evaluación de la viabilidad y concentración

EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD Y CONCENTRACIÓN CELULAR
Viabilidad Celular
Método del Colorante de Exclusión.
•Azul de tripano
Ensayos:
•Colorimétricos.
•Fluorescentes.
Método del Colorante de Exclusión
Solución de azul de tripano, al 0.4%
Prepared in 0.81% sodium chloride and 0.06% potassium phosphate, dibasic.
Aplicaciones
Para ensayos de Citotoxicidad y proliferación.
Es un colorante vital que no se absorve por células viables sanas.
Cuando las céluas son dañadas o están muertas, el azul de tripano puede entrar
a la célula, permitiendo a la célula muerta ser contada.
Ensayo Colorimétrico. Kits
Cell Counting Kit-8 (CCK-8)
WST-8
(2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium,
monosodium salt),  produce un colorante formazan soluble en agua por bioreducción
en la presencia de un acarreador de electrónes, 1-Methoxy PMS.
WST-8 es bioreducido por deshidrogenasa celular a un producto formazan anaranjado
soluble en el medio de cultivo.
El formazan producido es directamente proporcional al no. de células vivas.
La solución de CCK-8 es muy estable y de poca toxicidad, se incuba de 24 a 48 h.
La sensibilidad de la detección esmás alta que otras sales de tetrazolium como MTT,
XTT o MTS.
Ensayo Fluorescente.
Propidium iodide solution
solution (1.0 mg/ml in water)
Membrana impermeabilizante, colorante intercalante fenantridinio
exitado por láser de lámparas de mercurio o xenón.
Uso:
•Microscopía de fluorescencia,
•Microscopía láser confocal de barrido,
•Citometría de flujo, y
• Fluorometría.
Usado como contratinción nuclear.
Tinciones:
• Giemsa
• Cristal violeta
Tinción de Giemsa.
Colorante policromático rojizo,
 Tiñe células cultivadas.
Con la tinción de May-Grünwald se utiliza para teñir sangre,
Núcleo  rosa o magenta
Nucleolos  azul obscuro
Citoplasma  azul-gris pálido
Las células se fijan en alcohol o formaldehído,
y la preparación debe estar completamente anhidra.
PROTOCOLO:
Se cuenta con un cultivo celular en monocapa.
Fijar el cultivo en metanol, teñir directamente con Giemsa sin diluir y
después diluir el colorante 1:10.
Lavar el cultivo y examinarlo ya seco.
Materiales.
• PBS
• PBS-Metano, 1:1.
• Colorante de Giemsa sin diluir.
• Metanol.
• Agua desionisada
TINCIÓN CON CRISTAL VIOLETA.
MATERIALES. No estériles.
•
•
•
•
PBS.
PBS-Metanol (MeOH). 50% de metanol en PBS.
Metanol Cristal Violeta.
Embudo de filtración y papel filtro de tamaño apropiado
para tener 5 mL de colorante para cada caja Petri.
• Botella para reciclar el colorante.
PROTOCOLO.
1. Remover y descartar el medio.
2. Enjuagar la monocapa con PBS y descartar el líquido.
3. Agregar 5 mL de PBS-MeOH / 25 cm2. Reposar 2’, descartar el PBS-MeOH.
4. Agregar 5 mL de MeOH fresco por 10’.
5. Descartar el metanol, de la caja Petri y secar.
6. Agregar 5 mL del Cristal Violeta/ 25 cm2, reposar por 10’.
7. Pasar el colorante a la botella de reciclado.
8. Enjuagar con agua corriente y agua desionizada y dejar secar.
MÉTODOS DE TINCIÓN IN VITRO.
• Preparación.
• Permeabilización.
• Montaje.
• Tinción Adecuada.
Tinción directa
Tinción indirecta.
Afinidad de diferentes tejidos por diferentes colorantes.
Tinción Negativa.
COLORANTES
La mayoría son compuestos orgánicos que tienen
alguna afinidad específica por los materiales celulares.
Muchos colorantes utilizados con frecuencia son
moléculas cargadas positivamente (cationes) y se
combinan con intensidad con los constituyentes
celulares cargados negativamente, tales como los
ácidos nucléicos y los polisacáridos ácidos.
Colorantes catiónicos: azul de metileno, el cristal violeta y la safranina.
Colorantes aniónicos: eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo.
Colorantes liposolubles, negro Sudán.
Colorantes histológicos más comunes,
Reaccionan o se concentran en diferentes partes de las células o tejidos:
Azul brillante de Coomassie(azul brillante),
Azul de metileno,
tiñe específ. toda proteína con un fuerte color azul.
tiñe células animales, hace más visibles sus núcleos, colorante vital en reticulocitos.
Azul Nilo (Azul Nilo), tiñe a los núcleos de color azul y para teñir células vivas.
Bismarck brown (Bismarck brown Y o Manchester brown) imparte
color amarillo a las mucinas ácidas.
Bromuro de etidio (BE); se intercala en el ADN y le otorga un color rojo naranja fluorescente.
Carmín, colorante de un intenso color rojo , la sal de litio tiñe glicógeno,
las sales de alumbre-carmín se
adhieren al núcleo. Se requiere el uso de un mordiente, que usualmente es aluminio o alumbre.
Cristal violeta,
API,
combinado con un mordiente, tiñe las paredes celulares de color púrpura. Para Gram.
colorante nuclear (tiñe núcleos) fluorescencia azul, si se excita con luz ultravioleta al estar unido al ADN.
Eosina,
se usa frecuentemente como contracoloración de la hematoxilina, impartiendo un color que va del
rosado al rojo al material citoplasmático, membrana celular, y algunas estructuras extracelulares.
