Mutación

GENETICA BACTERIANA
1
Mutaciones
Transferencia de material genético
de un microorganismo a otro
Procesos que producen cambios en la
información genética de un microorganismo.
Estos pueden tener como consecuencia un
cambio en su fenotipo (cambios
morfológicos, estructurales o funcionales)
y adaptación a distintos ambientes.
Recombinación genética
Transposición
Estos procesos permiten el análisis de la
estructura génica de un organismo y de su
funcionalidad y tienen importancia y uso
para la construcción de nuevos organismos
con aplicaciones prácticas.
2
Mutaciones
Transferencia de material genético
de un organismo a otro
Procesos que producen cambios en la
información genética de un organismo
y pueden tener como consecuencia un
cambio en su fenotipo y adaptación a
distintos ambientes.
Recombinación genética
Transposición
Estos procesos permiten el análisis de la
estructura génica de un organismo y de su
funcionalidad y tienen importancia y uso
para la construcción de nuevos organismos
con aplicaciones prácticas.
3
Mutación en bacterias
Gen silvestre: secuencia de un gen en las bacterias aisladas en su hábitat natural
Mutación: cambio heredable en la secuencia de bases del genoma de un organismo.
Mutante: la cepa que lleva ese tipo de cambio (proviene de una cepa silvestre). Se
denominan de acuerdo a si se hace referencia al gen mutado (genotipo) o al fenotipo alterado.
Genotipo: dado por la secuencia de nucleótidos en el ADN
Gen: minúscula e itálica, ej.: el gen hisC, genes exo (mutante hisC o cepa hisC-)
Fenotipo: dado por las propiedades observables o detectables del organismo
Proteína o camino metabólico: His (cepa His-, cepa Exo-, mutante His).
The role of Mesorhizobium loti surface polysaccharides on
the nodulation process is not yet fully understood. In this
article, we describe the nodulation phenotype of mutants
affected in the synthesis of lipopolysaccharide (LPS) and
β(1,2) cyclic glucan. M. loti lpsβ2 mutant produces LPS
with reduced amount of O-antigen, whereas M. loti lpsβ1
mutant produces LPS totally devoid of O-antigen. Both
genes are clustered in the chromosome. Based on amino
acid sequence homology, LPS sugar composition, and enzymatic
activity, we concluded that lpsβ 2 codes for an enzyme
involved in the transformation of dTDP-glucose into dTDPrhamnose,
the sugar donor of rhamnose for the synthesis of
O-antigen. On the other hand, lpsβ1 codes for a glucosyltransferase
involved in the biosynthesis of the O-antigen.
Although LPS mutants elicited normal nodules, both show
reduced competitiveness compared with the wild type. M.
loti β(1-2) cyclic glucan synthase (cgs) mutant induces
white, empty, ineffective pseudonodules in Lotus tenuis.
Cgs mutant induces normal root hair curling but is unable
to induce the formation of infection threads. M. loti cgs
mutant was more sensitive to deoxycholate and displayed
4
Cómo se producen las mutantes?
Bacteria sensible a antibiótico
Se hace crecer en un medio con antibiótico
Se aíslan colonias que poseen una resistencia a la
droga (heredable).
¿Las mutaciones se indujeron a causa del antibiótico?
Medio con antibiótico
Colonia proveniente de
bacteria sensible a antibiótico
Colonias resistentes a antibiótico
5
En general la mutación es un evento que ocurre al azar y no está
relacionado con una adaptación específica al medio ambiente.
Todas las
replicas en
medio selectivo
son iguales
6
Luria y Delbruck (1943): investigaron el origen de la mutación que le confiere a E. coli
resistencia al fago T1
A
B
1
2
3
20
20 erlenmeyers(1ml/erlenmeyer)
conteniendo 103 células /ml
Cada uno se plaquea en una placa con fago T1
0,2 ml / placa
A
10 ml conteniendo
103 células/ml
Se crecen hasta alcanzar 109 células/ml
Se plaquean 20 placas que contienen el fago,
0,2 ml de cultivo / placa.
B
7
Tasa de mutación para un determinado fenotipo: La probabilidad de que una célula mute a un
determinado fenotipo cada vez que la misma se divide.
a=
m
d
=
m
N2 – N1
Si se hace en cultivo líquido hay que hacer
correcciones en base a cálculos estadísticos
porque el número de eventos de mutación ≠
número de mutantes
a= tasa de mutación
m= número de mutaciones surgidas en el cultivo
en el tiempo t
d= número de divisiones ocurridas en ese tiempo t
N= número de células
Se aplica esta aproximación
M/N
Pendiente= a
tiempo
Se debe trabajar con cultivos densos en fermentador
La tasa de mutación se saca experimentalmente
y depende del tamaño del gen, secuencia del gen,
secuencia de aa y estructura tridimensional del
producto del gen que se está mutando y si el fenotipo
depende de un solo gen o de varios.
