universidad nacional autónoma de méxico electroforesis
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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN ELECTROFORESIS: UNA HERRAMIENTA APLICADA AL DIAGNÓSTICO CLÍNICO TRABAJO PROFESIONAL QUE PARA OBTENER EL TITULO DE: QUÍMICA FARMACEÚTICA BIÓLOGA PRESENTA: DIANA CORDERO SEVILLA ASESOR: Q.F.B. MARTHA PATRICIA CAMPOS PEON CUAUTITLAN IZCALLI, EDO. DE MÉXICO 2010 AGRADECIMIENTOS A la Universidad Nacional Autónoma de México y a la Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán, por mi formación profesional. A todos y cada uno de los profesores de la FESC que realizan su labor con convicción y por los cuales aprendí a amar profundamente esta profesión. A la profesora Martha Patricia Campos Peón por su tiempo, apoyo y enseñanzas. A los sinodales por su valiosa colaboración en la conclusión del presente trabajo. A CARPERMOR por brindarme la oportunidad de desempeñarme como profesionista, así como por su flexibilidad y apoyo para el desarrollo de este trabajo. A todas aquellas personas que son parte fundamental en mi vida y que contribuyeron a que lograra uno de mis más grandes sueños. Muchas gracias DEDICATORIAS A mi madre: Este logro es principalmente gracias a ti, ya que nunca dejaste que mis sueños se desvanecieran. Gracias por tu inmenso amor, confianza, paciencia y sacrificios. Doy gracias a Dios por permitirme crecer y aprender al lado de una mujer como tú. TE AMO. A mis hermanos Angélica y José Luis: Gracias por darme todo su amor, confianza y consejos a lo largo de mi vida. A mis angelitos Santiago, Diego, Atzin y Angel, por darle alegría a mi vida. LOS AMO A mis amigos Gracias por estar conmigo, son tesoros invaluables en mi vida. A tí, que tuvimos un mismo sueño, y estoy segura que desde el cielo compartes mi alegría. INDICE 1. OBJETIVO...................................................................................................................................................... 1 2. INTRODUCCION............................................................................................................................................ 2 2.1 ELECTROFORESIS ..................................................................................................................................... 2 2.1.1 Antecedentes ........................................................................................................................................ 2 2.1.2 Principio ................................................................................................................................................ 2 2.2 HEMOGLOBINA ........................................................................................................................................... 7 2.2.1 Sintesis del grupo HEMO...................................................................................................................... 7 2.2.2 Síntesis de la globina ............................................................................................................................ 8 2.2.3 Estructura y función de la hemoglobina ................................................................................................ 8 2.2.4 Hemoglobinas normales ....................................................................................................................... 9 2.2.5 Anormalidades cualitativas ...................................................................................................................... 10 2.2.5.1 Hemoglobinopatías beta .................................................................................................................. 12 2.2.5.2 Anemia drepanocítica ...................................................................................................................... 12 2.2.5.3 Rasgo drepanocítico ........................................................................................................................ 14 2.2.5.4 Enfermedad de la Hemoglobina C ................................................................................................... 15 2.2.5.5 Rasgo de la Hemoglobina C ............................................................................................................ 15 2.2.5.6 Hemoglobina D ................................................................................................................................ 16 2.2.5.7 Enfermedad y rasgo de la Hemoglobina E....................................................................................... 16 2.2.6 Anormalidades cualtitativas ..................................................................................................................... 16 2.2.6.1 Talasemias alfa ................................................................................................................................ 17 2.2.6.2 Talasemias beta............................................................................................................................... 19 2.3 PROTEINAS ............................................................................................................................................... 20 2.3.1 Estructura proteica .............................................................................................................................. 20 2.3.2 Función ............................................................................................................................................... 22 2.3.3 Clasificación ........................................................................................................................................ 22 2.3.4 Separación por electroforesis ............................................................................................................. 22 2.3.5 Fracciones de proteínas séricas ......................................................................................................... 24 2.3.6 Características electroforéticas de proteínas séricas en ciertas condiciones clínicas ........................ 27 2.3.7 Proteínas urinarias .............................................................................................................................. 31 2.3.8 Proteínas en Líquido cefalorraquídeo ................................................................................................. 32 2.3.9 Inmunofijación de proteínas ................................................................................................................ 34 2.4 LIPOPROTEÍNAS ....................................................................................................................................... 37 2.4.1 Hiperlipoproteinemias primarias.......................................................................................................... 38 2.4.2 Hiperlipoproteinemias secundarias ..................................................................................................... 39 2.5 ISOENZIMAS DE FOSFATASA ALCALINA ............................................................................................... 41 2.5.1 Isoenzima hepática ............................................................................................................................. 41 2.5.2 Isoenzima ósea ................................................................................................................................... 41 2.5.3 Isoenzima intestinal............................................................................................................................. 42 2.5.4 Isoenzima placentaria ......................................................................................................................... 42 2.6 ISOENZIMAS DE CREATIN CINASA......................................................................................................... 43 3. DESCRIPCIÓN DEL DESEMPEÑO PROFESIONAL .................................................................................. 45 3.1 METODOLOGIA ......................................................................................................................................... 49 3.1.1 Material, reactivo y equipo general ..................................................................................................... 49 3.1.2 Electroforesis de Hemoglobina alcalina .............................................................................................. 50 3.1.3 Electroforesis de Proteínas en suero, líquido cefalorraquídeo y orina ................................................ 55 3.1.4 Electroforesis de Lipoporteínas........................................................................................................... 60 3.1.5 Electroforesis de isoenzimas de CK.................................................................................................... 64 3.1.6 Electroforesis de isoenzimas de Fosfatasa alcalina............................................................................ 68 3.1.7 Inmunofijación, Bandas oligoclonales y Proteína de Bence Jones ..................................................... 72 3.2 RESULTADOS: INTERPRETACIÓN Y ANÁLISIS ..................................................................................... 77 3.2.1 Electorforesis de Hemoglobina .......................................................................................................... 77 3.2.2 Electroforesis de Proteínas ................................................................................................................ 86 3.2.3 Electroforesis de Lipoproteínas.......................................................................................................... 95 3.2.4 Electroforesis de isoenzimas de CK................................................................................................. 101 3.2.5 Electroforesis de isoenzimas de Fosfatasa Alcalina ........................................................................ 107 3.2.6 Inmunofijación de Proteínas............................................................................................................. 112 3.2.7 Bandas oligoclonales ....................................................................................................................... 114 3.2.8 Proteína de Bence Jones ................................................................................................................. 116 4. CONCLUSIONES ....................................................................................................................................... 119 5. RECOMENDACIONES............................................................................................................................... 121 6. REFERENCIAS .......................................................................................................................................... 127 ANEXO 1. Valores de referencia de materiales de control empleados en electroforesis en gel de agarosa . 122 ANEXO 2. Rangos de referencia establecidos por el laboratorio para las diferentes determinaciones electroforéticas........................................................................................................................................... 124 ANEXO 3. Abreviaturas .................................................................................................................................. 126 INDICE DE FIGURAS FIGURA 1. Molécula de hemoglobina ................................................................................................................ 8 FIGURA 2. Estructura de la Hemoglobina .......................................................................................................... 9 FIGURA 3. Concentrador Minicon para orina y LCR ........................................................................................ 57 FIGURA 4. Equipo de electroforesis "Spife 3000" ............................................................................................ 76 FIGURA 5. Interpretación de las diferentes bandas en la electroforesis de Hemoglobina en medio alcalino.............................................................................................................................................................. 77 FIGURA 6. Corrimiento electroforético de las diversas variantes de hemoglobina en medio ácido y alcalino . 78 FIGURA 7. Gel de electroforesis de Hemoglobina en medio alcalino............................................................... 79 FIGURA 8. Gel de electroforesis de Hemoglobina en medio ácido .................................................................. 80 FIGURA 9. Interpretación de las diferentes fracciones de proteínas en suero ................................................. 86 FIGURA 10. Gel de electroforesis de Proteínas en suero ................................................................................ 86 FIGURA 11. Interpretación de las diferentes bandas en Electroforesis de Lipoproteínas ................................ 95 FIGURA 12. Gel de electroforesis de Lipoproteínas en suero.......................................................................... 95 FIGURA 13. Interpretación de las diferentes bandas de isoenzimas de CK................................................... 101 FIGURA 14. Electroforesis de isoenzimas de CK por el método de QG Spife CK Vis .................................. 101 FIGURA 15. Gel de electroforesis de isoenzimas de CK................................................................................ 102 FIGURA 16. Interpretación de las diferentes bandas de Isoenzimas de ALP................................................. 107 FIGURA 17. Gel de electroforesis de isoenzimas de Fosfatasa Alcalina (ALP) ............................................. 108 FIGURA 18. Paciente 1 y 2 de inmunofijación de proteínas en ausencia de componentes monoclonales .... 112 FIGURA 19. Paciente 3 Inmunofijación de proteínas con presencia de componentes monoclonales (IgG/lambda)................................................................................................................................................... 112 FIGURA 20. Paciente con bandas oligiclonales ausentes.............................................................................. 114 FIGURA 21. Paciente con bandas oligoclonales presentes ........................................................................... 114 FIGURA 22. Paciente con ausencia de la Proteína de Bence Jones ............................................................. 116 FIGURA 23. Paciente con Proteína de Bence Jones Positiva........................................................................ 116 INDICE DE GRÁFICAS GRÁFICA 1. Control de Hemoglobina FASC en medio alcalino....................................................................... 81 GRÁFICA 2. Paciente con patrón de hemoglobina normal............................................................................... 82 GRÁFICA 3. Paciente con incremento en la fracción de Hb A2 ........................................................................ 83 GRÁFICA 4. Paciente con incremento en la fracción de Hb A2 ........................................................................ 83 GRÁFICA 5. Paciente con un patrón anormal con presencia de Hb A, Hb F y Hb S ....................................... 84 GRÁFICA 6. Paciente con un patrón anormal con presencia de Hb A y Hb F ................................................. 85 GRÁFICA 7. Control Normal de Proteínas ....................................................................................................... 87 GRÁFICA 8. Control Anormal de Proteínas...................................................................................................... 88 GRÁFICA 9. Paciente en el cual se observa la presencia de una banda monoclonal...................................... 89 GRÁFICA 10. Paciente en el cual se observa un incremento en las fracciones alfa 2, beta y gamma ............ 90 GRÁFICA 11. Paciente con un patrón de electroforesis de Proteínas normal.................................................. 91 GRÁFICA 12. Paciente en el cual se observa la presencia de una banda monoclona .................................... 92 GRÁFICA 13. Paciente el cual se observa un incremento de las fracciones Alfa 2, Beta y Gamma................ 94 GRÁFICA 14. Control de Lipoproteínas LIPOTROL ......................................................................................... 96 GRÁFICA 15. Paciente que presenta un incremento en la fracción alfa de Lipoproteínas............................... 97 GRÁFICA 16. Paciente el cual presenta un incremento de la fracción Pre-beta de Lipoporteínas .................. 98 GRÁFICA 17. Paciente con patrón normal de Lipoporteínas ........................................................................... 99 GRÁFICA 18. Paciente con incremento en la fracción alfa de Lipoporteínas................................................. 100 GRÁFICA 19. Control de isoenzimas de Creatin cinasa (CK) ........................................................................ 103 GRÁFICA 20. Paciente que presenta una CK atípica y una CK-MB .............................................................. 104 GRÁFICA 21. Paciente con un patrón de isoenzimas de CK normal ............................................................. 105 GRÁFICA 22. Paciente que presenta la fracción de CK-BB........................................................................... 106 GRÁFICA 23. Paciente de isoenzimas de fosfatasa alcalina con presencia de las fracciones ósea, hepática y macrohepática ................................................................................................................................................ 109 GRÁFICA 24. Paciente de isoenzimas de fosfatasa alcalina con presencia de las fracciones hepática y ósea ........................................................................................................................................................................ 110 GRÁFICA 25. Electroforesis de Proteínas de paciente con proteína de Bence Jones................................... 117 INDICE DE TABLAS TABLA 1. Fracciones proteicas obtenidas mediante electroforesis.................................................................. 30 TABLA 2. Descripción de las funciones del Químico Analista en Carpermor ................................................... 46 TABLA 3. Factores de Concentración para Proteínas en orina ........................................................................ 56 TABLA 4. Límites de referencia establecidos para el control FASC en medio alcalino .................................. 122 TABLA 5. Límites de referencia establecidos para el control Normal de Proteínas........................................ 122 TABLA 6. Límites de referencia establecidos para el control Anormal de Proteínas...................................... 122 TABLA 7. Límites de referencia establecidos para el control LIPOTROL....................................................... 123 TABLA 8. Límites dereferncia establecidos para el control CK/LD................................................................. 123 TABLA 9. Rangos de referencia para las fracciones de Hemoglobina en medio alcalino .............................. 124 TABLA 10. Rangos de referencia para las fracciones de Proteínas en suero ................................................ 124 TABLA 11. Rangos de referencia para las fracciones de Lipoproteínas......................................................... 124 TABLA 12. Rangos de referencia para las fracciones de isoenzimas de CK ................................................. 125 TABLA 13. Rangos de referencia para las fracciones isoenzimas de Fosfatasa Alcalina .............................. 125 2. INTRODUCCIÓN 2.1 ELECTROFORESIS 2.1.1 ANTECEDENTES El término electroforesis fue creado por Michaelis en el año de 1909, para describir la migración de los iones por la influencia de un campo eléctrico.(27) En 1879, Helmholz sugirió la existencia de una doble capa eléctrica en la interfase de solvente y sólido, pero fue hasta 1930 cuando un grupo de físicos suecos lo llevó a la práctica, diseñando los primeros instrumentos electroforéticos. Theorell y Tiselius desarrollaron aparatos para electroforesis preparativa y analítica en fase líquida, la cual consistió en la separación de proteínas disueltas en una solución de electrolitos mediante la aplicación de una corriente eléctrica a través de un tubo de cuarzo en forma de U que contenía la solución proteica. A pH 7.6 fueron identificadas cuatro fracciones proteicas en el suero, denominadas albúmina, α, β y γ y se cuantificaron ópticamente por modificaciones en el índice de refracción en los límites entre estas bandas. Debido a que la separación se realizó en una separación homogénea, sin medio de soporte sólido, las fuerzas convectivas evitaron las resolución en distintas zonas. Sin embargo esta técnica resultaba costosa, difíciles de manejar, y requerían grandes cantidades de muestra. El uso de la electroforesis en la práctica clínica avanzó notablemente cuando se introdujo a principios de la década de 1940 la idea de utilizar un soporte poroso. (electroforesis de zona). El primer medio de soporte fue papel y durante decenios se emplearon numerosos materiales para separar prácticamente cualquier molécula cargada. Hoy en día los soportes más ampliamente utilizados son el acetato de celulosa, almidón, acrilamida, agar y agarosa.(1) 2.1.2 PRINCIPIO Se denomina electroforesis al método de separación mediante el transporte de partículas en un campo eléctrico. Cualquier ión o molécula cargada eléctricamente migrará cuando se someta a la 2 acción de dicho campo. A un pH determinado, muchas moléculas biológicas poseen carga eléctrica, cuya magnitud depende del pH y composición del medio en que se encuentren. (17) La electroforesis se aplica en el campo de la Bioquímica a la separación de compuestos que poseen grupos ionizables (aminoácidos, péptidos, proteínas, ácidos nucleicos) teniendo en cuenta que la carga neta de estas sustancias depende del pH del medio en que se encuentren. Si la molécula tiene carga positiva migrará hacia el cátodo y si tiene carga negativa, hacia el ánodo. La fuerza iónica de la solución tampón tiene una importancia fundamental en la electroforesis, puesto que cuando es baja, permite velocidades de migración de los solutos más rápidas y con menor desprendimiento de calor.(27) Las proteínas están compuestas de aminoácidos que poseen grupos ionizables (principalmente COO- y -NH3+) y pueden encontrarse cargadas positiva o negativamente, o bien permanecer eléctricamente neutras según la proporción de los diversos grupos ionizados a un determinado pH. En su punto isoeléctrico (pI ó pHI), la proteína tiene carga neta cero. Por debajo de pI las proteínas estarán cargadas positivamente y por encima del pI negativamente. (27) Es decir, cuando una molécula cargada se coloca en un campo eléctrico se moverá hacia uno u otro electrodo dependiendo de: 1) La carga eléctrica: La presencia de aminoácidos de diferentes grupos bioquímicos otorga a una determinada proteína una carga neta totalmente diferente a otra, compuesta por diferentes grupos de aminoácidos. Debido a que en la electroforesis, las muestras son sometidas a un determinado campo eléctrico, la migración de las proteínas en el gel dependerá básicamente de su carga y no de su peso molecular. Para evitar este efecto, es importante igualar la carga neta de todas las proteínas aprovechando sus propiedades anfotéricas. En ese sentido, el SDS evita el efecto de diferencias de carga entre las proteínas, a fin de favorecer la separación de ésta únicamente por su peso molecular. (27) 2) El tamaño: Las proteínas tienen características moleculares que actúan como factores intrínsecos durante la electroforesis alterando su migración y generando bandas de diferentes tamaños, que no necesariamente van acorde al peso molecular real del polipéptido. Ciertas modificaciones 3 postraduccionales, multimerización y formación de complejos con otro tipo de moléculas generan modificaciones en el tamaño de la proteína dando pesos moleculares aparentes en el momento del análisis.