estudio integral y sistemas de deteccion del agente causal de la

ESTUDIO INTEGRAL Y SISTEMAS DE DETECCION DEL AGENTE CAUSAL
DE LA PUDRICION BLANCA DEL AJO: SCLEROTIUM CEPIVORUM
Resumen ejecutivo
Los objetivos y avances de este proyecto fueron: a) obtener marcadores
moleculares específicos del genoma de Sclerotium cepivorum, los cuales ya se
tienen; b) validar los marcadores moleculares en muestras de suelo y semillas
en muestras de campo. Se enfrentaron muchos problemas para obtener la
reproducibilidad de los resultados de las amplificaciones, porque hubo mucha
interferencia con los restos orgánicos de las muestras de suelo; c) purificar
proteínas involucradas en el desarrollo del hongo, para que sirvan como
marcadores moleculares con el fin de determinar la presencia del patógeno en
suelo y semilla, para lo cual se purificó la proteína de desarrollo Sc1. El análisis
de su secuencia peptídica presento homología con una proteína hipotética
registrada en el genoma de Sclerotinia sclerotiorum. Se cuenta ya con el marco
de lectura abierto para continuar con la estrategia de RNA de interferencia con
el fin de disminuir los niveles de expresión de la proteína Sc1 y ver su efecto en
la formación del esclerocio; d) observar el efecto sobre la formación de
esclerocios en los diferentes aislados de la región al utilizar inhibidores de la
enzima encargada de la síntesis de poliaminas. Los resultados obtenidos
permiten detectar cepas que son más sensibles a los inhibidores que otras, ya
que se observaron desde la inhibición total de la formación de esclerocios,
hasta una inhibición del 50%; e) observar el efecto sobre el crecimiento y la
formación de esclerocios de los diferentes aislados de la región al utilizar un
agente de biocontrol. Al respecto, se determinó el efecto de un agente de
biocontrol mejorado genéticamente y se encontró que ninguno de los aislados
es resistente al efecto del agente biocontrolador; también se detectó que la
presencia del agente inhibe la formación de los esclerocios y polariza la
presencia de éstos.
En la búsqueda de marcadores moleculares específicos para Sclerotium
cepivorum, se utilizó el DNA de una cepa control de Sclerotium cepivorum
(cepa Sc), y se probaron 136 iniciadores inespecíficos, de los cuales se
conservaron los que dieron un patrón claro de amplificación a 50°C y que el
tamaño de las bandas amplificadas fuera de un rango entre 300 a 2,000 pares
de bases (PB).
Para la caracterización de proteínas involucradas en el desarrollo del
esclerocio, se caracterizó molecularmente una proteína llamada Sc1, cuya
presencia se detectó en el esclerocio, aun cuando todavía no es claro el papel
que tiene en el desarrollo o en la viabilidad del hongo. Sin embargo, se tiene
como antecedente la purificación de esta proteína denominada Sc1, la cual se
presenta cuando empieza la formación del esclerocio.
Con el fin de obtener anticuerpos contra del proteínas del esclerocio, se
obtuvieron anticuerpos contra las isoformas 1 y 2, para lo cual se purificó una
mayor cantidad de proteína, se sometió a electroforesis en doble dimensión
como se describió anteriormente, se cortaron las manchas correspondientes a
las proteínas, se mezclaron con 0.5 ml de adyuvante de Freund y se
homogenizaron para inyectar un conejo de raza Nueva Zelanda con cada una
de las proteínas, las inyecciones se repitieron cada 15 días hasta completar un
total de cinco inmunizaciones. A partir de la tercera inmunización se sangraron
a los conejos para medir la producción de anticuerpos por medio de la técnica
de ELISA, utilizando como segundo anticuerpo chivo anti-conejo acoplado a
peroxidada. Los conejos se sangraron totalmente, se recuperó el suero el cual
se tituló para los anticuerpos de interés. Estos anticuerpos podrán utilizarse
para la localización intracelular de las proteínas, así como para determinar si
ambas son antigénicamente similares.
