RT-qPCR

TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
DIA 1. 5 de Octubre

Microarrays (Ricardo Gonzalo y Alex Sánchez)

RTqPCR (Paqui Gallego y Alex Sánchez)
Programa del Seminario RTqPCR-2011
 Definición de la técnica
 Terminología asociada a qPCR
 Diseñando un experimento de qPCR
 Etapas en la realización de un experimento de qPCR
 Evaluación de un ensayo de qPCR
 Bibliografía muy recomendada
Definición de la Técnica
PCR en tiempo real o qPCR o RT-qPCR
Termociclador
Cebadores
A G CU
T
Taq
polimerasa
Ácido nucléico
Nucleótidos
Tampón de
reacción
UNG
ROX
(opcional)
R
Sonda
Q
Agentes intercalantes
http://www.appliedbiosystems.com/support/apptech/#rt_pcr
con sistema de detección
ROX como referente pasivo
ROX=6-carboxy-X-rhodamine
+ ROX
- ROX
Δ Rn
Desv St= ± 0.306
Desv St= ± 0.059
Ciclos
Ciclos
Fluoróforo referente pasivo más comúnmente utilizado
para normalizar la fluorescencia específica en instrumentos de ABI y Stratagene.
Programa del Seminario RTqPCR-2011
 Definición de la técnica
 Terminología asociada a qPCR
 Diseñando un experimento de qPCR
 Etapas en la realización de un experimento de qPCR
 Evaluación de un ensayo de qPCR
 Bibliografía muy recomendada
Terminología asociada a qPCR
Escala semi-logarítmica
Plató
Ex
pon
en
cia
l
Rn
Log Fluorescence
al
e
n
Li
Baseline
Ct value= 15.5
Cycle Number
Threshold
RT-qPCR vs PCR Convencional
RT-qPCR
PCR Convencional

Semi-cuantitativa:


Rango dinámico pequeño ›2 logs
Baja Precisión; baja resolución y poco
Sensible.
Manipulación post-PCR .
Baja Resolución
No-automatización
Discriminación basada sólo en tamaño
Los resultados no están expresados en
números.
El BrET no es muy cuantitativo







Cualitativa y cuantitativa.
A tiempo real
(fase exponencial)



A tiempo final
Cuantificación Absoluta
Cuantificación Relativa
Plus/Minus
Elevado
rango dinámico de detección
(fase plató)
Discriminación Alélica
Capaz de detectar cambios 2-fold.
No requiere procesado post-PCR
Programa del Seminario RTqPCR-2011
 Definición de la técnica
 Terminología asociada a qPCR
 Diseñando un experimento de qPCR
 Etapas en la realización de un experimento de qPCR
 Evaluación de un ensayo de qPCR
 Bibliografía muy recomendada
Diseñando un experimento de qPCR
 Aplicación
 Método de Normalización
 Química de detección:

Sondas específicas marcadas con fluorocromos

Agentes Intercalantes

Fluorocromos unidos a primers
 Reactivos:

Core kit vs Master Mix

dNTPs/dUTPs y UNG enzyme

ROX como referente pasivo
 Termociclador:

Formato

Número de canales de detección

Software de análisis

Duración del programa

Precio y flexibilidad de la oferta
Aplicaciones RTqPCR
3´oligo
5´oligo
Proteína
Tejido
Target
mRNA
miRNA
ncRNA
siRNA
saRNA
CNA
Validación Microarrays
Célula
Eucariota
RNA
Análisis en Células Stem
Análisis en célula Única
DNA
Bacteria
Micoplasma
Patógenos en la comida
Virus
SNP
CNV
Mutaciones
Análisis Metilación
Estrategias de Normalización qPCR

Normalización respecto a la masa total de RNA exraído
(chequeo calidad –RIN, moleculas/ng RNA)

Normalización respecto al volumen/masa de la muestra
( moléculas/mg tejido; moléculas/ml sangre)

Normalización respecto al número de células
( moléculas/célula)

Normalización respecto a un gen endógeno no regulable
(GAPDH, tubulina, actina, albúmina, ciclofilina, micro-globulina, histonas, rRNA, ……)