Tasa de mutación espontánea para cada gen: 10-6-10-10
Auxotrofía aa
resist Ab
8
Puntuales: Sustitución de pares de bases: transiciones Pu:Py
transversiones Pu:Py
Pu:Py
Py:Pu
Microinserciones
Mutaciones
Microdeleciones
Mutaciones debidas a cambio de muchos pares de bases (genes enteros): inserciones
deleciones
inversiones
Translocaciones
duplicaciones
Pu: A y G
Py: T y C
9
Consecuencias de las mutaciones puntuales
En zona codificante:
UAC
Codón de tirosina
Sustitución de pares de bases: El
cambio fenotípico depende de que
cambio de nucleótido tuvo lugar y
donde exactamente ocurre la mutación
en el gen.
CAC
Codón de
Histidina
UAG
codón de
terminación
UAU
codón de
tirosina
Proteína defectuosa
Proteína incompleta Proteína normal
Mutación de contrasentido Mutación sin sentido Mutación silenciosa
Mutaciones por desfase: Por inserción
o deleción (que no sea múltiplo de 3)
se origina un desfase en el marco de
lectura. La traducción resulta alterada.
En zona no codificante:
En zona promotora: inactivación o conversión de un promotor inducible en promotor constitutivo.
10
Por errores en la replicación: los errores ocurren
Espontáneas
con alta frecuencia pero
existen mecanismos de
corrección muy eficientes
Por alteración espontánea de ciertos nucleótidos
que lleva a un apareamiento equivocado
Tautomerismo, pérdida de amino.
Mutaciones
Mutágenos químicos y físicos
Provocadas
Para aislar una mutante:
Mutágenos biológicos: mutagénesis por transposón
Mutagénesis dirigida: Tecnología de ADN
recombinante.
Hay que tratar de aumentar la tasa de mutación
Hay que buscar un método eficiente de selección
11
Tautomerismo
T- - - A
T- - - G
TA
CG
forma
enol
Forma tautomérica
Se comporta como
A* (imino)
G
G* (enol)
A
C* (imino)
T
T* (enol)
C
12
Pérdida de NH2
5% de las citosinas están metiladas
C - - -G
MeC - - -G
Tanto C como MeC pueden perder el NH2
C
MeC
U
T- - -A
MeCG
TA
Hot Spots
13
Por errores en la replicación: ocurre con alta frecuencia
Ocurrir
naturalmente
Existen mecanismos de
corrección
Por alteración espontánea de ciertos nucleótidos
que lleva a un apareamiento equivocado
Tautomerismo, Hot Spots.
Mutaciones
Mutágenos químicos y físicos
Provocadas
Para aislar una mutante:
Mutágenos biológicos: mutagénesis por transposón
Mutagénesis dirigida: Tecnología de ADN
recombinante.
Hay que tratar de aumentar la tasa de mutación
Hay que buscar un método eficiente de selección
14
15
Por errores en la replicación: ocurre con alta frecuencia
Ocurrir
naturalmente
Existen mecanismos de
corrección
Por alteración espontánea de ciertos nucleótidos
que lleva a un apareamiento equivocado
Tautomerismo, Hot Spots.
Mutaciones
Mutágenos químicos y físicos
Provocadas
Para aislar una mutante:
Mutágenos biológicos: mutagénesis por transposón
Mutagénesis dirigida: Tecnología de ADN
recombinante.
Hay que tratar de aumentar la tasa de mutación
Hay que buscar un método eficiente de selección
16
Hipoxantina (APAREA CON CITOCINA)
Uracilo (APAREA CON ADENINA)
(la transforma en comp.
que se aparea con A)
y deleciones
In vivo e in vitro
salvo NTG que
actua solo in vivo
mutaciones puntuales por errores en apareamiento
Bloqueo de emparejamiento de bases
aflatoxina
distorción, error por reparación
Análogo de base
T
T(forma enol) (aparea con G)
BU
BU (forma enol)
BU - - - G
Más frecuentemente
AT
GC
17
Sistemas de reparación
Mecanismos de reparación general
Actividad correctora de la ADN polimerasa III durante la replicación (mutD)
(exo 3´ 5´). Frecuencia baja pero no nula. Innovaciones presión selectiva
evolución
Reparación de mismatch dependiente de metilo:
Reconocen cambios en la estructura del ADN debido a un apareo indebido
(pequeñas distorsiones en la hélice). Participan los genes mutS, mut L y
mut H.
El gen dam (codifica para una enzima que metila Adenina dentro de determinada
secuencia después de la replicación, la nueva hebra esta temporalmente
no metilada). Entonces cuando el daño y la formación de mismatch ocurre
durante la replicación puede ser corregido correctamente porque el sistema
reconoce cual es la hebra nueva.
Genes mut: genes mutadores
18
Mecanismos que reconocen distorsiones grandes en la hélice. Principalmente daños por UV, NTG,
especies reactivas de oxígeno
Reparación por escisión
Reparación recombinatoria
Reparación por mecanismo de SOS (mutagénico)
Reparación por escisión-resíntesis
Reparación recombinatoria
1) Helicasa (uvrA y uvrB)
2) Se une uvrC y se forma
la endonucleasa
3) Corta x número de nt a
izquierda y derecha del
dímero
4) DNA polimerasa I rellena sobre
molde
5) ligasa
1) DNA polimerasa III salta y
deja hueco
2) Se produce recombinación
entre cadenas por acción
de RecA
Intervienes los productos de los genes uvrA, uvrB, uvrC, uvrD y
DNA polimerasa. Son inducibles por daño al ADN
prereplicativo
posreplicativo
19
Reparación por mecanismo de emergencia (SOS) (propenso a error)
Por acción de mutágenos
o por stress ambiental
Daño al ADN
grande
Se induce el sistema de SOS
(normalmente reprimido por LexA)
Célula normal: nivel basal de LexA (represor de lexA, y de recA, uvrA, B, C, y umuDC (regulón SOS).
La represión no es total entonces hay niveles basales de estas enzimas y por lo tanto hay reparación
por recombinación y por escisión.
Célula dañada: muy afectada la replicación. Muchas zonas del cromosoma como simple cadena sin
reparar. RecA reconoce estas zonas y se activa a una forma que induce la autoproteólisis de LexA.
Deja de haber represor, aumenta reparación por mayor cantidad de RecA y de UvrA, B y C pero
aumenta expresión de umuDC. UmuDC permite la replicación sobre DNA dañado (bypass replicativo)
pero metiendo errores. La célula sigue viable pero adquiere múltiples mutaciones.
20
Mecanismos de reparación específicos para determinado tipo de mutación
Daño por Deaminación:
Actúan DNA glicosilasas específicas reconocen (hipoxantina, uracilo).
Rompen entre el azúcar y la base alterada. Luego actúan las AP endonucleasas que
cortan en el esqueleto azúcar-fosfato y finalmente actúa la ADN polimerasa I rellenando.
(Deaminación espontánea de C)
Deaminación por ácido nitroso)
Desaminación de citocinas metiladas
C
MeC
U
Uracil-glicosilasa
T- - -A
MeCG
No se saca con una glicosilasa
Hot spot
TA
(sobre las T en mismatch con G en el contexto de determinada
secuencia actúa otro sistema reparación llamado VSP (very
short patch. Repara en favor de la hebra que tiene la G
Daño por alquilación: (metil guanina por metanosulfonato de etilo)
glicosilasas específicas,
AP endonucleasas y la ADN pol I
Daño por especies reactivas de oxígeno: Formación de 8-oxo G. Aparea con A en lugar de C
Paricipan los genes mutM, mut T y mutY.
mut M codifica para una glicosilasa específica para 8-oxo G.
mutY codifica para una glicosilasa específica para A.
mutT inhibe la formación de 8-oxo G.
También en daño al ADN por especies reactivas de oxígeno
actúa el sistema de reparación por escisión (mecanismo general)
Daño por Radiación UV (formación de dímeros de timina). Fotoreactivación: ocurre en presencia de
la luz. Actúa una Fotoliasa que separa las bases unidas
También hay N-glicosilasas específicas para dímeros de timina
21
Por errores en la replicación: ocurre con alta frecuencia
Existen mecanismos de
corrección
Ocurrir
naturalmente
Por alteración espontánea de ciertos nucleótidos
que lleva a un apareamiento equivocado
Tautomerismo, Hot Spots.
Mutaciones
Mutágenos químicos y físicos
Provocadas
Mutágenos biológicos: mutagénesis
por transposón
Para aislar una mutante:
Genes
mutadores
Mutagénesis dirigida: Tecnología de ADN
recombinante.
Hay que tratar de aumentar la tasa de mutación
Hay que buscar un método eficiente de selección
22
Mutación adaptativa ?
Existen algunos ejemplos
Mutación adaptativa o de fase estacionaria: se forma durante la exposición a las condiciones selectivas y no está presente de antes.
Ocurre por hipermutación (inducción de SOS sin reparación de errores)
Mutantes lacZ (no pueden crecer en lactosa porque está mutada la β-galactosidasa, mutación por desfase).
Después de un tiempo en medio mínimo con lactosa empiezan a aparecer colonias de revertantes
Mecanismo:
Tasa de mutación general regulada por el ambiente
Stress
(ambiente adverso o ayuno exhaustivo)
Amplificación adaptativa
Hipermutación por inducción del sistema SOS
El ambiente provoca la hipermutación y el aumento de probabilidad de adaptarse a ese ambiente adverso
23
Reversiones
Una revertante es una cepa en la que se restauró el fenotipo silvestre que se había perdido.
Se vuelve a la secuencia original: revertante verdadera
Revertante de un mismo sitio
Secuencia que al traducir da el mismo aa
Mutación en el mismo gen: corrigen el marco
de lectura.
Mutación en otro gen que restaura el fenotipo
silvestre produciendo la misma proteína.
Ej. : mutación en genes de tRNA. Supresora informacional
Revertantes
También pueden
ocurrir naturalmente
o ser provocadas
Revertantes de segundo sitio o
mutaciones supresoras
Supresoras por sobrexpresión
Supresoras por interacción
Mutación que produce una vía metabólica
alternativa que permite el mismo fenotipo. Supresora
por bypass
24
Supresora informacional
También supresora informacional de desfase
25
Por errores en la replicación: ocurre con alta frecuencia
Ocurrir
naturalmente
Existen mecanismos de
corrección
Por alteración espontánea de ciertos nucleótidos
que lleva a un apareamiento equivocado
Tautomerismo, Hot Spots.
Mutaciones
Mutágenos químicos y físicos
Provocadas
Para aislar una mutante:
Hay que tratar de aumentar la tasa de mutación
Hay que buscar un método eficiente de selección
Mutágenos biológicos: mutagénesis por transposón
Mutagénesis dirigida: Tecnología de ADN
recombinante.
26
Aislamiento de mutantes
1) Detección por Rastreo o Screening
Observación cambios en fenotipo
Ej.: mucosas y no mucosas
a) Directo
mutagénesis
plaqueo
b) Por replica en placa
mutagénesis
plaqueo
Repique y
ordenamiento
Replica
Ej.: mutante sensible a antibiótico
c/Ab
mutante en motilidad
Medio con menor % de agar
27
2) Selección
a) Selección positiva: La mutación proporciona una ventaja para el crecimiento
bajo ciertas condiciones ambientales.
Ej.: resistencia a un antibiótico.
mutagénesis
s/Ab
c/Ab
b) Selección negativa: La mutación causa una desventaja:
Ej.: mutante auxotró
Enriquecimiento (penicilina, incorporación de precursor metabólico radioactivo)
Se repite el proceso
varias veces
Agrego al medio
penicilina
mutagénesis
Medio completo
Medio en el que no puede
crecer la mutante buscada
Ej.: sin aminoácido
Las bacterias no mutadas, que
pueden crecer, se lisan
Medio completo
Repique y
ordenamiento
Replica
Aumenta la cantidad de
mutantes obtenidas,
por eso se llama
selección
Medio sin aminoácido
Mutantes leaky
Mutantes letales
Mutantes condicionales
28
Mutagénesis y carcinogénesis: Test de Ames
Uso de cepas bacterianas mutantes para identificar sustancias potencialmente
carcinogénicas.
Se usa mutantes auxotróficas, puntuales (S. typhimurium, auxótrofa para histidina;,
E. coli, auxótrofa para triptofano).
La mutante auxótrofa no puede crecer en un medio carente del nutriente para el cual
es auxotrófica, si revierte entonces crece.
Una sustancia con capacidad mutagénica incrementa la frecuencia de reversión en la
mutante puntual.
Control
Disco de papel
Placa con bacterias
auxotróficas para
histidina
Medio con concentración muy baja de histidina
Disco de papel
Con sustancia a ensayar
activada
29
Mutaciones
Transferencia de material genético
de un organismo a otro
Procesos que producen cambios en la
información genética de un organismo
y pueden tener como consecuencia un
cambio en su fenotipo y adaptación a
distintos ambientes.
Recombinación genética
Transposición
Estos procesos permiten el análisis de la
estructura génica de un organismo y tienen
importancia y uso para la construcción de
nuevos organismos con aplicaciones
prácticas.
30
Existen 3 formas de transferencia de ADN a una bacteria
TRANSFORMACION
TRANSDUCCION
CONJUGACION
Exogenote: Replicación, dilución, degradación o recombinación
31
Mutaciones
Transferencia de material genético
de un organismo a otro
Procesos que producen cambios en la
información genética de un organismo
y pueden tener como consecuencia un
cambio en su fenotipo y adaptación a
distintos ambientes.
Recombinación genética
Transposición
Estos procesos permiten el análisis de la
estructura génica de un organismo y tienen
importancia y uso para la construcción de
nuevos organismos con aplicaciones
prácticas.
32
Recombinación: proceso por el que, en parte o por completo, las
moléculas de ADN de dos fuentes distintas se intercambian o juntan
en una unidad. La información genética se ve redistribuida
RECOMBINACION GENERAL
U HOMOLOGA
RECOMBINACION SITIO ESPECIFICA
O NO HOMÓLOGA
-Recombinación sitio específica ilegitima
-Recombinación sitio específica legítima
Entre fragmentos iguales o muy similares
RecA
Resolvasas
Transposasas
Integrasas
Invertasas y más..
33
RECOMBINACION GENERAL U HOMOLOGA
Intercambio de
cadenas homólogas
Modelo de
Holliday o de
invasion de
doble cadena
Isomerización
A
Dos cortes en cs
En el mismo lugar
Entrecruzamiento de
Extremos libres
Apareamiento con
Secuencia complementaria
Y formación de heteroduplex
Resolución
Secuencias homólogas (95-100%, 100pb mínimo)
RecA
Sinapsis
Heteroduplex
Estructura de Holliday
Endonucleasas, ligasas, polimerasas
Migracion de ramificacion
Parches
Empalmes
(recombinación verdadera)
34
Las dos cadenas de
una de las moléculas
de ADN se cortan y los
extremos 5´se degradan
Uno de los extremos 3´
invade la otra molécula
de ADN y encuentra su
secuencia complementaria
La ADN polimerasa
Desplaza y rellena
Ligación
Modelo de reparación de ruptura de
doble cadena
35
Enzimas que participan en la recombinación homóloga:
RecBCD: nucleasa se une a extremos de doble cadena.
Reconoce una secuencia determinada que determina
donde se va a formar un extremo 3´ que va a constituír la hebra invasora. Helicasa
RecA: Se une al extremo 3´de la cadena invasora, lo fuerza a adoptar la conformación de una hélice y permite que se meta
en la doble hélice de la otra molécula de ADN formando una hélice triple en la cual tiene lugar el apareamiento de
la hebra invasora con su complementaria.
RuvA, RuvB: involucradas en la migración de la ramificación.
RuvC: resuelve la estructura de Holliday
36
37
Consecuencias de la recombinación homóloga
Mutación ó complementación
Para que aparezca un nuevo fenotipo a
raíz de la recombinación homóloga, las
dos cadenas que se intercambian deben
tener alguna diferencia
Integración al cromosoma
La recombinación entre dos regiones de una
misma molécula de ADN que presentan
similitud puede ser la causa de:
Deleciones
Inversiones
empalme
38
Mutaciones
Transferencia de material genético
de un organismo a otro
Procesos que producen cambios en la
información genética de un organismo
y pueden tener como consecuencia un
cambio en su fenotipo y adaptación a
distintos ambientes.
Recombinación genética
Transposición
Estos procesos permiten el análisis de la
estructura génica de un organismo y tienen
importancia y uso para la construcción de
nuevos organismos con aplicaciones
prácticas.
39
Existen 3 formas de transferencia de ADN a una bacteria
TRANSFORMACION
TRANSDUCCION
CONJUGACION
40
PLASMIDOS
Elementos genéticos, doble cadena, generalmente circulares,
que se replican en forma independiente del cromosoma del
hospedador
No llevan genes que codifiquen para funciones esenciales. Están relacionados con la capacidad
evolutiva o adaptativa de las bacterias
Se conocen miles de tipos diferentes
Se encuentran en la mayoría de las bacterias
Tamaño entre 1000- 106 pb
Plásmido típico: circular, bicatenario, 0,2-0,4% del ADN cromosómico
41
Forma superenrollada. Con rotura en una cadena da círculo abierto. Con rotura en las dos
cadenas da forma lineal.
Los plásmidos se replican a partir de un origen de replicación.
En forma similar al
cromosoma bacteriano.
Replicación theta
En círculo rodante
42
Los genes necesarios para la replicación pertenecen en su mayoría al hospedador (DNA
Polimerasas, ligasas, helicasas, primasas) pero el plásmido lleva información:
 Para algunas de las enzimas necesarias para la iniciación de la replicación (esto determinará si
es de amplio o estrecho rango de huésped y que tipo de replicación sigue).
 Para el control temporal de la iniciación de la replicación determinando el número de copias
por célula. Plásmidos de alto y bajo número de copias.
 Para la regulación de la partición de los plásmidos entre las células hijas en la división celular
 Puede determinar su capacidad de compartir la célula con otros tipos de plásmidos:
incompatibilidad.
43
Número de copias:
Es característico del plásmido
Bajo número de copias (1-3)
Alto número de copias (10-100)
RepA, RNA
Curación:
Los plásmidos se pueden eliminar de la célula hospedadora por distintos tratamientos:
colorantes de acridina, detergentes, elevada temperatura, electroporación. Ocurre una dilución
del plásmido en la división celular.
Partición:
La segregación de los plásmidos en las dos células hijas, para plásmidos de bajo
número de copias está regulada (sitios par).