Para determinar la composición de la pared celular de Sclerotium cepivorum,
se obtuvo micelio y esclerocios de S. cepivorum creciendo al hongo en medio
Vogel y PDA (agar dextrosa papa) respectivamente. Tanto el micelio como los
esclerocios se resuspendieron en Tris-HCl 10 mM de pH 7, se sometieron a
rompimiento balístico en un homogenizador Braun.
En cuanto a la implementación de un método rápido para la obtención de DNA
a partir de semillas de ajo contaminadas con Sclerotium
Cepivorum, se estuvieron probando diferentes estrategias para obtener DNA de
buena calidad a partir ajos contaminados. Se probaron tres métodos rápidos de
extracción de DNA que involucran la utilización de polietilenglicol 2000 y un
método físico, utilizando ondas de baja energía (microondas). El DNA obtenido
se puede utilizar para la técnica de PCR, utilizando los iniciadores ya probados
para que se acorte el tiempo de detección del hongo patógeno en semillas.
La última etapa correspondió a la determinación de la interacción de la cepta
mutante Δtvk-1 del hongo biocontrolador Trichoderma virens con Sclerotium
cepivorum Berk, para lo cual se utilizó la cepa mutante de una MAPK de
Trichoderma virens, llamada Δtvk-1, ya que está reportado que tiene
incrementada su capacidad de mico parasitismo, la cual se confrontó con
aislados representativos de toda la colección del laboratorio.
Demanda o problemática que atiende
Avanzar en la elaboración de un método de diagnóstico simple, rápido y
eficiente que pueda detectar la presencia del hongo Sclerotium en el suelo y en
la semilla.
Profundizar los estudios genómicos que lleven a la detección de ese agente
causal de la pudrición blanca del ajo.
Resultados obtenidos y/o descripción. Características de la tecnología
generada
Se tienen las bandas de amplificación detectadas y clonadas, así como la
secuencia de todas las bandas y el diseño de cuando menos cuatro nuevos
iniciadores específicos. Falta probarlos con las demás cepas y organismos
presentes en suelo.
Identificación de las bandas que co-migran con el mismo peso molecular de la
proteína Sc1 y se obtuvieron anticuerpos contra éstas. Estos anticuerpos
permitirán detectar la presencia de la proteína en los esclerocios y en el
micelio.
Se caracterizaron los aislados con respecto al grupo de anastomosis,
sensibilidad a un agente de biocontrol y a un agente químico.
Impactos
Destaca la creación de un nuevo método de detección molecular a partir de
muestras de suelo, ya que los métodos que se han reportado para obtener
DNA de muestras de suelo utilizan compuestos muy contaminantes, por tal
motivo se trabajó en el diseño de una técnica que permita detectar a Sclerotium
cepivorum en suelo sin generar muchos residuos contaminantes del medio
ambiente.
Costos estimados de la aplicación de los resultados y/o tecnología generada
No se puede estimar el costo, en virtud de que los estudios genómicos son
parte de un quizá largo proceso científico.
Ámbito de aplicación
Comunidad científica nacional.
Información adicional o comentario
Sclerotium cepivorum es un hongo fitopatógeno de las plantas del género
Allium. En el ajo produce una enfermedad conocida como “pudrición blanca”,
la cual impacta en la producción de esta hortaliza en la región del Bajío,
ocasionando pérdidas económicas importantes para los productores de la
región. La estructura de resistencia y reproducción de Sclerotium cepivorum
son los esclerocios, los cuales permanecen viables en el suelo hasta por 20
años y pueden diseminarse de un campo de cultivo a otro muy fácilmente.
Clave del proyecto: SAGARPA 2005-C01-11919
Sistema Producto y/o línea estratégica de atención: Sistema Producto Ajo;
fitomejoramiento.
Investigador: doctora PATRICIA PONCE NOYOLA
Institución: