
mg
mg
mg
mg
Disolver en H 2O destilada y llevar a volumen de 1000 mL. De esta manera se obtiene una
solución 5X.
1.3. Solución stock de hierro
Pesar
FeSO4.7H2O
Na2EDTA
5560 mg
7400 mg
Disolver en H 2O destilada y llevar a volumen de 1000 mL. De esta manera se obtiene una
solución 5X.
1.4. Solución stock de vitaminas
Pesar
Ácido nicotínico
Piridoxina.HCl
Tiamina.HCl
Glicina
100
100
100
400
mg
mg
mg
mg
Crecimiento y Cultivo vegetal
Técnicas de Laboratorio
Disolver en H2O destilada y llevar a volumen de 200 mL. De esta manera se obtiene una
solución 1X.
1.5. Solución stock de vitaminas (MSRT -Medio de cultivo para Raíces Transformadas)
Pesar
Piridoxina
Nicotinamida
Tiamina
Ac. Fólico
Cianocobalamina (Vit B12)
10 mg
20 mg
10 mg
5 mg
0,015 mg
(Nota: Se prepara una solución con 1,5 mg/ml y se colocan 0,01 ml los cuales contienen 0,015
mg )
Riboflavina
Biotina
Colina
Pantotenato de calcio
5 mg
10 mg
10 mg
10 mg
Disolver en H2 O destilada y llevar a volumen de 10 mL. De esta manera se obtiene una solución
1X.
1.6. Solución stock de reguladores de crecimiento
Las diferentes auxinas y citoquininas se disuelven en agua bidestilada de manera de
obtenerse soluciones stock con una concentración de 200 ppm. Las drogas básicas pueden
acidificarse con HCl 0,1 N y las drogas ácidas alcalinizarse con NaOH 0,1 N para favorecer su
disolución.
Un ejemplo de preparación es pesar 40 mg de droga sólida y disolver en H 2 O
bidestilada para llevar a un volumen final de 200 mL.
Todas las soluciones stock deben conservarse en heladera y deber controlarse que no haya
habido contaminación o deterioro de las mismas antes de preparar los medios de cultivo. En
caso de observarse desarrollo microbiano o precipitación de sus componentes, deben ser
descartadas y se procederá a preparar nuevas soluciones de almacenamiento.
2. Preparación de medios de cultivo
2.1. Medir los volúmenes de las soluciones stock correspondiente al volumen de medio de
cultivo a preparar
2.2. Pesar los componentes sólidos. Por cada litro de medio MS, pesar
sacarosa
mioinositol
30 g
100 mg
2.3. Mezclar y homogeneizar los componentes líquidos y sólidos en las tres cuartas partes del
volumen total de medio a preparar.
2.4. Adicionar los reguladores de crecimiento
Crecimiento y Cultivo vegetal
Medio
ANA 0,5
ANA/KIN
IBA/BAP
2,4 D
MSRT
ANA
0,5 ppm
2 ppm
-
Técnicas de Laboratorio
KIN
0,1 ppm
-
IBA
4 ppm
-
BAP
4 ppm
-
2,4-D
1 ppm
-
2.5. Ajustar el pH (5,6 – 5,8) con el empleo de soluciones de KOH 0,5 N y/o HCl 0,5 N.
2.6. Ajustar al volumen final.
2.7. Agregar el agente solidificante en caso de preparar medio sólido, a razón de 9 – 10 g de
agar por litro de medio de cultivo.
2.8. Fraccionar en erlenmeyers en caso de medio líquido o fundir el agar por calentamiento a
baño maría y una vez fundido fraccionar en tubos o frascos de acuerdo al propósito deseado.
3. Esterilización
Esterilizar por calor húmedo en autoclave a 2 atm de presión (PEb. del agua = 121ºC) durante
15 minutos. No exceder dicho tiempo ya que el medio contiene una elevada proporción de
azúcar que puede caramelizarse y vitaminas que pueden sufrir descomposición.
4. Fraccionamiento
En caso de tratarse de medio sólido, se realiza el fraccionamiento en placas de Petri y cabina
de flujo laminar y se deja solidificar.