(27) 3) La intensidad del campo eléctrico: Es la fuerza que determina el movimiento o migración de la proteína a través del campo eléctrico. Su unidad de medición es voltios/cm y es por esa razón que la tasa de migración de una proteína puede ser alterada cambiando tanto la distancia comprendida entre los electrodos (cm) como el potencial eléctrico del sistema (Voltaje). Del mismo modo, los valores de la intensidad del campo eléctrico dependen de la fuerza direccional (Fa) y de la carga neta de la molécula (Q). (27) Puede ser calculada a través de la siguiente fórmula: E = Fa/Q E= v/d Donde: Fa = Fuerza direccional. v = voltios. d = distancia de los electrodos (en centímetros) Q = carga en (coulomb)(26) 4) La temperatura del medio: Depende básicamente del voltaje de la electroforesis, la concentración de sales (poder de conductancia) del tampón y del pH.(27) La velocidad de migración (V) de la partícula es directamente proporcional al producto de su carga efectiva (q) y el gradiente de potencial eléctrico (E) e inversamente proporcional al coeficiente de fricción (f) relativo al tamaño y forma de la molécula, es decir, a la resistencia que le ofrece el medio.(18) V = qE/f 4 Existen varios tipos de electroforesis, sin embargo en el presente trabajo nos enfocaremos a una en específico, electroforesis de zona.(17) En esta técnica, la muestra está obligada a desplazarse sobre un soporte sólido de papel, celulosa o gel. La pequeña cantidad necesaria de muestra permite que las moléculas migren en discretas zonas o bandas. La electroforesis zonal de biomoléculas cargadas, generalmente se lleva a cabo en una disolución estabilizada con un medio que sirve de soporte.(17) Un gel es un medio de soporte que se encuentra en un estado intermedio entre el sólido y el líquido. Este tipo de electroforesis se halla entre los métodos más resolutivos y convenientes empleados en la separación de macromoléculas. Los geles de uso más generalizado son: poliacrilamida y agarosa. Éstos poseen poros de diferentes dimensiones moleculares que delimitan la velocidad de migración y moléculas trasladadas durante el proceso electroforético. De esta forma, la separación no se produce sólo por las diferentes cargas de las moléculas, sino también por las diferencias de tamaño. Los geles están formados por un reticulado de polímeros (constituyendo una red enmarañada) y el líquido intersticial en el que se encuentra inmerso esta red.(17) Los geles de poliacrilamida se forman por la copolimerización de la acrilamida y la bis-acrilamida en presencia de persulfato de amonio y tetrametiletilendiamina (TEMED), siendo este último un catalizador de la liberación de radicales libres del persulfato, e iniciador de la polimerización. La combinación adecuada de acrilamida y bis-acrilamida, permitirá determinar características tales como densidad, elasticidad, resistencia mecánica y tamaño de los poros. Estas cualidades permiten definir el tamaño de las moléculas que migraran a través del gel. En general, se puede decir que las cualidades más atractivas para hacer uso de la poliacrilamida son la presencia de mayor poder de resolución, amplia variación en el diámetro de los poros, cuantificación de la concentración proteínica y de la actividad enzimática, a través de las técnicas de densitometría. Sin embargo, estos monómeros son compuestos extremadamente tóxicos en solución, y requieren de un manejo muy cuidadoso por parte del usuario. (27) La agarosa es un polisacárido extraído de las algas marinas, empleado a una concentración de 0.5 – 2 %. (27) 5 Existe una gran variedad de tipos de electroforesis en gel, que se pueden agrupar en dos categorías: • Electroforesis en gel en una dimensión (continuo o discontinuo) o PAGE-nativa o SDS-PAGE o Isoelectroenfoque • Electroforesis en gel en dos dimensiones (bidimensional)(17) Según las aplicaciones u objetivos que se pretendan conseguir en una práctica o experimento, se utilizará un tipo u otro de electroforesis en gel. Los geles discontinuos mejoran la resolución de la electroforesis pues se consigue agudizar las bandas en gran medida por el uso de dos geles y dos tampones diferentes.(17) La PAGE-nativa se utiliza para separar proteínas en condiciones no desnaturalizantes, por tanto, en función de la carga intrínseca de las mismas. La SDS-PAGE es muy útil para calcular el peso molecular de una proteína concreta ya que separa las proteínas según su tamaño, es una técnica muy utilizada para investigación en biología molecular y debido a su alto poder de resolución y separación de proteínas en multitud de subunidades, esta técnica no se utiliza de modo rutinario en el laboratorio clínico (1). El isoelectroenfoque es un tipo de PAGE en una dimensión que se basa en la separación de moléculas de acuerdo a sus diferentes puntos isoeléctricos. (17) Mediante esta técnica las proteínas migran a través de un gel que contiene un gradiente de pH establecido con una mezcla de anfolitos. A medida que cada proteína alcanza su localización en el gel, en la que el pH es igual a su pI, la carga neta se convierte en cero; cesa la fuerza electromotriz que actúa sobre ella y queda en reposo. De este modo el patrón final depende estrictamente del punto isoeléctrico. (1) La aplicación más importante de la electroforesis en clínica es la separación de constituyentes del plasma y otros líquidos corporales. Si bien con esta técnica es posible la separación de moléculas que difieren en sus cargas, la combinación con otras produce un aumento del poder analítico de este método. Así, la combinación de electroforesis y reacciones inmunológicas posibilita la identificación de distintos componentes que poseen movilidad electroforética semejante, pero determinantes antigénicos diferentes.(17) 6 De esta manera, con técnicas electroforéticas, es posible separar los diferentes componentes de una mezcla de aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos y otras biomoléculas cargadas.(1) En el presente trabajo se presentaran los principales analitos separados por electroforesis en el área clínica, como son Hemoglobina, Proteínas, Lipoproteínas y algunas Isoenzimas, por lo que es importante conocer algunos antecedentes referentes a las mismas. 2.2 HEMOGLOBINA La Hemoglobina es una molécula integrada por dos pares de cadenas polipeptídicas. Cada cadena está ligada al grupo HEMO, el cual está compuesto por un núcleo tetrapirrólico (porfirina) al que está unido un átomo de hierro. Es un grupo de proteínas que tienen la función de transportar oxígeno desde pulmones a los tejidos y dióxido de carbono en sentido contrario.(2) La síntesis del grupo Hemo se lleva a cabo en la mayoría de las células corporales, excepto en los eritrocitos maduros, pero sobre todo en los precursores eritroides(3). 2.2.1 SINTESIS DEL GRUPO HEMO La succinilcoenzima A se condensa con la glicina para formar un compuesto intermedio inestable, el ácido αamino-β-cetoadípico, que es descarboxilado para dar ácido δ- aminolevulínico (ALA). Esta condensación requiere de fosfato de piridoxal (Vitamina B6) y tiene lugar en las mitocondrias.(3) El ALA se excreta normalmente por la orina en pequeñas cantidades y su excreción aumenta en ciertas anormalidades de la síntesis de Hem (Por ejemplo, intoxicación con plomo). Dos moléculas de ALA se condensan para formar monopirrol, porfobilinógeno, catalizado por la enzima ALA-deshidrasa. El porfobilinógeno también se excreta por la orina en pequeñas cantidades. Para formar Uroporfirinógeno III o I, reaccionan cuatro moléculas de porfobilinógeno. El isómero tipo III se convierte por la vía de coproporfirinógeno III y protoporfirinógeno en protoporfirina.(3) La protoporfirina se suele encontrar en los eritrocitos maduros. El hierro se inserta en la molécula de protoporfirina mediante la enzima mitocondrial ferroquelatasa para formar parte de la molécula Hem completa (Fig 1) (3). 7 FIG No. 1 Molécula del grupo hemo 2.2.2 SÍNTESIS DE LA GLOBINA La síntesis de globina se produce en el citoplasma de los eritroblastos y de los reticulocitos. Las cadenas de polipéptidos se sintetizan en los ribosomas. Las pequeñas moléculas específicas de RNAt (RNA transferencia) se unen a cada aminoácido y determinan el lugar del mismo de acuerdo con el código de RNAm (RNA mensajero). El crecimiento progresivo de la cadena de aminoácidos empieza en el grupo amino final. Este proceso de síntesis proteica sucede en los ribosomas que están agregados como polirribososmas. Estos se mantienen juntos mediante la unión del RNAm. Ya que el retículo puede sintetizar Hemoglobina durante algunos días después de perder su núcleo, parece que el RNAm para la Hemoglobina es bastante estable. Las cadenas polipéptidicas liberadas de los ribosomas se pliegan de forma espontánea en una configuración tridimensional (3). El control de la síntesis de Hemoglobina se ejerce primariamente por la acción del grupo Hem. El aumento de Hem inhibe la síntesis de este grupo al inhibir la actividad y síntesis de ALA-sintetasa. El Hem también estimula la síntesis de globina, sobre todo en la zona de comienzo de la cadena, y la interacción de los ribosomas con el RNAm.(3) 2.2.3 ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE LA HEMOGLOBINA La Hemoglobina A del adulto normal consta de cuatro grupos Hem y cuatro cadenas de polipéptidos (dos cadenas alfa y dos cadenas beta) (Fig. 2). Los átomos de hierro ferroso tienen 6 enlaces de unión, cuatro para los nitrógenos pirrólicos del Hem, uno para el nitrógeno imidazólico de histidina de la cadena globínica y uno que se une reversiblemente con el oxígeno. A medida de que se incrementa la presión parcial de 8 oxígeno, los cuatro grupos Hem se unen respectivamente a una molécula de oxígeno. En este proceso se da un cambio en la configuración general de molécula de Hemoglobina, lo que permite la fijación del oxígeno. El dióxido de carbono (CO2) es transportado por los eritrocitos y en el plasma. Una pequeña parte de CO2 eritrocitario se disuelve, otra se fija a los grupos amino de Hemoglobina como Carbamino-CO2, pero la mayor parte se encuentra en forma de bicarbonato. La enzima anhidrasa carbónica cataliza la transformación de dióxido de carbono en bicarbonato dentro del Hematíe mientras está en el lecho capilar de los tejidos, y cataliza la rección inversa (liberación de dióxido de Carbono a partir del bicarbonato) en el eritrocito, cuando se haya en el lecho capilar pulmonar. (3) FIG. No. 2 Estructura de la Hemoglobina 2.2.4 HEMOGLOBINAS NORMALES La estructura Hem es común a todas las Hemoglobinas y sus variantes. El tipo de Hemoglobina está determinado por la fracción proteica, llamada globina. Las cadenas polipeptídicas α, β, γ y δ constituyen las Hemoglobinas humanas normales: • Hemoglobina A (α2β2). Es la más importante de las Hemoglobinas en el adulto normal. Las cadenas de polipéptidos de la parte globínica de las moléculas son de dos tipos: dos cadenas α idénticas, cada una con 141 aminoácidos, y dos cadenas β, también idénticas de 146 aminoácidos cada una. Cada cadena está ligada a un grupo Hem. La molécula es elipsoidal, con los cuatro grupos Hem en su superficie, donde funcionan combinándose reversiblemente con el oxígeno.(3) 9 • Hemoglobina A2 (α2 δ2). Constituye del 1.5 al 3.5 % de la Hemoglobina del adulto normal.(7) Sus dos cadenas α son iguales que las de la HbA y HbF; sus dos cadenas δ difieren de las cadenas β en solo 8 de sus 146 aminoácidos. La síntesis de cadenas δ se inicia tarde en la vida fetal y se produce sólo en normoblastos. El nivel de HbA2 aumenta de forma gradual durante el primer año de vida, periodo en que se consigue el nivel de adulto. Esta Hemoglobina se encuentra incrementada en algunas talasemias â. La deficiencia de hierro, causa una reducción en la síntesis de HbA2.(3). • Hemoglobina F (fetal) (α2γ 2). Es la Hemoglobina principal del feto y del recién nacido debido a la alta producción de cadenas α y γ. A los 6 meses suele ser menos del 8% y a los 12 meses menor del 5%, entre los 12 y 24 meses en menor al 3%, tras los 2 años de edad es menor al 2%. En adultos se observan indicios y debe ser menor al 1%. (7) La estructura espacial de las Hemoglobinas (como de todas las proteínas), dependen de la secuencia de aminoácidos que constituyen las cadenas. La sustitución de aminoácidos por mutación es la causa de la formación de variantes de Hemoglobina, las cuales tienen una carga superficial diferente y por tanto movilidades electroforéticas distintas, que también dependen del pH y la fuerza iónica del tampón. La separación electroforética de las Hemoglobinas humanas en medio alcalino sirve para determinar la presencia de variantes de Hemoglobina.(4) Las Hemoglobinopatías son alteraciones monogénicas cada vez más frecuentes en el mundo y tienen un patrón de herencia autosómico recesivo. Se dividen en: 1. Anormalidades cualitativas o Hemoglobinopatías estructurales, producidas por la síntesis de una cadena de globina estructuralmente anormal 2. Anormalidades cuantitativas o síndromes talasémicos, que manifiestan una disminución de la síntesis de una de las cadenas de globina de estructura normal. (11) En América Latina se pueden encontrar ambas patologías; en México son más frecuentes en las costas del Golfo y del Pacífico.(10) 2.2.5 ANORMALIDADES CUALITATIVAS: HEMOGLOBINOPATÍAS Se presentan por la sustitución por mutación de un aminoácido en uno de los 4 tipos de cadenas polipeptídicas. El significado clínico de tales cambios depende del tipo de aminoácido involucrado y de su posición. En las enfermedades clínicamente significativas, pueden estar afectadas las cadenas α y β. (3) 10 En las talasemias, se forman cadenas de globina de estructura normal, pero son producidas a una velocidad menor. La talasemia β se refiere a una menor producción de cadenas β; por tanto cabría esperar que la HbF (α2γ2) o la HbA2 (α2δ2) aumenten relativamente respecto a la HbA (α2β2). (3) En las Hemoglobinopatías β homocigóticas están presentes los dos genes alélicos de las cadenas β anormales, de manera que no se produce ninguna cadena β normal ( y por lo tanto no hay producción de HbA). Ejemplos de esto, son la anemia drepanocítica (HbS) y la enfermedad por la Hemoglobina C (HbC). Dado que los genes α, γ y δ ( y la producción de las cadenas) son normales, la HbF y HbA2 formadas tienen una estructura normal, aunque puede haber una aumento en la cantidad.(3) No se han descrito Hemoglobinopatías α homocigóticas(3) En las Hemoglobinopatías β heterocigóticas, la Hemoglobina anormal está presente junto a la HbA; también la HbF y la HbA2 tienen una estructura normal. Ejemplos de esto son el rasgo drepanocítico (HbS) y el rasgo de la Hemoglobina C (HbC). La HbA supera en cantidad la Hemoglobina anormal presente , debido a una producción mas lenta de cadenas β anormales que de cadenas β normales, destrucción selectiva precoz de los Hematíes con concentraciones mas altas de Hemoglobina anormal o eliminación selectiva de Hemoglobina anormal de la célula.(3) En las Hemoglobinopatías α heterocigóticas, la anomalía de la cadena α afectará los tres tipos de Hemoglobina. Ejemplos de esto son HbD Baltimore, Hb Ann Arbor y HbM Boston.(3) Existen combinaciones de anomalías. Los heterocigotos dobles para dos anormalidades de la cadena β producen dos cadenas β anormales y distintas; por ello hay dos Hemoglobinas anormales y no existe HbA; un ejemplo es la enfermedad de HbSC. Son raros los heterocigotos dobles para anomalías de cadenas β y δ y para las de las cadenas α y β.(3) Los heterocigotos dobles para la Hemoglobinopatía β y para la talasemia β son bien conocidos. Aquí, la cantidad de Hemoglobina anormal supera la de la normal, a diferencia de las Hemoglobinopatías β heterocigóticas, en las que ocurre lo contrario. (3) 11 2.2.5.1 HEMOGLOBINOPATÍAS β 2.2.5.2 Anemia drepanocítica La enfermedad homocigótica HbS es una anemia Hemolítica crónica cuya gravedad aumenta progresivamente desde la infancia, y suele ser fatal antes de los 30 años de edad. Sin embargo con cuidados médicos, muchos pacientes viven mas tiempo. La HbS se encuentra casi exclusivamente en la población de raza negra; 0,1 a 0,2 % de los individuos de raza negra nacidos en Estados Unidos presentan anemia de células falciformes.(3) En la HbS, el ácido glutámico en la sexta posición sobre la cadena β es sustituido por valina. Esta sustitución se efectúa en la superficie de la molécula y cambia su carga, de ahí su movilidad electroforética. (4) La HbS es soluble cuando está completamente oxigenada; cuando se elimina el oxígeno de la HbS, aparece la polimerización de la Hb anormal formando tactoides (cristales líquidos) que son rígidos y deforman la célula dándole la forma que su mismo nombre indica. (3) En la enfermedad de HbS homocigótica aparece la drepanocitosis en tensiones fisiológicas del oxígeno y la rigidez de los eritrocitos es la responsable de la Hemólisis, así como de la mayoría de las complicaciones. Las células rígidas son más vulnerables a los traumatismos, y son fácilmente atrapadas por el sistema reticuloendotelial, en especial por el bazo, lo que explica la Hemólisis. Como resultado de la Hemólisis, la hiperplasia medular grave y continuada durante la infancia produce cambios óseos: expansión de los espacios medulares óseos , adelgazamiento de la cortical ósea y estriaciones radiales observadas en las radiografías craneales. (3) Complicaciones: En la infancia se produce a causa de las células falciformes y la estasis capilar un edema doloroso bilateral del dorso de las manos y pies denominado síndrome mano-pie o dactilitis de células falciformes. Persiste alrededor de dos semanas, se acompaña de periostitis, y no se manifiesta después de los 4 años de edad.(3) El bazo es el centro de tres complicaciones: una crisis de secuestro, implica una acumulación repentina de sangre y un rápido aumento del volumen del bazo, lo que da lugar a un shock hipovolémico. Puede ocurrir en la infancia, cuando existe esplenomegalia. En ciertas alteraciones, la asplenia funcional consiste en una respuesta inadecuada de los anticuerpos y una incapacidad del sistema retículoendotelial para eliminar las bacterias de la sangre, lo cual se debe probablemente a un bloqueo de dicho sistema. Esto puede explicar 12 parcialmente el riesgo de infección en niños con esta enfermedad. Las infecciones por Salmonella y neumococos suelen predominar en niños con anemia drepanocítica.(3) La autoesplectomía es el resultado de episodios vasooclusivos que dan lugar a infartos progresivos, fibrosis y retracción del bazo. Aunque la esplenomegalia se produce en el niño, un pequeño remanente fibroso es lo normal en el adulto. Desde la infancia, los pacientes no pueden producir orina concentrada, aparentemente como resultado de una lesión anóxica en la zona medular renal. La Hematuria como resultado de una necrosis papilar es común. (3) Las crisis vasooclusivas son episodios debilitantes de dolor abdominal, óseo o articular, acompañados de fiebre debida probablemente al taponamiento de los pequeños vasos sanguíneos por masas de células falciformes. Se produce una necrosis ósea que puede actuar como foco para la osteomieliltis por salmoneras. La necrosis aséptica, de la cabeza del fémur representa una complicación ocasional, mientras que las diversas complicaciones que se producen como resultado de crisis vasooclusivas recurrentes afectan muchos sistemas.(3) Las crisis aplásicas pueden afectar en ocasiones a los pacientes con anemia Hemolítica crónica. La incapacidad temporal para producir eritrocitos que quizá no se observe en una persona con una vida media eritrocítica normal puede causar un descenso importante en la concentración de Hemoglobina en la anemia Hemolítica. Es posible que esto sea resultado de la infección, exposición a fármacos tóxicos o déficit de ácido fólico; en ocasiones no puede encontrarse ninguna causa . (3) En sangre: La anemia es normocítica normocrómica. La policromasia está aumentada y hay normoblastos presentes. Las células Diana son numerosas y se ven regularmente los corpúsculos de Howel-Jolly como resultado de la asplenia. En el frotis, se encuentran con frecuencia células falciformes. La fragilidad osmótica suele estar disminuída. Son habituales la neutrofilia y la trombocitosis. En la médula se observa una hiperplasia normoblástica y un aumento del hierro depositado. (3) Prueba del fenómeno falciforme con metabisulfito: La adición de metabisulfito (agente reductor) a la sangre, aumenta la desoxigenación de la Hemoglobina y la aparición del fenómeno falciforme de la HbS. Se coloca una gota de sangre en un portaobjetos, se agrega el metabisulfito, se tapa con un cubreobjetos y se sella. En pocos minutos se observa al microscopio. El fenómeno es más rápido cuanta más Hemoglobina S existe. Se pueden observar pruebas positivas con otras Hemoglobinas anormales raras (p. ej. HbC Harlem y con la Hb 13 de Bart) Se dan resultados falsos negativos cuando la concentración de HbS es inferior al 10% o la desoxigenación es inadecuada por deterioro del reactivo.(10) Prueba de solubilidad con ditionito: en esta prueba los eritrocitos se lisan, la HbS es reducida por el ditionito (hidrosulfito sódico) y la HbS reducida es insoluble en tampones inorgánicos concentrados. Los polímeros de desoxi-HbS producen opacidad (10). Las reacciones positivas se ven cuando hay numerosos cuerpos de Heinz, como en los trastornos de inestabilidad de Hemoglobina tras esplecnetomía y en los trastornos de las proteínas de la sangre por precipitación de las proteínas plasmáticas. Las reacciones negativas tienen lugar con Hb normales y con la mayoría de las Hemoglobinas anormales, y también cuando la concentración de HbS es demasiado pequeña, como ocurre en la anemia grave, o si el reactivo está deteriorado. (3) Electroforesis de Hemoglobina: Por la sustitución de un ácido glutámico de la cadena β por una valina (aminoácido neutro) su movilidad electroforética se ve disminuida, y en el gel de Hemoglobina alcalina la Hemoglobina S migra entre las fracciones A y A2. En la electroforesis a pH 8.6 no se encontrará HbA si el paciente no ha recibido una transfusión recientemente; más del 80% de la Hemoglobina será HbS, del 1 al 2 % HbF y del 2 al 4.5 % HbA2. La HbF está distribuida de forma irregular en los Hematíes. La HbS y la HbD tienen la misma movilidad electroforética a pH alcalino; sin embargo, en la electroforesis en gel de agarosa a pH ácido (6.2) la HbD migra con la HbA, de forma diferente a la HbS, lo que permite su distinción. (3) 2.2.5.3 Rasgo drepanocítico (HbAS) La drepanocitemia es la Hemoglobinopatía mas frecuente en Estados Unidos. En circunstancias normales no hay signos clínicos de enfermedad ni anomalías Hematológicas. Sin embargo una acidosis o hipoxia producidas por vuelos aéreos, infección respiratoria, anestesia o insuficiencia cardiaca congestiva pueden causar una crisis drepanocítica y complicaciones vasculares, incluyendo Hematuria. En adultos con este rasgo hereditario se observa incapacidad para concentrar la orina. Los frotis son normales, excepto acaso algunas células diana. La formación de células falciformes es positiva, y casi todos los eritrocitos se convierten en falciformes finalmente. La prueba de solubilidad es positiva.(3) Electroforesis de Hemoglobina: HbA, del 50 a 65 %; la HbS, del 35 a 45 %; HbF normal; HbA2 normal a ligero aumento hasta 4.5 %. Menos del 35 % de HbS suele indicar coexistencia de uno o más genes de talasemia α, que se asocian también con microcitosis. (3) 14 2.2.5.4 Enfermedad de la Hemoglobina C La enfermedad homocigótica de la Hemoglobina C es una anemia hemolítica leve con esplenomegalia, que a menudo es asintomática, pero a veces ocasiona ictericia y molestias abdominales. (3) En sangre: Se observa una anemia leve normocrómica y normocítica con una mezcla de microcitos y esferocitos, un aumento mínimo de reticulocitos y numerosas células diana. La fragilidad osmótica es difásica, con aumento y disminución.