Incompatibilidad:
Plásmidos distintos pero estrechamente relacionados no pueden permanecer juntos en forma
estable en una misma célula. Los plásmidos que no pueden coexistir forman parte del mismo
grupos de incompatibilidad. Los plásmidos que pertenecen al mismo grupo de incompatibilidad comparten el mecanismo de regulación de número de copias o el mecanismo de partición.
Hay numerosos grupos de incompatibilidad
44
Incompatibilidad
Diferente grupo de
incompatibilidad
Mismo grupo de
incompatibilidad
45
Hay distintos tipos de plásmidos en cuanto a genes extra que contienen y que le confieren al
hospedador un cierto fenotipo o una cierta capacidad.
46
Naturales
PLASMIDOS
Obtenidos por tecnología de ADN recombinante
Replicativos
Amplio o estrecho
rango de huésped
PLASMIDOS
Suicidas
47
Existen 3 formas de transferencia de ADN a una bacteria
TRANSFORMACION
TRANSDUCCION
CONJUGACION
48
Transformación
Lisis bacteriana
Extrucción de ADN por T4SS
Proceso por el cual el ADN libre
se incorpora en una célula
receptora y lleva a cabo un cambio
genético heredable.
Porque?
Nutrición
Adaptación
reparación
No todas las bacterias son transformables naturalmente.
Ejemplos de bacterias transformables naturalmente o naturalmente competentes: Bacillus,
Streptococcus, Haemophilus, Neisseria, Azotobacter, Pseudomonas
Célula competente: célula capaz de tomar
una molécula de ADN y ser
transformada.
La competencia natural depende de la especie, de la fase de crecimiento, del pH, etc.
Algunas especies presentan el 100% de las células en una cultivo competentes al final
de la fase exponencial (10-15´) (Streptococcus pneumoniae) y otras un 1-20 % de
células competentes y solo en fase Estacionaria (Bacillus subtilis)
En el proceso de transformación natural intervienen proteínas de membrana que
asocian ADN, autolisinas de pared celular, nucleasas.
49
Desarrollo de la competencia
Observado para Streptococcus pneumoniae, Bacillus subtilis (G+)
A medida que la célula crece, secreta al medio un péptido. Existen proteínas sensoras en la membrana celular
que sensan la concentración del péptido. Cuando el péptido llega a determinada concentración, esto es sensado
por las proteínas sensoras (mecanismo de quorum sensing) que transmiten la señal a una proteína reguladora
(sistema de regulación de dos componentes) que a su vez activa la transcripción de varios genes entre los que
se encuentran aquellos que codifican para la maquinaria necesaria para la captación del ADN exógeno, su
entrada y recombinación (proteínas unidoras del ADN cd, endonucleasas, exonucleasas, autolisinas de la pared,
canales de membrana, proteínas protectoras contra la degradación de la cadena simple que entra, proteínas
necesarias para la recombinación.
Sólo se puede transformar naturalmente con ADN doble cadena lineal.
Transformación natural es poco eficiente con plásmidos
El ADN se une como doble cadena
pero al citoplasma solo entra como
simple cadena
La captación de ADN es inespecífica
salvo para Neisseria y Haemophilus en
los que se reconoce una secuencia de
11 pb.
50
Gram (+)
En la transformación natural, entre el ADN simple cadena
(exogenote) y el cromosoma bacteriano ocurre una recombinación
homóloga no recíproca
51
Se puede inducir el estado de competencia: mecanismo de transformación distinto al que
ocurre en células naturalmente competentes.
Ej.: Tratamiento con Cl2Ca y shock térmico (E. coli).
Electroporación (distintas bacterias)
En el caso de competencia inducida se puede transformar con
plásmidos
Plásmidio replicable
Transformación
con plásmidos
Complementación o introducción de un gen nuevo
Complementación
Plásmido no replicable (suicida)
recombinación
mutación
Retomar al hablar de conjugación
52
Se debe tener un método de
selección
-
-
Eficiencia de
= número de colonias
Transformación
μg ADN
53
Existen 3 formas de transferencia de ADN a una bacteria
TRANSFORMACION
TRANSDUCCION
CONJUGACION
54
Transducción
Infección lítica y lisogénica
55
Generalizada
Transducción
Especializada
56
Formación de fago transductor para transducción generalizada
Fagos transductores:
Fago P1 y P22
Fago
transductor
57
Transducción generalizada
Selección en
Determinado
medio
Recombinación
Homóloga
(RecA)
58
Transducción especializada
Formación de fago transductor con fago atemperado
Fago lambda
Célula
lisogénica
Recombinación sitio
específica legítima
59
Transducción especializada
60
Existen 3 formas de transferencia de ADN a una bacteria
TRANSFORMACION
TRANSDUCCION
CONJUGACION
61
Conjugación
62
Plásmidos conjugativos (F en E. coli)
Conjugación en G (-)
4 etapas:
1) formación del par receptor-donor
2)Preparación para la transferencia
del ADN.
3)Transferencia del ADN.
4) Formación de una réplica funcional
en el aceptor.
Transconjugante
Conjugación en G(+): producción por parte de células
aceptoras de feromonas que inducen en la superficie de las
células donadoras la acumulación de sustancias de agregación que
median la unión entre los dos tipos celulares (Enterococcus)
63
(60 genes, 100kb)
Plásmido autotransferible o conjugativo (F):
llevan genes que permiten el contacto efectivo
y lleva la información necesaria para la
transferencia
Plásmido movilizable o transferible:
lleva parte de la información necesaria para la
transferencia y necesita de la ayuda de un
plásmido autotransferible para transferirse
(indispensable: origen de transferencia oriT).
Plásmido no transferible: no tiene los
genes necesarios para el efectivo
contacto ni para la transferencia del
ADN.
64
PLASMIDOS
Conjugación
Cl2Ca
Transformación
inducida
Electroporación
Autotransferibles (conjugativos y transferibles)
PLASMIDOS
Transferibles o movilizables
(necesito la presencia de otro autotransferible)
Conjugacón biparental y
triparental
Donación
65
Conjugación triparental
66
Conjugación
(como en transformación
con plásmidos)
Plásmido replicable
Complementación o introducción de gen nuevo
Complementación
Plásmido no replicable
(suicida)
recombinación
mutación
Tecnología de ADN recombinante
67
Conjugación
Medio de contraselección apropiado para seleccionar células
aceptoras (con la nueva información) y no las dadoras
Complementación
A-
Cm r
Cepa Aceptora
+
A
A
Vector Amp r
Replicativo
Vector de expresión
Cepa dadora con funciones
de conjugación
Conjugación biparental
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Conjugación
Medio de contraselección apropiado para seleccionar células
aceptoras (con la nueva información) y no las dadoras
Complementación
A-
Cm r
Aceptora
+
A
A
Vector Amp r
Replicativo
Medio c/Amp y c/ Cm
Crece aceptora con plásmido
Cepa dadora con funciones
de conjugación
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Mutación
E. coli (no crece en sacarosa)
Rhizobium
A
A
+
Crece en medio
Mínimo (MM)
con sacarosa
A-
Gm
Cepa dadora con funciones
de conjugación
Vector suicida en cepa aceptora
Ampr
70
Mutación
E. coli (no crece en sacarosa)
Rhizobium
A
A
+
Crece en medio
Mínimo (MM)
con sacarosa
A-
Gm
Cepa dadora con funciones
de conjugación
Vector suicida en cepa aceptora
Ampr
MM sacarosa
c/ Gm
Gmr Ampr
Un evento de recombinación
Gmr Amps
2 eventos de recombinación
Si en lugar de conjugación, introduzco el plásmido por transformación,
no se requiere usar un medio que no permita crecer E. coli
71
Integración
deleción
Un evento de recombinación
Gmr Ampr
Doble evento de recombinación
Gms Amps
Gmr Amps
72
Movilización del cromosoma
El plásmido F se puede integrar al cromosoma (episoma) y es capaz de transferir una
porción del cromosoma a una célula aceptora: Conducción y sexducción
F+: plásmido F no integrado (donadora)
F-: no tiene plásmido F (receptora)
Hfr: células que tienen el plásmido F integrado al cromosoma (conducción)
F´: Ocasionalmente el plásmido F integrado se puede escindir del cromosoma y existe la posibilidad de que se incorporen
al mismo genes cromosómicos adyacentes (donador si no perdió ninguno de los genes necesarios para el proceso)
(Sexducción)
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La integración del plásmido F al
cromosoma es a través de las
Secuencias de Inserción, IS,
que se encuentran tanto en el
plásmido como en determinados
lugares del cromosoma.
Recombinación homóloga
74
75
Existen diferentes secuencias de inserción y para cada tipo existen distintos sitios
en el cromosoma donde se pueden integrar, o sea se pueden tener diferentes cepas Hfr.
-
Como se detecta si hubo o
no transferencia de ADN
cromosómico y
recombinación
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Mediante el uso de una variedad de cepas Hfr se pudo determinar en E. coli la disposición (ubicación relativa
y orientación de un gran número de genes cromosómicos
Conjugación de:
Hfr a+ b+ c+ d+ e+ Strs
X
F- a- b- c- d- e- Strr
Producto de conjugación
(Se corta la conjugacion a distintos tiempos
por agitación)
Plaqueo en medio con estreptomicina
y todos los aa menos:
a
b
c
d
e
También se puede utilizar
la transducción generalizada
Para mapear el genoma de E. coli
77
78
Mutaciones
Transferencia de material genético
de un organismo a otro
Procesos que producen cambios en la
información genética de un organismo
y pueden tener como consecuencia un
cambio en su fenotipo y adaptación a
distintos ambientes.