Normalización respecto a más de un gen endógeno (›3)




geNorm (Vandesompele et al. 2002. Genome Biology)
BestKeeper (Pfaffl et. Al. 2004; Biotechnology Letters 2004)
Normfinder
Statistical modeling for selecting houskeeper genes (Szabo et al.2004, Genome Biology)
Genes and Immunity (2005) 6, 279-284. Review
BMC Bioinformatics 2009, 10:110
Plataforma de RTqPCR en la UCTS
7000 SDS
Formato
ROX
Química
FAM, TAMRA, VIC,
JOE, NED, SYBR, ROX
mode
9600 Emulation /Standard
Softwares
LightCycler 480
Tiras de 8 Tubos
Placas-96
Ref. Pasivo
7900HT Fast SDS
V1.2.3f2 con RQ study
Primer Express 2.0
Microfluidicas
(Arrays de baja densidad)
Placas-384
ROX
Formato 384-p: FAM, TAMRA,
VIC, JOE, NED, SYBR, ROX, TET.
Formato LDA: FAM, VIC, ROX.
9600 Emulation/Standard
Fast
SDS 2.4.1
RQ Manager 1.2
White Plates-384
Ninguno
Filtros/canales detección:
500, 533, 568, 610, 640, 670 nm
Fast
SW 1.5
La UCTS dispone de los siguientes reactivos:
Química:
UNG:
Mode:
SYBRGreen
SondasTaqMann
Sí
9600 Emulation/Standard
SondasTaqMann
Sí
Fast
Programa del Seminario RTqPCR-2011
 Definición de la técnica
 Terminología asociada a qPCR
 Diseñando un experimento de qPCR
 Etapas en la realización de un experimento de qPCR
 Evaluación de un ensayo de qPCR
 Bibliografía muy recomendada
Etapas Implicadas en la Realización de un ensayo de qPCR
Muestra
Preparación
Muestra
DNA
RNA
Extracción
Ác. Nucléicos
cDNA
Transcripción
Reversa (RT)
Producto
Amplificado
PCR a tiempo
Real (qPCR )
Preparación Material de partida
Muestra
Preparación
Muestra
DNA
RNA
Extracción
Ácidos Nucléicos
 Tipo de muestra
 Método Extracción
NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006
cDNA
Producto
Amplificado
Transcripción
Reversa (RT)
PCR a tiempo
Real (qPCR )
Preparación Material de partida
DNA
Muestra
RNA
Preparación
Muestra
cDNA
Extracción
Ácidos Nucléicos
 RNA total/mRNA/DNA
 Calidad & Cantidad
 Almacenamiento (-80ºC)
NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006
Producto
Amplificado
Transcripción
Reversa (RT)
PCR a tiempo
Real (qPCR )
Evaluación del RNA
RNA Q &Q
Pureza (ausencia
Integridad
de contaminación por
DNA y Proteínas y
ausencia de inhibidores)
• ODA260/A280=1.8-2.0
• OD A260/A230=2
• SPUD assay (Nolan, 2006)
• rRNA ( 28S:18S=2:1)
• Número RIN (› 5)
• Ensayo 3´:5´(alrededor de 1 indica
elevada integridad; ›5 degradado)
Molecular Aspects of Medicine 27 (2006) 126–139
PERFECTO
BUENO
10.0 9.2 8.1 7.2 6.0
MALO
5.0 4.4 4.0
2:1
Gel Desnt.
Agarosa
Cantidad
Agilent Bioanalyzer
• Existen dif. métodos de
cuantificación.
• Generan difs. resultados.
•Hay que cuantificar muestras
comparables entre sí con el
mismo método de cuantificación.
Expert Rev. Mol. Diagn. 5, 493-498 (2005)
Reacción de Transcripción Reversa (RT)
Muestra
Preparación
Muestra
RNA
cDNA
Extracción
Ácidos Nucléicos




NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006
Transcripción
Reversa (RT)
Producto
Amplifcado
PCR a tiempo
Real (qPCR )
One-Step vs Two Step
CDNA Priming
Pérfil Térmico
Consideraciones Experimentales
One Step RT-PCR vs Two Step RT-PCR
One-Step RT-PCR








RNA
RT
cDNA
qPCR
Producto Amplif.
Two-Step RT-PCR


RNA
cDNA
RT
Requiere una única mezcla de reacción ya que RT y PCR ocurren en el mismo
tubo.
AmpErase UNG no se puede usar.
Única enzima (ej. PolimerasaTth) RNA-y-DNA dependiente.
Minimiza tiempo de preparación y el riesgo de contaminación.
No es posible la optimización por separado de ambas reacciones.
Requiere primer RT específico de secuencia.
Menos sensible debido a la menor eficiencia de la actividad RT de la polimerasa.
Acumulación de dímeros de primers.
cDNA
qPCR
Producto Amplif.
NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006


Requiere dos mezclas de reacción (reacción RT y
reacción PCR).
Más flexible (El cDNA se puede guardar y ser usado
más tarde).
Permite la optimización por separado de ambas
reacciones.
Permite el uso de primer RT específico de secuencia,
random primers o oligo(dT).
Transcripción Reversa: cDNA Priming
Consideraciones Experimentales de la RT

En general, usar el RNA total como molde para la RT.