(3) En el frotis pueden apreciarse cristales hexagonales o en forma de bastoncitos en los eritrocitos. Los eritrocitos están deshidratados debido a la pérdida de cationes y de agua como resultado de la interacción de la Hemoglobina normal con la membrana de los eritrocitos. Como consecuencia las células son más rígidas y menos deformables de lo normal, incrementándose su posibilidad de ser retenidas y destruidas en el bazo. El VCM es normal o está dimninuído y la CHCM es normal o está incrementada. (3) Electroforesis de Hemoglobina: Un ácido glutámico de la cadena β es sustituido por lisina (aminoácido básico). Su movilidad se ve fuertemente reducida. En el gel de Hemoglobina alcalina C, E y A2 se superponen. Cuando esta fracción es > 15 %, debe sospecharse la presencia de Hemoglobinas C y E. (4) No existe HbA; más del 90% es HbC, y menos del 7% es HbF. La Hb E y la Hb O Arab tienen la misma movilidad electroforética que la Hb C a pH alcalino, pero pueden ser separadas por medio de una electroforesis en gel de agarosa a pH ácido, donde la Hb E migrará junto con la HbA. (3) 2.2.5.5 Rasgo de la Hemoglobina C El estado heterocigoto es asintomático, sin anemia y muestra hipocromía leve y células diana (hasta un 40%)(3) Electroforesis de Hemoglobina: La HbA representa del 50 a 60%; la Hemoglobina C del 30 al 40 %. Proporciones inferiores de HbC y microcitosis se asocian con talasemia α.(3) 15 2.2.5.6 Hemoglobina D Un ácido glutámico de la cadena β es sustituido por glutamina.(4) La homocigosis y heterocigosis para la HbD no manifiestan anomalías clínicas o Hematológicas, a excepción de unas pocas células diana en el frotis de individuos que son homocigotos para HbD.(3) Electroforesis de Hemoglobina: La HbD tiene una movilidad en la electroforesis alcalina idéntica a la de la HbS, pero una solubilidad y una prueba drepanocítica negativas (3). Al contrario de la Hemoglobina S, la Hemoglobina D no se separa de la Hemoglobina A en tampón ácido, esta propiedad permite diferenciar S y D.(4) 2.2.5.7 Enfermedad y rasgo de Hemoglobina E La HbE es la segunda Hemoglobina mas frecuente en el mundo. Un ácido glutámico de la cadena β es sustituido por lisina (aminoácido básico). (8) Se encuentra principalmente en el sudeste asiático y en especial en población tailandesa y birmana. El rasgo HbE (HbAE) es asintomático, con microcitosis y no hay anemia. La enfermedad de la HbE, también es asintomática; se parece al rasgo talasémico con microcitosis y eritrocitosis y, si la hay, ligera anemia. Las células diana son numerosas en el frotis sanguíneo. (3) Electroforesis: La HbE migra de manera similar a la HbA2, HbC y HbO Arab en la electroforesis alcalina. A pH ácido, la HbE migra con la HbA, la Hb O Arab tiende a separarse de la A y la HbC es distinta. En el homocigoto, la Hemoglobina E representa mas del 90% de la Hemoglobina, la HbF del 1 al 10%, no existe HbA y la HbA2 es normal. En el heterocigoto, la HbA representa del 65 al 70% de la Hemoglobina total y la HbE, del 30 al 35%. Si también hay uno o mas genes de talasemia α, la proporción de HbE disminuye. (3) 2.2.6 ANORMALIDADES CUANTITATIVAS: TALASEMIAS Constituyen un grupo heterogéneo de enfermedades que proceden de mutaciones en los genes de globina que reducen o anulan totalmente la síntesis de una o mas de dichas cadenas. Origina hipocromía y microcitosis, y en las formas mas severas anemia. Hay dos tipos de síndromes talasémicos: talasemias alfa y talasemias beta.(4) 16 2.2.6.1 Talasemias alfa Se caracterizan por una disminución en la síntesis de las cadenas α, que afecta por consiguiente la síntesis de todas las Hemoglobinas normales.(4) Las formas mas frecuentes de α-talasemias proceden de la deleción de uno, dos, tres o los cuatro loci de genes de la zona α-globina procedentes de las dos copias del cromosoma 16 presentes en los humanos normales. Es extremadamente común en Asia y la cuenca mediterránea, así como en la población indígena americana. (5) Fisiopatología y genética Los tipos de alfa talasemia clásicos se han definido por el número de genes afectados. La α-talasemia 2, es el estado de portador silencioso, es debido a la deleción de uno de los cuatro alelos. Es asintomática pero transmisible como un rasgo que puede añadir severidad en la desendencia con herencia adicional de alelos de α-talasemia del otro progenitor. (5) La α-talasemia 1 procede de la deleción de las dos copias unidas de los genes de la α-globina del mismo cromosoma. Se observan cambios hipocrómicos moderados y microcíticos y pueden parecerse al rasgo β talasémico, pero sin elevación de la HbA2 y normalmente con cambios menos dramáticos. (5) El exceso de síntesis de cadenas β y γ en relación con las cadenas α induce la formación de tetrámeros, como la Hemoglobina de Bart (γ 4) y la Hemoglobina H (β 4).(4) Enfermedad de Hemoglobina H Afecta a la herencia de la α-talasemia 1 de un progenitor y a la α-talasemia 2 del otro, por lo tanto tres de los cuatro alelos de la α-globina no están. Solo se forma una pequeña cantidad de HbA. El exceso de cadenas β provocan la formación del tetrámero (β4) Hb H, que se comporta como una Hemoglobina inestable. Estos pacientes presentan de una anemia Hemolítica de moderada a severa.(5) 17 Hemoglobina de Bart Afecta a la herencia de los dos cromosomas de la α-talasemia de ambos progenitores, originando una ausencia total de los genes de globina y por lo tanto hay ausencia total de la síntesis de la Hemoglobina fetal y adulta. La Hemoglobina de Bart consiste sólo en cadenas γ acumuladas, y tiene una afinidad extremadamente alta con el oxígeno y no hay liberación de este a los tejidos. Los niños desarrollan una insuficiencia cardiaca congestiva severa y normalmente mueren intraútero. Hay una tasa aumentada de polihidramnios y de morbilidad materna durante las primeras etapas del embarazo.(5) α-Talasemia con Hb Constant spring Procede de una mutación en el codón de transducción terminal del gen de la α-globina; por lo tanto se incorporan 31 aminoácidos extras en la zona carboxilo-terminal de la cadena de α-globina. (5) Diagnóstico El rasgo α-talasémico se reconoce como una microcitosis en pacientes con anemia mínima o sin ella y un frotis característico con poblaciones microcíticas hipocrómicas con un número excesivo de dianocitos y anisocitosis. El rasgo de α-talasemia 2 puede permanecer silente en lo que se refiere a hallazgos de laboratorio y a los síntomas. Los pacientes con Hb H presentan evidencias de Hemólisis, a veces con ictericia neonatal. Los neonatos que tienen una Hb de Bart en niveles altos tienen anemia microcítica con estigmas de Hemólisis.(5) La Hb H se detecta rápidamente con técnicas de hibridación molecular. Los estudios de DNA o la valoración de la síntesis de globina pueden confirmar el diagnóstico intraútero. El hidrops fetal se diagnostica por la presencia de un niño hidrópico en ausencia de compatibilidad inmune Rh o ABO y predominio de la Hemoglobina de Bart por electroforesis, así como la microcitosis e hipocromía características halladas en el frotis. (5) 18 2.2.6.2 Talasemias beta Se caracterizan por un descenso en la síntesis de las cadenas β, que es acompañada por el incremento de la síntesis de las cadenas γ y δ.(4) Las formas de talasemia surgen de mutaciones que afectan casi cada paso de la expresión de los genes de globina. El descenso o la ausencia en la síntesis de β-globina impide la acumulación de Hemoglobina en las células y por lo tanto son hipocrómicas y microcíticas. Las cadenas libres de α-globina se acumulan y precipitan durante el desarrollo inicial de los eritroblastos por que las cadenas α son muy insolubles. Las inclusiones de α-globina son altamente tóxicas para los eritroblastos, originando la destrucción intramedular de los mismos (eritropoyesis ineficaz). Los pocos precursores que sobreviven a la fase reticulocito eritrocito tienen una vida media muy corta (anemia Hemolítica). La anemia estimula a la eritropoyetina, que estimula todavía más el crecimiento ineficaz de la médula ósea; con frecuencia existe invasión del hueso cortical y en algunos casos se forman focos de Hematopoyesis extramedular, que se presentan clínicamente como masas semejando a los linfomas.(3) Los pacientes talasémicos homocigotos severamente afectados presentan una facies característica mongolide, debida al crecimiento de la médula ósea en los maxilares y el cráneo. También presentan anemia profunda con insuficiencia cardiaca congestiva, estigmas de Hemólisis, hepatomegalia, cálculos biliares, exceso de absorción de hierro y el frotis demuestra hipocromía y microcitosis con muchas formas anómalas, glóbulos rojos nucleados y eritroblastosis masiva. Sin transfusiones, los pacientes severamente afectados mueren en la infancia temprana de insuficiencia cardiaca congestiva o infección. Los pacientes talasémicos heterocigotos son totalmente asintomáticos.(3) Diagnóstico El rasgo β-talasémico se reconoce por una hipocromía y microcitosis significativa en pacientes con anemia moderada o mínima. El hierro y la ferritina son normales.(5) Electroforesis de Hemoglobina: los porcentajes de HbF y HbA2 se incrementan con respecto a la Hemoglobina A. En estado homocigoto existe anemia severa, la HbF esta muy elevada y la HbA2 moderadamente elevada. En heterocigotos la producción es normal o moderadamente disminuida de HbA, la cual es compensada por HbF (3-6%) y HbA2.(5) 19 La δ β-talasemia, es menos frecuente y se asocia a la elevación de la HbF (normalmente sobre un 5 – 10%), pero con una Hb A2 normal o baja. Otras formas raras de talasemia, como la Hb lepore, han sido descritas. Estas formas ya son reconocidas en los laboratorios clínicos.(5) 2.3 PROTEÍNAS Las proteínas son biomoléculas que constan de cadenas continuas de átomos de carbono y nitrógeno unidos mediante enlaces peptídicos entre aminoácidos adyacentes. En un extremo hay un grupo amino libre (aminoterminal) y en el otro un grupo carboxilo libre (carboxiloterminal). Mientras el esqueleto del péptido es cualitativamente invariable entre las diferentes proteínas (su longitud total es equivalente al número total de aminoácidos que se encuentran en una determinada proteína) las proteínas tienen una identidad estructural en virtud de los grupos laterales o restos de aminoácidos constituyentes. El peso molecular medio de un aminoácido es 120 daltons. Las proteínas séricas tienen un tamaño que varía aproximadamente de 66 a mas de 700 KDa. Estas cadenas laterales de aminoácidos se agrupan, convencionalmente de acuerdo a su naturaleza química: hidrógeno (glicina), alifáticas (alanina, valina, leucina, isoleucina), hidroximetilamina (serina y treonina), aromáticas (tirosina, fenilalanina y triptófano), imino (prolina e hidroxiprolina), ácidas (aspartato y glutamato), básicas (arginina, histidina y lisina), amidas (asparragina y glutamina) y con azufre (cisteína y metionina). Estas cadenas laterales diferentes son cargadas, polares o hidrófobas, dando como resultado su tendencia a ser relativamente solubles o insolubles en agua.(1) 2.3.1 ESTRUCTURA PROTEÍNICA Estructura primaria Es la secuencia lineal de aminoácidos, la cual determina la identidad de una proteína, su estructura molecular, que funciones puede realizar, como puede unirse a otras moléculas y como puede participar en los procesos de reconocimiento entre moléculas y células. Estas acciones biológicas están dirigidas mediante reacciones entre los grupos cargados de una molécula y los de otra y de modo similar, mediante interacciones hidrófobas entre las moléculas. Procesos analíticos como la electroforesis, dependen de la secuencia primaria de los aminoácidos (1). 20 Estructura secundaria Se refiere a las conformaciones tridimensionales regulares específicas en las que se pliegan las partes de la cadena polipeptídica. Existen tres estructuras. La primera es hélice α, en la cual la cadena forma una hélice regular de tal forma que el grupo C=O en posición i del esqueleto del péptido se une mediante puentes de hidrógeno al grupo N-H en posición (i + 4) de la unidad peptídica. La segunda es la estructura en hojas plegadas β, en estructuras extendidas completamente, en las cuales la cadena forma una estructura plana en la que las cadenas laterales de los aminoácidos adyacentes se sitúan en direcciones opuestas; en esta conformación pueden asociarse dos o mas cadenas extendidas de tal modo que se formen un número máximo de enlaces C=O…H-N entre ellas. La hoja plegada β puede tener sus cadenas β individuales en orientaciones paralelas o antiparalelas. Por último un tercer grupo de estructuras, es la conformación en giro, en la cual la dirección de la cadena polipeptídica se invierte sobre si misma, permitiendo así que las largas estructuras primarias se doblen hacia atrás y sobre ellas mismas, adoptando configuraciones compactas(1). Estructura terciaria La estructura tridimensional real o el patrón de plegamiento de la proteína, determinado únicamente por su secuencia de aminoácidos, se denomina estructura terciaria, es decir, se refiere a las relaciones espaciales entre los elementos de la estructura secundaria (1). Estructura cuaternaria Proteínas individuales o subunidades monoméricas pueden formar complejos más estables como dímeros, trímeros, tetrámeros, etc. lo cual se denomina estructura cuaternaria (1). Los aminoácidos ácidos y básicos determinan la carga neta de una proteína y por tanto su movilidad electroforética. La carga de los grupos carboxilo y amino depende del pH (es decir, si un hidrógeno está unido o disociado del grupo) combinando todos los grupos laterales, y sus distintos grados de disociación, se denomina punto isoeléctrico (pI) de una proteína al pH en el cual esta tiene carga neta igual a cero. Las proteínas con un pI inferior a 7 son ácidas y tienden a tener grupos laterales carboxilo disociados, mientras que las que tienen un pI superior a 7 son básicas (1). 21 2.3.2 FUNCIÓN Las miles de proteínas presentes en el cuerpo humano realizan funciones bastante numerosas, entre ellas destacan: • Acarreadores de vitaminas, oxígeno y bióxido de carbono • Funciones estructurales • Funciones catalíticas • Funciones de señalamiento (2) 2.3.3 CLASIFICACIÓN Si bien no existe un sistema universal de clasificación aceptado, las proteínas se pueden clasificar con base a su solubilidad, forma, función biológica o la estructura tridimensional.(2) Un sistema de uso limitado en bioquímica clínica diferencia la albúmina, las globulinas, las histonas, entre otras, con base a su solubilidad en soluciones salinas acuosas. (2) Las proteínas también pueden clasificarse con base a su forma. Por lo tanto, las proteínas globulares (enzimas) presentan cadenas polipeptídicas compactas, con hélices dobladas, que tienen dimensiones axiales (proporciones entre la longitud y la anchura) menores de 10 y, por lo general, no mayores de 3 a 4. A su vez, las proteínas fibrosas presentan proporciones axiales mayores a 10.(2) Con base en sus funciones biológicas, las proteínas pueden clasificarse como enzimas (deshidrogenasas, cinasas, etc.), proteínas de almacenamiento (ferritina, mioglobina), proteínas reguladoras (proteínas que se unen a DNA, hormonas peptídicas), proteínas estructurales (colágena, proteoglicanos), proteínas protectoras (factores de coagulación sanguínea, inmunoglobulinas), proteínas de transporte (Hemoglobina, lipoproteínas plasmáticas) y proteínas contráctiles y móviles (actina y tubulina). (2) 2.3.4 SEPARACIÓN PROTEÍNICA POR ELECTROFORESIS El conocimiento actual de la composición de las proteínas del suero y del plasma, deriva de las técnicas electroforéticas descritas por Tiselius.(1) La aplicación de muestras se puede hacer en pocillos realizados dentro del gel, aunque este proceso deja un artefacto característico que puede interferir con la exploración. Cada extremo del gel se sumerge en cámaras 22 de tampón, en las cuales se montan los electrodos. Se aplica un voltaje entre los electrodos y se genera una corriente eléctrica que pasa a través del gel. La fuerza iónica del tampón determina la cantidad de corriente y el movimiento de las partículas para un voltaje fijo. Si la fuerza iónica es baja, se conduce relativamente mas corriente por las proteínas cargadas. Si la fuerza iónica es alta, se conduce menos corriente por las proteínas, que se desplazan a una distancia mas corta. Si los electrodos no están alineados de modo apropiado, la corriente puede condensarse en un lado del gel más que en el otro; las proteínas migrarán mas en el lado de mayor corriente. Si la electroforesis transcurre durante demasiado tiempo, las proteínas pueden migrar fuera del gel (1). Tras la electroforesis, el gel se trata con un fijador suave, como el ácido acético, que precipita las proteínas en las posiciones donde han migrado. Entonces ellas se tiñen, se libera el exceso de colorante y el gel se seca. Los patrones proteicos se pueden inspeccionar visualmente para la inspección cualitativa de las proteínas anormales. Los densitómetros se utilizan para generar gráficos y cuantificar los porcentajes relativos de proteína en cada fracción. Los porcentajes se multiplican por las proteínas totales de la muestra para calcular la concentración proteica de cada fracción (1). Cuando un medio de soporte electroforético tiene una carga negativa, la fuerza electromotriz a la cual está sujeto tiende a desplazarlo hacia el ánodo (polo positivo). Sin embargo, el medio de soporte sólido está fijo y no puede desplazarse. De modo opuesto, los iones cargados positivamente del tampón circundante están libres para desplazarse bajo la fuerza electromotriz y pueden desplazarse con ellos moléculas de agua de la disolución, las cuales se agrupan alrededor de sus cargas. El resultado final es un flujo del tampón hacia el cátodo. Este flujo de tampón se denomina electro-ósmosis o endósmosis y en cierto grado, también transporta con él las proteínas por un flujo mecánico, no por carga. La distancia real realizada por una proteína determinada que migra en un campo eléctrico viene determinada por las magnitudes combinadas de la fuerza electromotriz (una característica de la proteína misma y del pH) y la fuerza electro-osmótica (una función primordialmente del medio de soporte). Cuando la fuerza electro-osmótica es superior a la fuerza electroforética que actúa sobre proteínas débilmente aniónicas (por ejemplo las gama globulinas), esas proteínas se mueven desde el punto de aplicación hacia el cátodo, aunque su carga sea levemente negativa. Por medio de ciertas modificaciones de la composición salina del tampón, propiedades endosmóticas del medio y del modo de aplicación de la muestra, las placas de electroforesis con agarosa, disponibles comercialmente en la actualidad consiguen calidades de alta resolución, permitiendo la separación de las principales especies de proteínas séricas. (1) 23 Para aplicaciones diagnósticas de rutina, las proteínas séricas se separan en cinco fracciones principales, de acuerdo con su carga a un pH determinado: albúmina, alfa-1 globulinas, alfa-2 globulinas, beta globulinas y gama globulinas. Cada fracción contiene una o más proteínas séricas. Los patrones proteÍnicos de la orina se parecen a los del suero. Sin embargo las intensidades relativas de las fracciones o su presencia pueden variar enormemente en función de la capacidad de filtración del riñón. (4) 2.3.5 FRACCIONES DE PROTEÍNAS SÉRICAS Albúmina Es una proteína que consta de 585 aminoácidos (69KDa) dispuestos en nueve giros mantenidos juntos mediante enlaces disulfuro entre restos de cisteína. La secuencia primaria de la albúmina contiene tres regiones principales con tres giros peptídicos cada una. Esta proteína tiene una vida media de 17 días. Es la proteína más abundante en el plasma normal, que habitualmente constituye hasta dos tercios de las proteínas totales. Por esta razón disminuciones en el nivel de albúmina debidas a una alteración en su síntesis (malnutrición, malabsorción, disfunción hepática) o pérdidas ( Ascitis, nefropatía o enteropatía con pérdida de proteínas) dan por resultado un grave desequilibrio de la presión oncótica intravascular. Esta pérdida se manifiesta clínicamente por el desarrollo de edemas periféricos. Sin embargo, la ausencia congénita de albúmina (analbuminemia) no conduce a estos problemas, posiblemente a causa de mecanismos compensadores que duran toda la vida y que controlan las presiones oncóticas. La albúmina sirve además como depósito móvil de aminoácidos para su incorporación a otras proteínas. Una tercera función es la de transporte general o de una proteína transportadora. Numerosas sustancias orgánicas e inorgánicas susceptibles a ser ligadas (por ejemplo, tiroxina, bilirrubina, penicilina, cortisol, estrógeno, ácidos grasos libres, calcio, magnesio, etc.) forman complejos con diferentes regiones de la molécula de albúmina de forma covalente o disociable. Estas interacciones son posibles debido a una amplia variedad de lugares de fijación en la molécula de albúmina.(1) Además de la anormalidad genética de la analibuminemia, hay muchas variantes hereditarias de la albúmina que difieren del alotipo mas frecuente, la albúmina A, por sustituciones de un solo aminoácido. Estas variantes pueden ser rápidas o lentas en su migración en comparación con la albúmina A, conduciendo a dos picos distintos de la albúmina (dialbuminemia) en el estado heterocigótico. Ninguna de las albúminas variantes parece afectar la salud, no obstante una variante recientemente descrita no presenta elevada 24 afinidad por la tiroxina, lo que conduce a un alto contenido de ésta en el suero de estas personas que, aun así, se mantienen eutiroideas (1). Los aumentos de la concentración de albúmina sérica son poco frecuentes, aunque ocurren durante la deshidratación, debido a la disminución de la fase acuosa del plasma. Tras la rehidratación, los niveles de albúmina deben situarse en los intervalos normales.(1) La disminución de la concentración de albúmina es frecuente en individuos enfermos, ya sea por disminución de su síntesis en el hígado debido a cualquier enfermedad hepática como cirrosis; al efecto secundario en su síntesis debido a una nutrición deficiente o a la desviación de la capacidad sintética hacia otras proteínas. En algunas enfermedades, las disminuciones de albúmina se compensan, al menos parcialmente, mediante incrementos de otras proteínas séricas, estabilizando la presión oncótica intravascular. En particular, en la cirrosis se produce el principal aumento policlonal en la fracción gamma de las inmunoglobulinas y en el síndrome nefrótico aparecen niveles elevados de α2-macroglobulina. (1) Alfa-1-globulina El principal componente de las α1- globulinas es el inhibidor de la proteasa α1- antitripsina (AAT). Es una proteína de cadena única de 394 aminoácidos y posee tres cadenas de oligosacáridos (2). Tiene la capacidad de unirse a la tripsina e inactivarla, así como de neutralizar la actividad de algunas proteasas, como la elastasa, de ahí que sea un factor intrínseco en el mecanismo homeostático que regula la proteinólisis endógena y previene una respuesta bioquímica inapropiadamente severa a la inflamación.(1) La mayoría de las personas son homocigotas para el alelo normal M de la AAT plenamente activo o fenotipo MM. Alrededor del 10% de los sujetos blancos son heterocigotos para M y algún otro alelo de inhibidor de la proteasa o sistema Pi. Más del 2% llevan el alelo PiZ y presentan el fenotipo MZ. (1) Existen dos áreas de interés clínico respecto a la α1-antitripsina. La deficiencia de esta proteína tiene relación con algunos casos (aproximadamente el 5%) de enfisema. Esto ocurre sobre todo en los individuos con el genotipo ZZ, quienes sintetizan PiZ y también los heterocigotos PiSZ. Cuando la cantidad de α1-antitripsina es deficiente y se eleva el número de leucocitos polimorfonucleares en los pulmones, el sujeto afectado carece de un mecanismo para contrarrestar el daño proteolítico del tejido pulmonar producido por las proteasas como la elastasa. Así mismo, cabe mencionar que una metionina en particular (residuo 358) de una α1-antitripsina, esté implicada en la unión de este compuesto a las proteasas. El hábito de fumar ocasiona que esta metionina se oxide a sulfóxido de metionina, y de esta manera la inactiva. Como consecuencia, las moléculas 25 afectadas de α1- antitripsina pierden su capacidad de neutralizar proteasas. La disminución de α1-antitrisina como efecto adverso del tabaquismo, resulta en un aumento de destrucción proteolítica en el tejido pulmonar, lo cual acelera el desarrollo del enfisema. La administración intravenosa de α1-antitripsina ha sido empleada como coadyuvante en el tratamiento de los pacientes con enfisema secundario a deficiencia de α1antitripsina.