Tinción
Tipo
Características
Uso
Hematoxilina
Tiñe núcleos, ácidos nucleicos y
Tinción
Básica /
estructuras basofílicas
histológica
Acidofílica
(mitocondrias y ribosomas) en azul. general
Eosina
Tiñe proteínas y estructuras con
Tinción
Ácida /
afinidad por los ácidos en diferentes histológica
Basofílica
tonos de rojo
general
Tinción
hematoxilinaeosina
Tinción
hemalumbreeosina
•Los núcleos aparecen en azul
(hematoxilina)
•Los ácidos nucleicos asociados a
proteína (ej. ribosomas) en violeta
•Fibra muscular en rojo
Bicompo- •Tejido conectivo en rosado
nente
Anfifílica
Tinción
histológica
general
Tinción
Similar a la tinción H&E con colores
histológica
más marcados y definidos
general
Tinción HOPS
•Los núcleos aparecen en azul
(hematoxilina)
•La elastina aparece en negro
(orceína)
•Fibra muscular en rojo (filoxina)
•Tejido conectivo (colágeno) en
amarillo (safranina)
Tinción HPS
•Los núcleos aparecen en azul
(hematoxilina)
•Fibra muscular en rojo (filoxina)
•Tejido conectivo (colágeno) en
amarillo (safranina)
Policromática
Tinción de
Papanicolau
•Permite ver la cromatina con mucha
claridad.
• Núcleos entre azul y negro.
•Células con alto contenido de
queratina en amarillo.
•Glucógeno en amarillo.
•Células superficiales de naranja a
rosado.
•Células intermedias y parabasales
entre turquesa y azul.
•Células metaplásicas muestran
coloraciones mezcladas (P. Ej. verde
y rosa)
Se utiliza para diferenciar
células en muestras de
secreciones biológicas
(esputo, LCR, orina, etc.)
y en raspados y biopsias.
Permite distinguir con
relativa facilidad células
con transformaciones
neoplásicas, levaduras y
bacterias.
Extendidos
sanguíneos
Tinción de
Romanowsky
Tinción de Wright
Tinción de Giemsa
Tinción de Jenner
Tinción de Leishman
Tinción de Field
Tinción de MayGrünwald
Tinción de MayGrünwald/Giemsa
Pancromática
de
Romanowsky
Tinción con
azul de
metileno
Tinción con
azul de prusia
Supravital
metacromática
Tiñe de azul oscuro
restos de ácidos
nucleicos, y los
proteoglicanos
ácidos en varios
tonos de violeta.
Tiñe los depósitos
de hemosiderina y
hierro de color
azul-celeste
Diagnóstico de
anemias
regenerativas
Demostración de
estructuras
metacromáticas
Diagnóstico de
hemopoyesis
ineficaz, y
hemocromatosis
Tinción tricrómica de
Masson
•Los núcleos aparecen en marrón o negro
•Keratina y músculo en rojo
•Los citoplasmas en tonos de rosa
•El colágeno y hueso en azul o verde
Tinción tricrómica de
Lillie
Símil tricrómica de Masson
Tinción tricrómica
AZAN de Heidenhan
Símil tricrómica de Masson, los
citoplasmas aparecen en tonos de rojo
más profundos y el conectivo en tonos
más intensos de azul
Tricrómica
Tinción tricrómica de
Mallory
Símil tricrómica de Masson
Tinción de Van
Gieson
•Núcleos celulares color marrón a negro.
•Colágeno (tejido conectivo fibroso):
Color rosa o rojo.
•Músculo y Citoplasma: Color amarillo.
Tinción de Movat
Tinción tricrómica de
Gömöri
•Negro = núcleos, fibras elásticas
•Amarillo = colágeno, fibras reticulares
•Azul = sustancia basal, mucina
•Rojo brillante = fibrina
•Rojo = músculo
Tricrómica
Argéntica
Tinción de WarthinStarry
Tiñe de tonos de marrón y negro los depósitos
de fosfato inorgánico en hueso.
Tinción de Von Kossa
Tinción de Golgi
Tinción de
Bielchowsky
Tinción de Jones
Argéntica
Lado A
Lado B
COLORANTES FLUORESCENTES
Caenorhabditis elegans
DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol).
Se une a la doble hélice metiéndose en el medio del canal menor.
Fluorescence In-Situ Hybridization
(FISH)
USO DE ANTICUERPOS
Filamentos Intermedios.
Ab
Microtúbulos.
Colorante
Fluorescente
Microfilamentos.
Células pulmonares en mitosis
Microtúbulos en verde.
Ab- anti-b tubulina conjugado con
fluoresceína.
Cromosomas teñidos de azul
con colorante fluorescente
(Hoechst 33342).
Células en cultivo.
Núcleos con
Ioduro de propidio (rojo).
Desmosomas con Ab anti-proteína desmosómica (verde).
PRUEBAS DE FUNCIONALIDAD
Reducción del MTT amarillo a Formazán de color azul.
(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide
MTT
actividad celular de
enzimas oxidoreductasas
dependientes de NAD (P)H
Malato
Deshidrogenasa
CICLO DE
KREBS
Isocitrato
Deshidrogenasa
A-cetoglutarato
Deshidrogenasa
MTT
XTT
MTS
WTS
Mide:
Viabilidad.
Proliferación.
Citotoxicidad.
Actividad Citostática
- Agentes potencialmente terapeúticos
- Materiales tóxicos.
Ensayos de Citotoxicidad
LDH
GOT-ASAT
GPT-ALAT
40
74
γ-GT -GGTP 40 a 78
ALAT: GPT
ASAT: GOT
γ-GT : GGT : GGTP
U/l
U/l
U/L
(5 - 37)
(5 - 40)
ROJO NEUTRO