Dado que la eficiencia de RT depende del gen diana y de la enzima de RT, es muy
importante usar siempre el mismo enzima RT, los mismos primers para la síntesis
de cDNA y las mismas condiciones experimentales si se quieren comparar
resultados entre sí.

Hacer réplicas

Incluir siempre control no-RT

Añadir la misma cantidad de RNA total en cada reacción.

Siempre que sea posible, montar las reacciones de RT de todas las muestras al
mismo tiempo para evitar la variación entre tandas.

Cuando se procesan múltiples muestras en diferentes tandas, incluir una muestra
control positiva de referencia en todas las tandas.
NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006
qPCR
Muestra
Preparación
Muestra
RNA
cDNA
Extracción
Ácidos Nucléicos
Transcripción
Reversa (RT)
Producto
Amplifcado
PCR a tiempo
Real (qPCR )
 Elección en el software del ensayo a realizar
 Perfil Térmico
 Consideraciones Experimentales
NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006
Elección en el software del ensayo a realizar
7000 SDS de ABI
7900 SDS de ABI
Con Curva Stándard
7000 SDS de ABI
Absolute Quantification
(Standard Curve)
7900 SDS de ABI
Standard Curve (AQ)
Elección en el software del ensayo a realizar
7000 SDS de ABI
7900 SDS de ABI
ddCt
7000 SDS
Relative Quantification (ddCt) Plate
Relative Quantification (ddCt) Study
7900 SDS
∆∆Ct (RQ)
LightCycler 480 II
Perfil térmico clásico qPCR
Perfil térmico que incluye paso de Activación UNG
1.- Activación UNG
2.- Activación Taq y desnaturalización UNG
3.- Desnaturalización del dsDNA
4.- Anillamiento y extensión primers
Consideraciones qPCR

Cuando se procesan múltiples muestras en diferentes placas, la inclusión de una muestra
calibradora o curva estándar en cada placa es un control importante para medir la
variabilidad inter-ensayo.

Duplicados técnicos son generalmente suficientes (Triplicados si Cts›35). Si las réplicas
difieren ›0.5 Ct, las reacciones deberían repetirse. Son más importantes los duplicados
biológicos.

Incluir Controles negativo (NTC) y positivos. Cargar el NTC en el pocillo que esté más
distanciado de aquel que contenga mayor concentración de cDNA para evitar contaminación
cruzada.

Preparar mezcla de reacción de pcr en laboratorio diferente de donde se manipule el cDNA.

Es siempre mejor no esperar demasiado en correr un run de qPCR después de la preparación
de la placa. Si necesitas comparar dos placas idénticas con diferente ciclo de temperaturas,
es mejor prepararlas al mismo tiempo, y guardar una de ellas a 4ºC protegido de la luz hasta
10 horas.

Especial atención en el sellado de la placa para evitar evaporaciones y evitar marcas y
huellas en la parte superior del cobertor/tapa.
NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006
Real-Time PCR Aplications Guide from Bio-Rad
Programa del Seminario RTqPCR-2011
 Definición de la técnica
 Terminología asociada a qPCR
 Diseñando un experimento de qPCR
 Etapas en la realización de un experimento de qPCR
 Evaluación de un ensayo de qPCR
 Bibliografía muy recomendada
Etapas Implicadas en la Realización de un ensayo de qPCR
Producto
Amplificado
DNA
Muestra
Preparación
Muestra
RNA
Extracción
Ác. Nucléicos
cDNA
Transcripción
Reversa (RT)
PCR a tiempo Real
(qPCR )
Análisis
de datos
Calidad del
Ensayo
Métodos de
Cuantificación
Estadística
Calidad del Ensayo
 Reproducibilidad (viene indicada por las réplicas)
 Controles qPCR
NEGATIVOS

NTC (Non Template Control)

NAC (Non Amplif. Control)

No RT (No RT control)
Detección de dímeros de primers y contaminación
Detección de degradación de sondas
Detección de contaminación por DNA genómico
POSITIVOS

Control Endógeno Testado de la calidad de los reactivos. Usado también para normalizar.

Control Exógeno Testado de la calidad de los reactivos

Spiking Control Detecta presencia de inhibidores
 Curva de Disociación (SYBR Green)
 Curva Estándar



Linealidad de los datos
Distancia entre las curvas de amplificación
Eficiencia de amplificación
Calidad del Ensayo
Curva Estándard:
R2 ›0.98 o r › 0.99
Slope= -3.73
Pendiente
Eficiencia
Amplificación
Convertir E en
Porcentaje
-3,0
(E= 10-1/slope)
2,2
%E= (E-1)100%
115
-3,1
2,1
110
-3,2
2,1
105
-3,3
2,0
101
-3,32
2,0
100
-3,4
2,0
97
-3,6
1,9
90
-3,7
1,9
86
-4
1,8
78
2n=Factor de dilución
Factor
Dilución
n=LG(Factor Dil.)/LG(2)
2
1,00
5
2,32
10
3,32
OK
Métodos de Cuantificación
Cuantificación Absoluta
Cuantificación Relativa
Cantidad de ácido nucléico (número de
copias, µg) por cantidad de muestra
dada (por célula, por µg de RNA total)
Cantidad relativa de ácido nucléico
de una muestra A
respecto a una muestra B
Ejemplo: Niveles de expresión génica
en Tumor vs Tejido normal.
Ejemplo: medida carga viral
A.- Cuantificación Relativa con Curva Stándard:
106
105
104
103
102
10
Qty gen problema
Muestra Problema =
Qty gen EC
Calibradora =
Qty gen problema
Qty gen EC
B.- Método Pfaffl:
RQ =
Ct
(Egen diana) dCT, gen diana (calibradora – muestra
(Egen EC)
problema)
dCT, gen EC (calibradora – muestra problema)
C.- Método (Livak) Doble Delta CT:
dCT = CT(gen diana) – CT(gen EC)
Log (Num de copias)
ddCT = dCT(muestra problema) – dCT (calibradora)
RQ= 2–ddCT
Eficiencias del Gen Target vs Eficiencia gen EC
ΔCt=
(Ct gen Target – Ct gen Endógeno)
Slope
R2
Y = 0.0471x + 3.0178
R2 = 0.2315
Log Diluciones
RTqPCR en tela de juicio
Routine lab method’s accuracy called into
question
NATURE MEDICINE VOL 16,page 349 APRIL 2010
Catherine Shaffer
Ejemplos:
1) Potential viral pathogenic mechanism for new variant inflammatory bowel disease
V Uhlmann et al. Mol Pathol 2002;55:84–90
Estudio que causó una polémica en 1998 al sugerir un vínculo entre la vacuna triple vírica y el autismo.
RT-qPCR and molecular diagnostics: no evidence for measles virus in the GI tract of autistic
children.
S.A. Bustin. Eur Pharm Rev Dig 1 (2008) 11-16.
2) The mRNA of the Arabidopsis Gene FT Moves from Leaf to Shoot Apex and Induces
flowering.
Huang et al. Science 309 September 2005: 1694-1696
“Breakthrough of the Year 2005”, the runners-up. Science 310:1880-1885
Retraction of Hung et al., Science 309 (5741) 1694-1696.
H. Bohlenius et al. Sience 316 April 2007:367.
Diseño y Optimización de un experimento de RTqPCR
MIQE Guidelines
Programa del Seminario RTqPCR-2011
 Definición de la técnica
 Terminología asociada a qPCR
 Diseñando un experimento de qPCR
 Etapas en la realización de un experimento de qPCR
 Evaluación de un ensayo de qPCR
 Bibliografía muy recomendada
Direcciones de interés relacionadas con qPCR
http://qpcr.gene-quantification.info/
http://genex.gene-quantification.info/
http://www.horizonpress.com/pcr/qPCR-machines.html
qPCR-Technical-Guide.pdf (Sigma Life Science)
http://www.eurogentec.com
http://www.dorak.info/genetics/glosrt.html
Seminario RTqPCR
18 de Octubre en VHIR
Prof. Michael Kubista
Está entre los pioneros que desarrollaron la RTqPCR
Gracias