(1) La deficiencia de α1-antitripsina también está implicada en un tipo de enfermedad hepática (hepatopatía por deficiencia de α1-antitripsina). En tal condición las moléculas del fenotipo ZZ se acumulan y se agregan en las cisternas del retículo endoplásmico de los hepatocitos. Tal agregación se debe a la formación de polímeros de una AAT mutante; los polímeros se forman a través de una fuerte interacción entre una asa específica de una molécula y una hoja β plegada de otra. A través de mecanismos que no están aún bien definidos, este tipo de pacientes desarrolla hepatitis y una cirrosis consecuente (acumulación de grandes cantidades de colágena, que resulta en fibrosis). Es posible que la administración de un péptido sintético con una secuencia muy parecida a la del asa mencionada, pueda inhibir la polimerización en asa-hoja. Hoy en día la hepatopatía por deficiencia grave de AAT puede ser tratada con éxito mediante el trasplante de hígado.(1) Alfa 2 - globulina Una de las proteínas mas importantes que migran en esta región es la α2-macroglobulina (AMG). Es una glucoproteína plasmática grande (720 kDa) constituida por cuatro subunidades idénticas de 180 kDa. Comprende de 8 – 10% de las proteínas plasmáticas totales en los humanos. Aproximadamente el 10% de zinc plasmático es transportado por la AMG; el resto es transportado por la albúmina. Esta proteína es sintetizada por una gran variedad de tipos celulares, incluyendo monocitos, hepatocitos y astrocitos. La AMG se une a muchas proteasas y resulta así un inhibidor panproteinasa importante. Los complejos AMG-Proteinasa son rápidamente depurados del plasma por un receptor localizado en muchos tipos celulares. Además la AMG se une a muchas citocinas y parece participar orientándolas hacia su blanco de acción en tejidos o células particulares. Una vez capturadas por las células, las citocinas pueden disociarse de la AMG para después inducir una variedad de efectos sobre el crecimiento y función celulares. (2) La concentración de AMG aumenta diez veces o más en el síndrome nefrótico cuando se pierden otras proteínas de peso molecular inferior. No se produce pérdida en la orina debido a su gran tamaño. Por esta razón alcanza niveles séricos equivalentes o superiores a la albúmina (de 2 – 6 g/dL) en el síndrome nefrótico, lo cual se tiene como consecuencia al mantenimiento de la presión oncótica. (1) 26 Aunque la función de la AMG es importante para el mantenimiento del flujo y reflujo de la proteonólisis, no se ha reconocido ninguna deficiencia específica asociada con enfermedad, no existiendo ningún estado patológico atribuible a concentraciones bajas de AMG. Se han observado elevaciones leves, pero claras de AMG en la electroforesis de proteínas séricas durante el inicio de la nefropatía diabética.(1) Otra proteína importante que migra en la región α2 es la Haptoglobina que es una glucoproteína plasmática la cual se une a la Hemoglobina extracorpuscular en un complejo no covalente para mantener los depósitos de hierro corporal y de Hemoglobina.(1) Las globulinas alfa y beta también son proteínas transportadoras. Estas se combinan con pigmentos, metales, carbohidratos y lípidos.(1) Las gammaglobulinas o inmunoglobulinas juegan un papel importante en el sistema inmunitario de defensa suministrando los anticuerpos necesarios para respuesta inmune contra bacterias, virus y toxinas.(1) 2.3.6 CARACTERÍSTICAS ELECTROFORÉTICAS DE LAS PROTEÍNAS SÉRICAS EN CIERTAS CONDICIONES CLÍNICAS Inflamación aguda La inflamación aguda es caracterizada por respuesta bioquímica localizada (activación de complemento) y por respuesta celular (movilización de fagocitos, incrementa la síntesis de proteínas). (4) Los signos clínicos en una inflamación aguda incluyen: - Resultado del incremento de sustancias toxicas que estimulan el sistema nervioso central. - Sedimentación eritrocitaria elevada, incremento en los niveles de globulinas alfa 1 y alfa 2, así como fibrinógeno. - Leucocitosis, seguida de actividad fagocítica. - Incremento de los niveles de proteínas de fase aguda, como alfa 1 antitripsina, orosomucoide, haptoglobina, proteína C reactiva, alfa 2 macroglobulina y ceruloplasmina.(4) El incremento de proteínas de fase aguda se presenta en los siguientes desordenes: - Infección aguda (bacterial, viral o parasitaria) - Trauma (mecánico, físico, químico), resultando en daño al tejido (contusiones, cirugía, trombosis, etc.) 27 - Fallo cardiaco - Coma metabólico (uremia, shock, etc.)(4) Inflamación crónica La condición de inflamación crónica está asociada con incremento de ciertas proteínas referidas como proteínas de fase crónica. Electroforéticamente, esta respuesta es vista como un ligero a moderado aumento en las fracciones alfa 2 y beta globulinas. La albúmina se encuentra ligeramente disminuida con un incremento policlonal de gamma globulinas.(4) Las proteínas de fase crónica se han visto en los siguientes desórdenes: - Infecciones crónicas (brucelosis, tuberculosis, enfermedad de Hodgkin, entre otros) - Enfermedad de colágeno o tejido conectivo. - Alergias - Desórdenes autoinmunes.(4) Enfermedades hepáticas El hígado es el sitio de síntesis de albúmina, por lo que enfermedades que involucren este órgano, afectarán los niveles de esta fracción proteica. Sin embargo una disminución en los niveles de albúmina solo se presenta en enfermedades hepatocelulares avanzadas.(4) Problemas hepáticos asociados a patrones de electroforesis de proteínas en suero: - Hepatitis viral aguda: Incremento en los niveles de IgG e IgM. - Enfermedad hepática crónica (Incluye cirrosis): Marcado incremento de IgG, IgM e IgA con una disminución de albúmina y transferrina. - Destrucción biliar: incremento de los niveles de C4 y beta lipoproteína.(4) Síndrome nefrótico El síndrome nefrótico puede ser ocasionado por diabetes mellitus, enfermedad del tejido conectivo, enfermedad glomerular o circulatoria. Este es caracterizado por: 28 - Hipoproteinemia - Hipoalbuminemia - Edema - Hiperlipidemia - Proteinuria (4) Hipogamaglobulinemia Es caracterizada por el decremento de algunas o todas las inmunoglobulinas. La mayoría de estas deficiencias son hereditarias y se manifiestan en la infancia (Síndrome de Wiskott-Aldrich, enfermedad de Bruton) (4) La deficiencia adquirida de inmunoglobulinas en adultos puede ser secundaria a un estado patológico, tal como gammopatías monoclonales o inducido por terapia con inmunosupresores.(4) Gammopatias mono y biclonales Representan desórdenes de síntesis de inmunoglobulinas asociados con la proliferación de clones de linfocitos B. La electroforesis muestra un pico homogéneo en el área beta-gamma (algunos en el área alfa 2) y es generalmente asociado con un disminución en las inmunoglobulinas normales. Estas paraproteínas homogéneas son formadas de un solo tipo de cadenas ligeras que son filtradas por túbulos glomerulares y forman la proteína Bence Jones.(4) En el siguiente cuadro se resumen las diferentes fracciones de proteínas obtenidas mediante electroforesis. 29 TABLA No. 1 FRACCIONES PROTEINICAS OBTENIDAS POR ELECTROFORESIS PROTEÍNA(S) FRACCIÓN Prealbúmina Albúmina Proteína enlazante de Retinol Transtiretina Albúmina Alfa1- globulina Alfa1-Antitripsina Orosomucoide Lipoproteína de alta densidad (HDL) Alfa2- globulina Alfa2-Macroglobulina Haptoglobina Ceruloplasmina Beta- globulina Transferrina Lipoproteína de baja densidad (LDL) Fracción 3 del Complemento IgA Fibrinógeno Gamma- globulina IgG IgM Proteína C-reactiva FUNCIÓN Transporte de Vitamina A Portadora de hormonas tiroideas Principal proteína plasmática; contribuye a reducir la acumulación de agua en los tejidos; transportadora de muchas sustancias Inactiva la tripsina y otras enzimas proteolíticos, reduce la lesión propia de una inflamación Modulador de la respuesta inmunitaria, unión de drogas ácidas tales como la lidocaína Transporte reverso del colesterol ("colesterol bueno" ) Unión a muchos enzimas, prevención de la lesión tisular Proteína de unión a la Hemoglobina Proteína transportadora de cobre, implicada en el metabolismo normal del hierro Transporte de hierro y liberación del mismo a las células Liberación de colesterol a los tejidos Ayuda a regular la respuesta inflamatoria a sustancias extrañas Inmunoglobulina relacionada con secreciones Factor de coagulación (hallado sólo en plasma, no en suero) Principal inmunoglobulina; inmunidad a largo plazo Inmunoglobulina de respuesta inicial Mediador de la respuesta inflamatoria 30 2.3.7 PROTEINAS URINARIAS Son derivadas de las proteínas plasmáticas que se filtran a través del riñón. Las proteínas de alto peso molecular son retenidas en su paso a través del glomérulo y las de bajo peso molecular pasan esta barrera para después ser reabsorbidas a través del túbulo renal. Las pequeñas cantidades de proteínas plasmáticas que son excretadas en orina normal van de 50 – 150 mg en un periodo de 24 horas.(4) La aparición de proteínas plasmáticas anormales en orina es de gran valor en la evaluación de la función renal. La electroforesis contribuye a la diferenciación de tipos de proteinuria severa: - Proteinuria fisiológica: La albúmina está muy pronunciada y las globulinas siguen un curso indiferente. - Proteinuria glomerular: o Selectiva: La orina consiste primariamente de albúmina (80%) y transferrina. Este patrón es característico de síndrome nefrótico. o No selectiva: El patrón de electroforesis urinaria es similar que el del suero. Este patrón aparece en glomerulonefropatías primarias y secundarias. (La glomerulonefropatía puede ser secundaria a enfermedades como diabetes, amiloidosis, disglobulinemia y enfermedades de colágeno). - Proteinuria tubular: La albúmina no es muy pronunciada; dominan alfa 1, alfa 2, beta y gamma globulinas. Este patrón es más observado en las siguientes condiciones: nefropatías tubulares congénitas, nefritis tubular intersticial, pielonefritis crónica y policistitis de riñón. - Proteinurias asociadas con disglobulinemias: una o más bandas en la región gamma, moléculas de inmunoglobulina intacta, cadenas ligeras libres o cadenas pesadas. (4) 31 PROTEINURIA DE BENCE JONES Las proteínas de Bence Jones son cadenas ligeras monoclonales (kappa o Lambda) de las inmunoglobulinas o sus fragmentos, producidas y secretadas por células B derivadas de un clon que prolifera en forma anómala.(19) Debido al tamaño molecular relativamente pequeño de las cadenas ligeras libres, estas se filtran a través de los glomérulos y son reabsorbidas y catabolizadas por las células tubulares proximales. Cuando se supera la capacidad de reabsorción tubular se excretan en orina.(19) El estudio de la proteinuria de Bence Jones está indicado ante la sospecha de mieloma de cadenas ligeras. En el caso de mieloma la presencia de la proteína de Bence Jones aporta información importante sobre el índice de masa tumoral y permite la monitorización de la enfermedad. Por otra parte es útil para diferenciar una gammapatía monoclonal de significado incierto de las enfermedades proliferativas malignas de células plasmáticas. (19) 2.3.8 PROTEÍNAS EN LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO (LCR) El LCR circula a lo largo del sistema nervioso central a través del cerebro y la médula espinal. Es producido por ultrafiltración de plasma en los plexos coroideos laterales, tercer y cuarto ventrículo cerebral. Su volumen varía con la edad. Cerca de un 95 % de las proteínas encontradas en LCR resulta del transporte activo de proteínas plasmáticas de la barrera Hematoencefálica. Una pequeña porción de LCR es resultado de su síntesis localizada. Cambios en la permeabilidad de la barrera Hematoencefálica por una compresión mecánica, lesiones extensivas, daño vascular o infecciones pueden resultar en una acumulación de proteínas en LCR. (4) DIFERENTES FRACCIONES PROTEÍNICAS Y SUS VARIANTES PATOLÓGICAS EN LCR - Prealbúmina: Elevada en atrofia cerebral, el origen ventricular de esta proteina es mostrada por: un elevado porcentaje en LCR de origen cisternal o ventricular; disminución o ausencia en fluido lumbar así como ocurre en bloqueo espinal. (4) 32 - Albúmina: Es considerada el gran marcador de la permeabilidad de la barrera Hematoencefálica. La cuantificación de albúmina puede ser utilizada para definir el tipo de fluido espinal, el porcentaje de trasudado, y en particular, el origen preciso del incremento de inmunoglobulinas LCR.(4) - Alfa globulinas: Alfa 1 y alfa 2 globulinas pueden ser observadas como dos fracciones entre la albúmina y la beta globulina. Su elevación es frecuentemente observada en procesos malignos (como tumores cerebrales) y muy raramente en el curso de alguna enfermedad de colágeno.(4) - Beta 1 globulinas: Un porcentaje elevado se observa frecuentemente después de una Hemorragia meningeal. (4) - Beta 2 globulinas: Su incremento aparece en ciertos desórdenes degenerativos.(4) - Gamma globulinas: • Policlonal: Esta es la apariencia normal y de reacción inmunológica de origen plasmático. Las reacciones inmunológicas involucran un gran número de moléculas (opsoninas, anticuerpos específicos). Este involucramiento general es reflejado por un incremento heterogéneo de las gamma globulinas y en este punto, las IgG tienen su característica policlonal.(4) • Monoclonal: Este es particularmente característico de mielomas, con el clásico pico, idéntico al que se observa en suero.(4) • Oligoclonal: Durante el curso de ciertos desórdenes inmunopatológicos del sistema nervioso, de dos a cinco bandas de gamma pueden aparecer en una característica oligoclonal. Esto es fisiopatológicamente considerable y de valor diagnóstico: fisiopatológico, en muchos casos las bandas oligoclonales indican síntesis intracraneal de IgG. Diagnóstico, varios desórdenes que manifiestan francamente esta característica son neurosífilis, tripanosomiasis y esclerosis múltiple.(4) 33 2.3.9 GAMMAPATIAS MONOCLONALES Las gammopatías monoclonales son un grupo de desórdenes caracterizados por la proliferación de un clon único de células plasmáticas que producen una proteína homogénea, monoclonal (M).(19) Las proteínas monoclonales constan de dos cadenas polipeptídicas pesadas de la misma clase y subclase y dos cadenas polipeptídicas ligeras del mismo tipo. Las gammopatías monoclonales son sinónimos de discrasias de células plasmáticas, inmunoglobulinopatías y disproteinemias. (6) Las gammopatías monoclonales se pueden clasificar como sigue: • Gammopatías monoclonales malignas o Mieloma múltiple (IgG, IgA, IgD, IgE y cadenas ligeras libres) Plasmocitoma óseo solitario Plasmocitoma extracelular, solitario y múltiple Leucemia de células plasmáticas Mieloma no secretor o Enfermedades linfoproliferativas malignas Macroglobulinemia de Waldenström, o macroglobulinemia primaria (IgM) Linfoma maligno o Enfermedades de cadena pesada (HCD) HCD γ HCD α HCD µ o Amiloidosis Primaria Con mieloma La amiloidosis secundaria localizada y familiar no presentan proteínas monoclonales. • Gammopatías monoclonales de significación no determinada o Benignas (IgG, IgA, IgD, IgM y raramente cadenas ligeras libres) o Asociadas con neoplasias de tipos celulares que se desconoce produzcan proteínas monoclonales. o Gammopatías biclonales. (6) 34 Aunque las proteínas monoclonales fueron consideradas durante mucho tiempo como anormales, estudios realizados demuestran que tan sólo son cantidades excesivas de inmunoglobulinas que se pueden producir de forma normal. La característica llamativa de las proteínas monoclonales que llevó a los investigadores a considerarlas anormales fue su homogeneidad, es decir, presentan una localización bien definida en el corrimiento electroforético. (6) La posibilidad expresada por Kunkel de que las proteínas del mieloma son anticuerpos individuales con origen de un clon único de células malignas, ha sido apoyada por su actividad antígeno combinante. La actividad de anticuerpo monoclonal en humanos se ha asociado con la enfermedad de aglutininas frías, así como también con una amplia variedad de antígenos bacterianos, incluyendo estreptolisina O, proteína estafilocócica, polisacáridos de Klebsiella y Brucella. (6) Proteínas monoclonales transitorias han sido observadas en niños pequeños con inmunodeficiencia e infecciones. Estas proteínas están presentes en escasa cantidad y desaparecen dentro de los dos meses. (28) Puesto que las infecciones pueden producir proteínas monoclonales transitorias, parece probable que la homogeneidad de las proteínas del mieloma y de las macroglobulinemias refleje la asociada con anticuerpos altamente purificados, o sea, la resultante de su producción por un clon único de células sintetizadoras de inmunoglobulinas.(6) Normalmente las células plasmáticas producen cadenas pesadas y un ligero exceso de cadenas ligeras que se vuelcan hacia la orina. En el mieloma IgG, cerca de las tres cuartas partes de los pacientes presentan un exceso de cadenas ligeras que se pueden excretar por la orina (proteinuria de Bence Jones). Este pequeño exceso de producción de cadenas ligeras puede ser debido a un desequilibrio en la traducción o transcripción dentro de clones ocasionales o una posible supresión de la síntesis de cadenas pesadas en tales clones. En otros casos, las células plasmáticas no excretan cadenas pesadas y sólo se detectan cantidades excesivas de cadenas ligeras. Por último una pequeña proporción de células del mieloma no segregan exceso de cadenas pesadas ni ligeras, ya sea por una simple falla en la síntesis o un bloqueo en la secreción; estas se denominan no secretoras. (6) El análisis de suero u orina requiere de un método de investigación sensible, rápido y seguro para detectar la presencia de una proteína monoclonal y un ensayo específico para la identificación de acuerdo a su clase de cadena pesada y ligera. La técnica de inmunofijación es empleada para discernir inmunoglobulinas con anomalías múltiples y lograr información adicional sobre sus propiedades, es especialmente útil para evidenciar gammopatías biclonales y detectar alguna proteína monoclonal en presencia de hipergammaglobulinemia difusa.(28) 35 En esta técnica, se emplean seis antisueros anti IgG, anti IgA, anti IgM, anti-κ y anti-λ, de tal forma que se puedan identificar cadenas pesadas (γ, α y µ) y cadenas ligeras (κ y λ).(28) En algunos casos de inmunoglobulina monoclonal se observan dos bandas de diferente movilidad electroforética en la zona de cadenas ligeras, mientras que sólo se presenta una banda con el antisuero anti cadenas pesadas, lo cual indica la presencia de cadenas ligeras libres, además de moléculas intactas de inmunoglobulinas.(28) En muchos casos (especialmente con proteínas IgA e IgM), la reacción con antisueros anti cadena ligera es negativa, debido a que la estructura cuaternaria de la molécula oculta los determinantes antigénicos de cadena ligera e impide que éstas reaccionen con el anticuerpo correspondiente.(28) Ningún método es por si solo adecuado para el diagnóstico de anormalidades en las proteínas. La correlación entre los resultados de electroforesis, inmunofijación y concentración proteica representa un enfoque racional en el análisis. (6) Así mismo, las características electroforéticas de los componentes monoclonales hacen que sean detectables en un proteinograma sérico convencional por la aparición de una banda delimitada y homogénea localizada, generalmente en la fracción gamma o, con menor frecuencia, en las fracciones beta y alfa 2. Esta técnica presenta una elevada sensibilidad, permitiendo la detección de componentes monoclonales séricos incluso a concentraciones muy bajas. (19) Las inmunoglobulinas monoclonales se pueden hallar en un 0.1 a 0.3 % de individuos normales sanos de más de 21 años. Esta frecuencia se incrementa con la edad. En todos los casos con hipergammaglobulinemia monoclonal benigna, la concentración de proteína monoclonal es constante a través de los años y no hay reducción de otras seroinmunoglobulinas. (6) 36 2.4 LIPOPROTEÍNAS Las lipoproteínas son complejos circulantes formados por lípidos y proteínas. La clasificación esta basada en las propiedades de las lipoproteínas que las llevan a su separación: 1.- Su densidad (ultracentrifugación) 2.- Su carga (Electroforesis de zona) 3.- Su tamaño (filtración molecular en poliacrilamida). Todas siguen la regla general, según la cual su densidad disminuye al aumentar su contenido de triglicéridos y disminuir el de proteínas. (3) La clasificación de las hiperlipemias está basadLLa en la electroforesis de zona. En los geles de agarosa las lipoproteínas se separan en las siguientes fracciones: • Quilomicrones: Son partículas esféricas de 0.1 a 0.5 µ de diámetro. Constan de una envoltura externa de lipoproteína beta, que contiene polipéptidos beta, fosfolípidos, colesterol y una pequeña cantidad de albúmina. Su contenido de lípidos es el siguiente: 95% de triglicéridos, 3% de fosfolípidos y 2% de colesterol. La relación de colesterol libre y esterificado es mayor en los quilomicrones que en cualquier otra lipoproteína. Por su alto contenido de triglicéridos, los quilomicrones son las más ligeras de las lipoproteínas (densidad < 1.006). En forma característica durante la electroforesis su movilidad es escasa o nula, quedan prácticamente en el punto de aplicación de la muestra. Son las responsables de la opacidad del suero. (3)(4) • Beta lipoproteínas o LDL (Lipoproteínas de baja densidad): moléculas de 20 a 25 nm de diámetro y una densidad entre 1.019 y 1.063. Migran normalmente en la posición de las beta 2 microglobulinas. Están constituidas por 55% de colesterol, 30% de fosfolípidos y 15% de triglicéridos. Son producidas por el hígado y quizá también por las células de la mucosa intestinal.(3)(4) • Pre-beta lipoproteínas o VLDL (Lipoproteínas de muy baja densidad): Tienen un diámetro de 30 a 100 nm, una densidad entre 0.94 y 1.019. Su componente lipídico fundamental son los triglicéridos (52%), de origen endógeno, aunque contienen un 22% de colesterol libre y esterificado. Migran en la posición de las beta globulinas. (3)(4) • Alfa lipoproteínas o HDL( Lipoproteínas de alta densidad): Moléculas de 20 a 25 nm de diámetro, su densidad va de 1.063 a 1.021. Son producidas en el hígado y contienen menos esfingomielina y mas 37 lisolecitina que las LDL. Son las mas rápidas electroforéticamente y migran en la posición de las alfa 2 globulinas. Contienen un 19 % de colesterol. En condicionas normales HDL transporta el colesterol de todos los tejidos al hígado. A diferencia de las LDL, no se conoce ninguna enfermedad relacionada con cifras altas de HDL. En cambio hay valores bajos en aterosclerosis, hipergliceridemia, estados de mala absorción, granuloma eosinófilo, enfermedad de Gaucher, enfermedad de Niemann-pck, y falta pronunciada o casi completa en la obtrucción biliar.(3) (4) Hay una fracción denominada lipoproteína de densidad intermedia (IDL) que resulta del catabolismo intravascular de VLDL. Migra entre la fracción beta y pre-beta, pero cierra en esta última. Una ayuda para interpretar los perfiles lipoproteicos es la clasificación de proteínas de Fredrickson: 2.4.1 HIPERLIPOPROTEINEMIAS PRIMARIAS • Tipo I: Hiperquilomicronemia Hay presencia de quilomicrones cerca del punto de aplicación. Las lipoproteínas beta, pre-beta y alfa están disminuidas o ausentes. El colesterol es normal o elevado. Los triglicéridos son muy elevados. El suero es lechoso.(4) • Tipo II: Hipercolesterolemia primaria No hay presencia de quilomicrones. Las Beta lipoproteínas están elevadas. Las lipoproteínas pre-beta y alfa están normales. Colesterol muy elevado y triglicéridos normales. El suero es claro.(4) • Tipo IIb: Hiperlipidemia mixta. No hay presencia de quilomicrones. Las lipoproteínas beta y pre-beta están aumentadas, mientras que las alfa son normales. El colesterol está elevado; los triglicéridos son normales o ligeramente elevados. El suero es opalescente.(4) 38 • Tipo III: Hiperlipidemias mixta Está presente una fracción de lipoproteínas de densidad intermedia (IDL) entre las fracciones beta y pre-beta. La fracción beta está disminuida, la Pre-beta está elevada. El colesterol y los triglicéridos están elevados. El suero es claro o ligeramente opalescente.(4) • Tipo IV: Hipertrigliceridemia endógena inducida por carbohidratos. Se presenta una banda de quilomicrones. Las lipoproteínas pre-Beta están elevadas. Las beta y alfa lipoproteínas están disminuidas. Los niveles de colesterol van de normal a ligeramente elevado; los triglicéridos también se encuentran incrementdos. El suero puede ser claro u opalescente.(4) • Tipo V: Hipertrigliceridemia endógena y exógena. Se presenta una banda de quilomicrones. Las lipoproteínas beta están normales o ligeramente elevadas. La fracción pre-beta se encuentra elevada y las lipoproteínas alfa disminuidas. Los triglicéridos pueden ser normales a ligeramente elevados. El suero es lechoso. (4) 2.4.2 HIPERLIPOPROTEINEMIAS SECUNDARIAS Endocrinas: • Diabetes: Esta enfermedad generalmente acompañada por una rápida y excesiva movilización de ácidos grasos almacenados en el cuerpo, dando como resultado una elevación de los lípidos totales en suero y en particular triglicéridos. Durante episodios de coma diabético y en acidosis, disminuyen los niveles de colesterol y de lipoproteínas beta. La electroforesis puede determinar un tipo I o IV de hiperlipoproteinemia.(4) • Hipotiroidismo • Acromegalia (16) Fármacos: • Alcoholismo: Los triglicéridos aumentan resultando en un patrón de lipoproteínas tipo IV.(4) • Corticoides (16) Renales: • Uremia 39 • Síndrome nefrótico: Las proteínas liberadas por el riñón resultan en un aumento en la producción de proteínas por el hígado. Los lípidos en el plasma se unen a las proteínas dando como resultado una hiperlipoproteinemia. Los resultados de lipoproteínas siguen el patrón tipo IV.(4) (16) Hepática: • Enfermedad hepática obstructiva: las lipoproteínas alfa y beta aumentan. En casos severos, la migración de proteínas alfa es retardada.(4) • Hepatitis viral aguda: Incremento de las lipoproteínas alfa se asocian generalmente con esta condición.(4) Inmunes: • Lupus eritematoso sistémico • Gammapatías monoclonales(16) 40 2.5 ISOENZIMAS DE FOSFATASA ALCALINA EN SUERO La fosfatasa alcalina (ALP por sus siglas en inglés Alkaline phosphatase) es una metaloglicoproteína con actividad monofosfoesterasa, que cataliza la hidrólisis de ésteres monofosfóricos, activada por iones de magnesio en medio alcalino. Se encuentra en todos los tejidos y órganos, por ejemplo, hígado, hueso, intestino, riñón y placenta. Su elevación es evidente en una variedad de afecciones hepáticas, en el crecimiento adolescente normal.(29) (4) Las isoenzimas hepática y ósea son las dos fracciones que aparecen en individuos sanos. Pueden observarse de una a tres fracciones intestinales en el suero que a un nivel normal de actividad de fosfatasa alcalina no se ha asociado con ninguna condición patológica. En los individuos que no han ayunado y en los que posen en grupo sanguíneo O o B aparece esta isoenzima intestinal mas a menudo.(29) 2.5.1 ISOENZIMAS HEPÁTICAS - Fracción L1.- Es la más anódica de todas las isoenzimas y la más significativa de las dos hepáticas. Está incrementada en algunas enfermedades como colestasis, cirrosis, hepatitis vírica y en varias patologías biliares y hepáticas. También L1 se incrementa en tumores malignos con metástasis hepáticas, en cáncer pulmonar y tracto digestivo y en el linfoma.(29) - Fracción L2.- También denominada macrohepática o hepática rápida, existe en los individuos sanos pero a una baja concentración (menor a 8UI/L). Podría ser de origen membranoso y estar asociada con lipoproteinas. Un aumento de L2 puede darse en colestasis y en enfermedades biliares (cirrosis, hepatico vírica) y en tumores malignos ( por ejemplo, de pecho, hígado, pulmón, próstata, aparato digestivo) con metástasis hepática.(29) 2.5.2 ISOENZIMA ÓSEA Es una isoenzima que está presente en todos los individuos normales. Tiene que interpretarse de acuerdo a la edad, ya que su elevación es fisiológicamente normal durante la edad de crecimiento. Su aumento se puede asociar con las siguientes afecciones: - En tumores malignos como el cáncer de pecho con metástasis ósea o hepática. También en el osteosarcoma y en el linfoma con o sin metástasis. 41 - En enfermedades reumáticas, hiperparatiroidismo, enfermedad de Paget y en el raquitismo. - En hiperfosfatasemia transitoria de la infancia, que está asociada con una fracción hepática especial (más anódica que la L1). En tal caso, la fosfatasa alcalina total se encuentra muy elevada (mayor a 2000 UI/L) Cuando está asociada con el aumento de otra fracción (L1 y L2) puede indicar malignidad del recto, pulmón y próstata (con metástasis ósea y hepática) (4) (29) 2.5.3 ISOENZIMAS INTESTINALES Pueden verse como 1, 2 ó 3 fracciones. Alrededor de un 40% de los individuos normales poseen la isoenzima intestinal. Su actividad puede estar aumentada en enfermedades como cirrosis hepática, diabetes, fallo renal crónico y enfermedades cancerosas del tracto intestinal. (29) En un estudio realizado a pacientes dializados se encontró un aumento de los niveles séricos de isoenzima intestinal, acompañada en todos los casos, de una fracción intestinal variante, ya que las fosfatasas intestinales podrían reflejar un daño en la membrana celular y resultar marcadores eficaces en las alteraciones gastrointestinales presentes en el paciente renal crónico. (26) 2.5.4 ISOENZIMA PLACENTARIA Hay dos formas de estas isoenzimas: la forma principal P1, y la forma minoritaria P2, que representan alrededor del 90 y 10% respectivamente. Se encuentra durante el embarazo y en algunas enfermedades malignas, principalmente cáncer de ovario, así como en los sarcomas y cánceres pancreáticos y de estómago. Su aumento también puede deberse a fumar en exceso (se libera desde pulmón).(29) COMPLEJO FOSFATASA ALCALINA/LP Este es un complejo de lipoproteínas y L2. Permanece muy cerca del punto de aplicación y puede aparecer en enfermedades biliares obstructivas.(29) 42 2.6 ISOENZIMAS DE CREATINA CINASA (CK) La CK es una enzima que tiene muchas formas moleculares y está presente en un gran número de tejidos. Esta enzima cataliza de forma reversible la reacción de defosforilación de creatin fosfato para formar ATP. CK Creatin fosfato + ADP Creatina + ATP (30) CK es un dímero formado por dos tipos de cadenas polipeptídicas, denominadas M y B. Cada una de estas asociaciones resulta en una molécula con diferente punto isoeléctrico, permitiendo su diferenciación por electroforesis. Son tres isoenzimas de CK que podemos diferenciar (30) • CK3 o CK-MM, que está presente en músculo esquelético, no migra en la electroforesis, está localizada en el punto de aplicación. Se encuentra aumentada en los siguientes casos: trauma quirúrgico, ejercicios físicos intensos, distrofia muscular, miopatía, polimiositis, hipotiroidismo, drogas e inyecciones intramusculares.(30) • CK2 o CK-MB, se encuentra en alta concentración en corazón, colon y placenta, migra entre la CKMM y la CK-BB. Esta fracción se aumenta entre 4 y 8 horas después de un infarto de miocardio. También se incrementa su actividad en infarto de placenta y colon.(30) • CK1 o CK-BB, Se encuentra principalmente en cerebro, su migración es anódica. Se encuentra incrementada principalmente en algunas afecciones y traumas del sistema nervioso. También se eleva su actividad en lesiones venosas o arteriales y en carcinomas de diversos orígenes. También se ha encontrado CK-BB en algunos casos de edema pulmonar agudo y en adicción a la heroína.(4)(30) Existen otras dos isoenzimas: • Isoenzima mitocondrial (CKm), su migración es catódica y no está formada por las subunidades B o M. Es caracterizada por su afinidad al creatin fosfato y su alta estabilidad. Se encuentra en el suero de la mayoría de los pacientes con enfermedades neoplásicas. La presencia de CK mitocondrial es considerada un marcador para carcinoma en estado metastático. Esta isoenzima también la 43 podemos localizar en el suero de recién nacidos indicando hiperactividad mitocondrial y anoxia tisular (seguido de procedimientos quirúrgicos).(4)(30) • Formas atípicas (Macro CK), es un complejo formado por CK e inmunoglobulinas. Se detecta entre las fracciones MM y MB. o CK-BB/IgA o IgM o CK-MM o CKBB/ IgA (4) 44 3. DESCRIPCIÓN DEL DESEMPEÑO PROFESIONAL Al egresar de la máxima casa de estudios, sobreviene uno de los más grandes retos profesionales: incursionar en el mercado laboral. En la mayoría de los casos, como estudiantes se desconoce la gran competencia que existe en este ámbito y que realmente los mejores preparados son los que ocuparán las escasas vacantes. Aunado a lo anterior, las empresas en su mayoría, exigen como requisito indispensable “experiencia laboral”, de la cual se carece por ser recién egresados y lo que dificulta enormemente conseguir un empleo. Por lo anterior considero de suma importancia la incursión del estudiante en el ámbito laboral durante la etapa escolar, ya sea mediante estancias, prácticas profesionales, servicio social o como becarios, lo que permita tener un panorama más amplio de lo que vamos a enfrentar una vez concluida una carrera universitaria, así como adquirir experiencia en algún área de interés en particular. La empresa que me brindó la oportunidad de ejercer mi profesión, aún sin la suficiente experiencia, y en la cual me encuentro laborando actualmente, se llama CARPERMOR. CARPERMOR, es un laboratorio clínico de referencia que surge en 1993, el cual cuenta con vanguardia tecnológica que le ha valido el reconocimiento nacional e internacional por su calidad. Presta servicios en pruebas de rutina, mediana y alta especialidad. Es una empresa que cuenta con la acreditación de la Entidad Mexicana de Acreditación (EMA) y en el año 2001, Carpermor logró la certificación ISO 9002. Cuenta con varias áreas entre las cuales se encuentran Microbiología, Hematología, Inmunoquímica, Toxicología, Histopatología y Biología Molecular El área en la que laboro es Inmunoquímica, la cual a su vez se divide en dos: bioquímica e inmunología. Esta última basada principalmente en reacciones antígeno-anticuerpo que permiten evidenciar (cualitativa o cuantitativamente) diversos analitos. En el área de Bioquímica se encuentran pruebas consideradas de rutina, así como pruebas especiales. 45 Al ingresar, hacen del conocimiento del personal la constitución de la empresa, su organigrama, así como los procedimientos generales de la misma, entre los que destacan los siguientes: 1.- Los que describen las funciones y responsabilidades de cada uno de los integrantes de la compañía dependiendo el puesto que en ella ocupen, enfocándose en el cargo que se va a desempeñar, en particular el de Químico Analista, los cuales se enlistan en la tabla 2. Tabla No. 2 Descripción de las funciones del Químico analista en Carpermor FUNCIONES DEL QUÍMICO ANALISTA EN CARPERMOR o Verificar que las muestras que se reciben para el análisis cumplen con las especificaciones de aceptación establecidas. o Identificar las pruebas solicitadas y los datos necesarios para el reporte de resultados. o Preparar las muestras para darles las condiciones específicas para su proceso analítico. o Generar las cargas de trabajo para las pruebas que se van a procesar. o Analizar las muestras siguiendo los procedimientos analíticos establecidos para cada prueba, en los tiempos indicados para obtener resultados en el tiempo comprometido y archivar los resultados en orden cronológico de acuerdo al procedimiento específico. o Verificar que los resultados del análisis del material de control sean los esperados y asegura también que ningún resultado se reporte si no son los correctos. o Ingresar los resultados de los pacientes en el sistema de cómputo cuando éstos son reportados manualmente. o Liberar los resultados de los pacientes que están fuera de los límites de referencia; sólo cuando los resultados del análisis del material de control se obtienen dentro de los límites esperados. o Liberar órdenes con cifras de alerta. o Verificar que existan en el sistema de cómputo los resultados completos y correctos para que todos los datos demográficos de cada paciente se encuentren con su resultado correspondiente. o Solicitar y autorizar la solicitud de los reactivos y materiales, registrando las entradas y 46 salidas de los mismos, para evidenciar que su consumo concuerda con su producción. o Asegurar que se realice la limpieza y el mantenimiento preventivo a los equipos y/o instrumentos que están bajo su responsabilidad y firmar los registros específicos de las actividades realizadas. o Manejar el o los instrumentos necesarios para realizar las pruebas que le requieren, buscando el apoyo del jefe inmediato para interpretar los resultados que no estando dentro de los límites de referencia, tenga duda para reportarlos, no sin antes ver si existen pruebas relacionadas. o Asegurar que no existan pendientes al final de la jornada. o Validar nuevas metodologías e instrumentos adquiridos por el departamento cuando se requiera. o Participar en proyectos de investigación desarrollados por el departamento, cuando se requiera. 2.- Los que detallan la forma de utilizar los diferentes sistemas electrónicos de CARPERMOR y los cuales permiten rastrear alguna muestra, revisar los antecedentes de laboratorio de los pacientes, ver los códigos de estudio de cada una de las determinaciones, así como los sistemas en los que se lleva a cabo el registro de las muestras y el reporte de los resultados. 3.- Procedimiento que describe la manera en el que se debe realizar el registro y almacén de los resultados. 4.- Procedimiento de como se debe llevar a cabo el Control de Calidad de acuerdo al área en la que se esté laborando. 5.- Procedimientos para el manejo de muestras, que van desde bioseguridad, hasta el control que se le debe dar a cada una de ellas desde que llegan al área de trabajo, hasta que se concluye el proceso (con el fin de que no sean extraviadas o confundidas debido a la cantidad exorbitante que se manejan) y la forma en la que se deben desechar una vez finalizada la jornada. Todo lo anterior se realiza con la finalidad de tener un panorama general del funcionamiento del laboratorio. 47 Posteriormente se asigna al personal de nuevo ingreso un área en específico, la cual fue en este caso particular ELECTROFORESIS en geles de agarosa, en la cual se llevan a cabo la determinación de las diferentes fracciones de Proteínas, Lipoproteínas, Hemoglobinas, algunas isoenzimas como Creatin cinasa (CK), Lactato deshidrogenasa (LDH) y Fosfatasa alcalina (ALP), así como la detección de proteínas específicas como la Bence Jones, o proteínas monoclonales mediante técnicas de Inmunofijación, tanto en suero como en Líquido cefalorraquídeo (éste último en la determinación de bandas oligoclonales). Para poder desempeñarme satisfactoriamente en esta área tuve que pasar por un proceso de capacitación la cual estuvo a cargo del proveedor del equipo, que incluyó desde el conocimiento de la técnica, hasta la interpretación de cada una de las determinaciones. La capacitación técnica incluyó el manejo del equipo (SPIFE 3000, Helena laboratories), el aprendizaje de las diferentes metodologías mediante las cuales se llevan a cabo cada una de las electroforesis mencionadas, así como los puntos críticos de las mismas, y el uso correcto del Software donde se obtienen las lecturas de los geles. Para la interpretación de cada una, se llevó a cabo una revisión bibliográfica, que incluyera fundamento, conocimiento de cada uno de los analitos a determinar, su comportamiento electroforético, así como la implicación clínica de los mismos, lo cual permitiera distinguir patrones anormales, relacionarlos a antecedentes clínicos que refiriera el paciente y asociarlos con alguna posible patología. 48 ELECTROFORESIS: UNA HERRAMIENTA APLICADA AL DIGNÓSTICO CLÍNICO 1. OBJETIVO: Establecer la importancia clínica del uso de la electroforesis , empleando resultados de individuos sanos, así como de pacientes, obtenidos a partir del trabajo realizado en CARPERMOR S.A. de C.V., para evidenciar el apoyo que ofrece dicha técnica en el diagnóstico de diversas enfermedades. OBJETIVOS PARTICULARES: • Establecer la importancia clínica de la electroforesis de Proteínas, Lipoproteínas, Hemoglobinas, Isoenzimas de creatina cinasa, Isoenzimas de fosfatasa alcalina, Inmunofijación de proteínas, determinación de bandas oligoclonales y proteína de Bence Jones realizadas en CARPERMOR S.A de C.V. • Mediante el análisis de casos clínicos, mostrar que la electroforesis es empleada como una herramienta en el diagnóstico clínico, relacionando los patrones electroforéticos obtenidos, con condiciones clínicas que puedan orientar a una posible patología. 1 3.1 METODOLOGÍA 3.1.1 MATERIAL 9 Tubos de ensaye 9 Probetas de 100, 1000 ml 9 Matraz aforado de 1000 ml 9 Vasos de precipitado 9 Pipetas semiautomáticas de 10, 200 y 1000 µl 9 Concentrador minicon EQUIPO 9 SPIFE 3000 (Helena laboratories) (Fig. 4) 9 Centrífuga REACTIVOS 9 Agua desionizada: Estable hasta consumo total, cerrada a temperatura ambiente o entre 2-8°C. 9 Solución Salina Fisiologíca: Estable hasta el consumo total del reactivo, si se mantiene cerrado el frasco. 9 REP Prep (Listo para su uso) A continuación se realizará la descripción del procedimiento para cada una de las electroforesis, así como los reactivos que se emplean y la preparación de los mismos. 49 3.1.2 ELECTROFORESIS DE HEMOGLOBINA ALCALINA Reactivos • QuickGel Alkaline Hemoglobin: Estable hasta la fecha de caducidad si se conserva a temperatura ambiente y posición horizontal. El kit contiene: • a) Geles de agarosa (listos para su uso) “QuickGel Alkaline Hemoglobin” b) Colorante azul ácido c) Solución Hemolizante (lista para su uso) d) Ácido cítrico (Decolorante ) e) Aplicadores (listos para su uso) f) Papel filtro (Listos para su uso) Hb AFSC CONTROL: Estable hasta su fecha de caducidad si se mantiene entre 2-8°C. Preparación de reactivos • QuickGel Alkaline Hemoglobin Gel: Cada gel contiene agarosa, tampón de glicina con 0.05% de EDTA y azida de sodio como conservador. Listo para su uso. Estable hasta la fecha de caducidad si se conserva a temperatura ambiente y posición horizontal. No refrigerar o congelar los geles. • Colorante azul ácido: a) Preparar una solución de ácido acético al 5% de la siguiente manera: medir 50.1 ml de ácido acético glacial al 99.8% y aforar a 1 L con agua destilada. b) Disolver el contenido del vial en 1 litro de la solución de ácido acético al 5% previamente preparada. Mezclar y dejar reposar 30 minutos. c) En estado sólido es estable hasta la fecha de caducidad si se conserva a temperatura ambiente. El colorante disuelto es estable seis meses si se conserva a temperatura ambiente. 50 • Reactivo Hemolizante: Es una solución acuosa de EDTA 0.005M, saponina 0.175% y cianuro de potasio 0.07%. Listo para su uso y es estable hasta la fecha de caducidad si se conserva a temperatura ambiente. • Ácido cítrico (decolorante): Disolver el contenido del empaque en 11 Litros de agua destilada y mezclar hasta su completa disolución (se obtiene una solución de ácido cítrico al 0.3 %). Es estable hasta la fecha de caducidad si se conserva a temperatura ambiente. Muestra • Sangre total con EDTA. • Estabilidad de la muestra: Si no es analizada el día en que se recibe, guardar entre 2-8°C, temperatura a la que es estable 1 semana. Preparación de la muestra a. Centrifugar la sangre total a 5000 rpm durante 5 minutos b. Desechar el plasma. c. Lavar el paquete globular 3 veces con 10 volúmenes de solución salina. d. Pipetear 10 µL del paquete globular previamente lavado y adicionar 100 µL de solución Hemolizante e. Agitar en un vortex e incubar 5 minutos a temperatura ambiente. 51 Preparación del control FASC de Hemoglobina a. No requiere previa dilución. b. Pipetear 10 µL del control y adicionar 10 µL de solución Hemolizante. c. Agitar e incubar 5 minutos a temperatura ambiente. TÉCNICA Se emplea la base porta copillas destinada a 20 muestras y se colocan las tiras de copillas deslizándolas por la base hasta el tope ( se emplean las copas pequeñas). Pipetear 20 µL del Hemolizado de las muestras y control en las copas numeradas de 1-5 a 6-10 y 11-15 a 16-20. Seleccionar el programa de migración (QG Alkaline Hemoglobin) Abrir la tapa del módulo de migración del equipo SPIFE 3000 (Helena), deslizar la platina de aplicación hacia el lado derecho oprimiendo el botón que se encuentra en la misma posición y colocar la base con las muestras, haciendo coincidir las entradas de la base con las del equipo. Deslizar la platina hacia el lado izquierdo oprimiendo el botón que se encuentra en dicha posición en el equipo. Romper el plástico protector precortado del (los) peine (s) de aplicación y colocar (los) en la posición 6 y 12 de la platina deslizable. Limpiar la cámara de migración con una gasa humedecida con agua destilada. Sacar el gel del empaque protector y extender un papel filtro en la superficie de agarosa del mismo, para retirar el exceso de líquido. Se debe cuidar que no haya formación de bolsas de aire ya que esto ocasionaría un corrimiento electroforético deficiente. Retirar el papel en un solo paso de forma rápida. Dispensar 600 µL de REP Prep en el marco serigrafiado del módulo de migración. Coloca el gel, dentro del marco serigrafiado, asegurándose de que no haya formación de burbujas. Si las hubiera se puede retirar el gel y volverlo a colocar. Limpiar los electrodos con una gasa humedecida con agua destilada y colocarlos en cada extremo del gel asegurando que hagan contacto con éste y con los postes que se encuentran a los costados de la cámara de migración. Cerrar la tapa e iniciar el proceso de migración, presionando la tecla START y el equipo realiza el proceso automáticamente de la siguiente forma: Los peines de aplicación descienden hacia las 52 copas que contienen las muestras, cargando los peines de las mismas, proceso que tiene 30 segundos de duración. La platina se eleva y desliza hacia el gel, donde desciende nuevamente para entrar en contacto con éste y llevar a cabo la aplicación de la muestra por 30 segundos. Transcurrido este tiempo, la platina se eleva y vuelve a su posición original para dar lugar a la migración, la cual se realiza a una corriente de 550 V a una temperatura controlada de 18°C, durante 15 minutos. Una señal audible indica el término de la migración y entonces se puede abrir la tapa. Una vez concluido el proceso electroforético, el gel es preparado para su tinción, la cual se realiza de la siguiente manera: Se abre la puerta del módulo de Migración, se retiran los electrodos y remueven los bloques de gel que sostienen a los electrodos, con ayuda de una espátula. Esta acción debe realizarse cortando en un solo paso y cuidando de conservar la integridad del gel. Retirar el gel de la cámara electroforética. (En este paso se pueden extraer los peines de aplicación desechándolos, así mismo las muestras). Colocar el gel en el soporte introduciéndolo en las ranuras y verificando que ensamble los orificios del gel en los soportes correspondientes. Introducir el soporte en la cámara de tinción y seleccionar el programa QG ALkaline Hemoglobin e iniciar el proceso presionando el botón START. El proceso de tinción se realiza de la siguiente manera: La tinción se realiza con el azul ácido por 4 minutos, seguido de un proceso de decoloración de 30 segundos y uno de secado de 15 minutos a 70°C. Continúan 2 ciclos de decoloración de 90 segundos, para finalizar con un secado de 7 minutos a 70°C. Durante la tinción, decoloración, lavado y secado del gel, no se debe extraer el soporte que lo contiene, después del enfriamiento de la cubeta, una señal audible indica el término de la tinción y en ese momento se puede retirar el soporte). Posteriormente el gel se edita de la forma siguiente: Retirar el soporte con el gel del compartimento Tinción/Procesado y abre el soporte para extraer el gel ya seco. Si es necesario limpiar la parte posterior del gel con un pañuelo humedecido con alcohol al 70%. Una vez seco el gel, se escanea. 53 Editar el gel escaneado en el Software QuickScan 2000 WIN. De cada muestra saca un impreso de cada grafica editada. 54 3.1.3 ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS EN SUERO, LÍQUIDO CEFALORRAQUIDEO Y ORINA Reactivos • QuickGel Split Beta SPE: Estable hasta la fecha de caducidad si se conserva a temperatura ambiente y posición horizontal. El kit contiene: a) Geles de agarosa (listos para su uso) “QuickGel Split Beta SPE Gel” b) Colorante azul ácido c) Ácido cítrico (Decolorante ) d) Aplicadores (listos para su uso) e) Papel filtro (Listos para su uso) • CONTROL NORMAL SPE: Estable hasta su fecha de caducidad si se mantiene entre 2-8°C. Una vez hidratado es estable 5 días entre 2-8°C y 2 meses a –20°C. • CONTROL ANORMAL SPE: Estable hasta su fecha de caducidad si se mantiene entre 2-8°C. Una vez hidratado es estable 5 días entre 2-8°C y 2 meses a –20°C. Preparación de reactivos • QuickGel Split Beta SPE: Cada gel contiene agarosa en un tampón de tris barbital/MOPS con lactato de calcio y un estabilizador. Además contiene timerosal como conservador. Listo para su uso. • Colorante azul ácido: Ver sección de electroforesis de Hemoglobina. • Ácido cítrico (decolorante): Ver sección de electroforesis de Hemoglobina. 55 Muestra • Suero Estabilidad de la muestra: Si no es analizada el día en que se recibe, guardar entre 2-8°C, temperatura a la que es estable 2 semanas, 1 mes congelada. • Líquido cefalorraquídeo Estabilidad de la muestra: Si no es analizada el día en que se recibe, guardar entre 2-8°C, temperatura a la que es estable 3 días, 1 mes en congelación. • Orina Estabilidad de la muestra: Si no es analizada el día en que se recibe, guardar entre 2-8°C, temperatura a la que es estable 3 días, 1 mes en congelación. Preparación de la muestra • Suero: no requiere tratamiento previo al corrimiento electroforético. • Líquido cefalorraquídeo: Se concentran 100X • Orina: Concentrar las muestras de de acuerdo a la siguiente tabla: Tabla No. 3 FACTORES DE CONCENTRACIÓN PARA PROTEINAS EN ORINA Proteínas totales (mg/dL) Factor de concentración <50 100X 100 50X 300 25X 600 10X >600 5X 56 Determinar proteínas en Orina en Architect C800, y se procede a concentrar la muestra en un concentrador minicon de la siguiente manera: 1) Con una pipeta Pasteur introducir el fluido biológico (Orina o LCR) en la cámara concentradora. FIG. No 3 Empleo del concentrador minicon para orina y LCR 2) Dejar que el líquido fluya libremente hasta la concentración que desea, que puede ser: 5, 10, 25, 50 o 100X. 3) Posteriormente con otra pipeta pasteur sacar el líquido ya concentrado y continuar su proceso. Preparación del control Normal y Anormal El Control Normal y Anormal se reconstituye con 2 ml de agua desionizada, se mezcla y se emplea hasta su completa disolución. TÉCNICA Se emplea la base porta copillas destinada a 20 muestras y se colocan las tiras de copillas deslizándolas por la base hasta el tope (se emplean las copas grandes con capacidad para 100 µL para muestras de suero y copas pequeñas, de 20 µL para muestras de orina o LCR). Pipetear 45 µL de la muestra si ésta se trata de suero y 20 µL si se trata de concentrado de orina o LCR en las copillas correspondientes. Así mismo, colocar 45 µL de control normal y anormal en 57 copas grandes. Las posiciones de controles y muestras es de 1-5 a 6-10 y 11-15 a 16-20. Cuando se tienen muestras de suero y orina/LCR, colocar las muestras de suero en las posiciones 1-5 a 6-10 y las de orina/LCR en 11-15 a 16-20. Seleccionar el programa de migración: QG Serum protein para muestras de suero; QG urine protein si se trata de orina o LCR; o QG SPLIT BETA SPE si se tiene suero y orina /LCR. Abre la tapa del módulo de migración del instrumento SPIFE 3000 (Helena), deslizar la platina de aplicación hacia el lado derecho oprimiendo el botón que se encuentra en la misma posición y colocar la base con las muestras, haciendo coincidir las entradas de la base con las del equipo. Deslizar la platina hacia el lado izquierdo oprimiendo el botón que se encuentra en dicha posición en el equipo. Romper el plástico protector precortado del (los) peine (s) de aplicación y colocar (los) en la posición 6 y 12 de la platina deslizable. Sacar el gel del empaque protector y extender un papel filtro en la superficie de agarosa del mismo, para retirar el exceso de líquido. Se debe cuidar que no haya formación de bolsas de aire ya que esto ocasionaría un corrimiento electroforético deficiente. Retirar el papel en un solo paso de forma rápida. Dispensar 600 µL de REP Prep en el marco serigrafiado del módulo de migración. Colocar el gel, dentro del marco serigrafiado, asegurándose de que no haya formación de burbujas. Si las hubiera se puede retirar el gel y volverlo a colocar. Limpiar los electrodos con una gasa humedecida con agua destilada y colocarlos en cada extremo del gel asegurando que hagan contacto con éste y con los postes que se encuentran a los costados de la cámara de migración. Cerrar la tapa e iniciar el proceso de migración, presionando la tecla START y el equipo realiza el proceso automáticamente de la siguiente forma: Los peines de aplicación descienden hacia las copas que contienen las muestras, cargando los peines de las mismas, proceso que tiene 30 segundos de duración. La platina se eleva y desliza hacia el gel, donde desciende nuevamente para entrar en contacto con éste y llevar a cabo la aplicación de la muestra por 60 segundos a 21°C. Lo anterior aplica si solo se trata de muestras de suero. Si la muestra es de orina o LCR se realizan adicionalmente otras 2 tomas y aplicaciones de 30 segundos cada una. Cuando en la misma corrida electroforética se tienen tanto muestras de suero como de orina o LCR, se realizan primero las 2 tomas y aplicaciones de 30 segundos, el equipo hace una pausa, donde se coloca el peine correspondiente a las muestras de sueros y se oprime continuar, y realizará la toma de muestra de 30 segundos y la aplicación de 60 seg, después de lo cual llevará a cabo una absorción de 60 segundos. Transcurrido este tiempo, la platina se eleva y vuelve a su posición original para dar lugar 58 a la migración, la cual se realiza a una corriente de 350 V y 60 mA, a una temperatura controlada de 21°C, durante 8 minutos. Una señal audible indica el término de la migración y entonces se puede abrir la tapa. Abrir la puerta del módulo de Migración, retirar los electrodos y remover los bloques de gel que sostienen a los mismos, con ayuda de una espátula. Esta acción debe realizarse cortando en un solo paso y cuidando de conservar la integridad del gel. Cerrar la tapa de la cámara de migración y oprimir el botón de continuar para proseguir con el secado, el cual se realiza a 54°C por 10 minutos. Una señal audible indica el término del secado. Realizar la Puesta en Marcha del procesado del gel la siguiente forma: Retirar el gel de la cámara electroforética. Colocar el gel en el soporte introduciéndolo en las ranuras y verificando que ensamble los orificios del gel en los soportes correspondientes. Introducir el soporte en la cámara de tinción y seleccionar el programa QG SPLIT BETA SPE e iniciar el proceso presionando el botón START. El proceso de tinción se realiza de la siguiente manera: La tinción se realiza con el azul ácido por 4 minutos, seguido de tres procesos de decoloración de 60 segundos y uno de secado de 10 minutos a 63°C. Durante la tinción, decoloración, lavado y secado del gel, no se debe extraer el soporte que lo contiene, después del enfriamiento de la cubeta, una señal audible indica el término de la tinción y en ese momento se puede retirar el soporte. Posteriormente el gel se edita de la forma siguiente: Retirar el soporte con el gel del compartimento Tinción/Procesado. Si es necesario limpiar la parte posterior del gel con un pañuelo humedecido con alcohol al 70%. Una vez seco el gel, se escanea. Editar el gel escaneado en el Software QuickScan 2000 WIN. De cada muestra saca un impreso de cada grafica editada. Se procesan proteínas totales y albúmina a las muestras, en el instrumento Architect C800. 59 3.1.4 ELECTROFORESIS DE LIPOPROTEINAS Reactivos • SPIFE Lipoprotein Electrophoresis System: Estable hasta la fecha de caducidad si se conserva a temperatura ambiente y posición horizontal. El kit contiene: a) Geles de agarosa (listos para su uso) SPIFE Lipoprotein Electrophoresis System. b) Colorante Fat Red 7B. c) Aplicadores (listos para su uso) d) Papel filtro (Listos para su uso) • Etanol de 96º: Estable hasta el consumo total del reactivo. • Metanol absoluto • SUERO CONTROL (LIPOTROL): Estable hasta su fecha de caducidad si se mantiene entre 2-8°C. Una vez hidratado es estable 3 días almacenado entre 2-8°C. Preparación de reactivos • SPIFE Lipoprotein Gel: Cada gel contiene agarosa, tampón de barbital de sodio con EDTA, hidrocloruro de guanidina, cloruro de magnesio y azida de sodio como conservador. Listo para su uso. • Colorante Fat Red 7B (Solución stock). Preparar un día antes de su uso: Disolver el contenido del vial de Fat Red 7B en 1 litro de metanol al 95%. Mezclar y dejar reposar 1 día. Filtrar antes de usar. En estado sólido es estable hasta la fecha de caducidad si se conserva a temperatura ambiente. El colorante disuelto es estable dos meses si se conserva a temperatura ambiente. • Colorante Fat Red 7B (Solución de trabajo): Medir en un probeta de 100 ml, 25 ml de la solución stock de fat red 7B y adicionar 5 ml de agua desionizada, mezclar. Preparar 5 minutos antes de su uso. 60 • Solución decolorante: Medir en una probeta de 100 ml, 75 ml de etanol y adicionar 25 ml de agua destilada, mezclar. Preparar antes de usar. • Preparación del control para la electroforesis de lipoproteínas. El control es reconstituido con 1 ml de agua desionizada, mezclar y emplear hasta su completa disolución. Muestra • Suero o plasma con EDTA Estabilidad de la muestra: Si no es analizada el día en que se recibe, guardar entre 2-8°C, temperatura a la que es estable 5 días, no congelar la muestra. Preparación de la muestra • Suero o plasma con EDTA: no requiere tratamiento previo al corrimiento electroforético. TÉCNICA Se emplea la base porta copillas destinada a 60 muestras y se colocan las tiras de copillas deslizándolas por la base hasta el tope (se emplean las copas con número de catálogo 3360, que tienen capacidad para 100 µl). Pipetear de 75 a 80 µL de la muestra y control en las copas de acuerdo a la numeración consecutiva de las mismas. Selecciona el programa de migración (LIPO) Abre la tapa del módulo de migración del instrumento SPIFE 3000 (Helena), deslizar la platina de aplicación hacia el lado derecho oprimiendo el botón que se encuentra en la misma posición y colocar la base con las muestras, haciendo coincidir las entradas de la base con las del equipo. Deslizar la platina hacia el lado izquierdo oprimiendo el botón que se encuentra en dicha posición en el equipo. Romper el plástico protector precortado del (los) peine (s) de aplicación y colocar (los) en la posición 2, 8 y 14 de la platina deslizable. Limpiar la cámara de migración con una gasa humedecida con agua destilada. 61 Sacar el gel del empaque protector y extender un papel filtro en la superficie de agarosa del mismo, para retirar el exceso de líquido. Se debe cuidar que no haya formación de bolsas de aire ya que esto ocasionaría un corrimiento electroforético deficiente. Retirar el papel en un solo paso de forma rápida. Dispensar 2 ml de REP Prep en el marco serigrafiado del módulo de migración. Coloca el gel (con la cara de agarosa hacia arriba), dentro del marco serigrafiado haciendo coincidir las entradas del gel con las de la cámara de migración y asegurándose de que no haya formación de burbujas. Si las hubiera se puede retirar el gel y volverlo a colocar. Limpiar los electrodos con una gasa humedecida con agua destilada y colocarlos en cada extremo del gel asegurando que hagan contacto con éste y con los postes que se encuentran a los costados de la cámara de migración. Cerrar la tapa e iniciar el proceso de migración, presionando la tecla START y el equipo realiza el proceso automáticamente de la siguiente forma: Los peines de aplicación descienden hacia las copas que contienen las muestras, cargando los peines de las mismas, proceso que tiene 30 segundos de duración. La platina se eleva y desliza hacia el gel, donde desciende nuevamente para entrar en contacto con éste y llevar a cabo la aplicación de la muestra por 60 segundos. Transcurrido este tiempo, la platina se eleva y vuelve a su posición original para dar lugar a la migración, la cual se realiza a una corriente de 400 V a una temperatura controlada de 16°C, durante 20 minutos. Una señal audible indica el término de la migración y entonces se puede abrir la tapa. Realizar la Puesta en Marcha del procesado del gel la siguiente forma: Abre la puerta del módulo de Migración, retirar los electrodos y remover los bloques de gel que sostienen a los electrodos, con ayuda de una espátula. Esta acción debe realizarse cortando en un solo paso y cuidando de conservar la integridad del gel. Colocar nuevamente los electrodos. Cerrar la puerta del módulo de migración, oprimir el botón de continuar para proceder al secado, el cual se realiza a 54°C por 8 minutos. Una señal audible indica el término del secado, abrir la cámara de migración, retirar los electrodos así como el gel. El proceso de tinción no se lleva a cabo en el equipo debido a que el empleo de metanol puede ser fuente de incendio. Por lo tanto, se acondiciona una cámara de tinción de plástico y se realiza de la siguiente manera: Se coloca el gel en la cámara y se adicionan 30 ml de colorante previamente preparado, se realiza una agitación suave por 4 minutos. Transcurrido este tiempo, se desecha el 62 colorante y se realizan dos decoloraciones de 20 segundos, con aproximadamente 50 ml de etanol al 75% en cada una. Se introduce el soporte en la cámara y presiona la tecla START dos veces para iniciar el proceso de secado, el cual se realiza a 70°C por 10 minutos. Una señal audible indica el término del secado. Posteriormente el gel se edita de la forma siguiente: Retirar el soporte con el gel del compartimento Tinción/Procesado y abre el soporte para extraer el gel ya seco. Si es necesario limpiar la parte posterior del gel con un pañuelo humedecido con alcohol al 70%. Una vez seco el gel, se escanea. Editar el gel escaneado en el Software QuickScan 2000 WIN. De cada muestra saca un impreso de cada grafica editada. Se procesa colesterol, triglicéridos, lípidos totales, VLDL, LDL, HDL a las muestras en el instrumento Architect C800. Se verifica que no exista incongruencia entre los resultados de colesterol, triglicéridos, lípidos totales, VLDL, LDL, HDL de las químicas sanguíneas y los de perfiles de lipoproteínas. 63 3.1.5 ELECTROFORESIS DE CREATINA CINASA (CK) Reactivos • QuickGel CK Vis Isoenzyme: Estable hasta la fecha de caducidad si se conserva a temperatura ambiente y posición horizontal. El kit contiene: a) Geles de agarosa(listos para su uso) “QuickGel CK Vis Isoenzyme” b) Reactivo de isoenzimas SPIFE CK Vis c) SPIFE CK diluyente d) SPIFE CK Cromógeno e) SPIFE CK Activador f) Ácido cítrico (Decolorante ) g) Aplicadores (listos para su uso) h) Papel filtro (Listos para su uso) Preparación de reactivos • QuickGel CK Vis Isoenzime: Cada gel contiene agarosa en tampón AMP/MOPSO y azida de sodio como conservador. Listo para su uso. • Preparar el Reactivo de isoenzimas SPIFE CK Vis, como se indica a continuación: a. Reconstituir un vial de reactivo con 1.5 ml de SPIFE CK diluyente, cerrarlo y mezclar suavemente. Una vez reconstituido es estable 1 hora a temperatura ambiente. b. Justo antes de su uso añadir 0.15 mL (150 µL) de SPIFE CK cromógeno y mezclar. Esta solución es para usarse inmediatamente y desechar el sobrante. • SPIFE CK Activador: Listo para usarse. Es estable hasta la fecha de caducidad si se almacena de 26°C 64 • Ácido cítrico (decolorante): Ver sección de electroforesis de Hemoglobina. • Control de isoenzimas CK/LD: Reconstituir cada vial con 2 ml de agua desionizada. Una vez hidratado es estable 4 días entre 2 – 8 °C. Muestra • Suero No procesar muestras Hemolizadas. La heparina, EDTA, citrato ó fluoruros, inhiben la actividad enzimática de la CK. Congelaciones y descongelaciones continuas producen disminución de la actividad enzimática. Si la muestra no es analizada el día en que se recibe, guardar entre 2-8°C, temperatura a la que es estable 2 días. Si se congela es estable por 2 semanas. Preparación de la muestra • Preparar las muestras para electroforesis de CK, como se indica a continuación: a) Colocar en un tubo de ensaye, previamente etiquetado, 100 µL de la muestra y adicionarle 1 µL de SPIFE CK Activador. b) Mezclar e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. • Preparación del control para la electroforesis de CK. a) Pipetear 100 µL del control y adicionar 1 µL de SPIFE CK Activador. b) Mezclar e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. TÉCNICA Se emplea la base porta copillas destinada a 20 muestras y se colocan las tiras de copillas deslizándolas por la base hasta el tope (se emplean las copas pequeñas con capacidad para 20 µL). Pipetear 20 µL de la muestra y control con activador en las copas numeradas de 1-5 a 6-10 y 11-15 a 16-20. 65 Selecciona el programa de migración (QG CK) Abrir la tapa del módulo de migración del instrumento SPIFE 3000 (Helena), deslizar la platina de aplicación hacia el lado derecho oprimiendo el botón que se encuentra en la misma posición y colocar la base con las muestras, haciendo coincidir las entradas de la base con las del equipo. Deslizar la platina hacia el lado izquierdo oprimiendo el botón que se encuentra en dicha posición en el equipo. Romper el plástico protector precortado del (los) peine (s) de aplicación y colocar (los) en la posición 6 y 12 de la platina deslizable. Sacar el gel del empaque protector y extender un papel filtro en la superficie de agarosa del mismo, para retirar el exceso de líquido. Se debe cuidar que no haya formación de bolsas de aire ya que esto ocasionaría un corrimiento electroforético deficiente. Retirar el papel en un solo paso de forma rápida. Dispensar 600 µL de REP Prep en el marco serigrafiado del módulo de migración. Coloca el gel, dentro del marco serigrafiado, asegurándose de que no haya formación de burbujas. Si las hubiera se puede retirar el gel y volverlo a colocar. Se emplean los electrodos que poseen adaptadores a los extremos. Limpiarlos con una gasa humedecida con agua destilada y colocarlos en cada extremo del gel asegurando que hagan contacto con éste y con los postes que se encuentran a los costados de la cámara de migración. Colocar el vial de reactivo de isoenzimas SPIFE CK Vis en el orificio intermedio que se encuentra al lado derecho de la platina deslizable. Cerrar la tapa e iniciar el proceso de migración, presionando la tecla START y el equipo realiza el proceso automáticamente de la siguiente forma: Los peines de aplicación descienden hacia las copas que contienen las muestras, cargando los peines de las mismas, proceso que tiene 30 segundos de duración. La platina se eleva y desliza hacia el gel, donde desciende nuevamente para entrar en contacto con éste y llevar a cabo la aplicación de la muestra por 60 segundos. Este ciclo lo repite tres veces. Transcurrido este tiempo, la platina se eleva y vuelve a su posición original para dar lugar a la migración, la cual se realiza a una corriente de 225 V, 30 mA, a una temperatura controlada de 13°C, durante 10 minutos. Una señal audible indica el término de la migración y entonces se puede abrir la tapa. Abrir la puerta del módulo de Migración, retirar los electrodos y remover los bloques de gel que sostienen a los mismos, con ayuda de una espátula. Esta acción debe realizarse cortando en un solo paso y cuidando de conservar la integridad del gel. Centrar el gel en el marco serigrafiado y colocar los electrodos de vidrio, situándolos por dentro de los postes. 66 Adicionar el cromógeno al reactivo de isoenzimas SPIFE CK Vis, colocarlo en el orificio correspondiente y oprimir el botón de continuar. Se realizara la aplicación del reactivo en el gel, deslizando la platina y vertiendo el contenido del vial, el cual será esparcido por el gel en 8 ciclos. Una vez terminada la aplicación, se retiran los electrodos, se coloca la cámara de incubación encima del gel y se oprime continuar, para proceder a la incubación, la cual se lleva a cabo por 18 minutos a 45°C 5.10.1.5 Realiza la Puesta en Marcha del procesado del gel la siguiente forma: Abrir la puerta del módulo de Migración, retirar la cámara de incubación y posteriormente retirar el gel de la cámara electroforética. Colocar el gel en el soporte de tinción introduciéndolo en las ranuras y verificando que ensamblen los orificios del gel en las entradas correspondientes. Introducir el soporte en la cámara de tinción y seleccionar el programa QG CK e iniciar el proceso presionando el botón START. El proceso de decoloración se realiza de la siguiente manera: 2 ciclos de decoloración de 2 minutos 30 segundos con ácido cítrico, dos lavados con agua destilada que tienen una duración de 2 minutos 30 segundos cada uno, para finalizar con un secado de 15 minutos a 63°C. Durante decoloración, lavado y secado del gel, no se debe extraer el soporte que lo contiene, después del enfriamiento de la cubeta, una señal audible indica el término de la tinción y en ese momento se puede retirar el soporte. Posteriormente el gel se edita de la forma siguiente: Retirar el soporte con el gel del compartimento Tinción/Procesado. Si es necesario limpiar la parte posterior del gel con un pañuelo humedecido con alcohol al 70%. Una vez seco el gel, se escanea. Editar el gel escaneado en el Software QuickScan 2000 WIN. De cada muestra saca un impreso de cada grafica editada. Así mismo se determina la concentración de CK total y fracción MB en el equipo Architect C 800. 67 3.1.6 ELECTROFORESIS DE FOSFATASA ALCALINA (ALP) Reactivos • SPIFE Alkaline Phosphatase Isoenzyme: Estable hasta la fecha de caducidad si se conserva a temperatura ambiente y posición horizontal. El kit contiene: a) Geles de agarosa “SPIFE ALP Gel” (listos para su uso) b) ALP Reactivo c) ALP diluyente d) SPIFE ALP Enhancer Separador e) Ácido cítrico (Decolorante ) f) Aplicadores (listos para su uso) g) Papel filtro (Listos para su uso) Preparación de reactivos • SPIFE ALP Gel: Cada gel contiene agarosa en tampón tris-barbital de sodio y 0.15 % de azida de sodio como conservador. Listo para su uso. • Preparar el Reactivo de ALP, como se indica a continuación: Reconstituir un vial de reactivo con 3.0 ml de ALP diluyente, cerrarlo y mezclar suavemente. Una vez reconstituido es estable 30 minutos a temperatura ambiente. • SPIFE ALP Enhancer Separador: Listo para usarse. Es estable hasta la fecha de caducidad si se almacena de 2-8°C. • Ácido cítrico (decolorante): Ver sección de electroforesis de Hemoglobina. 68 Muestra Suero. No procesar muestras Hemolizadas o muestras de plasma ya que los anticoagulantes como citratos, oxalatos o EDTA inhiben la actividad de la enzima. Si la muestra no es analizada el día en que se recibe, guardar de 2-80C a la que es estable 1 semana. Preparación de la muestra Preparar las muestras para electroforesis de ALP, como se indica a continuación: • Colocar en un tubo de ensaye, previamente etiquetado, 50 µL de la muestra y adicionarle 10 µL de SPIFE ALP Enhancer Separador. Mezclar. • El preparado solo tiene 10 minutos de estabilidad, ya que la enzima se degrada rápidamente, por lo que el inicio de la electroforesis debe realizarse antes de que culmine este tiempo • Diluir la muestra con solución salina, cuando la concentración de ALP es mayor a 600 U/L TÉCNICA Se emplea la base porta copillas destinada a 60 muestras y se colocan las tiras de copillas deslizándolas por la base hasta el tope (se emplean las copas grandes con capacidad para 100 µL). Pipetear 50 µL de la muestra en las copas. Selecciona el programa de migración (ALKALINE PHOS) Abre la tapa del módulo de migración del instrumento SPIFE 3000 (Helena), deslizar la platina de aplicación hacia el lado derecho oprimiendo el botón que se encuentra en la misma posición y colocar la base con las muestras, haciendo coincidir las entradas de la base con las del equipo. Deslizar la platina hacia el lado izquierdo oprimiendo el botón que se encuentra en dicha posición en el equipo. Romper el plástico protector precortado del (los) peine (s) de aplicación y colocar (los) en la posición 2 Y 9 de la platina deslizable. Limpiar la cámara de migración con una gasa humedecida con agua destilada. 69 Sacar el gel del empaque protector y extender un papel filtro en la superficie de agarosa del mismo, para retirar el exceso de líquido. Se debe cuidar que no haya formación de bolsas de aire ya que esto ocasionaría un corrimiento electroforético deficiente. Retirar el papel en un solo paso de forma rápida. Dispensar 2 ml de REP Prep en el marco serigrafiado del módulo de migración. Coloca el gel (con la cara de agarosa hacia arriba), dentro del marco serigrafiado, asegurándose de que no haya formación de burbujas. Si las hubiera se puede retirar el gel y volverlo a colocar. Se emplean los electrodos grandes y se deben limpiar con una gasa humedecida con agua destilada y colocar en cada extremo del gel asegurando que hagan contacto con éste y con los postes que se encuentran a los costados de la cámara de migración. Colocar el vial de reactivo ALP en el orificio intermedio que se encuentra al lado derecho de la platina deslizable. Cerrar la tapa e iniciar el proceso de migración, presionando la tecla START (botón localizado del lado izquierdo) y el equipo realiza el proceso automáticamente de la siguiente forma: Los peines de aplicación descienden hacia las copas que contienen las muestras, cargando los peines de las mismas, proceso que tiene 30 segundos de duración. La platina se eleva y desliza hacia el gel, donde desciende nuevamente para entrar en contacto con éste y llevar a cabo la aplicación de la muestra por 60 segundos. Este ciclo lo repite dos veces. Transcurrido este tiempo, la platina se eleva y vuelve a su posición original, se presiona la tecla de continuar para dar lugar la migración, la cual se realiza a una corriente de 430 V, 75 mA, a una temperatura controlada de 12°C, durante 30 minutos. Una señal audible indica el término de la migración y entonces se puede abrir la tapa. Abre la puerta del módulo de Migración, retirar los electrodos y remover los bloques de gel que sostienen a los mismos, con ayuda de una espátula. Esta acción debe realizarse cortando en un solo paso y cuidando de conservar la integridad del gel. Centrar el gel en el marco serigrafiado y colocar los electrodos de vidrio, situándolos por dentro de los postes. Oprimir el botón de continuar y se realizara la aplicación del reactivo en el gel, deslizando la platina y vertiendo el contenido del vial, el cual será esparcido por el gel en 10 ciclos a 45°C. Una vez terminada la aplicación, se retiran los electrodos y se oprime continuar, para proceder a la incubación, la cual se lleva a cabo por 28 minutos a 45°C Realizar la Puesta en Marcha del procesado del gel la siguiente forma: Abre la puerta del módulo de Migración, y retirar el gel. Colocar el gel en el soporte de tinción. 70 Introducir el soporte en la cámara de tinción y seleccionar el programa ALKALINE PHOS e iniciar el proceso presionando el botón START. El proceso de decoloración se realiza de la siguiente manera: 2 ciclos de decoloración de 5 minutos con ácido cítrico, un lavado con agua destilada que tiene una duración de 30 segundos, para finalizar con un secado de 10 minutos a 70°C. Durante decoloración, lavado y secado del gel, no se debe extraer el soporte que lo contiene, después del enfriamiento de la cubeta, una señal audible indica el término de la tinción y en ese momento se puede retirar el soporte. Posteriormente el gel se edita de la forma siguiente: Retirar el soporte con el gel del compartimento Tinción/Procesado y abre el soporte para extraer el gel ya seco. Si es necesario limpiar la parte posterior del gel con un pañuelo humedecido con alcohol al 70%. Una vez seco el gel, se escanea. Editar el gel escaneado en el Software QuickScan 2000 WIN. De cada muestra saca un impreso de cada grafica editada. Así mismo se determina la concentración de Fosfatasa alcalina total en el equipo Architect C 800. 71 3.1.7 INMUNOFIJACIÓN, BANDAS OLIGOCLONALES Y PROTEINA DE BENCE JONES Reactivos SPIFE ImmunoFix : Estable hasta la fecha de caducidad si se conserva a temperatura ambiente y posición horizontal. El kit contiene: a) Geles de agarosa(listos para su uso) b) Ácido cítrico (Decolorante ) c) Sal de Tris-tampón (Solución de lavado) d) SPIFE IFE fijador de proteínas (Listo para su uso) e) Antisueros IgG, IgA, IgM, Cadenas ligeras libres y unidas Kapa y Lambda (listos para su uso) f) Aplicadores (listos para su uso) g) Papel filtro (Listos para su uso) • REP Prep (Listo para su uso) • Solución Salina Fisiologíca: Estable hasta el consumo total del reactivo, si se mantiene cerrado el frasco. • Agua desionizada: Estable hasta consumo total, cerrada a temperatura ambiente o entre 2-8°C Preparación de los reactivos • SPIFE ImmunoFix: Cada gel contiene agarosa en Tris-Barbital/MOPS tampón con un estabilizador. Como conservadores contienen azida de sodio y timerosal. • Colorante violeta ácido: a) Preparar una solución de ácido acético al 10% de la siguiente manera: medir 100.2 ml de ácido acético glacial al 99.8% y aforar a 1 L con agua destilada. b) Disolver el contenido del vial en 1 litro de la solución de ácido acético al 10% previamente preparada. Mezclar y dejar reposar 30 minutos. c) En estado sólido es estable hasta la fecha de caducidad si se conserva a temperatura ambiente. El colorante disuelto es estable seis meses si se conserva a temperatura ambiente. 72 • Tris tampón: Disolver el contenido de un sobre en 8 L de agua destilada. Estable a temperatura ambiente. • Ácido cítrico (decolorante): Ver sección de electroforesis de Hemoglobina. • Fijador de Proteínas: contiene 2.5% de ácido sulfosalicílico, 1% de ácido tricloroacético y 0.25% de glutaraldehido. Está listo para su uso y es estable de 2 -8°C hasta su fecha de caducidad. • Antisueros: Cada vial contiene anticuerpos monoclonales de cabra dirigidos contra cadenas pesadas (alfa, mu y gamma) y cadenas ligeras (kappa y lambda) Listos para su uso, estables en refrigeración hasta su fecha de caducidad. Muestra • Suero Estabilidad de la muestra: Si no es analizada el día en que se recibe, guardar entre 2-8°C, temperatura a la que es estable 2 semanas, 1 mes congelada. • Líquido cefalorraquídeo Estabilidad de la muestra: Si no es analizada el día en que se recibe, guardar entre 2-8°C, temperatura a la que es estable 3 días, 1 mes en congelación. • Orina Estabilidad de la muestra: Si no es analizada el día en que se recibe, guardar entre 2-8°C, temperatura a la que es estable 3 días, 1 mes en congelación. Preparación de la muestra • Suero: diluir con Solución salina fisiológica 1:3 para el primer carril; 1:10 para IgG; 1:5 para IgA, IgM, Kappa y Lambda • Líquido cefalorraquídeo: Se concentran 100X • Orina: Concentrar las muestras de de acuerdo a la Tabla No. 3 73 Procesa Proteínas en Orina en Architect C800, y procede a concentrar la muestra en el concentrador minicon (ver sección preparación de la muestra para electroforesis de proteínas). TÉCNICA Se emplea la base porta copillas destinada a 12 muestras y se colocan las tiras de copillas deslizándolas por la base hasta el tope (se emplean copas pequeñas, de 20 µL ) Pipetear 20 µL de la muestra en las copillas correspondientes. Seleccionar el programa de migración: IFE . Abre la tapa del módulo de migración del instrumento SPIFE 3000 (Helena), deslizar la platina de aplicación hacia el lado derecho oprimiendo el botón que se encuentra en la misma posición y colocar la base con las muestras, haciendo coincidir las entradas de la base con las del equipo. Deslizar la platina hacia el lado izquierdo oprimiendo el botón que se encuentra en dicha posición en el equipo. Romper el plástico protector precortado del (los) peine (s) de aplicación y colocar (los) en la posición 4, 10, 16 de la platina deslizable, verificando que la parte luminosa del peine se encuentre del lado derecho. Colocar a cada peine una pesa, de tal manera que la parte ancha de la misma quede hacia la derecha. Limpiar la cámara de migración con una gasa humedecida con agua destilada. Sacar el gel del empaque protector y extender un papel filtro en la superficie de agarosa del mismo, para retirar el exceso de líquido. Se debe cuidar que no haya formación de bolsas de aire ya que esto ocasionaría un corrimiento electroforético deficiente. Retirar el papel en un solo paso de forma rápida. Dispensar 600 µL de REP Prep en el marco serigrafiado del módulo de migración. Colocar el gel (con la cara de agarosa hacia arriba), dentro del marco serigrafiado, asegurándose de que no haya formación de burbujas. Si las hubiera se puede retirar el gel y volverlo a colocar. Limpiar los electrodos con una gasa humedecida con agua destilada y colocarlos en cada extremo del gel asegurando que hagan contacto con éste y con los postes que se encuentran a los costados de la cámara de migración. Cerrar la tapa, elegir el programa SERUM IFE ó URINE IFE, e iniciar el proceso de migración, presionando la tecla START (botón localizado del lado izquierdo) y el equipo realiza el proceso automáticamente de la siguiente forma: Los peines de aplicación descienden hacia las copas que contienen las muestras, cargando los peines de las mismas, proceso que tiene 25 segundos de 74 duración. La platina se eleva y desliza hacia el gel, donde desciende nuevamente para entrar en contacto con éste y llevar a cabo la aplicación de la muestra por 25 segundos a 21°C, proceso que se repite tres veces para LCR y orina. En el suero sólo se realiza una aplicación. Transcurrido este tiempo, la platina se eleva y vuelve a su posición original para dar lugar a la migración, la cual se realiza a una corriente de 650 V y 160 mA, a una temperatura controlada de 21°C, durante 6 minutos y medio. Una señal audible indica el término de la migración y entonces se puede abrir la tapa. Abrir la puerta del módulo de Migración, retirar los electrodos y remover los bloques de gel que sostienen a los mismos, con ayuda de una espátula. Esta acción debe realizarse cortando en un solo paso y cuidando de conservar la integridad del gel. Se coloca la base para dispensar los antisueros correspondientes. Para inmunofijación y Bandas oligoclonales añadir los antisueros IgG, IgM, IgA, Kappa y Lambda y para Bence Jones antisuero GAM, Kappa y Lambda unidas y Kappa y Lambda libres, en cada uno de los canales. Cerrar la tapa de la cámara de migración y oprimir el botón de continuar para proseguir con una incubación de 10 minutos, después de los cuales se retiran los antisueros por medio de papeles absorbentes. Por último el gel es sometido a un proceso de secado, el cual se realiza a 54°C por 10 minutos. Una señal audible indica el término del secado. Realizar la Puesta en Marcha del procesado del gel la siguiente forma: Retirar el gel de la cámara electroforética. Colocar el gel en el soporte introduciéndolo en las ranuras y verificando que ensamble los orificios del gel en los soportes correspondientes. Introducir el soporte en la cámara de tinción y seleccionar el programa SERUM IFE ó URINE IFE e iniciar el proceso presionando el botón START. El proceso de tinción se realiza de la siguiente manera: Primero se realiza un lavado del gel, para eliminar el exceso de antisuero que no haya reaccionado. Posteriormente se lleva a cabo la tinción con violeta ácido por 4 minutos, seguido de dos procesos de decoloración de 60 segundos y uno de secado de 8 minutos a 63°C. Continúa con un proceso de decoloración de 60 segundos para finalizar con un secado de 5 minutos a 63°C. 75 Durante la tinción, decoloración, lavado y secado del gel, no se debe extraer el soporte que lo contiene, después del enfriamiento de la cubeta, una señal audible indica el término de la tinción y en ese momento se puede retirar el soporte. FIG. No 4 Imagen del equipo de electroforesis “Spife 3000” de Helena laboratorios. 76 3.1 RESULTADOS: INTERPRETACIÓN Y ANÁLISIS 3.2.1 ELECTROFORESIS DE HEMOGLOBINA FIG No. 5 Interpretación de las diferentes bandas en electroforesis de Hemoglobina en medio alcalino (pH= 8.6) A2 = Hemoglobina A2, A1 = Hemoglobina A1, S-D = Hemoglobina S y Hemoglobina D que migran a la misma distancia en medio alcalino y F = Hemoglobina F 77 FIG No. 6 CORRIMIENTO ELECTROFORÉTICO DE LAS DIVERSAS VARIANTES DE HEMOGLOBINAS, EN MEDIO ÁCIDO Y ALCALINO 78 PATRONES ELECTROFORÉTICOS FIG. No 7 Gel de electroforesis de Hemoglobina en medio alcalino (pH = 8.6) En el carril No. 2, se muestra el corrimiento electroforético del testigo FASC en medio alcalino. En los carriles 5 y 6 , 7 y 8, 9 y 10 se observan a tres diferentes pacientes, los cuales presentan un patrón electroforético de Hb A y Hb A2. Los carriles 12 y 13 muestran a un paciente que presenta fracciones correspondientes a Hb A, Hb F, Hb S y Hb A2. Los carriles 18 al 20 muestran a un sujeto que presenta fracciones de Hb A, Hb F y Hb A2. 79 FIG No. 8 Gel de electroforesis de Hemoglobina en medio ácido (pH = 6.2) En el carril 2 y 3 se muestra el corrimiento electroforético del testigo FASC. Los carriles 12 y 13 se observa el corrimiento electroforético en medio ácido del paciente que presenta Hb A, Hb S y Hb F, mostrado en la figura No. 6 carriles 12 y 13. En los carriles 18 al 20 se observa el corrimiento electroforético del paciente con Hb F y HbA, que corresponde al mismo de la fig. 6 carriles 18 – 20. Los carriles restantes corresponden a los pacientes que en la electroforesis en medio alcalino mostraron un comportamiento normal. 80 GRAFICAS E INTERPRETACIÓN A) B) GRÁFICA No. 1 A) Patrón de corrimiento electroforético del control FASC en medio alcalino. B) Gráfico de control FASC en medio alcalino. Para poder tener la certeza de que los resultados obtenidos son confiables, se tiene que llevar a cabo el análisis de un material de control. En el caso particular de la electroforesis de Hemoglobina, se emplea un control denominado FACS, ya que son las Hemoglobinas que podemos distinguir en el gel cuando se realiza la electroforesis en medio alcalino. El corrimiento obtenido no sólo se emplea para determinar de forma semicuantitativa el comportamiento del control, sino también para determinar la distancia a la que se sitúan cada una de las Hemoglobinas (A, F, S y C) en el gel y evaluar con mayor facilidad y precisión cuales variantes de Hemoglobina puede presentar un paciente determinado. Las gráficas mostradas en el presente trabajo fueron obtenidas del corrimiento de las muestras y control en medio alcalino. La electroforesis de Hemoglobina en medio ácido sólo es empleada para corroborar la 81 presencia de Hemoglobina S y C, descartando otras variantes que presenten el mismo patrón electroforético (Hemoglobina D y E respectivamente). A) B) GRÁFICA No. 2 A) Patrón de corrimiento electroforético del Paciente 1 en medio alcalino. B) Gráfico del mismo paciente, no hay presencia de alguna Hemoglobina anormal. En la gráfica No. 2 se presenta un patrón electroforético normal, donde el mayor porcentaje de Hemoglobina está constituido por Hb A, que es la encargada de realizar el transporte de oxígeno de pulmones a los tejidos y el dióxido de carbono en sentido contrario. El porcentaje en el que se encuentra la Hb A2. es también normal, lo que indica que el paciente no presenta ninguna patología asociada a una posible Hemoglobinopatía. 82 A) B) GRÁFICA No.3 A) Patrón de corrimiento electroforético de Paciente 2 en medio alcalino. B) Gráfico del mismo paciente, el cual indica un incremento en la fracción de Hb A2. A) B) GRÁFICA No.4 A) Patrón electroforético del Paciente 3 en medio alcalino. B) Gráfico del mismo paciente, el cual indica un incremento de la fracción de Hb A2. 83 Los pacientes que se muestran en los gráficos 3 y 4, pese a no presentar ninguna variante de Hemoglobina, la fracción correspondiente a la Hb A2 y/o HbC se encuentra incrementada. Debido al porcentaje en la que se encuentra se sospecha que se trate de una Hb A2 y no de Hb C; sin embargo este resultado se tendrá que ver reforzado con otros estudios, como el frotis sanguíneo, en el cual algunos pacientes con Hb C presentan células diana. El incremento de la Hb A2 se presenta en algunos casos de β- Talasemia, sin embargo casi siempre se acompaña de HbF, por lo que podríamos mencionar que el incremento de la Hb A2 por si sola raramente desemboca en una patología. A) B) GRÁFICA No.5 A) Patrón electroforético de Paciente 4 en medio alcalino. B) Gráfico del mismo paciente, en el cual se parecía un patrón anormal con presencia de Hb A, Hb F y Hb S En el gráfico No. 5 se presenta además de Hb A y A2, Hb F y S, esta última confirmada mediante el corrimiento en medio ácido, para descartar la presencia de Hb D. Es un caso donde en primera instancia, al haber presencia de Hb S se podría presumir que se trata de una anemia drepanocítica, en la cual la Hb S se encuentra en estado Heterocigoto; sin embargo la aparición de la fracción correspondiente a la HbF nos puede dar indicio de además una posible β- talasemia. Aunque también pueda existir la posibilidad de que la Hb F se presente debido a una persistencia hereditaria, que de cualquier forma desemboca en signos y síntomas de talasemia. La edad del paciente es un factor importante, ya que si se trata de un recién nacido, es normal que haya presencia de Hb F y sólo estaríamos hablando que se trata de Drepanocitosis. 84 A) B) GRÁFICA No.6 A) Patrón electroforético del Paciente 7 en medio alcalino. B) Gráfico del mismo paciente, en el cual se observa un patrón anormal, con presencia de Hb A y Hb F. En el corrimiento electroforético que corresponde al presente gráfico, se puede observar una banda correspondiente a Hb F acompañada de Hb A y Hb A2 disminuida. Una vez corroborado que el paciente no se trata de un neonato, se puede pensar en una posible β- talasemia o bien de una persistencia hereditaria de HbF que de igual forma desemboca en los signos y síntomas de la enfermedad mencionada. No obstante, con sólo el análisis de estos resultados no podemos aseverar un diagnóstico pues tendríamos que contar con el historial clínico del paciente para relacionar diversas pruebas de laboratorio que ayuden a descartar alguna otra posible enfermedad. 85 3.2.2 ELECTROFORESIS DE PROTEINAS . FIG No. 9 Interpretación de las diferentes fracciones en electroforesis de Proteínas en suero PATRONES ELECTROFORÉTICOS FIG No. 10 Electroforesis de proteínas en suero. Las posiciones 2, 3 corresponden a los testigos normal y anormal respectivamente. En los carriles 4 y 14 se aprecia un corrimiento con presencia de una banda monoclonal. 86 GRAFICAS E INTERPRETACIÓN A) B) GRÁFICA No. 7 A) Patrón electroforético del Control Normal de proteínas. B) Gráfico del Control Normal. 87 A) B) GRÁFICA No. 8 A) Patrón electroforético del Control Anormal de proteínas. B) Gráfico del Control Anormal. La electroforesis de proteínas en suero es una prueba comúnmente empleada, ya que proporciona bastante información de uso diagnóstico, especialmente cuando se complementa con otras determinaciones, como inmunofijación, cuantificación de inmunoglobulinas y otras proteínas específicas. En la determinación de las fracciones proteicas mediante electroforesis se emplea un material de control Normal y uno Anormal con la finalidad de garantizar que los resultados obtenidos, tanto altos como bajos sean confiables y poder brindar un resultado que tenga utilidad clínica para el paciente. Las cartas control contra las que se comparan los resultados obtenidos se encuentran anexas en la sección de Valores de referencia de materiales de control. 88 A) B) GRAFICA No. 9 A) Patrón electroforético de proteínas del Paciente 1. B) Gráfico del mismo paciente, en el cual se observa la presencia de una banda monoclonal. El gráfico 9 presenta en el corrimiento electroforético, un pico homogéneo en la región de las gamma globulinas, que corresponde a una paraproteína, lo que indica una gammopatía monoclonal, la cual representa un desorden en la síntesis de inmunoglobulinas asociadas con la proliferación de una clona de células plasmáticas y están constituidas de un solo tipo de cadenas pesadas. El estímulo de la proliferación es desconocido pero muy probablemente no antigénico. En el caso particular de este paciente se puede observar que las demás inmunoglobulinas se encuentran en decremento, lo que puede traer como consecuencia una inmunodeficiencia funcional, la que generalmente se acompaña de un incremento de las 89 gamma globulinas como consecuencia de la aparición de la proteína monoclonal. También puede tratarse de un mieloma múltiple, para lo cual se tendría que realizar la búsqueda de la proteína de Bence Jones para confirmar, ya que en estos casos la cadena pesada filtra a través de glomérulo y forma cadenas ligeras libres detectables en orina. A) B) GRAFICA No. 10 A) Patrón electroforético de proteínas del Paciente 2. B) Gráfico del mismo paciente, en el cual se observa un incremento en las fracciones alfa 2, beta y gamma. El paciente 2 (Gráfica No. 10) presenta un incremento de las regiones alfa 2, beta y gamma globulinas, con el consecuente decremento de albúmina para mantener la presión oncótica en torrente sanguíneo. El 90 incremento de estas fracciones se presenta principalmente en casos de inflamación donde existe presencia importante de las proteínas de fase aguda, como son ceruloplasmina, haptoglobIina, alfa 2 macroglobulina, que forman parte de la región alfa- 2; la activación de complemento y proteína c reactiva, forman parte de la fracción beta y el incremento de las inmunoglobulinas acompaña a la fracción gamma. Por lo tanto el proceso inflamatorio que estos pacientes están cursando pueden ser debidos a infecciones, a colagenosis (enfermedad del tejido conectivo), alergias, malignidad metastásica, enfermedad hepática o algún tipo de desorden autoinmune. A) B) GRAFICA No. 11 A) Patrón electroforético de Proteínas del Paciente 6. B) Gráfico del mismo paciente, en el que se observa un patrón normal. 91 En el gráfico No. 11 se puede apreciar un corrimiento de electroforesis de proteínas normal, comparado con los valores de referencia mostrados en el anexo de Valores de referencia de las diversas pruebas electroforéticas. A) B) GRAFICA No. 12 A) Patrón de electroforesis de Proteínas del Paciente 9. B) Gráfico del mismo paciente, en el cual se observa la presencia de una banda monoclonal (último pico). El gráfico del paciente 9 presenta una banda monoclonal en el corrimiento electroforético, lo cual desemboca en el análisis propuesto para el paciente 1, en el cual se observó un patrón similar. Lo ideal en ambos casos 92 es realizar una inmunofijación de proteínas para conocer si este componente monoclonal corresponde a una cadena ligera y/o pesada, ya que si sólo se trata de una cadena ligera libre, podría atribuirse a un posible mieloma múltiple, el cual se corrobora con una electroforesis en orina; sin embargo, si se trata de cadenas pesadas, puede tratarse de otras enfermedades como amiloidosis, macroglobulinemia de Waldenström, plasmacitomas, leucemias y linfomas o incluso puede tratarse de un paciente con una hipergamaglobulinemia monoclonal benigana, en el cual no presenta ningún signo ni síntoma de enfermedad, sin embargo tiene un importante factor de riesgo de desarrollarla en un futuro, por lo que hay que monitorearlo constantemente. 93 A) B) . GRAFICA No. 13 A) Patrón de electroforesis de Proteínas del Paciente 11. B) Gráfico del mismo paciente, en el cual se observa un incremento de las fracciones Alfa 2, Beta y Gamma. En el paciente 11 (Gráfico No. 13), se observa incremento en las fracciones alfa 2, beta y gamma, ésta última de forma importante. Se trata de un caso de inflamación, la cual puede ser originada por una infección, o alguna otra enfermedad como colagenosis (enfermedad del tejido conectivo), alergias, malignidad metastásica, enfermedad hepática o algún tipo de desorden autoinmune. En este caso particular sería conveniente realizar la prueba de inmunofijación en suero para descartar la presencia de un componente monoclonal, ya que la alta concentración de gamma globulinas impide la detección de cualquier pico homogéneo que pudiera estar presente. 94 3.2.3 ELECTROFORESIS DE LIPOPROTEÍNAS FIG No. 11 Interpretación de las diferentes bandas en electroforesis de Lipoproteínas PATRONES ELECTROFORÉTICOS FIG No. 12 Electroforesis de Lipoproteínas en suero En la presente figura se observa el corrimiento electroforético de las fracciones de lipoproteínas en cuatro sujetos (numeración 1-4) así como del testigo en los dos primeros carriles ( letra C). 95 GRÁFICAS E INTERPRETACIÓN A) B) GRÁFICA No. 14 A) Patrón de electroforesis de Lipoproteínas del Control (LIPOTROL). B) Gráfico correspondiente al inciso A. Comparando los valores obtenidos a partir del material de control, con los rangos de referencia establecidos para los mismos, podemos dar por válido y confiable el corrimiento electroforético, y con ello los resultados que de él se obtengan para cada uno de los pacientes. 