Recombinación genética
Transposición
Estos procesos permiten el análisis de la
estructura génica de un organismo y tienen
importancia y uso para la construcción de
nuevos organismos con aplicaciones
prácticas.
79
Recombinación: proceso por el que, en parte o por completo, las
moléculas de ADN de dos fuentes distintas se intercambian o juntan
en una unidad. La información genética se ve redistribuida
RECOMBINACION GENERAL
U HOMOLOGA
RECOMBINACION SITIO ESPECIFICA
O NO HOMÓLOGA
-Recombinación sitio específica ilegitima
-Recombinación sitio específica legítima
Entre fragmentos iguales o muy similares
RecA
Resolvasas
Integrasas
Transposasas
Invertasas y más..
80
RECOMBINACION NO HOMÓLOGA
Recombinación sitio específica legítima
Recombinación sitio específica ilegítima
81
Integrasas (Integración de fago)
Recombinación sitio específico
legítima
Resolvasa (una etapa de la transposición replicativa )
Invertasas (inversión)
Integrasas
Invertasas
82
Mutaciones
Transferencia de material genético
de un organismo a otro
Procesos que producen cambios en la
información genética de un organismo
y pueden tener como consecuencia un
cambio en su fenotipo y adaptación a
distintos ambientes.
Recombinación genética
Transposición
Estos procesos permiten el análisis de la
estructura génica de un organismo y tienen
importancia y uso para la construcción de
nuevos organismos con aplicaciones
prácticas.
83
Recombinación sitio específico ilegítima
Transposasas
Transposición
El ADN de bacterias, virus y células eucariotas contienen elementos que se pueden
mover de un lugar a otro del mismo
El movimiento se llama transposición.
Secuencias de inserción
Transposones compuestos
Transposones no compuestos
Fago Mu
84
IR
Secuencias de inserción
Transposones compuestos
Tn5, Tn9, Tn10
IR
Transposasa
E.coli contiene distintos IS,
algunos estan repetidos.
se los encuentra tanto en cromosoma
como en los plásmidos
Transposones no compuestos
Tn3
85
8-38 pb
Reconocimiento del
blanco:
Transposasa
Target: 3-12 pb
No es específica respecto de la
secuencia del huésped. Es característico
el número de bases duplicadas para
cada transposón.
Algunos transposones saltan
preferentemente a regiones con
determinado enrollamiento o grado
de metilación.
Conservativo (Tn5 y IS)
Mecanismo de transposición
compuesto
Replicativo (Tn3, Fago Mu) (hay un intermediario)
No compuesto
86
Transposición replicativa
Transposición conservativa
Transposición
(Transposasas)
Recombinación sitio
específica ilegítima
Recombinación
sitio específica
legítima
(Resolvasas)
IS y transposones compuestos
Tn3 y fago Mu
87
Consecuencias de la transposición
Mutagénesis: Se utilizan transposones para mutagenizar. La resistencia a antibióticos
para la cual codifican es útil para seleccionar las mutantes. Se utilizan como portadores
del transposón, plásmidos suicidas. Se utilizan transposones modificados: miniTn5 (no
codifica para la transposasa).
Inducción de la expresión: por secuencias promotoras que contiene y que quedan
rio arriba de algún gen.
Rearreglos: por inserción de transposones compuestos
(deleciones e inversiones, nuevos transposones)
88
Mutagenesis generalizada por transposición
Rhizobium
E. Coli (no crece en sacarosa)
+
Crece en
MM sacarosa
Vector (suicida en rhizobium) AmpR
con Tn5 (Kmr)
Medio selectivo c/ Km
(MM Sac Km)
Plásmido suicida, selecciono
Evento de transposición
La transposasa del transposón es inactiva y va otra copia intacta en el plásmido fuera del transposón
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Consecuencias de la transposición
Mutagénesis: Se utilizan transposones para mutagenizar. La resistencia a antibióticos
para la cual codifican es útil para seleccionar las mutantes. Se utilizan como portadores
del transposón, plásmidos suicidas. Se utilizan transposones modificados: miniTn5 (no
codifica para la transposasa).
Inducción de la expresión: por secuencias promotoras que contiene y que quedan
rio arriba de algún gen.
Rearreglos: por inserción de transposones compuestos
(deleciones e inversiones, nuevos transposones)
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Rearreglos
Deleción
Creación de un “nuevo transposón”
Inversión
Out-side end transposition
(transposición externa)
In-side end transposition
(transposición interna)
91
Thomas D. Brock and Michael T. Madigan. Biología de los
Microorganismos
Prescot, Harley and Klein. Microbiology
Snyder and Champness. Molecular genetics of bacteria
92