96 A) B) GRÁFICA No. 15 A) Patrón de electroforesis de Lipoproteínas del Paciente 1. B) Gráfico del mismo paciente, en el cual se observa un incremento de la fracción alfa. En la presente gráfica se puede observar un ligero incremento de la fracción alfa de lipoproteínas, la cual corresponde a las lipoproteínas de alta densidad (HDL). No se ha descrito alguna patología asociada con el incremento de esta fracción, sin embrago se puede presentar en algunos de los siguientes casos: en terapia con estrógenos, terapia con medicamentos antiepilépticos, ejercicio físico intenso y consumo de alcohol. Cabe mencionar que una disminución de la fracción alfa de lipoproteínas tiene más relevancia clínica, ya que está asociada a ateroesclerosis, sin ser ésta una prueba que confirme el diagnóstico de la enfermedad. 97 A) B) GRÁFICA No. 16 A) Patrón de electroforesis de Lipoproteínas del paciente 2. B) Gráfico del mismo paciente el cual presenta un incremento en la región pre-beta. El paciente 2 (gráfica 16), presenta un incremento de la fracción pre-beta de lipoproteínas, la cual se relaciona directamente con las lipoproteínas de muy baja densidad, las cuales al estar constituidas en su mayoría por triglicéridos, se espera que el resultado de dicho analito se encuentre aumentado en el suero del paciente, lo que sería una forma indirecta de corroborar la veracidad del resultado. De acuerdo a la clasificación de Fredrickson, el paciente puede presentar una Hiperlipoproteinemia primaria tipo I (hiperquilimicronemia) ya que los quilomicrones y la fracción pre-beta se superponen en el corrimiento electroforético, quedando cerca del punto de aplicación, incrementando la banda correspondiente a VLDL. Este incremento puede deberse a alguna patología que pueda presentar el paciente como diabetes, la cual generalmente es acompañada por una movilización de ácidos grasos almacenados en el cuerpo, dando como resultado un incremento en suero de lípidos totales y particularmente de los triglicéridos. 98 A) B) GRÁFICA No. 17 A) Patrón de electroforesis de Lipoproteínas del Paciente 3. B) Gráfico del mismo paciente, en el cual se observa un patrón normal. El paciente correspondiente a la gráfica No. 17 presenta un patrón electroforético normal de lipoproteínas. Sin embargo es conveniente acompañar está determinación con otras pruebas de laboratorio que confirmen alguna posible hiperlipoproteinemia. Cabe mencionar que la electroforesis de lipoproteínas está siendo reemplazada por métodos mas sensibles y específicos que determinan cada una de las lipoproteínas existentes, como son la espectrofotometría, la quimioluminiscencia y nefelometría. Sin embargo podemos obtener información de utilidad a partir de la electroforesis. 99 A) B) GRÁFICA No. 18 A) Patrón de electroforesis de Lipoproteínas del Paciente 4. B) Gráfico del mismo paciente, el cual presenta un incremento en la fracción alfa. Este último paciente presenta un patrón electroforético similar al paciente 1, el cual se discutió en el gráfico correspondiente. 100 3.2.4 ELECTROFORESIS DE ISOENZIMAS DE CK FIG No. 13 Interpretación de las diferentes bandas de isoenzimas de CK obtenidas mediante electroforesis, donde se aprecian las bandas atípicas que pueden aparecer en un corrimiento electroforético. FIG No. 14 Electroforesis de isoenzimas de CK por el método de QG SPIFE CK Vis 101 PATRONES ELECTROFORÉTICOS A) B) FIG No. 15 Electroforesis de isoenzimas de CK. A) Corrimiento con presencia de una banda de CK-Atípica (posiciones 5, 6 y 7 del gel). B) Corrimiento con presencia de CK-BB (posiciones 7,8 y 9 del gel) 102 A) B) GRÁFICA No. 19 A) Patrón de electroforesis de isoenzimas de CK del Control. B) Gráfico obtenido de dicho corrimiento electroforético Los resultados obtenidos a partir del material de control fueron comparados con las cartas correspondientes, cuyos valores se encuentran en el Anexo del presente trabajo. Cabe resaltar, que este control en específico no sólo nos es de utilidad para validar la electroforesis, si no también para determinar a que isoenzima corresponde cada una de las bandas que puedan presentar los pacientes, ya que en ocasiones existen patrones atípicos que serían difíciles de distinguir si no se contara con esta referencia. Una vez garantizando el corrimiento adecuado del material de control, podemos analizar los resultados obtenidos de los pacientes. 103 A) B) GRAFICA No. 20 A) Patrón de electroforesis de isoenzimas de CK de paciente correspondiente a la figura 15 A. B) Gráfico del mismo paciente, en el cual se observa una pico correspondiente a una CK atípica en un 39.67%, además de presentar una CK- MB en un 13.29%. En el presente gráfico se pueden apreciar tres fracciones, la primera correspondiente a la isoenzima CK-MM, la segunda a una CK- atípica y la tercera corresponde a CK-MB. En la Fig No.15 A se pueden observar las tres bandas mencionadas en el gel de electroforesis. La fracción que se observa en medio corresponde a una forma atípica de la enzima, conocida como Macro-CK, la cual no se ha encontrado relacionada a una patología en específico, sin embargo puede estar presente en casos de infarto masivo de miocardio, y considerando que la fracción CK-MB también se encuentra aumentada (obteniéndose un resultado cuantitativo de 216 U/L, cuando el valor de referencia es de 0 – 25 U/L) es una posibilidad viable. La actividad enzimática de CK total fue determinada cuantitativamente, obteniéndose un resultado de 3632.9 U/L. 104 A) B) GRÁFICA No. 21 A) Patrón de electroforesis de isoenzimas de CK del Paciente correspondiente a la figura 15 B. B) Gráfico del mismo paciente, en el que se observa un 100% de CK MM, de forma normal. Este paciente presenta un corrimiento electroforético normal, en el cual la totalidad de la enzima corresponde a CK-MM, (cabe mencionar que en electroforesis es difícil distinguir una banda de CK-MB a concentraciones normales, generalmente su aparición indica alguna patología). Debido a que la actividad de CK total determinada ( 33.6 U/L) se encuentra dentro de los valores normales ( 0- 165 U/L) podemos afirmar que a partir del resultado obtenido por electroforesis el paciente no cursa alguna patología relacionada con la misma. 105 A) B) GRÁFICA No. 22 A) Patrón de electroforesis de isoenzimas de CK correspondientes al paciente 2 de la figura 15 B. B) Gráfico del mismo paciente, en el cual se aprecia la fracción de CK-BB en un 6.67%. En la figura No.15 del lado derecho, se observa que el paciente 3 presenta una banda apenas visible que corresponde a la isoenzima CK-BB. Esta isoenzima proviene del encéfalo, por lo que su aparición en suero sugiere un problema cerebral en la mayoría de los casos. El trauma craneal también es una posibilidad. Como la aparición de esta isoenzima es poco frecuente, se indagaron los datos clínicos del paciente, los cuales arrojaron que presenta una enfermedad denominada Hiperreflexia. 106 3.2.5 ELECTROFORESIS DE ISOENZIMAS DE FOSFATASA ALCALINA HEPÁTICA ÓSEA MACROHEPÁTICA INTESTINAL FIG No. 16 Interpretación de las diferentes bandas de isoenzimas de ALP obtenidas mediante electroforesis. 107 PATRONES ELECTROFORÉTICOS FIG No. 17 Electroforesis de isoenzimas de Fosfatasa Alcalina. En la presente figura se puede observar el corrimiento electroforético de isoenzimas de fosfatasa alcalina de dos sujetos que presentan las isoenzimas hepática y ósea. 108 A) B) GRÁFICA No. 23 A) Patrón de electroforesis de fosfatasa alcalina de Paciente1. B) Gráfico en el que se aprecian los porcentajes de isoenzimas hepático 64%, ósea 33.5% y macrohepática 2.5% presentes. La fosfatasa alcalina se mide como elemento del diagnóstico diferencial de las enfermedades hepáticas, así como en el estudio de enfermedades óseas y del hiperparatiroidismo principalmente. En ambos pacientes los resultados obtenidos se encuentran dentro de los valores de referencia estipulados por el laboratorio clínico, sin embargo cabe mencionar que para la interpretación de estos resultados la edad del paciente es un factor muy importante a considerar, ya que si se trata de un niño, es completamente normal que la fosfatasa alcalina ósea se encuentre incrementada ya que el paciente se encuentra en etapa de crecimiento, sin embargo si se trata de una persona adulta puede tratarse de una enfermedad ósea. El paciente 1 (de 24 años de edad) presenta isoenzimas de fosfatasa alcalina hepática, ósea y macrohepática. Esta última se encuentra en un porcentaje bajo que representa una condición clínicamente normal. Se observa que la mayor proporción corresponde a la fracción hepática (64%) por lo que si existiera alguna patología sería nivel de dicho órgano, sin embargo estas afecciones se acompañan con un incremento 109 de la fosfatasa alcalina total, lo cual no es el caso, ya que el valor cuantificado fue de 73 U/L, siendo el límite de referencia de 28 – 300 U/L. Sin embargo debe considerarse la realización de otras pruebas, como perfiles hepáticos por ejemplo, para descartar completamente esta posibilidad. A) B) GRÁFICA No. 24 A) Patrón electroforético de isoenzimas de fosfatasa alcalina del Paciente 2. B) Gráfico del mismo paciente, en el cual observamos dos picos correspondientes a las fracciones hepática y ósea respectivamente. El paciente 2, se trata de una persona con 72 años de edad, que presenta una fosfatasa alcalina total de 44 U/L (dentro de los límites de referencia), del cual el 57.7% pertenece a la isoenzima hepática y el 42.3 % a la ósea. Como se puede observar los dos porcentajes se encuentran normales, según los rangos estipulados por el laboratorio. Si la paciente presentara una actividad enzimática elevada, por la proporción en que 110 ambas fracciones se encuentran, se podría presumir de una enfermedad ósea que proviniera de una afección en la actividad de los osteoblastos, los cuales contienen grandes concentraciones de ésta enzima, lo cual se vería reflejado en los resultados. Cabe mencionar que cuando se trata de un daño osteoclástico (destrucción del hueso) los valores de fosfatasa alcalina serán normales, como es el caso de la osteoporosis, donde los tejidos osteoides producen poca fosfatasa alcalina. Se debe de considerar la realización de otras pruebas, como la cuantificación de otras enzimas por ejemplo, para establecer con certeza un diagnóstico. 111 3.2.6 INMUNOFIJACIÓN DE PROTEÍNAS PACIENTE No. 1 PACIENTE No. 2 FIG No. 18 Paciente 1 y 2 inmunofijación de proteínas con ausencia de componentes monoclonales. PACIENTE No. 3 FIG No. 19 Paciente 3 inmunofijación de proteínas con presencia de componentes monoclonales (IgG/lambda) 112 ANÁLISIS DE RESULTADOS RESPECTO A INMUNOFIJACIÓN DE PROTEÍNAS Como se puede observar en la figura 18 ambos pacientes carecen de algún componente monoclonal, sin embargo en ambos se aprecia una alta concentración de inmunoglobulinas, que nos sugiere algún otro tipo de afección. En contraste, en la figura No. 19 se observa un paciente con un componente monoclonal gamma/lambda, es decir, que un clon de linfocitos B están produciendo un solo tipo de cadenas pesadas gamma y cadenas ligeras lambda. Esta inmunoglobulina monoclonal puede provenir de mieloma múltiple, o de otro tipo de enfermedad, e incluso tratarse de una hipergammaglobulinemia monoclonal beniga. Sin embargo en la región correspondiente a las cadenas ligeras Kappa se observa una banda un poco difusa, que no tiene asociada ninguna cadena pesada, lo que puede indicar la presencia de cadenas ligeras libres y por lo tanto tratarse de un mieloma múltiple secretorio. Pero la diferenciación entre una u otra enfermedad se debe efectuar mediante criterios clínicos y se debe realizar la determinación de la proteína de Bence Jones para comprobar la excreción de cadenas ligeras en la orina. 113 3.2.7 BANDAS OLIGOCLONALES FIG No. 20 Paciente con bandas oligoclonales ausentes FIG No. 21 Paciente con bandas oligoclonales presentes 114 ANÁLISIS DE RESULTADOS RESPECTO A BANDAS OLIGOCLONALES Las bandas oligoclonales, son la aparición de dos a más bandas de cadenas pesadas gamma en la inmunofijación, lo que indica una producción intracraneal de IgG. Se presenta principalmente en casos de esclerosis múltiple. En la fig No. 20 se presenta una inmunofijación con ausencia de bandas oligoclonales (región gamma). En la figura No. 21 se puede apreciar dos bandas en la región gamma, lo que indica la presencia de componentes oligoclonales. Sin embargo siempre se debe cerciorar que estas bandas, que corresponden a cadenas pesadas gamma, no correspondan a una filtración del suero al líquido cefalorraquídeo a través de la barrera Hematoencefálica, para lo cual sería conveniente realizar de forma complementaria un análisis del suero del paciente mediante electroforesis de proteínas o bien inmunofijación en suero, para descartar esta posibilidad e incrementar la veracidad del diagnóstico. 115 3.2.8 PROTEINA DE BENCE JONES FIG No. 22 Paciente con ausencia de la Proteína de Bence Jones ELECTROFORESIS DE PROTEINAS EN SUERO DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA DE BENCE JONES EN ORINA FIG No. 23 A la izquierda se señala con una flecha el resultado de electroforesis de proteínas en suero. A la derecha se muestra el resultado de Bence Jones del mismo paciente, con presencia de dicha proteína. 116 GRÁFICA No. 25 Electroforesis de proteínas del paciente No. 9, con presencia de la proteína de Bence Jones. 117 ANÁLSIS DE RESULTADOS RESPECTO A PROTEINA DE BENCE JONES Por definición, la proteína de Bence jones es la aparición de cadenas ligeras libres en orina y se asocian directamente con mieloma múltiple. En el presente trabajo se presenta un resultado Negativo (Fig.No 22) y uno Positivo (Fig No.23) a la Proteína de Bence jones. En esta última se observa en carril 3 y 5 del gel unas bandas claramente definidas, que corresponden a las cadenas Kappa unida y libre respectivamente, lo cual indica un resultado de Bence jones positivo. Así mismo se muestra el corrimiento de electroforesis de proteínas en suero para el mismo paciente (señalado con una flecha) que muestra un componente monoclonal, que como se mencionó con anterioridad se presenta tanto en casos benignos como patológicos, sin embargo, en este caso en particular se trata de un componente monoclonal de cadenas ligeras kappa, lo cual es indicativo de un mieloma múltiple secretor. En el mieloma , la mayoría de los pacientes presentan un exceso de cadenas ligeras que pueden excretarse por la orina. Este exceso en la producción puede ser debido a un desequilibrio en la traducción o transripción dentro de clones ocasionales o una posible supresión de la síntesis de cadenas pesadas en tales clones. 118 1. CONCLUSIONES El laboratorio clínico es un área que juega un papel preponderante en el ámbito de la salud, ya que en él se emplean herramientas que orientan al médico a establecer un diagnóstico certero. La electroforesis es una prueba empleada tanto de escrutinio como confirmatoria, ya que algunas determinaciones sólo se emplean para orientar al médico sobre alguna posible enfermedad, como es el caso de la electroforesis de proteínas, lipoproteínas e isoenzimas. En otros casos esta técnica contribuye a confirmar un diagnóstico, como en la electroforesis de Hemoglobina para descartar alguna Hemoglobinopatía de una talasemia; así como la proteína de Bence Jones que confirma una enfermedad de cadenas ligeras asociadas a un Mieloma, o las bandas oligoclonales, que su presencia es indicativo de esclerosis múltiple. La electroforesis es una herramienta útil en el diagnóstico clínico, debido a que en la separación electroforética de cualquiera de los analitos, se pueden apreciar fracciones que son imposibles de diferenciar en una simple cuantificación. Tal es el caso de las isoenzimas, por ejemplo, en creatina cinasa, hay métodos para cuantificar la enzima total y la fracción MB, sin embargo la fracción de CKBB sólo se puede evidenciar mediante corrimientos electroforéticos. Así mismo, sólo es posible conocer la proporción en la que se encuentran cada una de las isoenzimas de fosfatasa alcalina mediante electroforesis. Además de que en algunos casos hay isoenzimas atípicas que sólo las podemos encontrar empleando esta técnica. Alteraciones en el perfil electroforético de las proteínas pueden asociarse a una gran variedad de enfermedades y/o condiciones fisiológicas. Por esta razón esta técnica es una herramienta de utilidad en la evaluación del estado general del paciente y fundamental en el diagnóstico y seguimiento de Gammapatías monoclonales. La electroforesis de lipoproteínas, es útil para clasificar los desórdenes lipídicos, especialmente de las lipoporteinemias y esta técnica ha sido empleada para cuantificar el riesgo de enfermedades vasculares y coronarias. 119 La electroforesis es una técnica que se ha empleado para diversas finalidades, por ejemplo, para establecer criterios de pureza en protocolos de purificación de proteínas, para estimación de peso molecular tanto de proteínas como de ácidos nucleicos, en estudios genéticos moleculares, detección de proteólisis, y en algunos casos para identificación de proteínas. En la práctica clínica, su empleo es de suma importancia pues como se ha mencionado con anterioridad, contribuye a orientar al médico hacia un posible diagnóstico o bien a establecer con certeza una determinada enfermedad y comenzar un tratamiento oportuno que tenga como finalidad mejorar las condiciones de vida de un paciente. 120 2. RECOMENDACIONES • En relación a la electroforesis, cabe resaltar que los resultados obtenidos de las diversas pruebas de laboratorio, no deben considerarse de manera aislada, si no como un conjunto de datos que van a orientar al médico, a realizar un buen diagnóstico y que a los químicos nos son de gran utilidad para verificar la concordancia entre los mismos. • En la electroforesis de proteínas, una vez que se obtenido el proteinograma, se recomienda realizar determinaciones más específicas para cada una de las fracciones que arrojen un resultado fuera de los límites de referencia. • Es de suma importancia que el QFB interactúe directamente con los médicos, ya que esta retroalimentación conduce al bienestar del paciente, finalmente somos un equipo de trabajo que persigue un fin común. • A pesar de que la educación en la UNAM es de alta calidad, es necesario implementar prácticas en las que se tenga un panorama mas cercano a lo real de la práctica clínica y tener la visión de que no sólo son las pruebas de rutina lo que se realiza en un laboratorio clínico, si no hacer del conocimiento del estudiante las diversas pruebas que existen en la actualidad y lo ideal sería llevarlas a la práctica. • Considero de suma importancia que el estudiante incursione en el ámbito laboral durante la etapa escolar, ya sea mediante estancias, prácticas profesionales, servicio social o como becarios, lo que permita tener un panorama más amplio de lo que se va a enfrentar una vez concluida una carrera universitaria, así como adquirir experiencia en algún área de interés en particular, para facilitar la obtención de un empleo, ya que como recién egresados es el primer obstáculo con el que tenemos que lidiar la “experiencia”. 121 ANEXO 1. VALORES DE REFERENCIA DE MATERIALES DE CONTROL EMPLEADOS EN LA ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA TABLA No. 4 Límites de referencia establecidos para el control FASC en medio alcalino FRACCIÓN MEDIA (%) RANGO (%) Hb A 28.7 25.6 – 31.8 Hb F 24.5 22.0 – 27.0 Hb S 25.7 22.9 – 28.5 Hb C 21.1 18.7 – 23.5 TABLA No. 5 Límites de referencia establecidos para el control Normal de proteínas FRACCIÓN MEDIA (g/dL) RANGO (g/dL) Albúmina 3.39 3.0 – 3.77 Alfa 1 0.24 0.14 – 0.34 Alfa 2 0.71 0.40 – 1.02 Beta 0.95 0.78 – 1.11 Gamma 0.82 0.64 – 1.01 TABLA No. 6 Límites de referencia establecidos para el control Anormal de proteínas FRACCIÓN MEDIA (g/dL) RANGO (g/dL) Albúmina 4.40 3.99 – 4.82 Alfa 1 0.30 0.20 – 0.40 Alfa 2 0.89 0.60 – 1.18 Beta 0.98 0.86 – 1.10 Gamma 1.94 1.62 – 2.25 122 TABLA No. 7 Límites de referencia establecidos para el control LIPOTROL en electroforesis de lipoproteínas FRACCIÓN MEDIA (%) RANGO (%) Alfa 39.50 31.4 – 47.6 Pre- beta 28.53 21.0 – 36.0 Beta 31.45 22.0 – 38.0 TABLA No. 8 Límites de referencia establecidos para el control CK/LD en electroforesis de isoenzimas de CK FRACCIÓN MEDIA (%) RANGO (%) CK- MM 60.4 46.2 – 74.6 CK- MB 17.1 10.4 – 23.8 CK - BB 22.6 14.3 – 30.9 123 ANEXO 2. RANGOS DE REFERENCIA ESTABLECIDOS POR EL LABORATORIO PARA LAS DIFERENTES DETERMINACIONES ELECTROFORÉTICAS TABLA No . 9 Rangos de referencia para las fracciones de Hemoglobina determinadas mediante electroforesis en medio alcalino. HEMOGLOBINA (%) NORMAL A 96 – 98.5 A2 1–4 F 0 – 0.01 S 0 – 0.01 TABLA No. 10 Rangos de referencia para las fracciones de Proteínas en Suero determinadas mediante electroforesis FRACCIÓN PROTEICA g/dL Albúmina 3.5 – 5.5 Alfa 1 0.2 – 0.4 Alfa 2 0.4 – 0.7 Beta 0.5 – 1.0 Gamma 0.7 – 1.4 TABLA No. 11 Rangos de referencia para las fracciones de Lipoproteínas determinadas mediante electroforesis FRACCIÓN PROTEICA (%) Alfa 16 – 40 Pre-beta 10 – 30 Beta 26 – 57 124 TABLA No. 12 Rangos de referencia para las fracciones de isoenzimas de CK determinadas mediante electroforesis TABLA No. 13 ISOENZIMAS (%) NORMAL CK-MM 94 – 100 CK-MB 0 – 0.1 CK-BB 0 – 0.1 Rangos de referencia para las fracciones de isoenzimas de fosfatasa alcalina determinadas mediante electroforesis ISOENZIMAS (%) NORMAL HEPÁTICA 26 – 86 ÓSEA 10 – 68 MACROHEPÁTICA 0 – 11 INTESTINAL 0–5 125 ANEXO 3. ABREVIATURAS PAGE.- Electroforesis en gel de poliaclilamida SDS.- Dodecil sulfato de sodio ALA.- Ácido δ- aminolevulínico Hb A.- Hemoglobina A Hb A2.- Hemoglobina A2 Hb F.- Hemoglobina Fetal Hb S.- Hemoglobina S Hb C.- Hemoglobina C Hb D.- Hemoglobina D Hb E.- Hemoglobina E HbO.- Hemoglobina O Arab AMC.- Alfa-2-macroglobulina HCD.- Enfermedad de cadenas pesadas LDL.- Lipoproteínas de baja densidad VLDL.- Lipoproteínas de muy baja densidad HDL.- Lipoproteínas de alta densidad ALP.- Fosfatasa alcalina CK.- Creatin cinasa 126 6. REFERENCIAS 1. Henry, John Bernard (2005). El laboratorio en el diagnóstico clínico. Ed. Marbán. España. pp 250 – 262. 2. Murray K. Robert, Mayes A. Peter, et.al. (2001). Bioquímica de Harper. 15ª ed. Ed. El Manual Moderno. México pp. 55 – 67, 843 - 855. 3. Lynch J.Matthew (2001). Métodos de laboratorio. 2ª ed. Ed. Interamericana. México D.F. pp 329-385, 387,402 4. Fauchier P., Catalan F., Interpretive Guide to Clinical Electrophoresis: Important Normal and Abnormal Patterns. Helena Laboratories. Paris, Francia.pp. 2 - 52 5. Mazza J. Joseph (2004). Hematología clínica. Ed Marbán. España.pp 166 - 185 6. Friedman Herman, Rose Noel (1984). El laboratorio en la inmunología clínica. 2ª ed. Ed. Médica Panamericana. Argentina. pp 163 - 193 7. Henry, John Bernard (1993). Diagnóstico y tratamiento clínico por el laboratorio. 9ª ed. Ed. Salvat. México D.F. pp. 628 – 629, 666 – 669, 781-782 8. Gilberto Angel M. (2006). Interpretación clínica del laboratorio. 7ª ed. Ed. Medica Panamericana. Bogotá Colombia. pp 208 – 218 9. Lewis S.M (2001). Practical Hematology. 9ª ed. Ed Churchill livingstone. China. pp. 240 - 244 10. Ferguson Deidy, Sanchez Efraín, Rojo Julieta . Prevalencia de Hemoglobina AS en una población de adolescentes en Panamá. Rev Med Hospital General de Mexico 2003; 66 (3): 136-141 11. Talasemia y otras Hemoglobinopatías. 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El laboratorio clinico y la evaluación de riesgo coronario. Rev. Mex. Patol. Clin. 2000. 47:4, 202-218. 127 17. Tunez Fiñana Isaac. Electroforesis: Electroforesis en el papel de las proteínas séricas. Departamento de bioquímica y biología molecular. Facultad de Medicina. Universidad de Córdova pp 1-7 18. Yábar Varas Carlos Augusto.(2003) Manual de procedimientos de electroforesis para proteínas y DNA. Instituto Nacional de Salud. Lima, Perú. pp 1-20 19. Corte Arboleya Z, Zakariya-Yousef Breval F, Lequerica Fernández P, Ferreiro Artime N, Gutiérrez Cecchini B, Venta Obaya R. Interés clínico de la electroforesis de proteínas. Hospital de San Agustín, Servicios de Análisis Clínicos, Bioquímica. Boletín informativo. 2008, 9:1. pp. 1-4 20. Fortini S. Alexandre, Sanders L. Elizabeth, Weinsherker G. Brian, Katzmann A. Jerrry. Cerebroespinal fluid Oligoclonal Bands in the Diagnosis of Multiple Sclerosis. 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Inserto Alkaline Hemoglobine Procedure, Helena Laboratories 34. Inserto Acid Hemoglobine Procedure, Helena laboratories 129
